Summary
본 프로토콜은 육계 배아에서 지방 조직으로부터 지방전구세포를 단리하는 간단한 방법을 기술한다. 이 방법은 고수율, 일차 배양 및 지방전구세포의 아디포제닉 분화로 단리를 가능하게 한다. Oil Red O 염색 및 지질/DNA 염색은 분화 배지로 유도된 분리된 세포의 아디포겐 능력을 측정했습니다.
Abstract
일차 지방전구세포는 지방세포 분화 및 신진대사를 조절하는 분자 경로를 이해하는 데 유용한 실험 시스템이다. 닭 배아는 지방 발달의 초기 단계에서 지방 전구세포를 분리 할 수있는 기회를 제공합니다. 이 일차 세포는 지방세포 증식 및 아디포제닉 분화에 영향을 미치는 인자를 확인하는 데 사용될 수 있으며, 이는 어린 시절의 비만 및 가금류의 과도한 지방 침착 조절과 관련된 연구에 유용한 모델이 될 수 있습니다. 산후 지방 조직의 급속한 성장은 육계 닭의 근육 성장에서 멀리 할당함으로써 사료를 효과적으로 낭비합니다. 따라서 지방 조직 발달의 초기 단계를 이해하는 방법은 이러한 경향을 조절하고 삶의 초기에 지방 확장을 제한하는 방법을 식별하는 단서를 제공 할 수 있습니다. 본 연구는 상업적 육계(육류형) 병아리 배아의 지방조직 개발로부터 분리된 지방전구세포의 분리, 일차 배양 및 아디포제닉 분화를 위한 효율적인 방법을 개발하기 위해 고안되었다. 이 절차는 높은 생존력 (~ 98 %)을 가진 세포를 산출하고 성숙한 지방세포로 분화 할 수있는 능력을 증가시키도록 최적화되었습니다. 배아 지방세포 분리, 배양 및 분화의 이 간단한 방법은 초기 생활에서 지방 성장과 발달의 기능적 분석을 지원합니다.
Introduction
비만은 성인과 어린이 모두에게 세계적인 건강 위협입니다. 과체중 또는 비만 인 어린이는 성인보다 비만 할 확률이 약 다섯 배 더 높기 때문에 심혈관 질환, 당뇨병 및 기타 많은 합병증에 걸릴 위험이 크게 증가합니다. 2-5 세 미국 어린이의 약 13.4 %가 비만1을 앓고 있으며, 과도한 체지방을 축적하는 경향이 매우 일찍 시작될 수 있음을 보여줍니다. 매우 다른 이유로, 과도한 지방 조직의 축적은 육계 (고기 유형) 닭에 대한 우려입니다. 현대 육계는 믿을 수 없을만큼 효율적이지만 생리적으로 필요한 것보다 더 많은 지질을 축적합니다 2,3. 이러한 경향은 부화 직후에 시작되어 가장 비싼 생산 구성 요소 인 사료를 근육 성장에서 멀리 할당하여 효과적으로 낭비합니다. 따라서 어린이와 육계 닭 모두에게 매우 다른 이유로 인해 지방 조직 발달에 영향을 미치는 요인을 이해하고 조기에 지방 확장을 제한하는 방법을 찾아야합니다.
지방세포는 지방전구세포로부터 형성되며, 분화를 겪는 지방조직 유래 줄기세포는 성숙하고 지질을 저장하는 지방세포를 발달시킨다. 따라서, 시험관 내 지방전구세포는 비만 연구를 위한 귀중한 실험 모델이다. 지방 데포의 기질 혈관 분획으로부터 분리 된이 세포는 지방 세포 분화 및 신진 대사 4,5를 조절하는 분자 경로에 대한 근본적인 이해를 제공 할 수 있습니다. 병아리 배아는 원하는 일정에 따라 난자를 배양하면 배아의 일련의 발달 단계를 관찰하기 위해 어머니의 희생없이 배아를 얻을 수 있기 때문에 실험 조작이 더 쉬워지기 때문에 발달 연구에서 유리한 실험 모델입니다. 또한, 복잡한 수술 절차와 긴 기간은 더 큰 동물 모델에 비해 배아를 얻을 필요가 없습니다. 따라서 병아리 배아는 지방 조직 발달의 초기 단계에서 지방세포를 얻을 수있는 기회를 제공합니다. 피하 지방 조직은 허벅지 주위에 위치한 명확하게 정의된 데포로서 배아 12일째(E12) 주위의 병아리에서 보이게 된다. 이 디포는 성숙한 지방세포를 형성하기 위해 발달 단서 하에서 분화를 활발히 겪는 고도로 증식성 전지방세포에서 풍부해진다 6,7. 아디포겐 분화 과정은 닭과 인간 사이에서 비교할 수 있습니다. 따라서, 병아리 배아로부터 분리된 지방전구세포는 인간 및 가금류와 관련된 연구를 위한 이중 목적 모델로서 사용될 수 있다. 그러나, 지방전구세포의 수율은 세포가 성숙한 지방세포로 성장함에 따라 노화에 따라 감소한다5.
본 프로토콜은 아디포겐 분화 및 지방세포 비대증이 육계 병아리 배아8에서 피크에 있는 단계(E16-E18) 동안 지방 조직으로부터 지방전구세포의 분리를 최적화한다. 이 절차는 암탉 식단과 같은 난소 식단과 같은 난소 발달 배아가 오보에 노출되는 요인이 지방세포 발달 및 아디포겐 잠재력 ex 생체에 미치는 영향을 평가할 수 있습니다. 또한, 다양한 조작(예를 들어, 저산소증, 영양소 첨가, 약리학적 작용제 및 길항제)이 지방세포 전구물질의 지방발생 또는 다양한 '옴(예를 들어, 전사체, 대사체, 메틸롬)'에 미치는 영향을 시험할 수 있다. 지방 형성의 초기 단계를 나타내는 것으로,이 프로토콜을 사용하여 얻은 세포는 가금류 및 인간과 관련된 연구를위한 귀중한 모델입니다.
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Protocol
모든 동물 절차는 테네시 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 갓 수정 된 상업용 육계 알(Cobb 500)을 지역 부화장에서 얻었다. 난자는 배아 16-18일(E16-E18)에서 해부될 때까지 상대 습도 60%와 함께 38°C에서 배양되었다. 지방 조직은 피하(femoral) 데포로부터 수집되었다.
1. 고립과 문화를 위한 준비
- 문화 후드와 악기를 준비하십시오.
- 해부를 시작하기 전에 층류 후드에 작업 영역을 설정하십시오. 70 % 에탄올로 면도하여 작업 영역과 모든 장비를 소독하십시오. 멸균 물질을 사용하여 모든 절차를 수행하십시오.
참고: 용기와 기구를 세포 배양 후드에 다시 넣기 전에 항상 70% 에탄올로 면도하십시오. 배아 사이에서 장비를 쉽게 살균 할 수 있도록 벤치 탑 악기 살균기를 후드에 두는 것이 좋습니다.
주의: 기기 멸균기를 사용할 때는 화상 부상 및 조직 손상을 방지하기 위해 뜨거운 기기를 제대로 식히십시오. 최소 냉각 시간은 3 분입니다. 사용하기 전에 70 % 에탄올로 면봉하십시오. - 후드에 다음과 같은 장비와 용기를 조립하십시오 : 직선 포셉 (120 mm), 핀셋 (110 mm), 두 쌍의 곡선 포셉 (100 mm), 두 쌍의 직선 가위 (140 mm), 곡선 수술 가위 (115 mm), 티슈 스트레이너 (250 μm 나일론 메쉬), 세포 스트레이너 (40 μm 나일론 메쉬), 원뿔형 원심 분리 튜브 (15 mL 및 50 mL), 페트리 접시 (60 mm 및 100 mm), 작은 비커 (100 mL), 70 % 에탄올 스프레이 및 멸균 거즈, 종이 타월 및 벤치 탑 와이퍼 ( 재료 표 참조).
- 해부를 시작하기 전에 층류 후드에 작업 영역을 설정하십시오. 70 % 에탄올로 면도하여 작업 영역과 모든 장비를 소독하십시오. 멸균 물질을 사용하여 모든 절차를 수행하십시오.
- 아래 단계에 따라 효소 용액, 수집 배지 및 배양 배지를 준비하십시오.
참고: 용액을 미리 준비하고 사용할 때까지 4°C에서 보관하십시오. 미디어는 조직 수집 전에 얼음 위에 놓아야합니다. 이 단계에서 사용되는 모든 시약은 물질 표에 나열되어 있습니다.- DMEM/F12(Dulbecco의 개질된 이글 배지에 2.50mM의 L-글루타민과 15mM의 HEPES 완충액)를 2.5μg/mL의 암포테리신 B와 1x 페니실린/스트렙토마이신(P/S), 100U/mL로 보충하여 지방 조직 수집 및 효소 용액 제조에 사용되는 배지를 준비하십시오. 사용할 때까지 4°C에서 보관하십시오.
참고: 이 매체는 4°C에서 보관할 때 1년 동안 안정적으로 유지됩니다. - 베타딘을 1x PBS(칼슘, 마그네슘 또는 페놀 레드 없이 pH 7.4의 인산염 완충 식염수)에 2.5μg/mL의 암포테리신 B로 희석하여 멸균 용액을 준비합니다. 사용 전까지 4°C에서 보관하십시오.
참고: 이 용액은 4°C에서 보관할 때 2년 동안 안정적입니다. - DMEM/F12에 Type 1 콜라게나제(1mg/mL)를 2.5μg/mL의 암포테리신 B 및 1x P/S와 함께 용해시켜 효소 용액을 준비합니다(단계 1.2.1). 신선한 콜라게나제 용액을 만들어 해부 중에 얼음 위에 유지하십시오. 사용 약 10분 전에, 이 용액을 수조에서 37°C에서 인큐베이션하여 예비-가온하여 그의 효소 활성을 개시한다.
참고: 지방 조직 100mg당 약 1mL의 콜라게나제 용액(1mg/mL)이 필요합니다. - DMEM/F12 매체에 1x P/S 및 10% FBS를 보충하여 도금 및 전파에 사용되는 성장 매체를 준비합니다. 사용할 때까지 4°C에서 보관하십시오.
참고: 이 용액은 4°C에서 보관할 때 1년 동안 안정적입니다. - 1x PBS에 2.5 μg/mL의 암포테리신 B. 용액을 원하는 pH 7.4로 조정하여 세척 용액을 준비하십시오. 사용할 때까지 4°C에서 보관하십시오.
참고: 이 용액은 4°C에서 보관할 때 2년 동안 안정적입니다.
- DMEM/F12(Dulbecco의 개질된 이글 배지에 2.50mM의 L-글루타민과 15mM의 HEPES 완충액)를 2.5μg/mL의 암포테리신 B와 1x 페니실린/스트렙토마이신(P/S), 100U/mL로 보충하여 지방 조직 수집 및 효소 용액 제조에 사용되는 배지를 준비하십시오. 사용할 때까지 4°C에서 보관하십시오.
2. 지방 조직 수집 및 소화
- 배아를 안락사시킨다.
- 배아 16 일째에 인큐베이터에서 알을 제거하십시오. 미생물 오염의 주요 잠재적 인 원천은 계란의 표면입니다. 따라서 계란을 깨기 전에 70 % 에탄올에 담근 멸균 거즈로 달걀을 면봉하십시오. 면봉 후, 뾰족한 끝이있는 달걀을 종이 타월이 늘어선 작은 비커 (100 mL)에 수직으로 올려 유리에서 달걀을 쿠션하십시오.
- 집게의 손잡이를 사용하여 계란의 무딘 끝을 두드려 달걀을 부러 뜨립니다. 난각을 조심스럽게 제거하여 배아를 제거하기에 충분히 큰 개구부를 만든다(단계 2.1.3). 흰색 껍질 막을 부드럽게 찢어 배아를 노출시킵니다 (그림 1A). 멸균 핀셋을 사용하여 양수를 조심스럽게 관통합니다(그림 1B).
참고 : 양수 낭은 배아를 둘러싸고있는 양수로 채워진 투명한 막입니다. - 곧은 포셉을 사용하여 배아의 목을 가볍게 잡아 난자에서 배아를 제거하십시오. 노른자 낭을 절단하여 배아에서 분리하고 배아를 100mm 페트리 접시로 옮깁니다.
- 수술 가위와 포셉을 사용하여 즉시 목을 졸라.
- 지방 조직 수집을 수행하십시오.
- 배아 몸을 70 % 에탄올로 면도하고 멸균 거즈로 피부 표면을 부드럽게 문질러 깃털을 제거하면 소화 후 이후 단계에서 여과를 방해 할 수 있습니다. 벤치 탑 와이퍼를 사용하여 피부와 깃털이 수집 된 조직에 닿지 않도록하십시오.
- 다리와 복부 사이의 피부를 잘라 대퇴골 지방 창고 쌍을 드러냅니다.
- 한 손으로 구부러진 포셉을 사용하여 다리 주위의 피부를 잡으십시오. 다른 손으로 대퇴골 피하 지방을 부드럽게 제거하고 구부러진 포셉을 사용하여 디포를 다리에서 부드럽게 당깁니다.
참고 : 다리에 지방 패드에 부착되는 결합 조직은 상대적으로 적으며 전체 지방 패드는 포셉 만 사용하여 한 조각으로 분리해야합니다. 이것은 포셉을 뒤로 잡고 (끝이 아닌) 곡선 부분이 제거를 위해 지방 패드를 클램프하도록 함으로써 촉진 될 수 있습니다.- 필요한 경우 구부러진 가위로 뚱뚱한 패드를 잘라냅니다. 필요에 따라 다른 지방 패드와 추가 배아로 반복하십시오.
참고: E16에서 대부분의 배아에서 총 80mg의 피하 지방을 얻을 수 있습니다 (그림 1C). 이것은 전형적으로 ∼1 x 106 세포를 산출하며, 하나의 T-25 플라스크를 플레이트하기에 충분하다. 이 단계에서는 지방 패드 무게가 특정 육계 라인에 따라 다를 수 있고 육종가 암탉 연령 및식이 요법과 같은 통제 할 수없는 요인으로 인해 출발 물질의 양을 평가하기 위해 몇 배아에서 지방 패드를 계량하는 것이 유용 할 수 있습니다. 피하 지방은 여러 플라스크에서 도금을 위한 세포의 적절한 수율을 보장하기 위해 다섯 개의 알로부터 일상적으로 수집되었다.
- 필요한 경우 구부러진 가위로 뚱뚱한 패드를 잘라냅니다. 필요에 따라 다른 지방 패드와 추가 배아로 반복하십시오.
- 조직을 15 mL 튜브의 ~ 5 mL의 수집 배지로 옮기고 나머지 난자에 대해 해부를 반복하십시오.
- 수집 된 지방 패드를 살균 용액이 들어있는 60mm 페트리 접시로 옮기고 접시를 몇 번 소용돌이 치면서 간단히 헹구십시오.
- 지방 패드를 1x PBS가 들어있는 60 mm 페트리 접시로 옮겨 멸균 용액을 헹구십시오. 부드럽게 소용돌이치십시오. 1x PBS를 함유하는 두 번째 60 mm 페트리 접시로 옮겨서 이 단계를 반복한다.
- 아래 단계에 따라 효소 소화 및 지방세포 분리 작업을 수행합니다.
- 지방 조직을 조직 100 mg 당 ∼1 mL의 사전 가온된 효소 용액을 함유하는 15 mL 튜브로 옮긴다. 한 쌍의 길고 곧은 가위를 튜브에 담그고 용액 중의 지방 조직을 가능한 한 작은 조각(~1mm3)으로 미세하게 다듬습니다(그림 2A).
참고: 조직이 완전히 다듬어지지 않으면 세포 수율이 감소할 것입니다. - 다진 조직 및 효소 용액을 25 mL 오토클레이브 플라스크에 옮긴다. 플라스크를 파라핀 필름으로 감싸십시오. 인큐베이터 내부의 오비탈 쉐이커 위에 놓고 소화 단계 동안 37°C에서 진탕한다.
참고: 또는 흔들리는 수조를 사용하십시오. 두 가지 방법 중 하나를 사용하면 조직 조각이 플라스크 바닥에 침전되는 것을 방지하기에 충분해야하지만 조각이 플라스크 상단으로 추진되어 유리에 달라 붙거나 유체가 파라핀 필름 커버에 축적되는 속도가 너무 빨라서는 안됩니다. - ~30분 후, 1 mL 피펫 팁의 끝을 직경 약 3 mm로 절단한다. 조직 혼합물을 몇 번 위아래로 피펫하여 지방 조직으로부터 세포를 방출하는 데 도움을줍니다. 플라스크를 인큐베이터 / 수조로 되돌리고 흔들림을 재개하십시오.
- 추가 15 분 후, 플라스크에서 소화의 완전성을 확인하십시오. 쉐이커에서 플라스크를 제거한 후, 희끄무레 한 세포 층이 유체 층의 상부에 형성 될 것입니다. 조직 단편이 여전히 남아 있으면 다른 피펫 팁에서 끝을 자르고 혼합물을 위아래로 부드럽게 피펫 한 다음 추가 15 분 동안 계속 흔들어줍니다.
참고 : 완전히 소화 된 조직 / 콜라게나제 혼합물은 유백색 chyme처럼 보입니다. 전형적으로, 조직은 부드럽게 진탕한 1 시간 후에 충분히 소화된다. 이 시점에서 많은 단편이 남아 있으면 콜라게나제 효소 사용에 문제가 있음을 나타낼 수 있습니다. 일정한 흔들림은 수율을 증가시킬 수 있습니다. 그러나 효소에 장기간 노출되고 신체적 스트레스가 가해지면 세포가 손상 될 수도 있습니다. - 소화 후, 피펫을 부드럽게 위아래로 부드럽게 섞어서 잘 섞는다. 250 μm 조직 스트레이너를 통해 피펫팅에 의해 15 mL 튜브 내로 여과하여 소화되지 않은 조직 및 파편의 임의의 비트를 제거한다.
- 플라스크를 피펫팅에 의해 성장 배지 4 mL로 헹구어 유리에 부착될 수 있는 세포를 제거하고, 동일한 15 mL 튜브 내로 여과한다. 스트레이너를 피펫팅하여 추가 성장 배지로 헹구어 갇힌 세포를 최대 14 mL의 총 부피까지 느슨하게하십시오.
- 세포 분획을 RT에서 5분 동안 300 x g 에서 원심분리하여 펠릿화한다(50 mL 튜브에 대해 7분).
참고: 세포 배양 후드로 돌아가기 전에 항상 70% 에탄올로 튜브를 면봉하십시오. - 상층액을 흡인하십시오. 세포 펠릿을 빼내지 않도록 주의하십시오. 펠렛을 1 mL의 적혈구 용해 완충액 ( 물질 표 참조)에 부드럽게 재현탁시켜 위아래로 피펫팅하고, RT에서 5분 동안 인큐베이션한다. 적혈구가 용해되면 용액이 붉어집니다 (그림 2B).
참고: 사용하기 전에 RBC 용해 버퍼를 RT에 두십시오. 닭은 적혈구9를 유핵으로 만들었으며, 지방전구세포와 함께 조직 배양 접시에 부착한다. RBC 용해 완충액은 정확한 세포 수에 대한 간섭을 방지하기 위해 이러한 세포를 용해시키는 데 사용됩니다. - 세포가 들어있는 튜브에 성장 배지 5 mL를 첨가하여 용해 완충액을 희석하고 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합하십시오. 피펫을 사용하여 40 μm 세포 스트레이너를 통해 새로운 50 mL 튜브로 여과하고 추가 5 mL의 성장 배지로 스트레이너를 헹구십시오.
- 펠릿 세포를 RT에서 7분 동안 300 x g 에서 원심분리하여 상청액을 조심스럽게 흡인하고, 나머지 세포 펠릿을 1 mL의 성장 배지에 재현탁시켜 상하로 피펫팅한다.
- 혈구세포계, 세포 계수기 및 트리판 블루 염색을 사용하여 세포를 계수하고 세포 생존율을 결정하십시오. 10 μL의 샘플을 취하여 피펫팅으로 10 μL의 트리판 블루와 혼합하십시오. 혼합물 10 μL를 혈소세포계에 로딩하고10을 측정한다.
참고: 원심분리 속도는 초기 스핀 후 충분한 세포 펠릿이 쉽게 보이지 않는 경우 600 x g 로 증가시킬 수 있습니다.
- 혈구세포계, 세포 계수기 및 트리판 블루 염색을 사용하여 세포를 계수하고 세포 생존율을 결정하십시오. 10 μL의 샘플을 취하여 피펫팅으로 10 μL의 트리판 블루와 혼합하십시오. 혼합물 10 μL를 혈소세포계에 로딩하고10을 측정한다.
- 지방 조직을 조직 100 mg 당 ∼1 mL의 사전 가온된 효소 용액을 함유하는 15 mL 튜브로 옮긴다. 한 쌍의 길고 곧은 가위를 튜브에 담그고 용액 중의 지방 조직을 가능한 한 작은 조각(~1mm3)으로 미세하게 다듬습니다(그림 2A).
3. 지방전구세포의 시딩 및 배양
- T-25 플라스크에서 미리 가온된 성장 배지의 4 mL에 ∼1 x 106 세포를 시드한다. 다른 유형의 배양 용기를 사용하는 경우 동일한 도금 밀도를 따르십시오. 조직 배양 배양기에 넣고 밤새 부착할 수 있도록 한다.
참고: 세포는 5%CO2의 가습된 분위기의 38°C 인큐베이터에서 배양된다. 조류 세포(11 )의 성장을 위한 최적 온도는 38°C이고, 이들은 37°C에서 천천히 성장한다. - 다음날, 흡인물 배지는 피펫팅에 의해 세포를 1x PBS로 부드럽게 세척하여 부착되지 않거나 죽은 세포를 제거하였다. 4 mL의 신선한 성장 배지로 교체하십시오. 현미경으로 세포를 확인하십시오. 세포는 섬유아세포처럼 스핀드 모양이어야 합니다(그림 2A).
참고 : 일반적으로 전지방 세포는 상당히 빨리 부착됩니다 (몇 시간 이내). 세포 단리의 성공 또는 실패는 이 때(24시간 후)에 확인될 수 있다. - 2일마다 4mL의 신선한 성장 배지로 교체하고 70%-80% 합류율에 도달하면 세포를 계대배양하거나 동결보존합니다(그림 3C).
4. 계대 배양 및 냉동 보존
- 오래된 배지를 흡인하고, 피펫팅에 의해 4 mL의 1x PBS로 세포를 부드럽게 세척한다. 흡인물 PBS, 2 mL의 0.1% 트립신을 첨가하여 세포 표면을 T-25 플라스크에 덮고(다른 배양 용기에 따라 부피를 조절함), 이어서 38°C에서 3-4분 동안 인큐베이션한다.
참고: 세포가 배양 플레이트에서 분리되어 있는지 관찰하십시오. 배양 플레이트를 부드럽게 두드려 세포 분리를 돕습니다. 너무 오랫동안 트립신으로 세포를 배양하면 세포가 손상됩니다. - 트립신 반응을 억제하기 위해 동등한 부피의 사전 예열 된 성장 배지를 첨가하십시오. 세포 표면 위에 피펫을 여러 번 얹고, 플레이트를 기울여 나머지 세포를 느슨하게 한다.
- 세포 현탁액을 15 mL 튜브로 옮기고, RT에서 5분 동안 300 x g 에서 원심분리한다(50 mL 튜브의 경우 7분). 상층액을 흡인하십시오.
- 계대 배양하는 경우, 펠렛을 1 mL의 성장 배지에 재현탁시켜 위아래로 피펫팅한다. 단계 2.3.9.1에 기술된 바와 같이 셀을 계수한 다음, 단계 3.1에서 초기에 사용된 것과 동일한 도금 밀도를 사용하여 재플레이트한다.
- 냉동 보존하는 경우, 90 % 합류율의 T-25 플라스크에 4 mL의 냉동 매체를 준비하십시오.
참고: 동결 매체는 10% DMSO, 30% FBS 및 60% DMEM/F12로 구성됩니다. - 세포 펠릿을 동결 배지에 재현탁시키고 1 mL의 동결 배지를 냉동 배지로 옮긴다. 냉동 용기를 사용하여 냉동 용기를 사용하여 냉동 중량을 -1 °C / 분으로 천천히 동결시킵니다. 용기를 하룻밤 동안 -80°C 냉동고에 넣은 다음, 이를 액체 질소로 옮겨 장기간 보관한다.
참고 : 적절하게 동결 보존 된 전지방세포는 적어도 3 년 동안 생존력을 유지하며 일반적으로 해동 및 도금 될 때 새로 분리 된 세포처럼 수행됩니다.
5. 아디포제닉 분화
참고 : 2 % 젤라틴 코팅 플레이트를 사용하여 세포 접착력을 향상시킬 수 있습니다.
- 증류수에 2% (w/v) 젤라틴 용액 (물질 표 참조)을 준비하십시오. 121°C, 15 psi에서 30분 동안 오토클레이브하여 멸균한다. 5-10 μL의 젤라틴 용액 / cm2 (즉, 100-200 μg /cm2)로 코팅 배양 표면. 부드럽게 소용돌이 치며 표면을 고르게 코팅하십시오.
- 일부 부위가 초기에 코팅되지 않은 상태로 남아있을 수 있기 때문에 젤라틴 용액의 확산도 있는지 플레이트를 확인하십시오. 젤라틴 코팅된 플레이트가 적어도 1시간 동안 RT에 남아 있도록 하십시오. 웰에서 젤라틴 용액의 전체 부피를 제거하십시오.
참고 : 이것은 우물 / 접시의 바닥에 얇은 젤라틴 코트를 남깁니다. 젤라틴 용액은 세포 부착 및 성장을 변화시키지 않고 여러 번 (적어도 10 배) 재사용 할 수 있습니다. 젤라틴 코팅 접시가 세포를 도금하기 전에 적어도 30분 동안 조직 배양 후드에 남아 있도록 한다. - 닭 지방전구세포가 지방산으로 성장 배지를 보충함으로써 아디포제닉 분화를 겪도록 유도한다. 아디포제닉 분화 배지(ADM)를 준비하려면 DMEM/F12에 10% 닭 혈청, 1x 리놀레산-올레산-알부민(9.4μg/mL) 및 1x P/S를 보충 합니다(자료 표 참조). 사용하기 전에 ADM을 신선하고 따뜻하게 만드십시오.
참고: 닭 지방전구세포는 일반적으로 다른 종12의 지방세포에 일반적으로 사용되는 호르몬 칵테일이 아닌 지방산으로 배지를 보충하여 아디포제닉 분화를 겪도록 유도됩니다. - 세포가 ~90% 합류에 도달할 때 성장 배지를 아디포제닉 분화 배지로 대체함으로써 분화를 유도한다. 이 배지에 세포를 유지하고 2 일마다 교체하십시오. 분화를 유도한 후 48 h 이내에 쉽게 볼 수 있게 되는 지질 방울의 형성에 기초하여 현미경 (20x) 하에 육안으로 분화를 평가한다.
6. 지방발생 평가
- 아래 단계에 따라 Oil Red O 염색을 수행하십시오.
- 세포를 여섯 웰 플레이트에 플레이트하고, ∼90% 컨플루언시에서 아디포제닉 분화를 유도한다.
- 오일 레드 O 원액의 여섯 부분을 50 mL 튜브에서 네 부분의 증류수와 결합하여 오일 레드 O의 작업 용액을 준비한다. 피펫팅을 위아래로 부드럽게 섞어 RT에서 10분 동안 방치한 다음, 용액을 50mL 튜브에 천천히 부어 깔때기 내부의 Grade 1 여과지( 재료 표 참조)를 통해 여과합니다.
참고: Oil Red O 원액은 오토클레이브 병에 100% 이소프로판올 200mL에 0.7g의 Oil Red O( 재료표 참조)를 용해시켜 제조됩니다. 잘 섞어서 20 분 동안 그대로 두십시오. 4 °C에서 보관하고 사용할 때까지 빛으로부터 멀리하십시오. 이것은 1 년 동안 안정적입니다. 작업 용액은 3 시간 동안 사용할 수 있습니다. 그러나 2 시간 이내에 사용하는 것이 좋습니다. - 배지를 제거하고 피펫을 사용하여 미리 가온된 1x PBS 2 mL로 웰을 2회 부드럽게 세척한다. 피펫팅을 하여 PBS를 완전히 제거하십시오. 세포를 2 mL의 10% 완충된 포르말린으로 고정시키고 플레이트를 파라핀 필름으로 감싸십시오. 염색하기 전에 적어도 1 시간 및 최대 2 일 동안 RT에 두십시오.
참고: 10% 완충된 포르말린 용액 1L를 만들기 위해, 37% 포름알데히드 100mL, NaH2PO4 4.09g,Na2HPO46.5g(물자표 참조) 및 증류수 900mL를 섞는다. 포르말린을 세포에 직접 피펫하지 마십시오. 우물 바닥 근처의 측벽에 부드럽게 분배하십시오. - 포르말린을 제거하고 증류수 2mL로 웰을 부드럽게 세척합니다. 2mL의 60% 이소프로판올로 교체합니다. 5 분 후, 이소프로판올을 제거하고 웰을 약 10 분 동안 완전히 말리십시오. RT에서 모든 염색 단계를 수행하십시오.
- 세포에 Oil Red O 작업 용액 1 mL를 첨가하고 RT에서 10-20분 동안 배양합니다. 피펫팅하여 얼룩을 제거하고 과도한 얼룩이 보이지 않을 때까지 수돗물에 담그어 다섯 번 세척하십시오. 최종 헹굼 후, 염색을 시각화하고 현미경으로 이미지를 수집하기 전에 세포에 물 1 mL를 첨가하십시오.
- 접시 당 지질 축적을 정량화하기 위해, 물을 제거하고 여섯 웰 플레이트의 우물에서 세포를 완전히 덮기에 충분한 100 % 이소프로판올 1-2 mL를 첨가하여 세포에서 Oil Red O 염료를 추출하십시오. RT에서 10 분 동안 플레이트 쉐이커에서 부드럽게 흔들면서 배양하십시오.
- 추출된 200 μL를 96-웰 분석 플레이트의 웰 내로 옮긴다. 분광광도계 플레이트 리더를 사용하여 염색의 상대량을 정량화하여 495 nm에서의 흡광도를 측정한다.
- 세포내 지질 액적 및 핵에 대한 염색 분석을 수행한다.
- 플레이트 세포를 흑색 바닥 96-웰 플레이트에서 단계 5.3에 기재된 바와 같이 아디포제닉 분화를 유도한다.
- 세포를 염색하기 위해, 웰 당 1x PBS에 형광 지질 염색 및 형광 DNA 염색 ( 물질의 표 참조)을 함유하는 염색 용액 200 μL를 첨가한다. 필요한 얼룩의 총 부피를 계산한 후, 호일 래핑 튜브를 사용하여 미리 가온된 1x PBS의 mL 당 2방울의 DNA 염색 및 25 μL의 지질 염색을 첨가하여 용액을 빛으로부터 보호하였다. RT에서 20 분 동안 배양하고 빛으로부터 보호하십시오.
- 형광 플레이트 판독기를 사용하여 형광을 판독 한다(표 자료 참조). 빨간색 필터를 사용하여 지질 얼룩(여기: 485nm/방출: 572nm)을 검출하고 파란색/시안색 필터를 통해 DNA 염색(여기: 359nm/방출: 450nm)을 검출합니다.
참고: 염색은 또한 시각화 될 수 있으며 형광 현미경으로 이미지를 캡처 할 수 있습니다. - 지질 염색 강도를 DNA 염색 강도로 정상화하여 세포 번호13에 비해 지질 축적을 정량화한다.
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Representative Results
일차 지방전구세포는 형태학적으로 섬유아세포와 유사하며, 불규칙하고 별과 같은 모양과 중심 핵을 가지고 있다(도 2A-C). 세포는 조직 배양 플라스틱에 쉽게 부착되고 부착 직후에 증식하기 시작합니다. 그들은 신속하게 분화하고 배지에 지방산이 제공 될 때 지질 방울을 축적합니다 (그림 3D). 여기에 제시된 단리에서 보고된 생존력(98%, 염료 배제에 기초함)이 전형적이다. 세포는 상당히 견고하지만, 분리 중에 공격적인 취급은 세포 손상을 초래하며(그림 3E), 제대로 부착되지 않고 증식에 실패하는 세포를 산출합니다. 미생물 오염을 방지하기 위해 혼입된 절차에도 불구하고, 비멸균 물질의 이송이 발생할 수 있다(도 3F). 그들의 급속한 성장 속도 때문에, 병아리 배아 preadipocytes는 높은 비율로 배지에서 포도당을 소비합니다. 미디어는 에너지 공급을 유지하기 위해 48 시간마다 변경되어야합니다.
여기에 제시된 대표적인 결과는 병아리 배아 지방전구세포의 아디포겐 가능성을 보여준다. 이들 세포는 아디포겐 조건 하에서 지질 방울을 발달시키기 위해 빠르게 축적되고, 축적은 시간이 지남에 따라 진행된다(도 4 및 도 5). 이들 세포에서 지질 축적의 정도를 더 잘 시각화하고 정량화하는 데 사용될 수 있는 두 가지 방법이 제시되었는데, 이는 지방 생성의 직접적인 반영이다. Oil Red O로 지질을 염색하는 것은 지질 방울의 축적을 시각화하고 정량화하는 저비용 방법입니다 (그림 4). 광학 현미경은 이미지를 수집하는 데 사용되며 염색 된 세포는 이미지가 수집 될 때까지 벤치 탑에 보관할 수 있습니다. 세포의 각 접시에서의 지질 축적은 얼룩을 추출하고 분광 광도계를 사용하여 495 nm에서 흡광도를 판독함으로써 기재된 바와 같이 정량화될 수 있다. 선택된 지질과 DNA 염색의 조합을 사용하여, 세포 수에 비해 지질 축적을 정량화할 수 있었고, 이는 배양에서 지속될 수 있는 비아디포겐 세포를 보상한다(도 5). 여러 시점에 걸쳐 측정이 취해지면 (그림 5B-C), 이 조합은 예를 들어 첨가 된 호르몬 또는 펩티드에 대한 반응으로 지방 생성과 증식을 평가할 수있게합니다.
도 1: 지방 조직 수집 . (A) 달걀 껍질을 깨뜨리면 흰 껍질 막이 드러났다. (B) 멸균 핀셋을 사용하여 양수를 관통. (C) E16으로부터 총 ∼80mg의 대퇴골 피하 지방을 얻을 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 효소 소화를위한 조직 단편 및 소화 후 세포 펠릿. (A) 효소 용액 (~ 1 mm3)에서 다진 지방 조직. (B) 화살표는 RBC 용해 후 세포 펠릿을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 단리된 일차 지방전구세포의 세포 형태학 비교. (A) 단리 후 24시간에서의 지방전구세포. (B) 단리 후 48 h에서 지방전구세포. (C) 단리 후 72 h에서 80 % 컨플루언시를 갖는 지방전구세포. (d) 계대 4에서 48시간 아디포겐 유도 후 지방전구세포, 지질 방울이 보인다. 삽입물은 지질 액적의 확대된 이미지를 나타낸다. (e) 손상된 세포의 대표적인 이미지. (F) 화살표는 오염된 문화권에서 검은 수영 점을 나타낸다. 배율 막대 = 100μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: Oil Red O 염색에 의한 지질 축적의 평가. (A) 생체외 아디포겐 분화 후 24 h, 48 h, 및 72 h 아디포겐 분화 후 E16 지방전구세포의 Oil Red O 염색의 대표적인 이미지. 스케일 바 = 100 μm. (B) Oil Red O 염색의 용출에 의해 측정된 지질 액적의 정량화. 값은 SD. a, b, c P ± 0.05< 후속 Tukey의 HSD 테스트를 통해 단방향 ANOVA에 의해 평균으로 표현됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 지질 염색/DNA 염색에 의한 지방세포 분화 평가. (A) 24 h, 48 h 및 72 h 아디포제닉 분화 전 생체 후 E16 지방세포의 지질 염색 (적색) 및 DNA (청색) 염색의 대표적인 이미지. 스케일 바 = 150 μm. (B) 분화된 지방전구세포에서의 지질 축적을 평가하기 위해 지질 염색 (여기: 485 nm/방출: 572 nm)을 수행하였다. (c) 세포 수의 변이를 평가하기 위해 DNA 염색 (여기: 359 nm/방출: 450 nm)을 수행하였다. (d) 지질과 DNA 염색의 비율. 지질 축적은 DNA 함량으로 표준화된다. 값은 SD. a, b, c P ± 0.05< 후정부 Tukey의 HSD 검정을 사용한 단방향 ANOVA에 의해 평균으로 표현됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 나이(n=) | x106 세포/100 mg 조직 | 생존율(%) |
| E12 (4) | 0.97 ± 0.115 a,b | 98.5 ± 0.58 a |
| E14 (4) | 1.22 ± 0.232 a,b | 98.3 ± 0.96 a,b |
| E16 (21) | 1.61 ± 1.717 a | 97.6 ± 1.58 a |
| E17 (4) | 0.81 ± 0.282 a,b | 96.8 ± 2.63 a,b |
| E18 (7) | 0.72 ± 0.611 a,b | 95.9 ± 1.81 a,b |
| E20 (4) | 0.94 ± 0.171 a,b | 97.8 ± 0.8 a,b |
| D4 (9) | 0.24 ± 0.164 a,b | 93.6 ± 4.28 b |
| D5 (4) | 0.25 ± 0.073 a,b | 98.5 ± 0.71 a,b |
| D7 (10) | 0.17 ± 0.162 b | 96.8 ± 3.49 a,b |
| D14 (4) | 0.25 ± 0.051 a,b | 99.0 ± 0.00 a,b |
표 1: 배아 및 부화 후 병아리로부터 분리된 세포의 평균 세포 수 및 생존력.
값은 SD. a,b P ± 0.05< 후속 Tukey의 HSD 테스트를 통해 단방향 ANOVA에 의해 평균으로 표현됩니다.
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Discussion
몇몇 잘 기술된 프로토콜이 지방전구세포14,15,16,17의 단리를 보고했지만, 배아 지방전구세포에 대한 단리가 최적화되었으며, 이는 육계 병아리의 초기 생활 지방 성장 및 발달의 기능적 분석에 사용될 수 있다. 이 프로토콜은 높은 분화 잠재력을 가진 높은 생존력 배아 지방세포 전구 인자를 산출한다. 또한, 지방전구세포를 분리하기 위한 제시된 절차는 배아에 한정되지 않고 부화 후 병아리에 사용될 수 있다. 그러나 E16 배아와 함께 사용하도록 최적화되었으며 부화 후 병아리의 수확량은 상당히 낮으며 (표 1), 병아리가 빠르게 성장함에 따라 결합 조직의 상대적 양이 증가하기 때문일 수 있습니다.
세포 분리의 성공은 궁극적으로 부착된 세포의 모양과 수를 관찰함으로써 평가된다(도 3A). 낮은 세포 수 또는 손상된 세포는 조직 분획이 너무 오래 소화될 때, 특히 조직 해리가 1.5시간 이상 진행될 때 관찰될 수 있다(도 3E). 따라서 1.5 시간의 소화를 초과하지 않는 것이 좋습니다. 반면에, 소화 한 시간 후에 조직 단편이 명확하게 남아 있다면, 소화 시간 또는 양을 증가시켜야합니다. 수득된 지방 조직량은 또한 닭의 유전적 균주에 따라 변할 수 있다. 이 프로토콜이 다른 연령이나 종의 세포를 분리하는 데 사용되는 경우, 콜라게나제의 양과 소화 시간 모두 수정이 필요할 것입니다.
일차 세포 배양의 일반적인 한계는 단리된 세포가 배양물에서 여러 계대 후에 아디포겐 잠재력을 잃기 시작한다는 것이다; 따라서, 배아 지방전구세포가 그들의 지방형성 능력을 잃지 않도록 하기 위해 분리 후 며칠 이내에 분화를 유도하는 것이 중요하다. 배아의 아디포겐 전구체는 합류 또는 호르몬 유도의 필요 없이 상기 기술된 배지 제형에서 성숙한 지방세포로 쉽게 분화된다. 계대 4 (10-14 일)까지의 세포는 유도의 48 시간 이내에 쉽게 분화됩니다 (그림 3D).
일차 세포 배양에서 세포 오염을 통제하는 것은 곰팡이 오염이 가장 흔한 또 다른 과제입니다. 기술된 바와 같이 암포테리신 B의 사용은 일반적으로 진균 성장18,19를 예방하는데 효과적이다. 이는 생존력 또는 아디포겐 잠재력에 대한 현저한 영향 없이 배양 배지에 낮은 농도로 포함될 수 있다. 식별 불가능한 미생물 오염물질은 세포 분리 후 며칠 후에 나타나는 검은 수영 점의 형태로 관찰되었다(도 3F). 이들은 세포 성장에 악영향을 미쳤으며 일단 감염이 발생하면 제거가 불가능했습니다20. 이러한 오염 물질이 계란에서 또는 계란에서 발견되는 알려지지 않은 미생물 종인지 또는 다른 출처에서 발생했는지 여부는 알 수 없습니다. 이 프로토콜은 난자21에서 배아를 무균적으로 추출함으로써 오염의 위험을 최소화하려고 시도합니다. 해부 중에 후드에 열 기반 기기 살균기를 사용하면 특히 여러 배아가 해부 될 때 오염 가능성을 최소화하는 데 도움이됩니다.
이 과정에서 고려해야 할 한 가지 사항은 분화 동안 조직 배양 플레이트에 대한 세포 부착을 감소시키는 것인데, 이는 세포가 지질 방울을 형성하고 확장함에 따라 물리적 변화로 인한 것입니다. 세포 내에 포함되어 있지만, 지질 방울은 부력이며, 크면 표면에서 세포 들어 오기를 촉진하는 경향이있는 풍선으로 작용하는 것으로 보입니다. 따라서, 분화를 유도하면서 지방전구세포를 취급할 때, 특히 지방생성이 평가될 때 주의를 기울여야 한다. 여기에 제시된 프로토콜은 배양 표면을 변형시키지 않지만 2 % 젤라틴으로 코팅 된 접시에 세포를 도금 할 때 세포 접착력을 향상시킬 수 있습니다. 또한 세척액의 pH가 7.4임을 확인하고 세포를 세척하고 DNA 염색과 혼합할 때 미리 가온된 PBS 용액을 사용하여 차가운 스트레스를 줄이는 것도 중요합니다.
다중 배아를 사용하여, 충분한 수의 세포를 분리하여 다중 계대, 확장 및 세포가 아디포겐 잠재력을 잃을 위험없이 실험 반복실험을 산출 할 수 있습니다. RNA는 유전자 발현 연구를 위한 페놀- 또는 막-기반 상업적 방법을 사용하여 단리된 사전 및 분화된 병아리 배아 지방세포 둘 다로부터 용이하게 단리될 수 있다. 충분한 RNA는 cDNA 합성 및 후속 qPCR 또는 RNAseq에 사용하기 위한 여섯 웰 플레이트의 단일 웰로부터 수득될 수 있다.
요약하면, 세포 모델을 분리하기 위해 병아리 배아에서 지방 창고의 접근성은 가금류와 인간 모두에게 매우 관련이 있습니다. 이러한 프로토콜은 비교적 수행이 간단하고, 시험관내에서 아디포제닉 분화를 겪도록 용이하게 유도될 수 있는 생존 가능한 세포의 높은 비율을 산출한다. 수정 된 닭고기 알은 최소한의 비용으로 다양한 상업적 출처에서 얻을 수 있으므로 이러한 세포를 실제 사용을위한 쉽게 사용할 수있는 모델로 만듭니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자는이 프로토콜을 지원하고 최적화 한 UT AgResearch와 동물 과학부에 감사드립니다. 이 작품은 USDA 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Pipette | Eppendorf | Z683825 | Single Channel Pipette, 100 - 1000 µL |
| 1 mL Pipette Tip | Fisher Scientific | 02-707-402 | |
| 100% Isopropanol | Fisher Scientific | A426P4 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010023 | |
| 25 mL Flask | Pyrex | 4980-25 | |
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | F75P-1GAL | |
| 6-Well Plate | Falcon | 353046 | Tissue Culture-treated |
| 96-Well Assay Plate | Costar | 3632 | |
| 96-Well Plate, Black Bottom | Costar | 3603 | Tissue Culture-treated |
| AdipoRed | Lonza | PT-7009 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290026 | |
| Bench Top Wiper (Kimtechwiper) | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Betadine | Up & Up | NDC 1167300334 | 20% Working Solution |
| Cell Counter | Corning | 6749 | |
| Cell Strainer, 40 µm | SPL | 93040 | |
| Centrifugaton | Eppendorf | 5702 | |
| Chicken Serum | Gibco | 16110082 | |
| Conical Centrifuge Tubes, 15 mL | VWR | 10025-690 | |
| Conical Centrifuge Tubes, 50 mL | Falcon | 352098 | |
| Cryovial | Nunc | 343958 | |
| Curved Forceps, 100 mm | Roboz Surgical | RS-5137 | |
| Curved Surgical Scissors, 115 mm | Roboz Surgical | RS-6839 | |
| Distilled Water | Millipore | SYNSV0000 | Despensed as needed |
| DMEM/F12 | HyClone | SH30023.01 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | 70% Working Solution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10437028 | |
| Fluorescent Microscope | EVOS | M7000 | |
| Fluorescent Plate Reader | Biotek | Synergy H1 | |
| Foil | Reynolds | Reynolds Wrap Heavy Duty Aluminum Foil, 125 SQ. FT. | |
| Freezing Container | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| Gelatin | Millipore | 4055 | 2% Working Solution |
| Hematocytometer (Counting Chamber) | Corning | 480200 | 0.1 mm deep |
| Incubator | Fisher Scientific | 6845 | |
| Instrument Sterilizer | VWR | B1205 | |
| Linoleic Acid-Oleic Acid-Albumin | Sigma | L9655 | 1x Working Solution |
| Microscope | Evos | AMEX1000 | |
| Multi-Channel Pipette | Thermo Scientific | 4661070 | 12-Channel Pipetters, 30 - 300 µL |
| Na2HPO4 | Sigma | S-7907 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S-3139 | |
| NucBlue | Invitrogen | R37605 | |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | |
| Orbital Shaker | IKA | KS130BS1 | |
| Paper Towel | Tork | RK8002 | |
| Parafilm | Parafilm M | PM996 | |
| Penicillin/Steptomycin (P/S) | Gibco | 15140122 | 1x Working Solution |
| Petri dishes, 100 mm | Falcon | 351029 | |
| Petri dishes, 60 mm | Falcon | 351007 | |
| Plate Shaker | VWR | 200 | |
| RBC Lysis Buffer | Roche | 11814389001 | |
| Reagent Reservior | VWR | 89094-680 | |
| Small Beaker, 100 mL | Pyrex | 1000-100 | |
| Spectrophotometer Plate Reader | Biotek | Synergy H1 | |
| Sterile Gauze | McKesson | 762703 | |
| Straight Forceps, 120 mm | Roboz Surgical | RS-4960 | |
| Straight Scissors, 140 mm | Roboz Surgical | RS-6762 | |
| T-25 Flask | Corning | 430639 | Tissue Culture-treated |
| Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Tissue Strainer, 250 µm | Pierce | 87791 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250061 | |
| Trypsin | Gibco | 15400054 | 0.1% Working Solution |
| Tweezers, 110 mm | Roboz Surgical | RS-5035 | |
| Type 1 Collagenase | Gibco | 17100017 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | 15-462-10 | |
| Whatman Grade 1 Filter Paper | Whatman | 1001-110 |
References
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