Summary
Denne protokol beskriver en simpel metode til isolering af præadipocytter fra fedtvæv i slagtekyllinger. Denne metode muliggør isolering med højt udbytte, primær kultur og adipogen differentiering af præadipocytter. Olie Rød O farvning og lipid / DNA-plet målte den adipogene evne af isolerede celler induceret med differentieringsmedier.
Abstract
Primære præadipocytter er et værdifuldt eksperimentelt system til forståelse af de molekylære veje, der styrer adipocytdifferentiering og metabolisme. Kyllingembryoner giver mulighed for at isolere præadipocytter fra det tidligste stadium af fedtudvikling. Denne primære celle kan bruges til at identificere faktorer, der påvirker præadipocytproliferation og adipogen differentiering, hvilket gør dem til en værdifuld model for undersøgelser relateret til fedme hos børn og kontrol af overskydende fedtaflejring hos fjerkræ. Den hurtige vækst af postnatal fedtvæv spilder effektivt foder ved at allokere det væk fra muskelvækst hos slagtekyllinger. Derfor kan metoder til at forstå de tidligste stadier af fedtvævsudvikling give spor til at regulere denne tendens og identificere måder at begrænse fedtudvidelse tidligt i livet. Denne undersøgelse var designet til at udvikle en effektiv metode til isolering, primær dyrkning og adipogen differentiering af præadipocytter isoleret fra udvikling af fedtvæv af kommercielle slagtekyllinger (kødtype) kyllingeembryoner. Proceduren er optimeret til at give celler med høj levedygtighed (~ 98%) og øget kapacitet til at differentiere sig til modne adipocytter. Denne enkle metode til embryonal præadipocytisolering, kultur og differentiering understøtter funktionelle analyser af fedtvækst og udvikling tidligt i livet.
Introduction
Fedme er en global sundhedstrussel for både voksne og børn. Børn, der er overvægtige eller fede, er cirka fem gange mere tilbøjelige til at være overvægtige som voksne, hvilket placerer dem i signifikant øget risiko for hjerte-kar-sygdomme, diabetes og mange andre comorbiditeter. Omkring 13,4% af amerikanske børn i alderen 2-5 har fedme1, hvilket illustrerer, at tendensen til at akkumulere overskydende kropsfedt kan sættes i gang meget tidligt i livet. Af meget forskellige grunde er akkumuleringen af overskydende fedtvæv en bekymring for slagtekyllinger (kødtype). Moderne slagtekyllinger er utroligt effektive, men akkumulerer stadig mere lipid end det er fysiologisk nødvendigt 2,3. Denne tendens begynder kort efter luge og spilder effektivt foder, den dyreste produktionskomponent, ved at allokere det væk fra muskelvækst. Derfor er der for både børn og slagtekyllinger, omend af meget forskellige grunde, behov for at forstå faktorer, der påvirker fedtvævsudviklingen og identificere måder at begrænse fedtudvidelsen tidligt i livet.
Adipocytter dannes fra preadipocytter, fedtvævsafledte stamceller, der gennemgår differentiering for at udvikle modne, lipidlagrende fedtceller. Følgelig er præadipocytter in vitro en værdifuld eksperimentel model for fedmeundersøgelser. Disse celler, isoleret fra den stromale vaskulære fraktion af fedtdepoter, kan give en grundlæggende forståelse af molekylære veje, der styrer adipocytdifferentiering og metabolisme 4,5. Kyllingeembryoner er en gunstig eksperimentel model i udviklingsundersøgelser, fordi dyrkning af æg på den ønskede tidsplan gør eksperimentel manipulation lettere, da det gør det muligt at opnå embryoner uden moderens offer for at observere en række udviklingsstadier af embryoner. Desuden er komplicerede kirurgiske procedurer og lange perioder ikke nødvendige for at opnå embryoner i forhold til større dyremodeller. Derfor giver kyllingembryret mulighed for at opnå præadipocytter fra de tidligste stadier af fedtvævsudvikling. Subkutant fedtvæv bliver synligt i kyllingen omkring embryonal dag 12 (E12) som et klart defineret depot placeret omkring låret. Dette depot er beriget i stærkt proliferative præadipocytter, der aktivt gennemgår differentiering under udviklingssignaler for at danne modne adipocytter 6,7. Processen med adipogen differentiering er sammenlignelig mellem kyllinger og mennesker. Derfor kan præadipocytter isoleret fra kyllingeembryoner anvendes som en model med dobbelt formål til undersøgelser, der er relevante for mennesker og fjerkræ. Udbyttet af præadipocytter falder imidlertid med aldring, da celler vokser til modne adipocytter5.
Den nuværende protokol optimerer isoleringen af præadipocytter fra fedtvæv i det stadium (E16-E18), hvor adipogen differentiering og adipocythypertrofi er på deres højeste islagtekyllingermbryoner 8. Denne procedure kan vurdere virkningerne af faktorer, som det udviklende embryo udsættes for i ovo, såsom hønediet, på adipocytudvikling og adipogent potentiale ex vivo. Det kan også teste virkningen af forskellige manipulationer (f.eks. Hypoxi, næringsstoftilsætninger, farmakologiske agonister og antagonister) på adipogenese eller de forskellige 'omes (f.eks. Transkriptom, metabolom, methylom) af adipocytprogenitorer. Som en repræsentation af det tidligste stadium af fedtdannelse er celler opnået ved anvendelse af denne protokol værdifulde modeller for undersøgelser, der er relevante for fjerkræ og mennesker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreprocedurer blev godkendt af University of Tennessee Institutional Animal Care and Use Committee. Frisk befrugtede kommercielle slagtekyllinger (Cobb 500) blev opnået fra et lokalt rugeri. Æggene blev inkuberet ved 38 °C med 60 % relativ luftfugtighed indtil dissektioner ved embryonale dage 16-18 (E16-E18). Fedtvæv blev opsamlet fra det subkutane (lårbens) depot.
1. Forberedelse til isolation og kultur
- Forbered kulturhætten og instrumenterne.
- Før du starter dissektioner, skal du oprette et arbejdsområde i laminar-flowhætten. Desinficer arbejdsområdet og alle instrumenterne ved podning med 70% ethanol. Udfør alle procedurer ved hjælp af sterile materialer.
BEMÆRK: Vatpind altid beholderne og instrumenterne med 70% ethanol, før du placerer dem tilbage i cellekulturhætten. Det anbefales at placere en stationær instrumentsterilisator i emhætten, så instrumenter let kan steriliseres mellem embryoner.
FORSIGTIG: Når du bruger en instrumentsterilisator, skal du køle det varme instrument ordentligt ned for at forhindre forbrændingsskade og vævsskade. En minimum køletid på 3 min anbefales. Vatpind med 70% ethanol før brug. - Saml følgende instrumenter og kar i emhætten: lige tang (120 mm), pincet (110 mm), to par buede tang (100 mm), to par lige saks (140 mm), buet kirurgisk saks (115 mm), vævssi (250 μm nylonnet), cellestam (40 μm nylonnet), koniske centrifugerør (15 ml og 50 ml), petriskåle (60 mm og 100 mm), lille bægerglas (100 ml), 70% ethanolspray og sterilt gazebind, køkkenrulle og vinduesvisker (se materialetabel).
- Før du starter dissektioner, skal du oprette et arbejdsområde i laminar-flowhætten. Desinficer arbejdsområdet og alle instrumenterne ved podning med 70% ethanol. Udfør alle procedurer ved hjælp af sterile materialer.
- Forbered enzymatisk opløsning, indsamlingsmedier og kulturmedier ved at følge nedenstående trin.
BEMÆRK: Forbered opløsningerne på forhånd, og opbevar dem ved 4 °C indtil brug. Medier skal placeres på is før vævsindsamling. Alle reagenser, der anvendes i dette trin, er angivet i materialetabellen.- Forbered medier, der anvendes til både opsamling af fedtvæv og fremstilling af enzymatisk opløsning ved at supplere DMEM / F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium med 2,50 mM L-glutamin og 15 mM HEPES-buffer) med 2,5 μg / ml Amphotericin B og 1x penicillin / streptomycin (P / S), 100 U / ml. Opbevares ved 4 °C indtil brug.
BEMÆRK: Dette medie forbliver stabilt i 1 år, når det opbevares ved 4 °C. - Steriliseringsopløsningen fremstilles ved fortynding af Betadin til 20 % (v/v) i 1x PBS (Phosphate Buffered Saline med pH 7,4, uden calcium, magnesium eller phenolrødt) med 2,5 μg/ml Amphotericin B. Opbevares ved 4 °C indtil brug.
BEMÆRK: Opløsningen er stabil i 2 år, når den opbevares ved 4 °C. - Enzymatisk opløsning opløses ved at opløse type 1-collagenase (1 mg/ml) i DMEM/F12 med 2,5 μg/ml amphotericin B og 1x P/S (trin 1.2.1). Lav frisk collagenaseopløsning og opbevar den på is under dissektioner. Ca. 10 minutter før brug forvarm ved at inkubere denne opløsning ved 37 °C i et vandbad for at starte dens enzymatiske aktivitet.
BEMÆRK: Ca. 1 ml collagenaseopløsning (1 mg / ml) er nødvendig pr. 100 mg fedtvæv. - Forbered vækstmedier, der bruges til plettering og formering ved at supplere DMEM / F12-medier med 1x P / S og 10% FBS. Opbevares ved 4 °C indtil brug.
BEMÆRK: Opløsningen er stabil i 1 år, når den opbevares ved 4 °C. - Vaskeopløsningen fremstilles ved at supplere 1x PBS med 2,5 μg/ml amphotericin B. Opløsningen justeres til ønsket pH 7,4. Opbevares ved 4 °C indtil brug.
BEMÆRK: Opløsningen er stabil i 2 år, når den opbevares ved 4 °C.
- Forbered medier, der anvendes til både opsamling af fedtvæv og fremstilling af enzymatisk opløsning ved at supplere DMEM / F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium med 2,50 mM L-glutamin og 15 mM HEPES-buffer) med 2,5 μg / ml Amphotericin B og 1x penicillin / streptomycin (P / S), 100 U / ml. Opbevares ved 4 °C indtil brug.
2. Indsamling og fordøjelse af fedtvæv
- Afliv embryoet.
- På embryonal dag 16 skal du fjerne æggene fra inkubatoren. Den primære potentielle kilde til mikrobiel kontaminering er æggets overflade; derfor swab æggene med en steril gasbind gennemblødt i 70% ethanol, inden de knækkes. Efter podning anbringes ægget lodret med den spidse ende ned på et lille bægerglas (100 ml) foret med køkkenrulle for at dæmpe ægget fra glasset.
- Brug pincettens håndtag til at bryde et æg ved at trykke på den stumpe ende af ægget. Æggeskallen fjernes forsigtigt for at skabe en åbning, der er tilstrækkelig stor til at fjerne embryoet (trin 2.1.3). Riv forsigtigt den hvide skalmembran for at udsætte embryoet (figur 1A). Gennembor amnionen omhyggeligt ved hjælp af steril pincet (figur 1B).
BEMÆRK: Fostervandet er en gennemsigtig membran fyldt med fostervand, der omslutter embryoet. - Fjern embryoet fra ægget ved let at gribe fat i embryoets hals ved hjælp af lige tang. Skær æggeblommesækken for at afbryde den fra embryoet, og overfør embryoet til en 100 mm petriskål.
- Halshug straks ved hjælp af kirurgisk saks og tang.
- Udfør fedtvævsindsamlingen.
- Swab embryokroppen med 70% ethanol og skrub hudoverfladen forsigtigt med en steril gasbind for at fjerne fjer, da de kan forstyrre filtrering på senere trin efter fordøjelsen. Brug bordviskere til at forhindre hud og fjer i at røre ved opsamlet væv.
- Skær huden mellem benene og maveregionen af for at afsløre parret lårbensfedtdepoter.
- Hold huden rundt om benet ved hjælp af buede pincet med den ene hånd. Fjern forsigtigt lårbenets subkutane fedt med den anden hånd ved hjælp af buede pincet til forsigtigt at trække depotet væk fra benet.
BEMÆRK: Der er relativt lidt bindevæv, der klæber til fedtpuden til benet, og hele fedtpuden skal fjernes i ét stykke ved kun at bruge tang. Dette kan lettes ved at holde tangen bagud, så de buede dele (snarere end enderne) klemmer fedtpuden til fjernelse.- Skær om nødvendigt fedtpuden væk med buet saks. Gentag med den anden fedtpude og yderligere embryoner efter behov.
BEMÆRK: I alt 80 mg subkutant fedt kan opnås fra de fleste embryoner ved E16 (figur 1C). Dette giver typisk ~ 1 x 106 celler, tilstrækkeligt til at plade en T-25 kolbe. Det kan være nyttigt på dette trin at veje fedtpuder fra nogle få embryoner for at vurdere mængden af udgangsmateriale, da fedtpudevægte kan variere på tværs af specifikke slagtekyllingelinjer og på grund af ukontrollable faktorer, såsom opdrætterhøns alder og kost. Subkutant fedt blev rutinemæssigt opsamlet fra fem æg for at sikre et tilstrækkeligt udbytte af celler til plettering i flere kolber.
- Skær om nødvendigt fedtpuden væk med buet saks. Gentag med den anden fedtpude og yderligere embryoner efter behov.
- Overfør vævene til ~ 5 ml opsamlingsmedier i et 15 ml rør og gentag dissektion for de resterende æg.
- Skyl kort de opsamlede fedtpuder ved at overføre dem til en 60 mm petriskål indeholdende steriliseringsopløsning og hvirvle skålen et par gange.
- Steriliseringsopløsningen skylles af ved at overføre fedtpuder til en 60 mm petriskål indeholdende 1x PBS. Hvirvl forsigtigt. Gentag dette trin ved at overføre til en anden 60 mm petriskål indeholdende 1x PBS.
- Udfør enzymatisk fordøjelse og preadipocytisolering ved at følge nedenstående trin.
- Overfør fedtvævet til et 15 ml rør indeholdende ~ 1 ml forvarmet enzymatisk opløsning pr. 100 mg væv. Nedsænk en lang, lige saks i røret og hak fedtvævet fint i opløsningen i så små stykker som muligt (~ 1 mm3) (figur 2A).
BEMÆRK: Celleudbyttet reduceres, hvis vævene ikke er grundigt hakket. - Hakket væv og enzymatisk opløsning overføres til en 25 ml autoklaveret kolbe. Pak kolben med paraffinfilm. Anbring på en orbital shaker inde i en inkubator og ryst ved 37 ° C under fordøjelsestrinnet.
BEMÆRK: Alternativt kan du bruge et rystende vandbad. Ved begge fremgangsmåder skal hastigheden være tilstrækkelig til at forhindre vævsstykker i at sætte sig til bunden af kolben, men må ikke være så hurtig, at stykkerne drives frem til toppen af kolben og klæber til glasset, eller at der ophobes væske på paraffinfilmdækslet. - Efter ~30 min skæres enden af en 1 ml pipettespids til en diameter på ca. 3 mm. Pipetter vævsblandingen op og ned et par gange for at hjælpe med at frigøre cellerne fra fedtvævet. Kolben sættes tilbage i kuvøsen/vandbadet, og rystningen genoptages.
- Efter yderligere 15 minutter kontrolleres kolben for fuldstændig fordøjelse. Efter fjernelse af kolben fra rysteren dannes et lag hvidlige celler øverst i væskelaget. Hvis der stadig er vævsfragmenter tilbage, skal du skære enden fra en anden pipettespids og forsigtigt pipettere blandingen op og ned og derefter fortsætte med at ryste i yderligere 15 minutter.
BEMÆRK: Fuldstændig fordøjet væv / collagenase blanding ligner mælkeagtig chyme. Typisk fordøjes væv tilstrækkeligt efter 1 times blid omrystning. Hvis der er mange fragmenter tilbage på dette tidspunkt, kan det indikere et problem med det anvendte collagenaseenzym. Konstant omrystning kan øge udbyttet; langvarig eksponering for enzymet og den fysiske stress kan dog også skade cellerne. - Efter fordøjelsen pipetteres forsigtigt op og ned for at blande godt. Gennem en 250 μm vævssi filtreres ind i et 15 ml rør ved pipettering for at fjerne eventuelle stykker ufordøjet væv og snavs.
- Kolben skylles med 4 ml vækstmedier ved pipettering for at fjerne celler, der kan klæbes til glasset, og filtrer i det samme 15 ml rør. Skyl silen med yderligere vækstmedier ved pipettering for at løsne eventuelle fangede celler op til et samlet volumen på 14 ml.
- Pellet cellefraktionen ved centrifugering ved 300 x g i 5 min ved RT (7 min for 50 ml rør).
BEMÆRK: Vatpind altid rørene med 70% ethanol, inden du vender tilbage til cellekulturhætten. - Aspirere supernatanten. Pas på ikke at løsne cellepillen. Resuspender forsigtigt pelleten i 1 ml lysisbuffer til røde blodlegemer (se materialetabel) ved at pipettere op og ned, og inkuberes i 5 minutter ved RT. Opløsningen bliver rødlig, når røde blodlegemer lyses (figur 2B).
BEMÆRK: Placer RBC lysis-bufferen på RT før brug. Kyllinger har nukleerede røde blodlegemer9, og de fastgøres til vævskulturskåle sammen med præadipocytter. RBC lysis buffer bruges til at lyse disse celler for at forhindre deres interferens med nøjagtige celletal. - Der tilsættes 5 ml vækstmedier til røret, der indeholder cellerne, for at fortynde lysisbufferen og blandes forsigtigt ved at pipettere op og ned. Ved hjælp af en pipette filtreres gennem en 40 μm cellesi i et nyt 50 ml rør og skylles sien med yderligere 5 ml vækstmedier.
- Pelletceller ved centrifugering ved 300 x g i 7 minutter ved RT. Aspirer forsigtigt supernatanten og resuspender den resterende cellepellet i 1 ml vækstmedier ved at pipettere op og ned.
- Brug et hæmocytometer, celletæller og Trypan Blue-plet til at tælle celler og bestemme cellelevedygtighed. Der udtages 10 μL prøve og blandes med 10 μL Trypan Blue ved pipettering. Der hældes 10 μL af blandingen på hæmatocytometeret, og der måles10.
BEMÆRK: Centrifugeringshastighederne kan øges til 600 x g, hvis tilstrækkelige cellepiller ikke er let synlige efter den indledende centrifugering.
- Brug et hæmocytometer, celletæller og Trypan Blue-plet til at tælle celler og bestemme cellelevedygtighed. Der udtages 10 μL prøve og blandes med 10 μL Trypan Blue ved pipettering. Der hældes 10 μL af blandingen på hæmatocytometeret, og der måles10.
- Overfør fedtvævet til et 15 ml rør indeholdende ~ 1 ml forvarmet enzymatisk opløsning pr. 100 mg væv. Nedsænk en lang, lige saks i røret og hak fedtvævet fint i opløsningen i så små stykker som muligt (~ 1 mm3) (figur 2A).
3. Såning og dyrkning af præadipocytter
- Frø ~ 1 x 106 celler i 4 ml forvarmet vækstmedier i en T-25 kolbe. Følg den samme belægningstæthed, hvis du bruger andre typer kulturbeholdere. Placer i vævskultur inkubator og lad det fastgøre natten over.
BEMÆRK: Celler dyrkes i en 38 ° C inkubator med en befugtet atmosfære på 5% CO2. Den optimale temperatur for vækst af fugleceller11 er 38 °C, og de vokser langsomt ved 37 °C. - Næste dag skal du aspirere medier og forsigtigt vaske cellerne med 1x PBS ved pipettering for at fjerne ikke-fastgjorte eller døde celler. Udskift med 4 ml friske vækstmedier. Kontroller cellerne under et mikroskop. Celler skal være spindelformede, som fibroblaster (figur 2A).
BEMÆRK: Typisk vedhæftes præadipocytter ret hurtigt (inden for få timer). Succes eller fiasko i celleisolering kan bekræftes på dette tidspunkt (efter 24 timer). - Udskift med 4 ml friske vækstmedier hver 2. dag og subkultur- eller kryopreserveceller, når de når 70% -80% sammenløb (figur 3C).
4. Subkulturering og kryopræservering
- Opsuge gamle medier og vask forsigtigt celler med 4 ml 1x PBS ved pipettering. Aspirer PBS, tilsæt 2 ml 0,1% trypsin for at dække celleoverfladen i en T-25 kolbe (juster volumenet i overensstemmelse hermed for andre kulturbeholdere), og inkuber derefter i 3-4 minutter ved 38 °C.
BEMÆRK: Bemærk, om cellerne er løsrevet fra kulturpladen. Tryk forsigtigt på kulturpladen for at hjælpe celleløsningen. Inkubering af celler med trypsin for længe vil beskadige celler. - Tilsæt et tilsvarende volumen af forvarmede vækstmedier for at hæmme trypsinreaktionen. Pipetter over celleoverfladen flere gange, vip pladen for at løsne de resterende celler.
- Cellesuspensionen overføres til et 15 ml rør og centrifugeres ved 300 x g i 5 min ved RT (7 min for 50 ml rør). Aspirere supernatanten.
- Ved subkulturering skal pelleten resuspenderes i 1 ml vækstmedier ved at pipettere op og ned. Cellerne tælles som beskrevet i trin 2.3.9.1, og pladernes derefter omlægges med samme belægningstæthed, som oprindeligt blev anvendt i trin 3.1.
- Hvis der er tale om kryopræservering, forberedes 4 ml frysemedier til en T-25-kolbe med 90 % sammenløb.
BEMÆRK: Frysemedier består af 10% DMSO, 30% FBS og 60% DMEM / F12. - Resuspend celle pellet i frysemedier og overfør 1 ml frysemedier til et kryofil. Kryoviralerne fryses langsomt til -1 °C/min ved hjælp af en frysebeholder. Anbring beholderen i en -80 °C fryser natten over, og overfør den derefter til flydende nitrogen til langtidsopbevaring.
BEMÆRK: Korrekt kryopreserverede præadipocytter opretholder deres levedygtighed i mindst 3 år og fungerer typisk som frisk isolerede celler, når de optøes og belagt.
5. Adipogen differentiering
BEMÆRK: 2% gelatinebelagte plader kan bruges til at forbedre celleadhæsion.
- Der fremstilles en gelatineopløsning på 2 % (w/v) (se materialetabel) i destilleret vand. Autoklave ved 121 °C, 15 psi i 30 minutter for at sterilisere. Overtrækskulturoverflade med 5-10 μL gelatineopløsning/cm2 (dvs. 100-200 μg/cm2). Hvirvl forsigtigt for jævnt at belægge overfladen.
- Kontroller pladerne for jævn spredning af gelatineopløsningen, da nogle regioner kan forblive ubelagte i starten. Den gelatinebelagte plade forbliver ved RT i mindst 1 time. Fjern hele mængden af gelatineopløsning fra brøndene.
BEMÆRK: Dette efterlader en tynd gelatinebelægning i bunden af brøndene / fadene. Gelatineopløsning kan genbruges flere gange (mindst 10 gange) uden at ændre celleadhæsion og vækst. Lad de gelatinebelagte fade forblive i vævskulturhætten i mindst 30 minutter, før cellerne pletteres. - Inducer kyllingens præadipocytter til at gennemgå adipogen differentiering ved at supplere vækstmedier med fedtsyrer. For at forberede adipogene differentieringsmedier (ADM) skal du supplere DMEM / F12 med 10% kyllingeserum, 1x linolsyre-oliesyre-albumin (9,4 μg / ml) og 1x P / S (se materialetabel). Gør ADM frisk og varm før brug.
BEMÆRK: Kylling preadipocytter er almindeligt induceret til at gennemgå adipogenic differentiering ved at supplere medier med fedtsyrer snarere end hormonelle cocktails, der typisk anvendes til adipocytter fra andre arter12. - Inducer differentiering ved at erstatte vækstmedier med adipogene differentieringsmedier, når celler når ~ 90% sammenløb. Vedligehold celler i dette medie, udskift dem hver 2. dag. Vurder differentieringen visuelt under et mikroskop (20x) baseret på dannelsen af lipiddråber, som bliver let synlige inden for 48 timer efter inducerende differentiering.
6. Vurdering af adipogenese
- Udfør Oil Red O-farvning ved at følge nedenstående trin.
- Plader cellerne i en seks-brønds plade og inducerer adipogen differentiering ved ~ 90% sammenløb.
- Forbered en arbejdsløsning af Oil Red O ved at kombinere seks dele af Oil Red O-stamopløsningen med fire dele destilleret vand i et 50 ml rør. Bland forsigtigt ved at pipettere op og ned og lad stå i 10 minutter ved RT, og filtrer derefter gennem et klasse 1 filterpapir (se Materialetabel) inde i tragten ved langsomt at hælde opløsningen i et 50 ml rør.
BEMÆRK: Olie Rød O stamopløsning fremstilles ved at opløse 0,7 g olierød O (se materialetabel) i 200 ml 100% isopropanol i en autoklaveret flaske. Bland godt og lad det sidde i 20 min. Opbevares ved 4 °C og holdes væk fra lys indtil brug. Dette er stabilt i 1 år. Arbejdsløsningen kan bruges i 3 timer; Det anbefales dog at bruge det inden for 2 timer. - Fjern medier, og vask forsigtigt brøndene to gange med 2 ml forvarmet 1x PBS med en pipette. Fjern PBS helt ved pipettering. Fastgør celler med 2 ml 10% bufferet formalin og pakk pladen med paraffinfilm. Lad ved RT stå i mindst 1 time og op til 2 dage før farvning.
BEMÆRK: For at fremstille 1 liter 10% bufferet formalinopløsning blandes 100 ml 37% formaldehyd, 4,09 g NaH2PO4, 6,5 g Na2HPO4 (se materialetabel) og 900 ml destilleret vand. Pipetter ikke formalin direkte på cellerne. Dispenser forsigtigt på sidevæggen nær bunden af brønden. - Fjern formalin og vask forsigtigt brøndene med 2 ml destilleret vand. Udskift med 2 ml 60% isopropanol. Efter 5 min fjernes isopropanol og brøndene tørre helt i ca. 10 min. Udfør alle farvningstrin på RT.
- Tilsæt 1 ml Olierød O arbejdsløsning til celler og inkuber i 10-20 minutter ved RT. Fjern pletter ved pipettering og vask fem gange ved at dyppe i ledningsvand, indtil der ikke ses overskydende pletter. Efter den sidste skylning tilsættes 1 ml vand til celler, inden du visualiserer farvning og samler billeder under et mikroskop.
- For at kvantificere lipidakkumulering pr. Skål skal du fjerne vand og ekstrahere OlierødT O-farvestof fra celler ved at tilsætte 1-2 ml 100% isopropanol, der er tilstrækkeligt til at dække celler i en brønd med seks-brøndplade fuldstændigt. Inkuberes med blid omrystning på en tallerkenryster i 10 min ved RT.
- Overfør 200 μL af ekstraktionen til en brønd af 96-brøndens analyseplade. Kvantificer den relative mængde pletter ved hjælp af en spektrofotometerpladelæser til måling af absorbans ved 495 nm.
- Udfør farvningsassayet af de intracellulære lipiddråber og kernen.
- Pladeceller i sorte bundplader med 96 brønde og inducerer adipogen differentiering som beskrevet i trin 5.3.
- For at plette cellerne tilsættes 200 μL af farvningsopløsningen indeholdende en fluorescerende lipidplet og en fluorescerende DNA-plet (se Materialetabel) i 1x PBS pr. Brønd. Efter beregning af det samlede volumen af den krævede plet tilsættes to dråber af DNA-pletten og 25 μL af lipidpletten pr. ml forvarmet 1x PBS ved hjælp af et folieindpakket rør for at beskytte opløsningen mod lys. Inkuberes ved RT i 20 minutter og beskyt mod lys.
- Læs fluorescensen ved hjælp af en fluorescerende pladelæser (se Materialetabel). Registrer lipidpletten (Excitation: 485 nm / Emission: 572 nm) ved hjælp af et rødt filter og DNA-pletten (Excitation: 359 nm / Emission: 450 nm) gennem et blåt / cyanfilter.
BEMÆRK: Farvning kan også visualiseres og billeder tages under et fluorescerende mikroskop. - Normaliser lipidpletintensiteterne til DNA-pletintensiteterne for at kvantificere lipidakkumulering i forhold til celle nummer13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Primære præadipocytter ligner morfologisk fibroblaster med uregelmæssige, stjernelignende former og en central kerne (figur 2A-C). Cellerne klæber let til vævskulturplastik og begynder at sprede sig kort efter vedhæftning. De differentierer hurtigt og akkumulerer lipiddråber (figur 3D), når de forsynes med fedtsyrer i medierne. Levedygtigheden (98%, baseret på farveeksklusion) rapporteret i de isolationer, der er repræsenteret her, er typisk. Mens cellerne er ret robuste, fører aggressiv håndtering under isolering til celleskader (figur 3E), hvilket giver celler, der binder sig dårligt og ikke formerer sig. På trods af de procedurer, der er indarbejdet for at forhindre mikrobiel kontaminering, kan overførsel af ikke-sterilt materiale forekomme (figur 3F). På grund af deres hurtige vækstrate forbruger kyllingembryde-præadipocytter glukose i medierne med høje hastigheder. Medier bør udskiftes hver 48. time for at opretholde deres energiforsyning.
De repræsentative resultater, der præsenteres her, illustrerer det adipogene potentiale hos chick embryo preadipocytter. Disse celler akkumuleres hurtigt for at udvikle lipiddråber under adipogene forhold, og akkumuleringen skrider frem over tid (figur 4 og figur 5). To metoder er blevet præsenteret, som kan bruges til bedre at visualisere og kvantificere graden af lipidakkumulering i disse celler, hvilket er en direkte afspejling af adipogenese. Farvning af lipider med Oil Red O er en billig metode til at visualisere og kvantificere akkumuleringen af lipiddråber (figur 4). Et lysmikroskop bruges til at indsamle billeder, og farvede celler kan holdes på bordpladen, indtil billeder er samlet. Lipidakkumulering i hver skål af celler kan kvantificeres som beskrevet ved at ekstrahere pletten og aflæse absorbansen ved 495 nm ved hjælp af et spektrofotometer. Ved hjælp af kombinationen af de valgte lipid- og DNA-pletter var det muligt at kvantificere lipidakkumuleringen i forhold til celleantal, hvilket kompenserer for ikke-adipogene celler, der kan fortsætte i kultur (figur 5). Hvis der træffes foranstaltninger over flere tidspunkter (figur 5B-C), gør denne kombination det muligt at vurdere både adipogenese og proliferation, for eksempel som reaktion på tilsatte hormoner eller peptider.
Figur 1: Fedtvævsopsamling. (A) Ved brud på æggeskallen blev den hvide skalmembran afsløret. (B) Gennemboring af amnionen ved hjælp af steril pincet. (C) I alt ~ 80 mg lårben subkutant fedt kan opnås fra E16. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Vævsfragmenter til enzymatisk fordøjelse og cellepellet efter fordøjelse. (A) Hakket fedtvæv i enzymatisk opløsning (~ 1 mm3). (B) Pile angiver cellepiller efter RBC lysis. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Cellemorfologi sammenligninger af isolerede primære præadipocytter. (A) Preadipocytter ved 24 timer efter isolering. (B) Præadipocytter ved 48 timer efter isolering. (C) Præadipocytter med 80% sammenløb ved 72 timer efter isolering. (D) Præadipocytter efter 48 timers adipogen induktion ved passage 4 er lipiddråber synlige. Indsats angiver det forstørrede billede af lipiddråber. (E) Repræsentativt billede af beskadigede celler. (F) Pilen angiver sorte svømmeprikker i forurenet kultur. Skalabjælker = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Evaluering af lipidakkumulering ved olierød O-farvning. (A) Repræsentative billeder af olierød O-farvning af E16-præadipocytter efter 24 timer, 48 timer og 72 timers adipogen differentiering ex vivo. Skalastænger = 100 μm. (B) Kvantificering af lipiddråber målt ved eluering af olierød O-farvning. Værdier udtrykkes som middel ± SD. a,b,c P < 0,05 ved envejs ANOVA med posthoc Tukeys HSD-test. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Vurdering af adipocytdifferentiering ved lipidfarve /DNA-plet. (A) Repræsentative billeder af lipidpletten (rød) og DNA (blå) farvning af E16-præadipocytter efter 24 timer, 48 timer og 72 timer adipogen differentiering ex vivo. Skalastænger = 150 μm. (B) Lipidfarvning (Excitation: 485 nm / Emission: 572 nm) blev udført for at vurdere lipidakkumulering i differentierede præadipocytter. (C) DNA-farvning (Excitation: 359 nm / Emission: 450 nm) blev udført for at vurdere variationer i antallet af celler. (D) Forholdet mellem lipid og DNA-plet. Lipidakkumulering normaliseres til DNA-indholdet. Værdier udtrykkes som middel ± SD. a,b,c P < 0,05 ved envejs ANOVA med posthoc Tukeys HSD-test. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Alder (n=) | x106 celler/100 mg væv | Levedygtighed (%) |
| E12 (4) | 0,97 ± 0,115 a,b | 98,5 ± 0,58 a |
| E14 (4) | 1,22 ± 0,232 a,b | 98,3 ± 0,96 a,b |
| E16 (21) | 1.61 ± 1.717 a | 97,6 ± 1,58 a |
| E17 (4) | 0,81 ± 0,282 a,b | 96,8 ± 2,63 a,b |
| E18 (7) | 0,72 ± 0,611 a,b | 95,9 ± 1,81 a,b |
| E20 (4) | 0,94 ± 0,171 a,b | 97,8 ± 0,8 a,b |
| D4 (9) | 0,24 ± 0,164 a,b | 93,6 ± 4,28 b |
| D5 (4) | 0,25 ± 0,073 a,b | 98,5 ± 0,71 a,b |
| D7 (10) | 0,17 ± 0,162 b | 96,8 ± 3,49 a,b |
| D14 (4) | 0,25 ± 0,051 a,b | 99,0 ± 0,00 a,b |
Tabel 1: Gennemsnitligt celleantal og levedygtighed af isolerede celler fra embryo- og post-hatch kyllinger.
Værdier udtrykkes som middel ± SD. a,b P < 0,05 ved envejs ANOVA med posthoc Tukeys HSD-test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selvom flere velbeskrevne protokoller har rapporteret isolering af præadipocytter 14,15,16,17, er isolering for embryonale præadipocytter blevet optimeret, hvilket kan bruges til funktionelle analyser af fedtvækst og udvikling i det tidlige liv hos slagtekyllinger. Denne protokol giver embryonale adipocytprogenitter med høj levedygtighed med højt differentieringspotentiale. Desuden er den præsenterede procedure til isolering af præadipocytter ikke begrænset til embryoner, men kan anvendes i kyllinger efter klækken. Det er imidlertid optimeret til brug med E16-embryoner, og udbyttet fra kyllinger efter luge er betydeligt lavere (tabel 1), sandsynligvis på grund af stigninger i den relative mængde bindevæv, da kyllinger vokser hurtigt.
Succesen med celleisolering evalueres i sidste ende ved at observere formen og antallet af vedhæftede celler (figur 3A). Lavt celleantal eller beskadigede celler kan observeres, når vævsfraktionerne fordøjes for længe, især når vævsdissociation skrider frem i mere end 1,5 time (figur 3E). Derfor anbefales det, at 1,5 timers fordøjelse ikke overskrides. På den anden side, hvis vævsfragmentet forbliver tydeligt efter en times fordøjelse, skal fordøjelsestiden eller mængden øges. Den opnåede fedtvævsmængde kan også varieres afhængigt af kyllingens genetiske stamme. Hvis denne protokol bruges til at isolere celler i andre aldre eller arter, skal både mængden af collagenase og fordøjelsestiden sandsynligvis ændres.
En almindelig begrænsning af primær cellekultur er, at isolerede celler begynder at miste adipogent potentiale efter flere passager i kultur; Det er derfor vigtigt at inducere differentiering inden for få dage efter isolering for at sikre, at de embryonale præadipocytter ikke mister deres adipogene evne. Adipogene prækursorer af embryoner differentieres let til modne adipocytter i medieformuleringen beskrevet ovenfor uden behov for sammenløb eller hormonel induktion. Cellerne op til passage 4 (10-14 dage) skelnes let inden for 48 timer efter inducering (figur 3D).
Kontrol af celleforurening i primær cellekultur er en anden udfordring, hvor svampeforurening er den mest almindelige. Anvendelsen af Amphotericin B, som beskrevet, er generelt effektiv til at forhindre svampevækst18,19. Det kan inkluderes i lave koncentrationer i kulturmedierne uden mærkbare virkninger på levedygtighed eller adipogent potentiale. Uidentificerbare mikrobielle forurenende stoffer er blevet observeret i form af sorte svømmeprikker, der vises et par dage efter celleisolering (figur 3F). Disse påvirkede cellevæksten negativt og var umulige at fjerne, når denne infektion opstod20. Om disse forurenende stoffer var en ukendt mikrobiel art, der blev fundet i eller på æg eller opstod fra en anden kilde, vides ikke. Denne protokol forsøger at minimere risikoen for forurening ved at ekstrahere embryoner aseptisk fra ægget21. Brug af en varmebaseret instrumentsterilisator i emhætten under dissektion hjælper også med at minimere potentialet for forurening, især når flere embryoner dissekeres.
En overvejelse i processen er nedsat celleadhæsion til vævskulturplade under differentiering som følge af fysiske ændringer, når celler dannes og udvider lipiddråber. Selvom de er indeholdt i cellerne, er lipiddråber flydende, og når de er store, ser de ud til at fungere som balloner, der har tendens til at fremme celler, der løfter sig fra overfladen. Der skal derfor udvises forsigtighed ved håndtering af præadipocytter, samtidig med at differentiering induceres, og især når adipogenese vurderes. Mens protokollen, der præsenteres her, ikke ændrer kulturoverfladen, kan celleadhæsion forbedres, når der pletteres celler på tallerkener belagt med 2% gelatine. Det er også vigtigt at bekræfte, at vaskeopløsningernes pH er 7,4, og at anvende forvarmet PBS-opløsning, når celler vaskes og blandes med DNA-pletten for at reducere kuldestress.
Ved hjælp af flere embryoner kan et tilstrækkeligt antal celler isoleres til at give eksperimentelle replikater uden behov for flere passager, ekspansion og risikoen for, at celler mister deres adipogene potentiale. RNA kan let isoleres fra både præ- og differentierede chick embryo adipocytter isoleret ved hjælp af phenol- eller membranbaserede kommercielle metoder til genekspressionsundersøgelser. Tilstrækkeligt RNA kan opnås fra en enkelt brønd af en seks-brøndplade til brug i cDNA-syntese og efterfølgende qPCR eller RNAseq.
Sammenfattende er tilgængeligheden af fedtdepoter i kyllingeembryoet til at isolere en cellemodel yderst relevant for både fjerkræ og mennesker. Denne protokol er relativt enkel at udføre, og den giver en høj procentdel af levedygtige celler, der let kan induceres til at gennemgå adipogen differentiering in vitro. Befrugtede kyllingæg kan fås fra forskellige kommercielle kilder til minimale omkostninger, hvilket gør disse celler til en let tilgængelig model til praktisk brug.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker UT AgResearch og Institut for Husdyrvidenskab for at støtte og optimere denne protokol. Dette arbejde blev finansieret af USDA-tilskud.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Pipette | Eppendorf | Z683825 | Single Channel Pipette, 100 - 1000 µL |
| 1 mL Pipette Tip | Fisher Scientific | 02-707-402 | |
| 100% Isopropanol | Fisher Scientific | A426P4 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010023 | |
| 25 mL Flask | Pyrex | 4980-25 | |
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | F75P-1GAL | |
| 6-Well Plate | Falcon | 353046 | Tissue Culture-treated |
| 96-Well Assay Plate | Costar | 3632 | |
| 96-Well Plate, Black Bottom | Costar | 3603 | Tissue Culture-treated |
| AdipoRed | Lonza | PT-7009 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290026 | |
| Bench Top Wiper (Kimtechwiper) | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Betadine | Up & Up | NDC 1167300334 | 20% Working Solution |
| Cell Counter | Corning | 6749 | |
| Cell Strainer, 40 µm | SPL | 93040 | |
| Centrifugaton | Eppendorf | 5702 | |
| Chicken Serum | Gibco | 16110082 | |
| Conical Centrifuge Tubes, 15 mL | VWR | 10025-690 | |
| Conical Centrifuge Tubes, 50 mL | Falcon | 352098 | |
| Cryovial | Nunc | 343958 | |
| Curved Forceps, 100 mm | Roboz Surgical | RS-5137 | |
| Curved Surgical Scissors, 115 mm | Roboz Surgical | RS-6839 | |
| Distilled Water | Millipore | SYNSV0000 | Despensed as needed |
| DMEM/F12 | HyClone | SH30023.01 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | 70% Working Solution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10437028 | |
| Fluorescent Microscope | EVOS | M7000 | |
| Fluorescent Plate Reader | Biotek | Synergy H1 | |
| Foil | Reynolds | Reynolds Wrap Heavy Duty Aluminum Foil, 125 SQ. FT. | |
| Freezing Container | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| Gelatin | Millipore | 4055 | 2% Working Solution |
| Hematocytometer (Counting Chamber) | Corning | 480200 | 0.1 mm deep |
| Incubator | Fisher Scientific | 6845 | |
| Instrument Sterilizer | VWR | B1205 | |
| Linoleic Acid-Oleic Acid-Albumin | Sigma | L9655 | 1x Working Solution |
| Microscope | Evos | AMEX1000 | |
| Multi-Channel Pipette | Thermo Scientific | 4661070 | 12-Channel Pipetters, 30 - 300 µL |
| Na2HPO4 | Sigma | S-7907 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S-3139 | |
| NucBlue | Invitrogen | R37605 | |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | |
| Orbital Shaker | IKA | KS130BS1 | |
| Paper Towel | Tork | RK8002 | |
| Parafilm | Parafilm M | PM996 | |
| Penicillin/Steptomycin (P/S) | Gibco | 15140122 | 1x Working Solution |
| Petri dishes, 100 mm | Falcon | 351029 | |
| Petri dishes, 60 mm | Falcon | 351007 | |
| Plate Shaker | VWR | 200 | |
| RBC Lysis Buffer | Roche | 11814389001 | |
| Reagent Reservior | VWR | 89094-680 | |
| Small Beaker, 100 mL | Pyrex | 1000-100 | |
| Spectrophotometer Plate Reader | Biotek | Synergy H1 | |
| Sterile Gauze | McKesson | 762703 | |
| Straight Forceps, 120 mm | Roboz Surgical | RS-4960 | |
| Straight Scissors, 140 mm | Roboz Surgical | RS-6762 | |
| T-25 Flask | Corning | 430639 | Tissue Culture-treated |
| Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Tissue Strainer, 250 µm | Pierce | 87791 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250061 | |
| Trypsin | Gibco | 15400054 | 0.1% Working Solution |
| Tweezers, 110 mm | Roboz Surgical | RS-5035 | |
| Type 1 Collagenase | Gibco | 17100017 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | 15-462-10 | |
| Whatman Grade 1 Filter Paper | Whatman | 1001-110 |
References
- Fryar, C. D., Carroll, M. D., Ogden, C. L. Prevalence of overweight, obesity, and severe obesity among children and adolescents aged 2-19 years: United States, 1963-1965 through 2015-2016. , (2018).
- Siegel, P. B. Evolution of the modern broiler and feed efficiency. Annual Review of Animal Biosciences. 2 (1), 375-385 (2014).
- Zuidhof, M. J., Schneider, B. L., Carney, V. L., Korver, D., Robinson, F. Growth, efficiency, and yield of commercial broilers from 1957, 1978, and 2005. Poultry Science. 93 (12), 2970-2982 (2014).
- Poulos, S. P., Dodson, M. V., Hausman, G. J. Cell line models for differentiation: preadipocytes and adipocytes. Experimental Biology and Medicine. 235 (10), 1185-1193 (2010).
- Vilaboa, S. D. -A., Navarro-Palou, M., Llull, R. Age influence on stromal vascular fraction cell yield obtained from human lipoaspirates. Cytotherapy. 16 (8), 1092-1097 (2014).
- Speake, B. K., Noble, R. C., McCartney, R. J. Tissue-specific changes in lipid composition and lipoprotein lipase activity during the development of the chick embryo. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Lipids and Lipid Metabolism. 1165 (3), 263-270 (1993).
- Chen, P., Suh, Y., Choi, Y. M., Shin, S., Lee, K. Developmental regulation of adipose tissue growth through hyperplasia and hypertrophy in the embryonic Leghorn and broiler. Poultry Science. 93 (7), 1809-1817 (2014).
- Farkas, K., Ratchford, I. A., Noble, R. C., Speake, B. K. Changes in the size and docosahexaenoic acid content of adipocytes during chick embryo development. Lipids. 31 (3), 313-321 (1996).
- Claver, J. A., Quaglia, A. I. Comparative morphology, development, and function of blood cells in nonmammalian vertebrates. Journal of Exotic Pet Medicine. 18 (2), 87-97 (2009).
- Corning Cell Counter Demo Video. , Available from: https://www.youtube.com/watch?v=JWjckEHO6Wg (2022).
- Nema, R., Khare, S. An animal cell culture: Advance technology for modern research. Advances in Bioscience and Biotechnology. 3 (3), 219-226 (2012).
- Regassa, A., Kim, W. K. Effects of oleic acid and chicken serum on the expression of adipogenic transcription factors and adipogenic differentiation in hen preadipocytes. Cell Biology International. 37 (9), 961-971 (2013).
- Temkin, A. M. Effects of crude oil/dispersant mixture and dispersant components on PPAR γ activity in vitro and in vivo: identification of dioctyl sodium sulfosuccinate (DOSS; CAS# 577-11-7) as a probable obesogen. Environmental Health Perspectives. 124, 112-119 (2016).
- Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. Adipose Tissue Protocols. , Springer. 201-219 (2008).
- Lee, M. J., Wu, Y., Fried, S. K. A modified protocol to maximize differentiation of human preadipocytes and improve metabolic phenotypes. Obesity. 20 (12), 2334-2340 (2012).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).
- Akbar, N., Pinnick, K. E., Paget, D., Choudhury, R. P. Isolation and characterization of human adipocyte-derived extracellular vesicles using filtration and ultracentrifugation. Journal of Visualized Experiments. (170), e61979 (2021).
- Perlman, D., Giuffre, N. A., Brindle, S. A. Use of Fungizone in control of fungi and yeasts in tissue culture. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 106 (4), 880-883 (1961).
- Kuhlmann, I. The prophylactic use of antibiotics in cell culture. Cytotechnology. 19 (2), 95-105 (1995).
- Yang, X., et al. Black swimming dots in cell culture: the identity, detection method and judging criteria. bioRxiv. , 366906 (2018).
- Freshney, R. I. Culture of animal cells: a manual of basic technique and specialized applications. , John Wiley & Sons. 163-186 (2015).
