Summary
Il presente protocollo descrive un metodo semplice per isolare i preadipociti dal tessuto adiposo negli embrioni di polli da carne. Questo metodo consente l'isolamento con alta resa, coltura primaria e differenziazione adipogenica dei preadipociti. La colorazione Oil Red O e la colorazione lipidico/DNA hanno misurato la capacità adipogenica delle cellule isolate indotte con mezzi di differenziazione.
Abstract
I preadipociti primari sono un prezioso sistema sperimentale per comprendere le vie molecolari che controllano la differenziazione e il metabolismo degli adipociti. Gli embrioni di pollo offrono l'opportunità di isolare i preadipociti fin dalla prima fase dello sviluppo adiposo. Questa cellula primaria può essere utilizzata per identificare i fattori che influenzano la proliferazione dei preadipociti e la differenziazione adipogenica, rendendoli un modello prezioso per gli studi relativi all'obesità infantile e al controllo della deposizione di grasso in eccesso nel pollame. La rapida crescita del tessuto adiposo postnatale spreca efficacemente il mangime allocandolo lontano dalla crescita muscolare nei polli da carne. Pertanto, i metodi per comprendere le prime fasi dello sviluppo del tessuto adiposo possono fornire indizi per regolare questa tendenza e identificare modi per limitare l'espansione adiposa all'inizio della vita. Il presente studio è stato progettato per sviluppare un metodo efficiente per l'isolamento, la coltura primaria e la differenziazione adipogenica dei preadipociti isolati dallo sviluppo del tessuto adiposo di embrioni di pulcino di polli da carne commerciali (tipo carne). La procedura è stata ottimizzata per produrre cellule con elevata vitalità (~ 98%) e una maggiore capacità di differenziarsi in adipociti maturi. Questo semplice metodo di isolamento, coltura e differenziazione dei preadipociti embrionali supporta le analisi funzionali della crescita e dello sviluppo del grasso nei primi anni di vita.
Introduction
L'obesità è una minaccia per la salute globale sia per gli adulti che per i bambini. I bambini in sovrappeso o obesi hanno circa cinque volte più probabilità di essere obesi da adulti, ponendoli a un rischio significativamente maggiore di malattie cardiovascolari, diabete e molte altre comorbidità. Circa il 13,4% dei bambini statunitensi di età compresa tra 2 e 5 anni ha l'obesità1, dimostrando che la tendenza ad accumulare grasso corporeo in eccesso può essere messa in moto molto presto nella vita. Per ragioni molto diverse, l'accumulo di tessuto adiposo in eccesso è una preoccupazione per i polli da carne (tipo carne). I polli da carne moderni sono incredibilmente efficienti ma accumulano ancora più lipidi di quanto sia fisiologicamente necessario 2,3. Questa tendenza inizia subito dopo la schiusa e spreca efficacemente mangime, il componente di produzione più costoso, allocandolo lontano dalla crescita muscolare. Pertanto, sia per i bambini che per i polli da carne, anche se per ragioni molto diverse, è necessario comprendere i fattori che influenzano lo sviluppo del tessuto adiposo e identificare modi per limitare l'espansione adiposa nelle prime fasi della vita.
Gli adipociti si formano dai preadipociti, cellule staminali derivate dal tessuto adiposo che subiscono la differenziazione per sviluppare cellule adipose mature che immagazzinano lipidi. Di conseguenza, i preadipociti in vitro sono un prezioso modello sperimentale per gli studi sull'obesità. Queste cellule, isolate dalla frazione vascolare stromale dei depositi adiposi, possono fornire una comprensione fondamentale delle vie molecolari che controllano la differenziazione degli adipociti e il metabolismo 4,5. Gli embrioni di pulcino sono un modello sperimentale favorevole negli studi sullo sviluppo perché la coltura delle uova secondo il programma desiderato rende più facile la manipolazione sperimentale, in quanto consente di ottenere embrioni senza il sacrificio della madre per osservare una serie di fasi di sviluppo degli embrioni. Inoltre, non sono necessarie complicate procedure chirurgiche e lunghi periodi di tempo per ottenere embrioni rispetto a modelli animali più grandi. Pertanto, l'embrione di pulcino presenta l'opportunità di ottenere preadipociti fin dalle prime fasi dello sviluppo del tessuto adiposo. Il tessuto adiposo sottocutaneo diventa visibile nel pulcino intorno al giorno embrionale 12 (E12) come un deposito chiaramente definito situato intorno alla coscia. Questo deposito è arricchito in preadipociti altamente proliferativi che subiscono attivamente la differenziazione sotto segnali di sviluppo per formare adipociti maturi 6,7. Il processo di differenziazione adipogenica è paragonabile tra polli e umani. Pertanto, i preadipociti isolati da embrioni di pulcino possono essere utilizzati come modello a doppio scopo per studi rilevanti per l'uomo e il pollame. Tuttavia, la resa dei preadipociti diminuisce con l'invecchiamento man mano che le cellule crescono in adipociti maturi5.
Il presente protocollo ottimizza l'isolamento dei preadipociti dal tessuto adiposo durante lo stadio (E16-E18) in cui il differenziamento adipogenico e l'ipertrofia degli adipociti sono al loro apice negli embrioni di pulcino di pollo8. Questa procedura può valutare gli effetti dei fattori a cui l'embrione in via di sviluppo è esposto in ovo, come la dieta della gallina, sullo sviluppo degli adipociti e sul potenziale adipogenico ex vivo. Può anche testare l'impatto di varie manipolazioni (ad esempio, ipossia, aggiunte di nutrienti, agonisti farmacologici e antagonisti) sull'adipogenesi o sui vari 'omes (ad esempio, trascrittoma, metaboloma, metiloma) dei progenitori degli adipociti. Come rappresentazione del primo stadio della formazione adiposa, le cellule ottenute utilizzando questo protocollo sono modelli preziosi per studi rilevanti per il pollame e l'uomo.
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Protocol
Tutte le procedure per gli animali sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Tennessee. Le uova di pollo commerciali appena fecondate (Cobb 500) sono state ottenute da un incubatoio locale. Le uova sono state incubate a 38 °C con il 60% di umidità relativa fino alle dissezioni nei giorni embrionali 16-18 (E16-E18). Il tessuto adiposo è stato raccolto dal deposito sottocutaneo (femorale).
1. Preparazione all'isolamento e alla cultura
- Preparare la cappa di cultura e gli strumenti.
- Prima di iniziare le dissezioni, impostare un'area di lavoro nella cappa a flusso laminare. Disinfettare l'area di lavoro e tutti gli strumenti mediante tampone con etanolo al 70%. Eseguire tutte le procedure utilizzando materiali sterili.
NOTA: Tamponare sempre i contenitori e gli strumenti con etanolo al 70% prima di rimetterli nella cappa di coltura cellulare. Si raccomanda di posizionare uno sterilizzatore per strumenti da banco nel cofano in modo che gli strumenti possano essere facilmente sterilizzati tra gli embrioni.
ATTENZIONE: Quando si utilizza uno strumento sterilizzatore, raffreddare correttamente lo strumento caldo per evitare ustioni e danni ai tessuti. Si consiglia un tempo di raffreddamento minimo di 3 minuti. Tampone con etanolo al 70% prima dell'uso. - Assemblare i seguenti strumenti e recipienti nel cofano: pinze diritte (120 mm), pinzette (110 mm), due paia di pinze curve (100 mm), due paia di forbici diritte (140 mm), forbici chirurgiche curve (115 mm), filtro per tessuti (rete di nylon da 250 μm), filtro cellulare (rete di nylon da 40 μm), tubi centrifughi conici (15 ml e 50 ml), piastre di Petri (60 mm e 100 mm), piccolo becher (100 ml), spray al 70% di etanolo e garza sterile, tovagliolo di carta e tergicristallo da banco (vedere Tabella dei materiali).
- Prima di iniziare le dissezioni, impostare un'area di lavoro nella cappa a flusso laminare. Disinfettare l'area di lavoro e tutti gli strumenti mediante tampone con etanolo al 70%. Eseguire tutte le procedure utilizzando materiali sterili.
- Preparare la soluzione enzimatica, i supporti di raccolta e i supporti di coltura seguendo i passaggi seguenti.
NOTA: Preparare le soluzioni in anticipo e conservare a 4 °C fino all'uso. I supporti devono essere posti sul ghiaccio prima della raccolta dei tessuti. Tutti i reagenti utilizzati in questa fase sono elencati nella Tabella dei materiali.- Preparare i mezzi utilizzati sia per la raccolta del tessuto adiposo che per la preparazione della soluzione enzimatica integrando DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium con 2,50 mM di L-glutammina e 15 mM di tampone HEPES) con 2,5 μg/mL di Amfotericina B e 1x penicillina/streptomicina (P/S), 100 U/mL. Conservare a 4 °C fino all'uso.
NOTA: questo supporto rimane stabile per 1 anno se conservato a 4 °C. - Preparare la soluzione di sterilizzazione diluendo Betadine al 20% (v/v) in 1x PBS (Soluzione salina tamponata con fosfato a pH 7,4, senza calcio, magnesio o rosso fenolo) con 2,5 μg/mL di amfotericina B. Conservare a 4 °C fino all'uso.
NOTA: La soluzione è stabile per 2 anni se conservata a 4 °C. - Preparare la soluzione enzimatica sciogliendo la collagenasi di tipo 1 (1 mg/mL) in DMEM/F12 con 2,5 μg/mL di amfotericina B e 1x P/S (fase 1.2.1). Preparare una soluzione di collagenasi fresca e mantenerla sul ghiaccio durante le dissezioni. Circa 10 minuti prima dell'uso, pre-riscaldare incubando questa soluzione a 37 °C a bagnomaria per iniziare la sua attività enzimatica.
NOTA: è necessario circa 1 mL di soluzione di collagenasi (1 mg/mL) per 100 mg di tessuto adiposo. - Preparare i mezzi di crescita utilizzati per la placcatura e la propagazione integrando i supporti DMEM/F12 con 1x P/S e 10% FBS. Conservare a 4 °C fino all'uso.
NOTA: la soluzione è stabile per 1 anno se conservata a 4 °C. - Preparare la soluzione di lavaggio integrando 1x PBS con 2,5 μg/mL di amfotericina B. Regolare la soluzione al pH desiderato 7,4. Conservare a 4 °C fino all'uso.
NOTA: La soluzione è stabile per 2 anni se conservata a 4 °C.
- Preparare i mezzi utilizzati sia per la raccolta del tessuto adiposo che per la preparazione della soluzione enzimatica integrando DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium con 2,50 mM di L-glutammina e 15 mM di tampone HEPES) con 2,5 μg/mL di Amfotericina B e 1x penicillina/streptomicina (P/S), 100 U/mL. Conservare a 4 °C fino all'uso.
2. Raccolta e digestione del tessuto adiposo
- Eutanasia dell'embrione.
- Il giorno embrionale 16, rimuovere le uova dall'incubatrice. La principale fonte potenziale di contaminazione microbica è la superficie dell'uovo; pertanto, tamponare le uova con una garza sterile imbevuta di etanolo al 70% prima di romperle. Dopo il tampone, posizionare l'uovo verticalmente con l'estremità appuntita verso il basso su un piccolo becher (100 ml) rivestito con carta assorbente per ammortizzare l'uovo dal bicchiere.
- Usando il manico della pinza, rompere un uovo toccando l'estremità smussata dell'uovo. Rimuovere con cautela il guscio d'uovo per creare un'apertura sufficientemente grande da rimuovere l'embrione (fase 2.1.3). Strappare delicatamente la membrana del guscio bianco per esporre l'embrione (Figura 1A). Forare accuratamente l'amnione usando una pinzetta sterile (Figura 1B).
NOTA: Il sacco amniotico è una membrana trasparente piena di liquido amniotico che racchiude l'embrione. - Rimuovere l'embrione dall'uovo afferrando leggermente il collo dell'embrione con una pinza diritta. Tagliare il sacco vitellino per scollegarlo dall'embrione e trasferire l'embrione in una capsula di Petri da 100 mm.
- Decapitare immediatamente usando forbici chirurgiche e pinze.
- Eseguire la raccolta del tessuto adiposo.
- Tamponare il corpo dell'embrione con il 70% di etanolo e strofinare delicatamente la superficie della pelle con una garza sterile per rimuovere le piume, poiché possono interferire con la filtrazione nelle fasi successive dopo la digestione. Utilizzare tergicristalli da banco per evitare che la pelle e le piume tocchino il tessuto raccolto.
- Tagliare la pelle tra le gambe e la regione addominale per rivelare la coppia di depositi adiposi femorali.
- Tieni la pelle intorno alla gamba usando una pinza curva con una mano. Rimuovere delicatamente il grasso sottocutaneo femorale con l'altra mano, usando una pinza curva per allontanare delicatamente il deposito dalla gamba.
NOTA: C'è relativamente poco tessuto connettivo che aderisce al cuscinetto grasso alla gamba, e l'intero cuscinetto grasso dovrebbe essere rimovibile in un unico pezzo usando solo pinze. Questo può essere facilitato tenendo la pinza all'indietro in modo che le parti curve (piuttosto che le estremità) blocchino il cuscinetto di grasso per la rimozione.- Se necessario, tagliare via il cuscinetto di grasso con forbici curve. Ripetere con l'altro cuscinetto di grasso e altri embrioni secondo necessità.
NOTA: Un totale di 80 mg di grasso sottocutaneo può essere ottenuto dalla maggior parte degli embrioni a E16 (Figura 1C). Questo in genere produce ~ 1 x 106 celle, sufficienti per placcare un pallone T-25. Potrebbe essere utile in questa fase pesare i cuscinetti di grasso da alcuni embrioni per valutare la quantità di materiale di partenza, poiché i pesi dei cuscinetti di grasso possono variare tra specifiche linee di polli da carne e a causa di fattori incontrollabili, come l'età e la dieta dell'allevatore di galline. Il grasso sottocutaneo è stato regolarmente raccolto da cinque uova per garantire un'adeguata resa di cellule per la placcatura in più palloni.
- Se necessario, tagliare via il cuscinetto di grasso con forbici curve. Ripetere con l'altro cuscinetto di grasso e altri embrioni secondo necessità.
- Trasferire i tessuti in ~ 5 mL di mezzi di raccolta in un tubo da 15 ml e ripetere la dissezione per le uova rimanenti.
- Risciacquare brevemente i cuscinetti di grasso raccolti trasferendoli in una capsula di Petri da 60 mm contenente soluzione di sterilizzazione e facendo roteare il piatto un paio di volte.
- Risciacquare la soluzione di sterilizzazione trasferendo i cuscinetti di grasso in una capsula di Petri da 60 mm contenente 1x PBS. Ruota delicatamente. Ripetere questo passaggio trasferendolo su una seconda capsula di Petri da 60 mm contenente 1x PBS.
- Eseguire la digestione enzimatica e l'isolamento dei preadipociti seguendo i passaggi seguenti.
- Trasferire i tessuti adiposi in un tubo da 15 ml contenente ~1 mL di soluzione enzimatica preriscaldata per 100 mg di tessuto. Immergere un paio di forbici lunghe e dritte nel tubo e tritare finemente i tessuti adiposi nella soluzione in pezzi il più piccoli possibile (~ 1 mm3) (Figura 2A).
NOTA: la resa cellulare sarà ridotta se i tessuti non sono accuratamente tritati. - Trasferire il tessuto tritato e la soluzione enzimatica in un matraccio autoclavato da 25 ml. Avvolgere il pallone con pellicola di paraffina. Posizionare su uno shaker orbitale all'interno di un'incubatrice e agitare a 37 °C durante la fase di digestione.
NOTA: In alternativa, utilizzare un bagno d'acqua tremante. Con entrambi gli approcci, la velocità deve essere sufficiente per evitare che pezzi di tessuto si depositino sul fondo del pallone, ma non deve essere così veloce da spingere i pezzi verso la parte superiore del pallone e attaccarsi al vetro, o che il fluido si accumuli sul coperchio del film di paraffina. - Dopo ~ 30 minuti, tagliare l'estremità di una punta della pipetta da 1 mL ad un diametro di circa 3 mm. Pipettare la miscela di tessuti su e giù un paio di volte per aiutare a rilasciare le cellule dal tessuto adiposo. Riportare il matraccio nell'incubatrice/bagno d'acqua e riprendere a tremare.
- Dopo altri 15 minuti, controllare il pallone per la completezza della digestione. Dopo aver rimosso il pallone dallo shaker, si formerà uno strato di cellule biancastre nella parte superiore dello strato fluido. Se rimangono ancora frammenti di tessuto, tagliare l'estremità da un'altra punta della pipetta e pipettare delicatamente la miscela su e giù, quindi continuare a scuotere per altri 15 minuti.
NOTA: La miscela di tessuto / collagenasi completamente digerita sembra un chimo lattiginoso. In genere, il tessuto viene sufficientemente digerito dopo 1 ora di agitazione delicata. Se molti frammenti rimangono a questo punto, potrebbe indicare un problema con l'enzima collagenasi utilizzato. Lo scuotimento costante può aumentare la resa; tuttavia, l'esposizione prolungata all'enzima e lo stress fisico possono anche danneggiare le cellule. - Dopo la digestione, pipettare delicatamente su e giù per mescolare bene. Filtrare attraverso un filtro di tessuto da 250 μm in un tubo da 15 ml mediante pipettaggio per rimuovere eventuali frammenti di tessuto e detriti non digeriti.
- Risciacquare il matraccio con 4 mL di terreno di crescita mediante pipettaggio per rimuovere le cellule che possono essere aderenti al vetro e filtrare nello stesso tubo da 15 ml. Risciacquare il colino con ulteriori mezzi di crescita mediante pipettaggio per allentare eventuali cellule intrappolate, fino a un volume totale di 14 ml.
- Pellet la frazione cellulare mediante centrifugazione a 300 x g per 5 min a RT (7 min per tubo da 50 ml).
NOTA: Tamponare sempre i tubi con etanolo al 70% prima di tornare al cappuccio di coltura cellulare. - Aspirare il surnatante. Fare attenzione a non rimuovere il pellet cellulare. Risospesciare delicatamente il pellet in 1 mL di tampone di lisi dei globuli rossi (vedere Tabella dei materiali) tubando su e giù e incubare per 5 minuti a RT. La soluzione diventerà rossastra quando i globuli rossi vengono lisati (Figura 2B).
NOTA: posizionare il buffer di lisi RBC su RT prima dell'uso. I polli hanno globuli rossi nucleati9 e si attaccano ai piatti di coltura tissutale insieme ai preadipociti. Il tampone di lisi RBC viene utilizzato per lisare queste cellule per prevenire la loro interferenza con conteggi cellulari accurati. - Aggiungere 5 ml di terreno di crescita al tubo contenente le cellule per diluire il tampone di lisi e mescolare delicatamente pipettando su e giù. Utilizzando una pipetta, filtrare attraverso un filtro cellulare da 40 μm in un nuovo tubo da 50 ml e risciacquare il filtro con ulteriori 5 mL di terreno di crescita.
- Celle a pellet mediante centrifugazione a 300 x g per 7 minuti a RT. Aspirare accuratamente il surnatante e risospescere il pellet cellulare rimanente in 1 mL di terreno di crescita mediante pipettaggio su e giù.
- Utilizzare un emocitometro, un contatore di cellule e una macchia di Trypan Blue per contare le cellule e determinare la vitalità cellulare. Prelevare 10 μL di campione e mescolare con 10 μL di Trypan Blue mediante pipettaggio. Caricare 10 μL della miscela sull'ematocitometro emisurare 10.
NOTA: le velocità di centrifugazione possono essere aumentate a 600 x g se un numero sufficiente di pellet di celle non è facilmente visibile dopo la rotazione iniziale.
- Utilizzare un emocitometro, un contatore di cellule e una macchia di Trypan Blue per contare le cellule e determinare la vitalità cellulare. Prelevare 10 μL di campione e mescolare con 10 μL di Trypan Blue mediante pipettaggio. Caricare 10 μL della miscela sull'ematocitometro emisurare 10.
- Trasferire i tessuti adiposi in un tubo da 15 ml contenente ~1 mL di soluzione enzimatica preriscaldata per 100 mg di tessuto. Immergere un paio di forbici lunghe e dritte nel tubo e tritare finemente i tessuti adiposi nella soluzione in pezzi il più piccoli possibile (~ 1 mm3) (Figura 2A).
3. Semina e coltura dei preadipociti
- Semina ~1 x 106 cellule in 4 mL di terreno di crescita preriscaldato in un pallone T-25. Seguire la stessa densità di placcatura se si utilizzano altri tipi di vasi di coltura. Posizionare nell'incubatore di colture tissutali e consentire di attaccare durante la notte.
NOTA: Le cellule vengono coltivate in un incubatore a 38 °C con un'atmosfera umidificata del 5% di CO2. La temperatura ottimale per la crescita delle cellule aviarie11 è di 38 °C e crescono lentamente a 37 °C. - Il giorno successivo, aspirare il mezzo e lavare delicatamente le cellule con 1x PBS mediante pipettaggio per rimuovere le cellule non attaccate o morte. Sostituire con 4 ml di nuovi mezzi di crescita. Controllare le cellule al microscopio. Le cellule dovrebbero essere a forma spinosa, come i fibroblasti (Figura 2A).
NOTA: In genere, i preadipociti si attaccano abbastanza rapidamente (entro poche ore). Il successo o il fallimento dell'isolamento cellulare può essere confermato in questo momento (dopo 24 ore). - Sostituire con 4 ml di terreni di crescita freschi ogni 2 giorni e sottocoltura o crioconservare le cellule quando raggiungono il 70% -80% di confluenza (Figura 3C).
4. Subculturazione e crioconservazione
- Aspirare vecchi mezzi e lavare delicatamente le celle con 4 ml di 1x PBS mediante pipettaggio. Aspirare PBS, aggiungere 2 mL di tripsina allo 0,1% per coprire la superficie cellulare in un matraccio T-25 (regolare il volume di conseguenza per altri recipienti di coltura), quindi incubare per 3-4 minuti a 38 °C.
NOTA: Osservare se le cellule sono staccate dalla piastra di coltura. Toccare delicatamente la piastra di coltura per aiutare il distacco delle cellule. Incubare le cellule con tripsina per troppo tempo danneggerà le cellule. - Aggiungere un volume equivalente di mezzi di crescita preriscaldati per inibire la reazione alla tripsina. Pipettare più volte sulla superficie della cella, inclinando la piastra per allentare le celle rimanenti.
- Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 mL e centrifugare a 300 x g per 5 minuti a RT (7 minuti per tubo da 50 ml). Aspirare il surnatante.
- In caso di subcoltura, risospesare il pellet in 1 mL di terreno di crescita mediante pipettaggio su e giù. Contare le celle come descritto nel punto 2.3.9.1 e quindi riplazionare utilizzando la stessa densità di placcatura utilizzata inizialmente nel passaggio 3.1.
- In caso di crioconservazione, preparare 4 ml di mezzi di congelamento per un pallone T-25 con confluenza del 90%.
NOTA: i supporti di congelamento sono costituiti dal 10% di DMSO, dal 30% di FBS e dal 60% di DMEM/F12. - Sostituire il pellet cellulare nel mezzo di congelamento e trasferire 1 mL di mezzo di congelamento in un crioviale. Congelare lentamente i criocerali a -1 °C/min utilizzando un contenitore di congelamento. Posizionare il contenitore in un congelatore a -80 °C durante la notte e quindi trasferirlo in azoto liquido per la conservazione a lungo termine.
NOTA: I preadipociti correttamente crioconservati mantengono la loro vitalità per almeno 3 anni e in genere si comportano come cellule appena isolate quando scongelati e placcati.
5. Differenziamento adipogenico
NOTA: le piastre rivestite di gelatina al 2% possono essere utilizzate per migliorare l'adesione cellulare.
- Preparare una soluzione di gelatina al 2% (p/v) (vedere Tabella dei materiali) in acqua distillata. Autoclave a 121 °C, 15 psi per 30 minuti per sterilizzare. Superficie di coltura del rivestimento con 5-10 μL di soluzione di gelatina/cm2 (cioè 100-200 μg/cm2). Ruotare delicatamente per rivestire uniformemente la superficie.
- Controllare le piastre per la diffusione uniforme della soluzione di gelatina poiché alcune regioni potrebbero rimanere inizialmente non rivestite. Lasciare che la piastra rivestita di gelatina rimanga a RT per almeno 1 ora. Rimuovere l'intero volume di soluzione di gelatina dai pozzetti.
NOTA: Questo lascerà un sottile strato di gelatina sul fondo dei pozzetti / piatti. La soluzione di gelatina può essere riutilizzata più volte (almeno 10 volte) senza alterare l'adesione e la crescita cellulare. Lasciare che i piatti rivestiti di gelatina rimangano nella cappa di coltura del tessuto per almeno 30 minuti prima di placcare le cellule. - Indurre i preadipociti di pollo a subire differenziazione adipogenica integrando i mezzi di crescita con acidi grassi. Per preparare mezzi di differenziazione adipogenici (ADM), integrare DMEM/F12 con il 10% di siero di pollo, 1x acido linoleico-acido oleico-albumina (9,4 μg/ml) e 1x P/S (vedere Tabella dei materiali). Rendere ADM fresco e caldo prima dell'uso.
NOTA: I preadipociti di pollo sono comunemente indotti a subire una differenziazione adipogenica integrando i mezzi con acidi grassi piuttosto che con cocktail ormonali tipicamente utilizzati per gli adipociti di altre specie12. - Indurre la differenziazione sostituendo i mezzi di crescita con mezzi di differenziazione adipogenici quando le cellule raggiungono ~ 90% di confluenza. Mantenere le cellule in questo mezzo, sostituendole ogni 2 giorni. Valutare visivamente la differenziazione al microscopio (20x) in base alla formazione di goccioline lipidiche, che diventano facilmente visibili entro 48 ore dall'indurre la differenziazione.
6. Valutazione dell'adipogenesi
- Eseguire la colorazione Oil Red O seguendo i passaggi seguenti.
- Placcare le cellule in una piastra a sei pozzetti e indurre la differenziazione adipogenica a ~ 90% di confluenza.
- Preparare una soluzione di lavoro di Oil Red O combinando sei parti della soluzione madre Oil Red O con quattro parti di acqua distillata in un tubo da 50 ml. Mescolare delicatamente con il pipettaggio su e giù e lasciare riposare per 10 minuti a RT, quindi filtrare attraverso una carta da filtro di grado 1 (vedere Tabella dei materiali) all'interno dell'imbuto versando lentamente la soluzione in un tubo da 50 ml.
NOTA: La soluzione madre oil red O viene prodotta sciogliendo 0,7 g di Oil Red O (vedi Tabella dei materiali) in 200 ml di isopropanolo al 100% in una bottiglia autoclavata. Mescolare bene e lasciare riposare per 20 minuti. Conservare a 4 °C e tenere lontano dalla luce fino all'uso. Questo è stabile per 1 anno. La soluzione di lavoro può essere utilizzata per 3 ore; tuttavia, si consiglia di utilizzarlo entro 2 ore. - Rimuovere il supporto e lavare delicatamente i pozzetti due volte con 2 ml di PBS 1x preriscaldato usando una pipetta. Rimuovere completamente PBS mediante pipettaggio. Fissare le celle con 2 ml di formalina tamponata al 10% e avvolgere la piastra con pellicola di paraffina. Lasciare a RT per almeno 1 ora e fino a 2 giorni prima della colorazione.
NOTA: per produrre 1 L di soluzione di formalina tamponata al 10%, mescolare 100 mL di formaldeide al 37%, 4,09 g di NaH2PO4, 6,5 g di Na2HPO4 (vedere Tabella dei materiali) e 900 ml di acqua distillata. Non pipettare la formalina direttamente sulle cellule. Erogare delicatamente sulla parete laterale vicino al fondo del pozzo. - Rimuovere la formalina e lavare delicatamente i pozzetti con 2 ml di acqua distillata. Sostituire con 2 ml di isopropanolo al 60%. Dopo 5 minuti, rimuovere l'isopropanolo e lasciare asciugare completamente i pozzetti per circa 10 minuti. Eseguire tutte le fasi di colorazione su RT.
- Aggiungere 1 mL di soluzione di lavoro Oil Red O alle cellule e incubare per 10-20 minuti a RT. Rimuovere la macchia mediante pipettaggio e lavare cinque volte immergendo l'acqua del rubinetto fino a quando non si vede alcuna macchia in eccesso. Dopo il risciacquo finale, aggiungere 1 mL di acqua alle cellule prima di visualizzare la colorazione e raccogliere le immagini al microscopio.
- Per quantificare l'accumulo lipidico per piatto, rimuovere l'acqua ed estrarre il colorante Oil Red O dalle cellule aggiungendo 1-2 ml di isopropanolo al 100% che è sufficiente a coprire completamente le cellule in un pozzo di piastra a sei pozzetti. Incubare con un delicato scuotimento su uno shaker a piastre per 10 minuti a RT.
- Trasferire 200 μL dell'estrazione in un pozzetto della piastra di saggio a 96 pozzetti. Quantificare la quantità relativa di macchia utilizzando un lettore di piastre spettrofotometriche per misurare l'assorbanza a 495 nm.
- Eseguire il test di colorazione delle goccioline lipidiche intracellulari e del nucleo.
- Cellule a piastre in piastre nere inferiori a 96 pozzetti e inducono la differenziazione adipogenica come descritto nel passaggio 5.3.
- Per macchiare le cellule, aggiungere 200 μL della soluzione colorante contenente una macchia lipidica fluorescente e una macchia di DNA fluorescente (vedere Tabella dei materiali) in 1x PBS per pozzetto. Dopo aver calcolato il volume totale della macchia richiesta, aggiungere due gocce della macchia di DNA e 25 μL della macchia lipidica per mL di PBS 1x preriscaldato utilizzando un tubo avvolto in un foglio per proteggere la soluzione dalla luce. Incubare a RT per 20 minuti e proteggere dalla luce.
- Leggere la fluorescenza utilizzando un lettore di piastre fluorescenti (vedi Tabella dei materiali). Rilevare la macchia lipidica (Eccitazione: 485 nm/Emissione: 572 nm) utilizzando un filtro rosso e la colorazione del DNA (Eccitazione: 359 nm/Emissione: 450 nm) attraverso un filtro blu/ciano.
NOTA: la colorazione può anche essere visualizzata e le immagini catturate al microscopio fluorescente. - Normalizzare le intensità della colorazione lipidica alle intensità della macchia di DNA per quantificare l'accumulo lipidico rispetto alla cellula numero13.
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Representative Results
I preadipociti primari sono morfologicamente simili ai fibroblasti, con forme irregolari simili a stelle e un nucleo centrale (Figura 2A-C). Le cellule aderiscono prontamente alla plastica di coltura tissutale e iniziano a proliferare subito dopo l'attaccamento. Differenziano e accumulano rapidamente goccioline lipidiche (Figura 3D) quando vengono fornite di acidi grassi nel mezzo. La vitalità (98%, basata sull'esclusione del colorante) riportata negli isolamenti qui rappresentati è tipica. Mentre le cellule sono abbastanza robuste, la manipolazione aggressiva durante l'isolamento porta a danni alle cellule (Figura 3E), producendo cellule che si attaccano male e non riescono a proliferare. Nonostante le procedure incorporate per prevenire la contaminazione microbica, può verificarsi il trasferimento di materiale non sterile (Figura 3F). A causa del loro rapido tasso di crescita, i preadipociti embrionali di pulcino consumano glucosio nei media a tassi elevati. I media dovrebbero essere cambiati ogni 48 ore per mantenere la loro fornitura di energia.
I risultati rappresentativi qui presentati illustrano il potenziale adipogenico dei preadipociti embrionali di pulcino. Queste cellule si accumulano rapidamente per sviluppare goccioline lipidiche in condizioni adipogene e l'accumulo progredisce nel tempo (Figura 4 e Figura 5). Sono stati presentati due metodi che possono essere utilizzati per visualizzare e quantificare meglio il grado di accumulo lipidico in queste cellule, che è un riflesso diretto dell'adipogenesi. La colorazione dei lipidi con Oil Red O è un metodo a basso costo per visualizzare e quantificare l'accumulo di goccioline lipidiche (Figura 4). Un microscopio ottico viene utilizzato per raccogliere immagini e le cellule macchiate possono essere tenute sul banco fino a quando le immagini non vengono raccolte. L'accumulo lipidico in ogni piatto di cellule può essere quantificato come descritto estraendo la macchia e leggendo l'assorbanza a 495 nm utilizzando uno spettrofotometro. Utilizzando la combinazione delle macchie lipidiche e di DNA selezionate, è stato possibile quantificare l'accumulo lipidico relativo al numero di cellule, che compensa le cellule non adipogeniche che possono persistere in coltura (Figura 5). Se le misure vengono adottate su più punti temporali (Figura 5B-C), questa combinazione consente di valutare sia l'adipogenesi che la proliferazione, ad esempio in risposta all'aggiunta di ormoni o peptidi.
Figura 1: Raccolta del tessuto adiposo. (A) Rompendo il guscio d'uovo, è stata rivelata la membrana del guscio bianco. (B) Forare l'amnione con pinzette sterili. (C) Un totale di ~ 80 mg di grasso sottocutaneo femorale può essere ottenuto da E16. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Frammenti tissutali per la digestione enzimatica e pellet cellulare dopo digestione. (A) Tessuto adiposo tritato in soluzione enzimatica (~1 mm3). (B) Le frecce indicano i pellet cellulari dopo la lisi dei globuli rossi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Confronti della morfologia cellulare di preadipociti primari isolati. (A) Preadipociti a 24 ore dopo l'isolamento. (B) Preadipociti a 48 ore dopo l'isolamento. (C) Preadipociti con confluenza dell'80% a 72 ore dopo l'isolamento. (D) Preadipociti dopo 48 ore di induzione adipogenica al passaggio 4, sono visibili goccioline lipidiche. L'inserto indica l'immagine ingrandita delle goccioline lipidiche. (E) Immagine rappresentativa delle cellule danneggiate. (F) La freccia indica punti di nuoto neri in colture contaminate. Barre di scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Valutazione dell'accumulo lipidico mediante colorazione Oil Red O. (A) Immagini rappresentative della colorazione Oil Red O dei preadipociti E16 dopo 24 ore, 48 ore e 72 ore di differenziazione adipogenica ex vivo. Barre di scala = 100 μm. (B) Quantificazione delle goccioline lipidiche misurate mediante eluizione della colorazione Oil Red O. I valori sono espressi come media ± SD. a,b,c P < 0,05 da ANOVA unidirezionale con test HSD posthoc di Tukey. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Valutazione della differenziazione degli adipociti mediante colorazione lipidica/colorazione del DNA. (A) Immagini rappresentative della colorazione lipidica (rossa) e della colorazione del DNA (blu) dei preadipociti E16 dopo 24 ore, 48 ore e 72 ore di differenziazione adipogenica ex vivo. Barre di scala = 150 μm. (B) La colorazione lipidica (Eccitazione: 485 nm/Emissione: 572 nm) è stata eseguita per valutare l'accumulo lipidico nei preadipociti differenziati. (C) La colorazione del DNA (eccitazione: 359 nm/Emissione: 450 nm) è stata eseguita per valutare le variazioni nel numero di cellule. (D) Il rapporto tra lipidi e macchie di DNA. L'accumulo di lipidi è normalizzato al contenuto di DNA. I valori sono espressi come media ± SD. a,b,c P < 0,05 da ANOVA unidirezionale con test HSD posthoc di Tukey. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Età (n=) | x106 cellule/100 mg di tessuto | Vitalità (%) |
| E12 (4) | 0,97 ± 0,115 a,b | 98,5 ± 0,58 a |
| E14 (4) | 1,22 ± 0,232 a,b | 98,3 ± 0,96 a,b |
| E16 (21) | 1,61 ± 1,717 a | 97,6 ± 1,58 a |
| E17 (4) | 0,81 ± 0,282 a,b | 96,8 ± 2,63 a,b |
| E18 (7) | 0,72 ± 0,611 a,b | 95,9 ± 1,81 a,b |
| E20 (4) | 0,94 ± 0,171 a,b | 97,8 ± 0,8 a,b |
| D4 (9) | 0,24 ± 0,164 a,b | 93,6 ± 4,28 byte |
| D5 (4) | 0,25 ± 0,073 a,b | 98,5 ± 0,71 a,b |
| D7 (10) | 0,17 ± 0,162 b | 96,8 ± 3,49 a,b |
| D14 (4) | 0,25 ± 0,051 a,b | 99,0 ± 0,00 a,b |
Tabella 1: Numero medio di cellule e vitalità di cellule isolate da embrioni e pulcini post-schiusa.
I valori sono espressi come media ± SD. a,b P < 0,05 da ANOVA unidirezionale con test HSD posthoc Tukey.
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Discussion
Sebbene diversi protocolli ben descritti abbiano riportato l'isolamento dei preadipociti 14,15,16,17, l'isolamento per i preadipociti embrionali è stato ottimizzato, che può essere utilizzato per analisi funzionali della crescita e dello sviluppo del grasso precoce nei pulcini da carne. Questo protocollo produce progenitori embrionali di adipociti ad alta vitalità con un elevato potenziale di differenziazione. Inoltre, la procedura presentata per isolare i preadipociti non è limitata agli embrioni, ma può essere utilizzata nei pulcini post-schiusa. Tuttavia, è stato ottimizzato per l'uso con embrioni E16 e le rese dei pulcini dopo la schiusa sono considerevolmente inferiori (Tabella 1), probabilmente a causa dell'aumento della quantità relativa di tessuto connettivo man mano che i pulcini crescono rapidamente.
Il successo dell'isolamento cellulare viene infine valutato osservando la forma e il numero di cellule attaccate (Figura 3A). Un basso numero di cellule o cellule danneggiate possono essere osservate quando le frazioni tissutali vengono digerite troppo a lungo, specialmente quando la dissociazione dei tessuti progredisce per più di 1,5 ore (Figura 3E). Pertanto, si raccomanda di non superare 1,5 ore di digestione. D'altra parte, se il frammento di tessuto rimane chiaramente dopo un'ora di digestione, il tempo digestivo o la quantità dovrebbero essere aumentati. La quantità di tessuto adiposo ottenuta potrebbe anche essere variata a seconda del ceppo genetico del pollo. Se questo protocollo viene utilizzato per isolare cellule di altre età o specie, sia la quantità di collagenasi che il tempo di digestione dovranno probabilmente essere modificati.
Una limitazione comune della coltura cellulare primaria è che le cellule isolate iniziano a perdere il potenziale adipogenico dopo diversi passaggi in coltura; pertanto, è importante indurre la differenziazione entro pochi giorni dall'isolamento per garantire che i preadipociti embrionali non perdano la loro capacità adipogenica. I precursori adipogenici degli embrioni si differenziano facilmente in adipociti maturi nella formulazione dei mezzi sopra descritta, senza la necessità di confluenza o induzione ormonale. Le cellule fino al passaggio 4 (10-14 giorni) sono facilmente differenziabili entro 48 ore dall'induzione (Figura 3D).
Controllare la contaminazione cellulare nella coltura cellulare primaria è un'altra sfida, dove la contaminazione fungina è la più comune. L'uso di amfotericina B, come descritto, è generalmente efficace nel prevenire la crescita fungina18,19. Può essere incluso a basse concentrazioni nei terreni di coltura senza effetti evidenti sulla vitalità o sul potenziale adipogenico. Contaminanti microbici non identificabili sono stati osservati sotto forma di punti neri di nuoto che appaiono pochi giorni dopo l'isolamento cellulare (Figura 3F). Questi hanno influenzato negativamente la crescita cellulare ed erano impossibili da rimuovere una volta che questa infezione si è verificata20. Non è noto se questi contaminanti fossero una specie microbica sconosciuta trovata in o sulle uova o fossero sorti da un'altra fonte. Questo protocollo tenta di ridurre al minimo il rischio di contaminazione estraendo gli embrioni in modo asettico dall'uovo21. L'utilizzo di uno sterilizzatore a base di calore nel cappuccio durante la dissezione aiuta anche a ridurre al minimo il potenziale di contaminazione, specialmente quando vengono sezionati più embrioni.
Una considerazione nel processo è la diminuzione dell'adesione cellulare alla piastra di coltura tissutale durante la differenziazione, derivante da cambiamenti fisici mentre le cellule formano ed espandono le goccioline lipidiche. Sebbene contenute all'interno delle cellule, le goccioline lipidiche sono galleggianti e, quando grandi, sembrano agire come palloncini che tendono a promuovere il sollevamento delle cellule dalla superficie. Pertanto, si deve prestare attenzione nel maneggiare i preadipociti mentre si induce la differenziazione, e in particolare quando si valuta l'adipogenesi. Mentre il protocollo qui presentato non modifica la superficie di coltura, l'adesione cellulare può essere migliorata quando si placcano le cellule su piatti rivestiti con gelatina al 2%. È anche importante confermare che il pH delle soluzioni di lavaggio sia 7,4 e utilizzare una soluzione PBS preriscaldata quando si lavano le cellule e si mescola con la macchia di DNA per ridurre lo stress da freddo.
Utilizzando più embrioni, è possibile isolare un numero sufficiente di cellule per produrre repliche sperimentali senza la necessità di passaggi multipli, espansione e il rischio che le cellule perdano il loro potenziale adipogenico. L'RNA può essere facilmente isolato da adipociti embrionali di pulcino pre- e differenziati isolati utilizzando metodi commerciali basati su fenolo o membrana per studi di espressione genica. Un RNA sufficiente può essere ottenuto da un singolo pozzetto di una piastra a sei pozzetti per l'uso nella sintesi del cDNA e nel follow-on qPCR o RNAseq.
In sintesi, l'accessibilità dei depositi adiposi nell'embrione di pulcino per isolare un modello cellulare è molto rilevante sia per il pollame che per l'uomo. Questo protocollo è relativamente semplice da eseguire e produce un'alta percentuale di cellule vitali che possono essere facilmente indotte a subire la differenziazione adipogenica in vitro. Le uova di gallina fecondate possono essere ottenute da varie fonti commerciali a costi minimi, rendendo queste cellule un modello prontamente disponibile per l'uso pratico.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano UT AgResearch e il Dipartimento di Scienze Animali per aver supportato e ottimizzato questo protocollo. Questo lavoro è stato finanziato dalla sovvenzione USDA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Pipette | Eppendorf | Z683825 | Single Channel Pipette, 100 - 1000 µL |
| 1 mL Pipette Tip | Fisher Scientific | 02-707-402 | |
| 100% Isopropanol | Fisher Scientific | A426P4 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010023 | |
| 25 mL Flask | Pyrex | 4980-25 | |
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | F75P-1GAL | |
| 6-Well Plate | Falcon | 353046 | Tissue Culture-treated |
| 96-Well Assay Plate | Costar | 3632 | |
| 96-Well Plate, Black Bottom | Costar | 3603 | Tissue Culture-treated |
| AdipoRed | Lonza | PT-7009 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290026 | |
| Bench Top Wiper (Kimtechwiper) | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Betadine | Up & Up | NDC 1167300334 | 20% Working Solution |
| Cell Counter | Corning | 6749 | |
| Cell Strainer, 40 µm | SPL | 93040 | |
| Centrifugaton | Eppendorf | 5702 | |
| Chicken Serum | Gibco | 16110082 | |
| Conical Centrifuge Tubes, 15 mL | VWR | 10025-690 | |
| Conical Centrifuge Tubes, 50 mL | Falcon | 352098 | |
| Cryovial | Nunc | 343958 | |
| Curved Forceps, 100 mm | Roboz Surgical | RS-5137 | |
| Curved Surgical Scissors, 115 mm | Roboz Surgical | RS-6839 | |
| Distilled Water | Millipore | SYNSV0000 | Despensed as needed |
| DMEM/F12 | HyClone | SH30023.01 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | 70% Working Solution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10437028 | |
| Fluorescent Microscope | EVOS | M7000 | |
| Fluorescent Plate Reader | Biotek | Synergy H1 | |
| Foil | Reynolds | Reynolds Wrap Heavy Duty Aluminum Foil, 125 SQ. FT. | |
| Freezing Container | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| Gelatin | Millipore | 4055 | 2% Working Solution |
| Hematocytometer (Counting Chamber) | Corning | 480200 | 0.1 mm deep |
| Incubator | Fisher Scientific | 6845 | |
| Instrument Sterilizer | VWR | B1205 | |
| Linoleic Acid-Oleic Acid-Albumin | Sigma | L9655 | 1x Working Solution |
| Microscope | Evos | AMEX1000 | |
| Multi-Channel Pipette | Thermo Scientific | 4661070 | 12-Channel Pipetters, 30 - 300 µL |
| Na2HPO4 | Sigma | S-7907 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S-3139 | |
| NucBlue | Invitrogen | R37605 | |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | |
| Orbital Shaker | IKA | KS130BS1 | |
| Paper Towel | Tork | RK8002 | |
| Parafilm | Parafilm M | PM996 | |
| Penicillin/Steptomycin (P/S) | Gibco | 15140122 | 1x Working Solution |
| Petri dishes, 100 mm | Falcon | 351029 | |
| Petri dishes, 60 mm | Falcon | 351007 | |
| Plate Shaker | VWR | 200 | |
| RBC Lysis Buffer | Roche | 11814389001 | |
| Reagent Reservior | VWR | 89094-680 | |
| Small Beaker, 100 mL | Pyrex | 1000-100 | |
| Spectrophotometer Plate Reader | Biotek | Synergy H1 | |
| Sterile Gauze | McKesson | 762703 | |
| Straight Forceps, 120 mm | Roboz Surgical | RS-4960 | |
| Straight Scissors, 140 mm | Roboz Surgical | RS-6762 | |
| T-25 Flask | Corning | 430639 | Tissue Culture-treated |
| Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Tissue Strainer, 250 µm | Pierce | 87791 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250061 | |
| Trypsin | Gibco | 15400054 | 0.1% Working Solution |
| Tweezers, 110 mm | Roboz Surgical | RS-5035 | |
| Type 1 Collagenase | Gibco | 17100017 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | 15-462-10 | |
| Whatman Grade 1 Filter Paper | Whatman | 1001-110 |
References
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