Summary
O presente protocolo descreve um método simples para isolar pré-apócitos do tecido adiposo em embriões de frango. Este método permite o isolamento com alto rendimento, cultura primária e diferenciação adipogênica de pré-apócitos. Manchas de óleo Vermelho O e mancha lipídica/DNA mediram a capacidade adipogênica de células isoladas induzidas com meios de diferenciação.
Abstract
Pré-iadipócitos primários são um valioso sistema experimental para entender as vias moleculares que controlam a diferenciação e o metabolismo adipócitos. Embriões de frango oferecem a oportunidade de isolar os pré-idócitos do estágio inicial do desenvolvimento adiposo. Esta célula primária pode ser usada para identificar fatores que influenciam a proliferação de pré-doenças e a diferenciação adipogênica, tornando-as um modelo valioso para estudos relacionados à obesidade infantil e controle do excesso de deposição de gordura em aves de capoeira. O rápido crescimento do tecido adiposo pós-natal efetivamente desperdiça ração, alocando-o longe do crescimento muscular em frangos de corte. Portanto, métodos para entender os estágios iniciais do desenvolvimento de tecidos adiposos podem fornecer pistas para regular essa tendência e identificar maneiras de limitar a expansão adiposa no início da vida. O presente estudo foi concebido para desenvolver um método eficiente de isolamento, cultura primária e diferenciação adipogênica de pré-iadipócitos isolados do desenvolvimento de tecido adiposo de embriões de filhotes de frango comercial (tipo carne). O procedimento foi otimizado para produzir células com alta viabilidade (~98%) e capacidade aumentada de diferenciação em adipócitos maduros. Este método simples de isolamento, cultura e diferenciação pré-apócis embrionárias suporta análises funcionais de crescimento e desenvolvimento de gordura no início da vida.
Introduction
A obesidade é uma ameaça à saúde global para adultos e crianças. Crianças com sobrepeso ou obesidade têm aproximadamente cinco vezes mais chances de serem obesas quando adultos, colocando-as em risco significativamente aumentado para doenças cardiovasculares, diabetes e muitas outras comorbidades. Cerca de 13,4% das crianças norte-americanas de 2 a 5 anos têm obesidade1, ilustrando que a tendência de acumular excesso de gordura corporal pode ser iniciada muito cedo na vida. Por razões muito diferentes, o acúmulo de excesso de tecido adiposo é uma preocupação para frangos de corte (tipo carne). Os frangos modernos são incrivelmente eficientes, mas ainda acumulam mais lipídios do que é fisiologicamente necessário 2,3. Essa tendência começa logo após o hatch e efetivamente desperdiça ração, o componente de produção mais caro, alocando-o longe do crescimento muscular. Portanto, tanto para crianças quanto para galinhas de corte, embora por razões muito diferentes, há a necessidade de entender fatores que influenciam o desenvolvimento de tecidos adiposos e identificar maneiras de limitar a expansão adiposa no início da vida.
Os adipócitos formam-se de pré-apócitos, células-tronco derivadas de tecido adiposo que sofrem diferenciação para desenvolver células de gordura maduras e armazenadas por lipídios. Assim, os pré-apócitos in vitro são um modelo experimental valioso para estudos de obesidade. Essas células, isoladas da fração vascular estromica dos depósitos adiposos, podem fornecer uma compreensão fundamental das vias moleculares que controlam a diferenciação de adipócitos e o metabolismo 4,5. Os embriões de pintinhos são um modelo experimental favorável em estudos de desenvolvimento porque a colheita de ovos no cronograma desejado facilita a manipulação experimental, pois permite a obtenção de embriões sem o sacrifício da mãe para observar uma série de estágios de desenvolvimento de embriões. Além disso, procedimentos cirúrgicos complicados e longos períodos de tempo não são necessários para obter embriões relativos a modelos animais maiores. Portanto, o embrião do filhote apresenta uma oportunidade de obter pré-nascidos desde os estágios iniciais do desenvolvimento do tecido adiposo. O tecido adiposo subcutâneo torna-se visível no filhote em torno do dia embrionário 12 (E12) como um depósito claramente definido localizado ao redor da coxa. Este depósito é enriquecido em pré-iadipócitos altamente proliferativos que passam ativamente por diferenciação sob pistas de desenvolvimento para formar adipócitos maduros 6,7. O processo de diferenciação adipogênica é comparável entre galinhas e humanos. Portanto, preadipócitos isolados de embriões de filhotes podem ser usados como modelo de dupla finalidade para estudos relevantes para humanos e aves. No entanto, o rendimento dos preadipócitos diminui com o envelhecimento à medida que as células crescem em adipócitos maduros5.
O presente protocolo otimiza o isolamento de pré-nascidos do tecido adiposo durante a etapa (E16-E18) em que a diferenciação adipogênica e a hipertrofia adipócite estão no seu auge em embriões de filhotesde corte 8. Este procedimento pode avaliar os efeitos de fatores aos quais o embrião em desenvolvimento está exposto no ovo, como a dieta da galinha, sobre o desenvolvimento de adipócitos e potencial adipogênico ex vivo. Também pode testar o impacto de várias manipulações (por exemplo, hipóxia, adições de nutrientes, agonistas farmacológicos e antagonistas) sobre adipogênese ou os vários 'omes (por exemplo, transcrito, metabolome, metilome) de progenitores adipócitos. Como representação do estágio inicial da formação adiposa, as células obtidas usando este protocolo são modelos valiosos para estudos relevantes para aves e seres humanos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os procedimentos animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Tennessee. Ovos de frango comercial recém-fertilizados (Cobb 500) foram obtidos de um incubatório local. Os ovos foram incubados a 38 °C com 60% de umidade relativa até dissecções nos dias embrionários 16-18 (E16-E18). O tecido adiposo foi coletado do depósito subcutâneo (femoral).
1. Preparação para o isolamento e a cultura
- Prepare o capuz cultural e os instrumentos.
- Antes de iniciar as dissecções, configure uma área de trabalho no capô de fluxo de laminar. Desinfetar a área de trabalho e todos os instrumentos, limpando com 70% de etanol. Realizar todos os procedimentos utilizando materiais estéreis.
NOTA: Sempre cotonete os recipientes e instrumentos com 70% de etanol antes de colocá-los de volta na capa de cultura celular. Recomenda-se colocar um esterilizador de instrumentos no capô para que os instrumentos possam ser facilmente esterilizados entre embriões.
ATENÇÃO: Ao usar um esterilizador de instrumentos, esfrie corretamente o instrumento quente para evitar ferimentos de queimadura e danos teciduais. Recomenda-se um tempo mínimo de resfriamento de 3 min. Swab com 70% de etanol antes de usar. - Montar os seguintes instrumentos e vasos no capô: fórceps retos (120 mm), pinças (110 mm), dois pares de fórceps curvos (100 mm), dois pares de tesouras retas (140 mm), tesoura cirúrgica curva (11 5 mm), coador de tecido (250 μm de malha de nylon), coador de células (malha de nylon de 40 μm), tubos de centrífugas cônicas (15 mL e 50 mL), placas de Petri (60 mm e 100 mm), Béquer pequeno (100 mL), spray de 70% de etanol e gaze estéril, papel toalha e limpador de bancada (ver Tabela de Materiais).
- Antes de iniciar as dissecções, configure uma área de trabalho no capô de fluxo de laminar. Desinfetar a área de trabalho e todos os instrumentos, limpando com 70% de etanol. Realizar todos os procedimentos utilizando materiais estéreis.
- Prepare soluções enzimáticas, mídia de coleta e mídia cultural seguindo os passos abaixo.
NOTA: Prepare as soluções com antecedência e armazene a 4 °C até o uso. A mídia precisa ser colocada no gelo antes da coleta de tecidos. Todos os reagentes utilizados nesta etapa estão listados na Tabela de Materiais.- Prepare as mídias utilizadas tanto para a coleta de tecido adiposo quanto para a preparação de solução enzimática, suplementando o DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium com 2,50 mM de L-glutamina e 15 mM de tampão HEPES) com 2,5 μg/mL de Anfotericina B e penicilina/estreptomicina 1x (P/S), 100 U/mL. Armazene a 4 °C até o uso.
NOTA: Esta mídia permanece estável por 1 ano quando armazenada a 4 °C. - Prepare a solução de esterilização diluindo Betadina a 20% (v/v) em 1x PBS (Salina Tamponada fosfato com pH 7.4, sem cálcio, magnésio ou vermelho fenol) com 2,5 μg/mL de Anfotericina B. Armazenar a 4 °C até o uso.
NOTA: A solução é estável por 2 anos quando armazenada a 4 °C. - Prepare a solução enzimática dissolvendo a colagem tipo 1 (1 mg/mL) em DMEM/F12 com 2,5 μg/mL de Anfotericina B e 1x P/S (etapa 1.2.1). Faça uma nova solução de colagem e mantenha-a no gelo durante as dissecções. Aproximadamente 10 minutos antes do uso, pré-aqueça incubando esta solução a 37 °C em um banho de água para iniciar sua atividade enzimática.
NOTA: Aproximadamente 1 mL de solução de colagenase (1 mg/mL) é necessário por 100 mg de tecido adiposo. - Prepare as mídias de crescimento utilizadas para chapeamento e propagação, complementando a mídia DMEM/F12 com 1x P/S e 10% FBS. Armazene a 4 °C até o uso.
NOTA: A solução é estável por 1 ano quando armazenada a 4 °C. - Prepare a solução de lavagem suplementando 1x PBS com 2,5 μg/mL de Anfotericina B. Ajuste a solução ao pH 7.4 desejado. Armazene a 4 °C até o uso.
NOTA: A solução é estável por 2 anos quando armazenada a 4 °C.
- Prepare as mídias utilizadas tanto para a coleta de tecido adiposo quanto para a preparação de solução enzimática, suplementando o DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium com 2,50 mM de L-glutamina e 15 mM de tampão HEPES) com 2,5 μg/mL de Anfotericina B e penicilina/estreptomicina 1x (P/S), 100 U/mL. Armazene a 4 °C até o uso.
2. Coleta e digestão de tecidos adiposos
- Eutanize o embrião.
- No dia 16, remova os ovos da incubadora. A principal fonte potencial de contaminação microbiana é a superfície do ovo; portanto, cotonhe os ovos com uma gaze estéril encharcada em 70% de etanol antes de quebrá-los. Depois de limpar, coloque o ovo verticalmente com a extremidade pontiadeira para baixo em um pequeno béquer (100 mL) forrado com toalhas de papel para amortecer o ovo do copo.
- Usando a alça do fórceps, quebre um ovo batendo na extremidade cega do ovo. Remova cuidadosamente a casca de ovo para criar uma abertura suficientemente grande para remover o embrião (etapa 2.1.3). Rasgue suavemente a membrana da casca branca para expor o embrião (Figura 1A). Fure o amnion cuidadosamente usando pinças estéreis (Figura 1B).
NOTA: O saco amniótico é uma membrana transparente cheia de fluido amniótico que envolve o embrião. - Remova o embrião do ovo agarrando levemente o pescoço do embrião usando fórceps retos. Corte o saco de gema para desconectá-lo do embrião, e transfira o embrião para uma placa de Petri de 100 mm.
- Decapitar imediatamente usando tesoura cirúrgica e fórceps.
- Realize a coleta de tecido adiposo.
- Limpe o corpo do embrião com 70% de etanol e esfregue a superfície da pele suavemente com uma gaze estéril para remover penas, pois elas podem interferir com a filtragem em passos posteriores após a digestão. Use limpadores de bancada para evitar que a pele e as penas toquem o tecido coletado.
- Corte a pele entre as pernas e a região abdominal para revelar o par de depósitos de adiposos femorais.
- Segure a pele ao redor da perna usando fórceps curvos com uma mão. Remova suavemente a gordura subcutânea femoral com a outra mão, usando fórceps curvos para puxar suavemente o depósito para longe da perna.
NOTA: Há relativamente pouco tecido conjuntivo que adere à almofada de gordura à perna, e toda a almofada de gordura deve ser removível em uma peça usando apenas fórceps. Isso pode ser facilitado segurando os fórceps para trás para que as porções curvas (em vez das extremidades) fixem a almofada de gordura para remoção.- Se necessário, corte a almofada de gordura com uma tesoura curva. Repita com o outro bloco de gordura e embriões adicionais conforme necessário.
NOTA: Um total de 80 mg de gordura subcutânea pode ser obtido da maioria dos embriões em E16 (Figura 1C). Isso normalmente rende ~1 x 106 células, suficientes para emplacar um frasco T-25. Pode ser útil nesta etapa pesar almofadas de gordura de alguns embriões para avaliar a quantidade de material inicial, já que os pesos das almofadas de gordura podem variar entre linhas específicas de frango, e devido a fatores incontroláveis, como a idade da galinha criadora e a dieta. A gordura subcutânea foi coletada rotineiramente de cinco ovos para garantir um rendimento adequado de células para chapeamento em frascos múltiplos.
- Se necessário, corte a almofada de gordura com uma tesoura curva. Repita com o outro bloco de gordura e embriões adicionais conforme necessário.
- Transfira os tecidos para ~5 mL de mídia de coleta em um tubo de 15 mL e repita a dissecção para os ovos restantes.
- Enxágue brevemente as almofadas de gordura coletadas transferindo-as para uma placa de Petri de 60 mm contendo solução de esterilização e rodopiando a placa algumas vezes.
- Enxágüe a solução de esterilização transferindo almofadas de gordura para uma placa de Petri de 60 mm contendo 1x PBS. Gire suavemente. Repita esta etapa transferindo para uma segunda placa de Petri de 60 mm contendo 1x PBS.
- Realize a digestão enzimática e o isolamento pré-doença seguindo os passos abaixo.
- Transfira os tecidos adiposos para um tubo de 15 mL contendo ~1 mL de solução enzimática pré-aquecida por 100 mg de tecido. Mergulhe um par de tesouras longas e retas no tubo e pique finamente os tecidos adiposos da solução em pedaços tão pequenos quanto possível (~1 mm3) (Figura 2A).
NOTA: O rendimento celular será reduzido se os tecidos não estiverem completamente picados. - Transfira o tecido picado e a solução enzimática para um frasco autoclavado de 25 mL. Enrole o frasco com filme de parafina. Coloque em um agitador orbital dentro de uma incubadora e agite a 37 °C durante a etapa de digestão.
NOTA: Alternativamente, use um banho de água tremendo. Com qualquer aproximação, a velocidade deve ser suficiente para evitar que pedaços de tecido se acomodem na parte inferior do frasco, mas não deve ser tão rápido que as peças são impulsionadas para o topo do frasco e grudam no vidro, ou que o fluido se acumula na capa do filme de parafina. - Depois de ~30 min, corte a extremidade de uma ponta de pipeta de 1 mL para um diâmetro de aproximadamente 3 mm. Pipeta a mistura de tecido para cima e para baixo algumas vezes para ajudar a liberar as células do tecido adiposo. Devolva o frasco para a incubadora/banho de água e retome o tremor.
- Depois de mais 15 minutos, verifique se há completude da digestão. Depois de remover o frasco do agitador, uma camada de células esbranquiçadas se formará na parte superior da camada de fluido. Se ainda permanecerem fragmentos de tecido, corte a extremidade de outra ponta de pipeta e encobre suavemente a mistura para cima e para baixo, em seguida, continue tremendo por mais 15 minutos.
NOTA: A mistura de tecido/colagenase completamente digerida parece chyme leitoso. Normalmente, o tecido é suficientemente digerido após 1h de agitação suave. Se muitos fragmentos permanecerem neste momento, pode indicar um problema com a enzima colagenase usada. Agitação constante pode aumentar o rendimento; no entanto, a exposição prolongada à enzima e ao estresse físico também podem danificar as células. - Após a digestão, pipeta suavemente para cima e para baixo para misturar bem. Filtre através de um coador de tecido de 250 μm em um tubo de 15 mL por pipetação para remover quaisquer pedaços de tecido e detritos não digeridos.
- Enxágüe o frasco com 4 mL de mídia de crescimento por pipetação para remover células que podem ser aderidas ao vidro e filtrar no mesmo tubo de 15 mL. Enxágüe o coador com mídia de crescimento adicional por tubulação para soltar quaisquer células presas, até um volume total de 14 mL.
- Pelota a fração celular por centrifugação a 300 x g por 5 min no RT (7 min para tubo de 50 mL).
NOTA: Sempre cotone os tubos com 70% de etanol antes de retornar ao capô da cultura celular. - Aspire o supernatante. Tenha cuidado para não desalojar a pelota da célula. Levemente resuspenque a pelota em 1 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos (ver Tabela de Materiais) por tubulação para cima e para baixo, e incubar por 5 min na RT. A solução ficará avermelhada à medida que os glóbulos vermelhos forem lírios (Figura 2B).
NOTA: Coloque o tampão de lise RBC em RT antes de usar. Galinhas têm glóbulos vermelhos nucleados9, e se prendem a pratos de cultura tecidual junto com preadipócitos. O buffer de lise RBC é usado para lise essas células para evitar sua interferência com contagem de células precisas. - Adicione 5 mL de mídia de crescimento ao tubo contendo as células para diluir o tampão de lise e misture suavemente por pipetar para cima e para baixo. Usando uma pipeta, filtrar através de um coador de célula de 40 μm em um novo tubo de 50 mL e enxágue o coador com um adicional de 5 mL de mídia de crescimento.
- Células de pelotas por centrifugação a 300 x g por 7 min na RT. Aspire cuidadosamente o supernasce e resuspense a pelota de célula restante em 1 mL de mídia de crescimento, pipetando para cima e para baixo.
- Use um hemótmetro, contador de células e mancha Trypan Blue para contar células e determinar a viabilidade celular. Pegue 10 μL de amostra e misture com 10 μL de Trypan Blue por pipetação. Carregue 10 μL da mistura no hematócito e meça10.
NOTA: As velocidades de centrifugação podem ser aumentadas para 600 x g se as pelotas de célula suficientes não forem facilmente visíveis após o giro inicial.
- Use um hemótmetro, contador de células e mancha Trypan Blue para contar células e determinar a viabilidade celular. Pegue 10 μL de amostra e misture com 10 μL de Trypan Blue por pipetação. Carregue 10 μL da mistura no hematócito e meça10.
- Transfira os tecidos adiposos para um tubo de 15 mL contendo ~1 mL de solução enzimática pré-aquecida por 100 mg de tecido. Mergulhe um par de tesouras longas e retas no tubo e pique finamente os tecidos adiposos da solução em pedaços tão pequenos quanto possível (~1 mm3) (Figura 2A).
3. Semeadura e cultura de preadipócitos
- Sementes ~1 x 106 células em 4 mL de mídia de crescimento pré-aquecida em um frasco T-25. Siga a mesma densidade de revestimento se usar outros tipos de vasos culturais. Coloque na incubadora de cultura de tecidos e deixe anexar durante a noite.
NOTA: As células são cultivadas em uma incubadora de 38 °C com uma atmosfera umidificada de 5% de CO2. A temperatura ideal para o crescimento das células aviárias11 é de 38 °C, e elas crescem lentamente a 37 °C. - No dia seguinte, aspirar a mídia e lavar suavemente as células com 1x PBS por pipetação para remover células nãoectadas ou mortas. Substitua por 4 mL de nova mídia de crescimento. Verifique as células sob um microscópio. As células devem ser em forma de spindly, como os fibroblastos (Figura 2A).
NOTA: Normalmente, os pré-apócis se conectam rapidamente (dentro de algumas horas). O sucesso ou falha do isolamento celular pode ser confirmado neste momento (após 24 h). - Substitua por 4 mL de nova mídia de crescimento a cada 2 dias e células de subcultura ou criopreserve quando atingirem 70%-80% de confluência (Figura 3C).
4. Subcultura e criopreservação
- Aspirar mídia antiga e lavar suavemente as células com 4 mL de 1x PBS por pipetação. A aspire PBS, adicione 2 mL de 0,1% de trippsina para cobrir a superfície celular em um frasco T-25 (ajuste o volume de acordo para outros vasos culturais) e, em seguida, incubar por 3-4 min a 38 °C.
NOTA: Observe se as células estão separadas da placa de cultura. Toque suavemente na placa de cultura para ajudar o desprendimento celular. Incubar células com trippsina por muito tempo danificará as células. - Adicione um volume equivalente de mídia de crescimento pré-aquecida para inibir a reação de trippsina. Pipeta sobre a superfície celular várias vezes, inclinando a placa para afrouxar as células restantes.
- Transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mL e centrífuga a 300 x g por 5 min a RT (7 min para tubo de 50 mL). Aspire o supernatante.
- Se subculturar, resuspende a pelota em 1 mL de mídia de crescimento, pipetando para cima e para baixo. Conte células como descrito na etapa 2.3.9.1 e, em seguida, relate usando a mesma densidade de revestimento usada inicialmente na etapa 3.1.
- Se criopreservar, prepare 4 mL de mídia congelante para um frasco T-25 com 90% de confluência.
NOTA: A mídia de congelamento consiste em 10% DMSO, 30% FBS e 60% DMEM/F12. - Resuspend cell pellet in freezing media and transfer 1 mL de mídia congelante para um criovial. Congele lentamente os criovials para -1 °C/min usando um recipiente de congelamento. Coloque o recipiente em um congelador de -80 °C durante a noite e, em seguida, transfira-o para nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.
NOTA: Preadipócitos devidamente criopreservados mantêm sua viabilidade por pelo menos 3 anos e normalmente funcionam como células recém-isoladas quando descongelados e banhados.
5. Diferenciação adipogênica
NOTA: 2% de placas revestidas de gelatina podem ser usadas para aumentar a adesão celular.
- Prepare uma solução de gelatina de 2% (w/v) (ver Tabela de Materiais) em água destilada. Autoclave a 121 °C, 15 psi por 30 min para esterilizar. Superfície de cultura do revestimento com 5-10 μL de solução de gelatina/cm2 (ou seja, 100-200 μg/cm2). Gire suavemente para revestir uniformemente a superfície.
- Verifique as placas para até mesmo a disseminação da solução de gelatina, uma vez que algumas regiões podem permanecer sem revestimento inicialmente. Deixe que a placa revestida de gelatina permaneça no RT por pelo menos 1 h. Remova todo o volume da solução de gelatina dos poços.
NOTA: Isso deixará um fino casaco de gelatina na parte inferior dos poços/pratos. A solução de gelatina pode ser reutilizada várias vezes (pelo menos 10 vezes) sem alterar a adesão e o crescimento celular. Deixe que os pratos revestidos de gelatina permaneçam na capa da cultura tecidual por pelo menos 30 minutos antes de emplacar as células. - Induzir os pré-apócitos de frango a se submeterem à diferenciação adipogênica, suplementando a mídia de crescimento com ácidos graxos. Para preparar a mídia de diferenciação adipogênica (ADM), suplementar o DMEM/F12 com 10% de soro de frango, 1x Ácido Linoleico-Oleic Ácido-Albumina (9,4 μg/mL) e 1x P/S (ver Tabela de Materiais). Faça ADM fresco e quente antes de usar.
NOTA: Os pré-apócis de frango são comumente induzidos a se submeter à diferenciação adipogênica, suplementando a mídia com ácidos graxos em vez de coquetéis hormonais tipicamente usados para adipócitos de outras espécies12. - Induzir a diferenciação substituindo a mídia de crescimento por mídia de diferenciação adipogênica quando as células atingem ~90% de confluência. Mantenha células nesta mídia, substituindo-as a cada 2 dias. Avalie a diferenciação visualmente sob um microscópio (20x) com base na formação de gotículas lipídicas, que se tornam facilmente visíveis dentro de 48 horas de diferenciação indutora.
6. Avaliação da adipogênese
- Executar manchas de Óleo Vermelho O seguindo os passos abaixo.
- Aplaque as células em uma placa de seis poços e induza a diferenciação adipogênica a ~90% de confluência.
- Prepare uma solução de trabalho de Oil Red O combinando seis partes da solução de estoque Oil Red O com quatro partes de água destilada em um tubo de 50 mL. Misture suavemente por tubos para cima e para baixo e deixe ficar por 10 minutos no RT e, em seguida, filtrar através de um papel filtro grau 1 (ver Tabela de Materiais) dentro do funil, despejando lentamente a solução em um tubo de 50 mL.
NOTA: A solução de estoque O vermelho-óleo é feita dissolvendo 0,7 g de Oil Red O (ver Tabela de Materiais) em 200 mL de isopropanol de 100% em uma garrafa autoclavada. Misture bem e deixe descansar por 20 minutos. Armazene a 4 °C e mantenha-se afastado da luz até usar. Isso é estável por 1 ano. A solução de trabalho pode ser usada por 3h; no entanto, recomenda-se usá-lo dentro de 2 h. - Remova a mídia e lave suavemente os poços duas vezes com 2 mL de PBS 1x pré-aquecido usando uma pipeta. Remova o PBS completamente por pipetar. Fixar células com 2 mL de formalina tampão de 10% e enrolar a placa com filme de parafina. Deixe no RT por pelo menos 1h e até 2 dias antes da coloração.
NOTA: Para fazer 1 L de solução formalina 10% tamponada, misture 100 mL de 37% de formaldeído, 4,09 g de NaH2PO4, 6,5 g de Na2HPO4 (ver Tabela de Materiais) e 900 mL de água destilada. Não pipeta formalina diretamente sobre as células. Dispense suavemente na parede lateral perto da parte inferior do poço. - Retire a formalina e lave delicadamente os poços com 2 mL de água destilada. Substitua por 2 mL de isopropanol de 60%. Depois de 5 min, remova o isopropanol e deixe os poços secarem completamente por cerca de 10 minutos. Realize todas as etapas de coloração na RT.
- Adicione 1 mL de óleo vermelho O solução de trabalho para as células e incubar por 10-20 min no RT. Remova a mancha por pipetação e lave cinco vezes mergulhando na água da torneira até que nenhuma mancha em excesso seja vista. Após a lavagem final, adicione 1 mL de água às células antes de visualizar a coloração e coletar imagens sob um microscópio.
- Para quantificar o acúmulo lipídico por prato, remova a água e extraia o corante Óleo Vermelho O das células adicionando 1-2 mL de isopropanol de 100% que é suficiente para cobrir as células em um poço de placa de seis poços completamente. Incubar com agitação suave em um agitador de pratos por 10 minutos no RT.
- Transfira 200 μL da extração para um poço da placa de ensaio de 96 poços. Quantifique a quantidade relativa de mancha usando um leitor de placas espectrômetros para medir a absorvência em 495 nm.
- Realize o ensaio de coloração das gotículas lipídicas intracelulares e do núcleo.
- Células de placas em placas de fundo preto 96-poços e induzem diferenciação adipogênica conforme descrito na etapa 5.3.
- Para colorição das células, adicione 200 μL da solução de coloração contendo uma mancha lipídica fluorescente e uma mancha de DNA fluorescente (ver Tabela de Materiais) em 1x PBS por poço. Após calcular o volume total da mancha necessária, adicione duas gotas da mancha de DNA e 25 μL da mancha lipídica por mL de PBS 1x pré-aquecido usando um tubo embrulhado em papel alumínio para proteger a solução da luz. Incubar na RT por 20 minutos e proteger da luz.
- Leia a fluorescência usando um leitor de placas fluorescentes (ver Tabela de Materiais). Detecte a mancha lipídica (Excitação: 485 nm/Emissão: 572 nm) utilizando um filtro vermelho e a mancha de DNA (Excitação: 359 nm/Emissão: 450 nm) através de um filtro azul/ciano.
NOTA: A coloração também pode ser visualizada e imagens capturadas sob um microscópio fluorescente. - Normalize as intensidades da mancha lipídica às intensidades da mancha de DNA para quantificar o acúmulo de lipídios em relação à célula número13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Os pré-apócis primários são morfologicamente semelhantes aos fibroblastos, com formas irregulares, semelhantes a estrelas e um núcleo central (Figura 2A-C). As células prontamente aderem à cultura tecidual e começam a proliferar logo após o apego. Eles rapidamente se diferenciam e acumulam gotículas lipídicas (Figura 3D) quando fornecidos com ácidos graxos na mídia. A viabilidade (98%, baseada na exclusão de corantes) relatada nos isolamentos aqui representados é típica. Embora as células sejam bastante robustas, o manuseio agressivo durante o isolamento leva a danos celulares (Figura 3E), produzindo células que se prendem mal e não se proliferam. Apesar dos procedimentos incorporados para evitar a contaminação microbiana, pode ocorrer transferência de material não estéril (Figura 3F). Devido à sua rápida taxa de crescimento, os preadipócitos de embriões de filhotes consomem glicose na mídia a altas taxas. A mídia deve ser mudada a cada 48 horas para manter seu fornecimento de energia.
Os resultados representativos aqui apresentados ilustram o potencial adipogênico dos preadipócitos de embriões de filhotes. Essas células rapidamente se acumulam para desenvolver gotículas lipídicas sob condições adipogênicas, e o acúmulo progride ao longo do tempo (Figura 4 e Figura 5). Foram apresentados dois métodos que podem ser utilizados para melhor visualizar e quantificar o grau de acúmulo lipídico nessas células, que é um reflexo direto da adipogênese. A coloração de lipídios com O Vermelho-Óleo é um método de baixo custo para visualizar e quantificar o acúmulo de gotículas lipídicas (Figura 4). Um microscópio leve é usado para coletar imagens, e células manchadas podem ser mantidas no banco até que as imagens sejam coletadas. O acúmulo de lipídios em cada prato de células pode ser quantificado como descrito extraindo a mancha e lendo a absorvância a 495 nm usando um espectrofotômetro. Utilizando a combinação das manchas de lipídio e DNA selecionadas, foi possível quantificar o acúmulo lipídico em relação ao número celular, o que compensa as células não adipogênicas que podem persistir na cultura (Figura 5). Se medidas forem tomadas ao longo de vários pontos de tempo (Figura 5B-C), essa combinação torna possível avaliar tanto a adipogênese quanto a proliferação, por exemplo, em resposta a hormônios adicionados ou peptídeos.
Figura 1: Coleta de tecido adiposo. (A) Ao quebrar a casca de ovo, foi revelada a membrana da casca branca. (B) Perfurar o amnion usando pinças estéreis. (C) Um total de ~80 mg de gordura subcutânea femoral pode ser obtido a partir de E16. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Fragmentos teciduais para digestão enzimática e pelota celular após a digestão. (A) Tecido adiposo picado em solução enzimática (~1 mm3). (B) As setas indicam pelotas celulares após a lise RBC. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Comparações de morfologia celular de preadipócitos primários isolados. (A) Preadipócitos a 24 h após o isolamento. (B) Preadipócitos a 48 h após o isolamento. (C) Preadipócitos com 80% de confluência a 72 h após o isolamento. (D) Preadipócitos após 48 h de indução adipogênica na passagem 4, gotículas lipídicas são visíveis. O inset indica a imagem ampliada das gotículas lipídicas. (E) Imagem representativa das células danificadas. (F) A seta indica pontos de natação pretos na cultura contaminada. Barras de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Avaliação do acúmulo lipídial por Manchas de Óleo Vermelho O. (A) Imagens representativas da mancha de E16 preadipócitos após 24h, 48 h e 72 h de diferenciação adipogênica ex vivo. Barras de escala = 100 μm. (B) Quantificação de gotículas lipídicas medida pela eluição da mancha de Óleo Vermelho O. Os valores são expressos como ± SD. a,b,c P < 0,05 por ANOVA unidirecional com o teste HSD do pós-ptu. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Avaliação da diferenciação de adipócito por mancha lipídica/mancha de DNA. (A) Imagens representativas da mancha lipídica (vermelha) e da coloração do DNA (azul) dos preadipócitos E16 após 24h, 48 h e 72 h de diferenciação adipogênica ex vivo. Barras de escala = 150 μm. (B) Coloração lipídica (Excitação: 485 nm/Emissão: 572 nm) foi realizada para avaliar o acúmulo lipídudo em pré-apócitos diferenciados. (C) Coloração de DNA (Excitação: 359 nm/Emissão: 450 nm) foi realizada para avaliar variações no número de células. (D) A razão de lipídio e mancha de DNA. O acúmulo de lipídios é normalizado para o conteúdo de DNA. Os valores são expressos como ± SD. a,b,c P < 0,05 por ANOVA unidirecional com o teste HSD do pós-ptu. Tukey. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Idade (n=) | x106 células/100 mgs de tecido | Viabilidade (%) |
| E12 (4) | 0,97 ± 0,115 a,b | 98,5 ± 0,58 a |
| E14 (4) | 1.22 ± 0,232 a,b | 98,3 ± 0,96 a,b |
| E16 (21) | 1,61 ± 1.717 a | 97,6 ± 1,58 a |
| E17 (4) | 0,81 ± 0,282 a,b | 96,8 ± 2,63 a,b |
| E18 (7) | 0,72 ± 0,611 a,b | 95,9 ± 1,81 a,b |
| E20 (4) | 0,94 ± 0,171 a,b | 97,8 ± 0,8 a,b |
| D4 (9) | 0,24 ± 0,164 a,b | 93,6 ± 4,28 b |
| D5 (4) | 0,25 ± 0,073 a,b | 98,5 ± 0,71 a,b |
| D7 (10) | 0.17 ± 0,162 b | 96,8 ± 3,49 a,b |
| D14 (4) | 0,25 ± 0,051 a,b | 99,0 ± 0,00 a,b |
Tabela 1: Número médio de células e viabilidade de células isoladas de filhotes de embriões e pós-eclosão.
Os valores são expressos como ± SD. a,b P < 0,05 por ANOVA unidirecional com o teste HSD pós-pt. Tukey.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Embora vários protocolos bem descritos tenham relatado o isolamento de pré-doenças 14,15,16,17, o isolamento para preadipócitos embrionários foi otimizado, o que pode ser usado para análises funcionais do crescimento e desenvolvimento de gorduras no início da vida. Este protocolo produz progenitores adipócidos embrionários de alta viabilidade com alto potencial de diferenciação. Além disso, o procedimento apresentado para isolar preadipócitos não se limita aos embriões, mas pode ser usado em filhotes pós-eclosão. No entanto, foi otimizado para uso com embriões E16, e os rendimentos dos filhotes após o hatch são consideravelmente mais baixos (Tabela 1), provavelmente devido ao aumento da quantidade relativa de tecido conjuntivo à medida que os filhotes crescem rapidamente.
O sucesso do isolamento celular é finalmente avaliado observando a forma e o número de células anexadas (Figura 3A). O baixo número celular ou as células danificadas podem ser observados quando as frações teciduais são digeridas por muito tempo, especialmente quando a dissociação tecidual progride por mais de 1,5 h (Figura 3E). Portanto, recomenda-se que 1,5 h de digestão não seja excedida. Por outro lado, se o fragmento de tecido permanecer claramente após uma hora de digestão, o tempo digestivo ou a quantidade devem ser aumentados. A quantidade de tecido adiposo obtida também pode ser variada dependendo da cepa genética do frango. Se este protocolo for usado para isolar células de outras idades ou espécies, tanto a quantidade de colagemnase quanto o tempo de digestão provavelmente precisarão ser modificados.
Uma limitação comum da cultura celular primária é que as células isoladas começam a perder potencial adipogênico após várias passagens na cultura; assim, é importante induzir a diferenciação dentro de poucos dias de isolamento para garantir que os preadipócitos embrionários não percam sua capacidade adipogênica. Precursores adipogênicos de embriões facilmente se diferenciam em adipócitos maduros na formulação de mídia descrita acima, sem a necessidade de confluência ou indução hormonal. As células até a passagem 4 (10-14 dias) são facilmente diferenciadas dentro de 48h de indução (Figura 3D).
Controlar a contaminação celular na cultura celular primária é outro desafio, onde a contaminação fúngica é a mais comum. O uso de Anfotericina B, como descrito, é geralmente eficaz na prevenção do crescimento fúngico18,19. Pode ser incluído em baixas concentrações na mídia cultural sem efeitos perceptíveis sobre viabilidade ou potencial adipogênico. Contaminantes microbianos não identificáveis têm sido observados na forma de pontos de natação pretos que aparecem poucos dias após o isolamento celular (Figura 3F). Estes afetaram negativamente o crescimento celular e eram impossíveis de remover uma vez que essa infecção ocorreu20. Se esses contaminantes eram uma espécie microbiana desconhecida encontrada dentro ou em ovos ou surgida de outra fonte é desconhecida. Este protocolo tenta minimizar o risco de contaminação extraindo embriões aseptamente do ovo21. O uso de um esterilizador de instrumentos à base de calor no capô durante a dissecção também ajuda a minimizar o potencial de contaminação, especialmente quando vários embriões são dissecados.
Uma consideração no processo é a diminuição da adesão celular à placa de cultura tecidual durante a diferenciação, resultante de alterações físicas à medida que as células se formam e expandem gotículas lipídicas. Embora contidos dentro das células, gotículas lipídicas são flutuantes e, quando grandes, parecem agir como balões que tendem a promover o levantamento de células da superfície. Assim, deve-se tomar cuidado no manuseio de pré-acritos ao induzir diferenciação, e particularmente quando a adipogênese é avaliada. Embora o protocolo aqui apresentado não modifique a superfície da cultura, a adesão celular pode ser aprimorada ao emplacar células em pratos revestidos com 2% de gelatina. Também é importante confirmar que o pH das soluções de lavagem seja 7.4 e usar solução PBS pré-aquecida ao lavar células e misturar com a mancha de DNA para reduzir o estresse frio.
Usando múltiplos embriões, um número suficiente de células pode ser isolado para produzir réplicas experimentais sem a necessidade de múltiplas passagens, expansão e o risco de as células perderem seu potencial adipogênico. O RNA pode ser facilmente isolado tanto de adipócitos de embriões de filhotes pré e diferenciados isolados usando métodos comerciais baseados em fenol ou membrana para estudos de expressão genética. RNA suficiente pode ser obtido a partir de um único poço de uma placa de seis poços para uso na síntese cDNA e follow-on qPCR ou RNAseq.
Em resumo, a acessibilidade dos depósitos adiposos no embrião do filhote para isolar um modelo celular é altamente relevante tanto para aves quanto para humanos. Este protocolo é relativamente simples de executar, e produz uma alta porcentagem de células viáveis que podem ser facilmente induzidas a se submeter à diferenciação adipogênica in vitro. Ovos de galinha fertilizados podem ser obtidos de várias fontes comerciais por um custo mínimo, tornando essas células um modelo prontamente disponível para uso prático.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores agradecem à UT AgResearch e ao Departamento de Zootecnia por apoiarem e otimizarem esse protocolo. Este trabalho foi financiado por subvenção do USDA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Pipette | Eppendorf | Z683825 | Single Channel Pipette, 100 - 1000 µL |
| 1 mL Pipette Tip | Fisher Scientific | 02-707-402 | |
| 100% Isopropanol | Fisher Scientific | A426P4 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010023 | |
| 25 mL Flask | Pyrex | 4980-25 | |
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | F75P-1GAL | |
| 6-Well Plate | Falcon | 353046 | Tissue Culture-treated |
| 96-Well Assay Plate | Costar | 3632 | |
| 96-Well Plate, Black Bottom | Costar | 3603 | Tissue Culture-treated |
| AdipoRed | Lonza | PT-7009 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290026 | |
| Bench Top Wiper (Kimtechwiper) | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Betadine | Up & Up | NDC 1167300334 | 20% Working Solution |
| Cell Counter | Corning | 6749 | |
| Cell Strainer, 40 µm | SPL | 93040 | |
| Centrifugaton | Eppendorf | 5702 | |
| Chicken Serum | Gibco | 16110082 | |
| Conical Centrifuge Tubes, 15 mL | VWR | 10025-690 | |
| Conical Centrifuge Tubes, 50 mL | Falcon | 352098 | |
| Cryovial | Nunc | 343958 | |
| Curved Forceps, 100 mm | Roboz Surgical | RS-5137 | |
| Curved Surgical Scissors, 115 mm | Roboz Surgical | RS-6839 | |
| Distilled Water | Millipore | SYNSV0000 | Despensed as needed |
| DMEM/F12 | HyClone | SH30023.01 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | 70% Working Solution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10437028 | |
| Fluorescent Microscope | EVOS | M7000 | |
| Fluorescent Plate Reader | Biotek | Synergy H1 | |
| Foil | Reynolds | Reynolds Wrap Heavy Duty Aluminum Foil, 125 SQ. FT. | |
| Freezing Container | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| Gelatin | Millipore | 4055 | 2% Working Solution |
| Hematocytometer (Counting Chamber) | Corning | 480200 | 0.1 mm deep |
| Incubator | Fisher Scientific | 6845 | |
| Instrument Sterilizer | VWR | B1205 | |
| Linoleic Acid-Oleic Acid-Albumin | Sigma | L9655 | 1x Working Solution |
| Microscope | Evos | AMEX1000 | |
| Multi-Channel Pipette | Thermo Scientific | 4661070 | 12-Channel Pipetters, 30 - 300 µL |
| Na2HPO4 | Sigma | S-7907 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S-3139 | |
| NucBlue | Invitrogen | R37605 | |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | |
| Orbital Shaker | IKA | KS130BS1 | |
| Paper Towel | Tork | RK8002 | |
| Parafilm | Parafilm M | PM996 | |
| Penicillin/Steptomycin (P/S) | Gibco | 15140122 | 1x Working Solution |
| Petri dishes, 100 mm | Falcon | 351029 | |
| Petri dishes, 60 mm | Falcon | 351007 | |
| Plate Shaker | VWR | 200 | |
| RBC Lysis Buffer | Roche | 11814389001 | |
| Reagent Reservior | VWR | 89094-680 | |
| Small Beaker, 100 mL | Pyrex | 1000-100 | |
| Spectrophotometer Plate Reader | Biotek | Synergy H1 | |
| Sterile Gauze | McKesson | 762703 | |
| Straight Forceps, 120 mm | Roboz Surgical | RS-4960 | |
| Straight Scissors, 140 mm | Roboz Surgical | RS-6762 | |
| T-25 Flask | Corning | 430639 | Tissue Culture-treated |
| Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Tissue Strainer, 250 µm | Pierce | 87791 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250061 | |
| Trypsin | Gibco | 15400054 | 0.1% Working Solution |
| Tweezers, 110 mm | Roboz Surgical | RS-5035 | |
| Type 1 Collagenase | Gibco | 17100017 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | 15-462-10 | |
| Whatman Grade 1 Filter Paper | Whatman | 1001-110 |
References
- Fryar, C. D., Carroll, M. D., Ogden, C. L. Prevalence of overweight, obesity, and severe obesity among children and adolescents aged 2-19 years: United States, 1963-1965 through 2015-2016. , (2018).
- Siegel, P. B. Evolution of the modern broiler and feed efficiency. Annual Review of Animal Biosciences. 2 (1), 375-385 (2014).
- Zuidhof, M. J., Schneider, B. L., Carney, V. L., Korver, D., Robinson, F. Growth, efficiency, and yield of commercial broilers from 1957, 1978, and 2005. Poultry Science. 93 (12), 2970-2982 (2014).
- Poulos, S. P., Dodson, M. V., Hausman, G. J. Cell line models for differentiation: preadipocytes and adipocytes. Experimental Biology and Medicine. 235 (10), 1185-1193 (2010).
- Vilaboa, S. D. -A., Navarro-Palou, M., Llull, R. Age influence on stromal vascular fraction cell yield obtained from human lipoaspirates. Cytotherapy. 16 (8), 1092-1097 (2014).
- Speake, B. K., Noble, R. C., McCartney, R. J. Tissue-specific changes in lipid composition and lipoprotein lipase activity during the development of the chick embryo. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Lipids and Lipid Metabolism. 1165 (3), 263-270 (1993).
- Chen, P., Suh, Y., Choi, Y. M., Shin, S., Lee, K. Developmental regulation of adipose tissue growth through hyperplasia and hypertrophy in the embryonic Leghorn and broiler. Poultry Science. 93 (7), 1809-1817 (2014).
- Farkas, K., Ratchford, I. A., Noble, R. C., Speake, B. K. Changes in the size and docosahexaenoic acid content of adipocytes during chick embryo development. Lipids. 31 (3), 313-321 (1996).
- Claver, J. A., Quaglia, A. I. Comparative morphology, development, and function of blood cells in nonmammalian vertebrates. Journal of Exotic Pet Medicine. 18 (2), 87-97 (2009).
- Corning Cell Counter Demo Video. , Available from: https://www.youtube.com/watch?v=JWjckEHO6Wg (2022).
- Nema, R., Khare, S. An animal cell culture: Advance technology for modern research. Advances in Bioscience and Biotechnology. 3 (3), 219-226 (2012).
- Regassa, A., Kim, W. K. Effects of oleic acid and chicken serum on the expression of adipogenic transcription factors and adipogenic differentiation in hen preadipocytes. Cell Biology International. 37 (9), 961-971 (2013).
- Temkin, A. M. Effects of crude oil/dispersant mixture and dispersant components on PPAR γ activity in vitro and in vivo: identification of dioctyl sodium sulfosuccinate (DOSS; CAS# 577-11-7) as a probable obesogen. Environmental Health Perspectives. 124, 112-119 (2016).
- Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. Adipose Tissue Protocols. , Springer. 201-219 (2008).
- Lee, M. J., Wu, Y., Fried, S. K. A modified protocol to maximize differentiation of human preadipocytes and improve metabolic phenotypes. Obesity. 20 (12), 2334-2340 (2012).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).
- Akbar, N., Pinnick, K. E., Paget, D., Choudhury, R. P. Isolation and characterization of human adipocyte-derived extracellular vesicles using filtration and ultracentrifugation. Journal of Visualized Experiments. (170), e61979 (2021).
- Perlman, D., Giuffre, N. A., Brindle, S. A. Use of Fungizone in control of fungi and yeasts in tissue culture. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 106 (4), 880-883 (1961).
- Kuhlmann, I. The prophylactic use of antibiotics in cell culture. Cytotechnology. 19 (2), 95-105 (1995).
- Yang, X., et al. Black swimming dots in cell culture: the identity, detection method and judging criteria. bioRxiv. , 366906 (2018).
- Freshney, R. I. Culture of animal cells: a manual of basic technique and specialized applications. , John Wiley & Sons. 163-186 (2015).
