Summary
Настоящий протокол описывает простой способ выделения преадипоцитов из жировой ткани у эмбрионов бройлеров. Этот метод позволяет выделить с высоким выходом, первичной культурой и адипогенной дифференцировкой преадипоцитов. Окрашивание маслом Red O и окрашивание липидов/ДНК измеряли адипогенную способность изолированных клеток, индуцированных дифференцировочными средами.
Abstract
Первичные преадипоциты являются ценной экспериментальной системой для понимания молекулярных путей, которые контролируют дифференцировку и метаболизм адипоцитов. Куриные эмбрионы дают возможность выделить преадипоциты с самой ранней стадии развития жировой ткани. Эта первичная клетка может быть использована для выявления факторов, влияющих на пролиферацию преадипоцитов и адипогенную дифференцировку, что делает их ценной моделью для исследований, связанных с детским ожирением и контролем избыточного отложения жира у домашней птицы. Быстрый рост постнатальной жировой ткани эффективно истощает корм, распределяя его вдали от роста мышц у цыплят-бройлеров. Таким образом, методы понимания самых ранних стадий развития жировой ткани могут дать подсказки для регулирования этой тенденции и определения способов ограничения расширения жировой ткани в раннем возрасте. Настоящее исследование было разработано для разработки эффективного метода выделения, первичной культуры и адипогенной дифференцировки преадипоцитов, выделенных из развивающейся жировой ткани коммерческих эмбрионов цыплят бройлеров (мясного типа). Процедура была оптимизирована для получения клеток с высокой жизнеспособностью (~ 98%) и повышенной способностью дифференцироваться в зрелые адипоциты. Этот простой метод выделения, культивирования и дифференцировки эмбриональных преадипоцитов поддерживает функциональный анализ роста и развития жиров в раннем возрасте.
Introduction
Ожирение является глобальной угрозой для здоровья как взрослых, так и детей. Дети с избыточным весом или ожирением примерно в пять раз чаще страдают ожирением во взрослом возрасте, что подвергает их значительно повышенному риску сердечно-сосудистых заболеваний, диабета и многих других сопутствующих заболеваний. Около 13,4% американских детей в возрасте 2-5 лет имеют ожирение1, что свидетельствует о том, что тенденция накапливать избыток жира в организме может быть приведена в движение очень рано в жизни. По самым разным причинам накопление избыточной жировой ткани является проблемой для цыплят-бройлеров (мясного типа). Современные бройлеры невероятно эффективны, но все же накапливают больше липидов, чем физиологически необходимо 2,3. Эта тенденция начинается вскоре после вылупления и эффективно растрачивает корм, самый дорогой производственный компонент, выделяя его вдали от роста мышц. Поэтому как для детей, так и для цыплят-бройлеров, хотя и по самым разным причинам, необходимо понимать факторы, влияющие на развитие жировой ткани, и определять способы ограничения жирового расширения в раннем возрасте.
Адипоциты образуются из преадипоцитов, стволовых клеток, полученных из жировой ткани, которые подвергаются дифференцировке для развития зрелых, накапливающих липиды жировых клеток. Соответственно, преадипоциты in vitro являются ценной экспериментальной моделью для исследований ожирения. Эти клетки, выделенные из стромальной сосудистой фракции жировых депо, могут обеспечить фундаментальное понимание молекулярных путей, контролирующих дифференцировку и метаболизм адипоцитов 4,5. Эмбрионы цыплят являются благоприятной экспериментальной моделью в исследованиях развития, потому что культивирование яиц по желаемому графику облегчает экспериментальные манипуляции, поскольку позволяет получить эмбрионы без жертв матери для наблюдения за серией стадий развития эмбрионов. Кроме того, для получения эмбрионов по сравнению с более крупными моделями животных не требуются сложные хирургические процедуры и длительные периоды времени. Поэтому эмбрион цыпленка представляет возможность получения преадипоцитов с самых ранних стадий развития жировой ткани. Подкожная жировая клетчатка становится видимой у птенца около эмбрионального дня 12 (Е12) в виде четко очерченного депо, расположенного вокруг бедра. Это депо обогащено высокопролиферативными преадипоцитами, которые активно подвергаются дифференцировке под сигналами развития с образованием зрелых адипоцитов 6,7. Процесс адипогенной дифференциации сопоставим между курами и человеком. Поэтому преадипоциты, выделенные из эмбрионов цыплят, могут быть использованы в качестве модели двойного назначения для исследований, имеющих отношение к людям и домашней птице. Однако выход преадипоцитов снижается со старением, поскольку клетки вырастают в зрелые адипоциты5.
Настоящий протокол оптимизирует выделение преадипоцитов из жировой ткани на стадии (E16-E18), на которой адипогенная дифференцировка и гипертрофия адипоцитов находятся на пике у эмбрионов цыплят бройлеров8. Эта процедура может оценить влияние факторов, которым развивается эмбрион в ово, таких как диета курицы, на развитие адипоцитов и адипогенный потенциал ex vivo. Он также может проверить влияние различных манипуляций (например, гипоксии, питательных добавок, фармакологических агонистов и антагонистов) на адипогенез или различные «омы» (например, транскриптом, метаболом, метилом) предшественников адипоцитов. Как представление самой ранней стадии образования жиров, клетки, полученные с использованием этого протокола, являются ценными моделями для исследований, относящихся к домашней птице и человеку.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры для животных были одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Университета Теннесси. Свежеоплодотворенные коммерческие яйца бройлеров (Cobb 500) были получены из местного инкубатория. Яйца инкубировали при 38 °C с относительной влажностью 60% до рассечения в эмбриональные дни 16-18 (E16-E18). Жировую ткань собирали из подкожного (бедренного) депо.
1. Подготовка к изоляции и культуре
- Подготовьте культуру и инструменты.
- Перед началом вскрытия установите рабочую зону в ламинарной вытяжке. Продезинфицируйте рабочую зону и все инструменты, обмазав их 70% этанолом. Выполняйте все процедуры с использованием стерильных материалов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда смазывайте контейнеры и инструменты 70% этанолом, прежде чем помещать их обратно в вытяжку для культивирования клеток. Рекомендуется поместить настольный стерилизатор инструментов в капот, чтобы инструменты можно было легко стерилизовать между эмбрионами.
ВНИМАНИЕ: При использовании стерилизатора инструмента охладите горячий инструмент должным образом, чтобы предотвратить ожоговую травму и повреждение тканей. Рекомендуется минимальное время охлаждения 3 мин. Тампон с 70% этанолом перед применением. - Соберите в капоте следующие инструменты и сосуды: прямые щипцы (120 мм), пинцет (110 мм), две пары изогнутых щипцов (100 мм), две пары прямых ножниц (140 мм), изогнутые хирургические ножницы (115 мм), тканевый сетчатый фильтр (250 мкм нейлоновой сетки), клеточный сетчатый фильтр (40 мкм нейлоновой сетки), конические центрифужные трубки (15 мл и 50 мл), чашки Петри (60 мм и 100 мм), маленький стакан (100 мл), 70% этаноловый спрей и стерильная марля, бумажное полотенце и настольный стеклоочиститель (см. Таблицу материалов).
- Перед началом вскрытия установите рабочую зону в ламинарной вытяжке. Продезинфицируйте рабочую зону и все инструменты, обмазав их 70% этанолом. Выполняйте все процедуры с использованием стерильных материалов.
- Подготовьте ферментативный раствор, носители для сбора и питательные вещества, выполнив следующие действия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Заранее подготовьте растворы и храните при температуре 4 °C до использования. Среда должна быть помещена на лед перед сбором тканей. Все реагенты, используемые на этом этапе, перечислены в Таблице материалов.- Готовят среду, используемую как для сбора жировой ткани, так и для приготовления ферментативного раствора путем добавления DMEM/F12 (модифицированная орлиная среда Dulbecco с 2,50 мМ L-глутамина и 15 мМ буфера HEPES) 2,5 мкг/мл амфотерицина B и 1x пенициллина/стрептомицина (P/S), 100 Ед/мл. Хранить при температуре 4 °C до использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот носитель остается стабильным в течение 1 года при хранении при температуре 4 °C. - Готовят стерилизационный раствор, разбавляя бетадин до 20% (v/v) в 1x PBS (фосфатный буферизованный физиологический раствор с рН 7,4, без кальция, магния или фенольного красного цвета) с 2,5 мкг/мл амфотерицина B. Хранить при 4 °C до использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор стабилен в течение 2 лет при хранении при температуре 4 °C. - Готовят ферментативный раствор путем растворения коллагеназы типа 1 (1 мг/мл) в DMEM/F12 с 2,5 мкг/мл амфотерицина B и 1x P/S (этап 1.2.1). Сделайте свежий раствор коллагеназы и выдержите его на льду во время вскрытия. Примерно за 10 мин до использования предварительно подогревают, инкубируя этот раствор при 37 °C на водяной бане, чтобы инициировать его ферментативную активность.
ПРИМЕЧАНИЕ: Приблизительно 1 мл раствора коллагеназы (1 мг/мл) необходим на 100 мг жировой ткани. - Подготовьте питательные среды, используемые для нанесения покрытий и размножения, дополнив среду DMEM/F12 1x P/S и 10% FBS. Хранить при температуре 4 °C до использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор стабилен в течение 1 года при хранении при температуре 4 °C. - Приготовьте моющий раствор, дополнив 1x PBS 2,5 мкг/мл амфотерицина B. Отрегулируйте раствор до желаемого рН 7,4. Хранить при температуре 4 °C до использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор стабилен в течение 2 лет при хранении при температуре 4 °C.
- Готовят среду, используемую как для сбора жировой ткани, так и для приготовления ферментативного раствора путем добавления DMEM/F12 (модифицированная орлиная среда Dulbecco с 2,50 мМ L-глутамина и 15 мМ буфера HEPES) 2,5 мкг/мл амфотерицина B и 1x пенициллина/стрептомицина (P/S), 100 Ед/мл. Хранить при температуре 4 °C до использования.
2. Сбор и переваривание жировой ткани
- Усыплите эмбрион.
- На 16-й день эмбриона выньте яйца из инкубатора. Основным потенциальным источником микробного загрязнения является поверхность яйца; поэтому перед растрескиванием яиц смажьте стерильной марлей, смоченной в 70% этаноле. После тампонирования поместите яйцо вертикально заостренным концом вниз на небольшой стакан (100 мл), выстланный бумажными полотенцами, чтобы смягчить яйцо от стакана.
- Используя ручку щипцов, разбейте яйцо, постукивая тупым концом яйца. Осторожно удалите яичную скорлупу, чтобы создать отверстие, достаточно большое для удаления эмбриона (этап 2.1.3). Осторожно разорвите белую оболочку мембраны, чтобы обнажить эмбрион (рисунок 1А). Осторожно прокалывайте амнион стерильным пинцетом (рисунок 1В).
ПРИМЕЧАНИЕ: Амниотический мешок представляет собой прозрачную мембрану, заполненную амниотической жидкостью, которая окружает эмбрион. - Извлеките эмбрион из яйцеклетки, слегка захватив шею эмбриона с помощью прямых щипцов. Разрежьте желточный мешок, чтобы отсоединить его от эмбриона, и перенесите эмбрион в чашку Петри толщиной 100 мм.
- Обезглавить сразу же с помощью хирургических ножниц и щипцов.
- Выполните сбор жировой ткани.
- Смажьте тело эмбриона 70% этанолом и аккуратно протрите поверхность кожи стерильной марлей, чтобы удалить перья, так как они могут помешать фильтрации на более поздних этапах после пищеварения. Используйте настольные стеклоочистители, чтобы кожа и перья не касались собранной ткани.
- Срежьте кожу между ногами и брюшной областью, чтобы выявить пару бедренных жировых депо.
- Держите кожу вокруг ноги с помощью изогнутых щипцов одной рукой. Осторожно удалите бедренный подкожный жир другой рукой, используя изогнутые щипцы, чтобы аккуратно оттянуть депо от ноги.
ПРИМЕЧАНИЕ: Существует относительно мало соединительной ткани, которая прилипает к жировой подушке к ноге, и вся жировая подушка должна быть удалена в одном куске с использованием только щипцов. Этому можно способствовать, удерживая щипцы назад так, чтобы изогнутые части (а не концы) зажимали жировую подушку для удаления.- При необходимости срежьте жировую подушку изогнутыми ножницами. Повторите с другой жировой подушкой и дополнительными эмбрионами по мере необходимости.
ПРИМЕЧАНИЕ: В общей сложности 80 мг подкожного жира может быть получено из большинства эмбрионов на E16 (рисунок 1C). Это обычно дает ~ 1 х 106 ячеек, достаточных для покрытия одной колбы T-25. На этом этапе может быть полезно взвесить жировые подушечки из нескольких эмбрионов, чтобы оценить количество исходного материала, так как вес жировых подушечек может варьироваться в зависимости от конкретных линий бройлеров и из-за неконтролируемых факторов, таких как возраст заводчика и диета. Подкожный жир обычно собирали из пяти яиц, чтобы обеспечить достаточный выход клеток для покрытия в нескольких колбах.
- При необходимости срежьте жировую подушку изогнутыми ножницами. Повторите с другой жировой подушкой и дополнительными эмбрионами по мере необходимости.
- Переведите ткани в ~5 мл сборных сред в пробирке объемом 15 мл и повторите рассечение оставшихся яйцеклеток.
- Ненадолго промойте собранные жировые прокладки, перенеся их в 60-миллиметровую чашку Петри, содержащую стерилизационный раствор, и несколько раз закрутив посуду.
- Смойте стерилизационный раствор, перенеся жировые прокладки в 60-миллиметровую чашку Петри, содержащую 1x PBS. Осторожно закрутите. Повторите этот шаг, перенеся на вторую 60-миллиметровую чашку Петри, содержащую 1x PBS.
- Выполните ферментативное пищеварение и выделение преадипоцитов, выполнив следующие действия.
- Переложите жировые ткани в пробирку объемом 15 мл, содержащую ~1 мл предварительно подогретого ферментативного раствора на 100 мг ткани. Погрузите пару длинных прямых ножниц в трубку и мелко измельчите жировые ткани в растворе на как можно более мелкие кусочки (~1 мм3) (рисунок 2A).
ПРИМЕЧАНИЕ: Выход клеток будет снижен, если ткани не будут тщательно измельчены. - Переложить измельченную ткань и ферментативный раствор в автоклавную колбу объемом 25 мл. Оберните колбу парафиновой пленкой. Поместите на орбитальный шейкер внутри инкубатора и встряхните при 37 °C на стадии пищеварения.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, используйте встряхивающую водяную баню. При любом приближении скорость должна быть достаточной, чтобы предотвратить оседание кусочков ткани на дно колбы, но не должна быть настолько быстрой, чтобы куски продвигались к верхней части колбы и прилипали к стеклу, или чтобы жидкость накапливалась на крышке парафиновой пленки. - Через ~30 мин отрежьте конец наконечника пипетки объемом 1 мл до диаметра около 3 мм. Пипетка тканевой смеси вверх и вниз несколько раз, чтобы помочь освободить клетки из жировой ткани. Верните колбу в инкубатор/водяную баню и возобновите встряхивание.
- Еще через 15 мин проверьте колбу на полноту пищеварения. После извлечения колбы из шейкера в верхней части слоя жидкости образуется слой беловатых клеток. Если фрагменты ткани все же остались, отрежьте конец от другого кончика пипетки и аккуратно пипеткой смесь вверх и вниз, затем продолжайте встряхивать еще 15 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Полностью переваренная смесь тканей и коллагеназы выглядит как молочный химус. Как правило, ткань достаточно переваривается после 1 ч мягкого встряхивания. Если в этот момент остается много фрагментов, это может указывать на проблему с используемым ферментом коллагеназы. Постоянное встряхивание может увеличить урожайность; однако длительное воздействие фермента и физический стресс также могут повредить клетки. - После переваривания пипетку осторожно вверх и вниз, чтобы хорошо перемешать. Фильтруйте через тканевое ситечко 250 мкм в трубку объемом 15 мл путем пипетки, чтобы удалить любые кусочки непереваренной ткани и мусора.
- Промыть колбу 4 мл питательной среды путем пипетки для удаления клеток, которые могут быть прилипшими к стеклу, и отфильтровать в ту же трубку объемом 15 мл. Промыть ситечко дополнительной питательной средой путем пипетки для ослабления любых захваченных клеток, до общего объема 14 мл.
- Гранулируйте клеточную фракцию центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин при РТ (7 мин на 50 мл пробирки).
ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда смазывайте пробирки 70% этанолом перед возвращением в вытяжку клеточной культуры. - Аспирировать супернатанта. Будьте осторожны, чтобы не выбить ячейку гранулы. Осторожно повторно суспендируют гранулу в 1 мл буфера лизиса эритроцитов (см. Таблицу материалов) путем пипетки вверх и вниз и инкубируют в течение 5 мин при РТ. Раствор станет красноватым, когда красные кровяные клетки будут лизированы (рисунок 2B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите буфер лизиса RBC в RT перед использованием. Куры имеют ядро эритроцитов9, и они прикрепляются к тканевой культуре вместе с преадипоцитами. Буфер лизиса RBC используется для лизирования этих клеток, чтобы предотвратить их вмешательство в точное количество клеток. - Добавьте 5 мл питательной среды в трубку, содержащую клетки, чтобы разбавить буфер лизиса и осторожно перемешать, пипетируя вверх и вниз. Используя пипетку, фильтруйте через клеточный сетчатый фильтр 40 мкм в новую трубку объемом 50 мл и промывайте ситечко дополнительными 5 мл питательной среды.
- Пеллетные ячейки центрифугированием при 300 х г в течение 7 мин при РТ. Осторожно аспирируют супернатант и повторно суспендируют оставшуюся ячейку гранулы в 1 мл питательной среды путем пипетирования вверх и вниз.
- Используйте гемоцитометр, счетчик клеток и пятно Trypan Blue для подсчета клеток и определения жизнеспособности клеток. Взять 10 мкл образца и смешать с 10 мкл трипана синего путем пипетирования. Загрузите 10 мкл смеси на гематоцитометр и измерьте10.
ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость центрифугирования может быть увеличена до 600 х г , если достаточное количество гранул ячейки не видно после первоначального отжима.
- Используйте гемоцитометр, счетчик клеток и пятно Trypan Blue для подсчета клеток и определения жизнеспособности клеток. Взять 10 мкл образца и смешать с 10 мкл трипана синего путем пипетирования. Загрузите 10 мкл смеси на гематоцитометр и измерьте10.
- Переложите жировые ткани в пробирку объемом 15 мл, содержащую ~1 мл предварительно подогретого ферментативного раствора на 100 мг ткани. Погрузите пару длинных прямых ножниц в трубку и мелко измельчите жировые ткани в растворе на как можно более мелкие кусочки (~1 мм3) (рисунок 2A).
3. Посев и посев преадипоцитов
- Семена ~1 х 106 клеток в 4 мл предварительно нагретой питательной среды в колбе Т-25. Соблюдайте ту же плотность покрытия при использовании других типов сосудов для культивирования. Поместите в инкубатор культуры тканей и дайте прикрепить на ночь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки культивируют в инкубаторе с температурой 38 °C с увлажненной атмосферой 5% CO2. Оптимальная температура для роста птичьих клеток11 составляет 38 °C, и они растут медленно при 37 °C. - На следующий день аспирировать среду и аккуратно промыть клетки с 1x PBS путем пипетирования, чтобы удалить неприкрепленные или мертвые клетки. Заменить 4 мл свежих питательных сред. Проверьте клетки под микроскопом. Клетки должны иметь веретенообразную форму, как фибробласты (рисунок 2А).
ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, преадипоциты прикрепляются довольно быстро (в течение нескольких часов). Успех или неудача изоляции клеток может быть подтверждена в это время (через 24 ч). - Заменяйте 4 мл свежих питательных сред каждые 2 дня и субкультурными или криоконсервированными клетками, когда они достигают 70-80% слияния (рисунок 3C).
4. Субкультура и криоконсервация
- Аспирируйте старые носители и аккуратно промывайте ячейки 4 мл 1x PBS путем пипетки. Аспират PBS, добавляют 2 мл 0,1% трипсина для покрытия поверхности клетки в колбе Т-25 (соответствующим образом регулируют объем для других сосудов для культивирования), а затем инкубируют в течение 3-4 мин при 38 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Наблюдайте, отделены ли клетки от культуральной пластины. Осторожно постучите по тарелке культуры, чтобы помочь отслоению клеток. Инкубация клеток с трипсином слишком долго повреждает клетки. - Добавьте эквивалентный объем предварительно нагретой питательной среды, чтобы ингибировать реакцию трипсина. Пипетка над поверхностью ячейки несколько раз, наклоняя пластину, чтобы ослабить оставшиеся ячейки.
- Переложите клеточную суспензию в трубку 15 мл и центрифугу при 300 х г в течение 5 мин при РТ (7 мин на 50 мл пробирки). Аспирировать супернатанта.
- При субкультурации повторно суспендируют гранулы в 1 мл питательной среды путем пипетки вверх и вниз. Подсчитайте ячейки, как описано на этапе 2.3.9.1, а затем перекладывайте, используя ту же плотность покрытия, которая первоначально использовалась на этапе 3.1.
- При криоконсервации подготовьте 4 мл морозильной среды для колбы Т-25 с 90% сливанием.
ПРИМЕЧАНИЕ: Морозильная среда состоит из 10% DMSO, 30% FBS и 60% DMEM/F12. - Повторно суспендировать клеточную гранулу в морозильной среде и перевести 1 мл морозильной среды в криовиальную. Заморозьте криовиалы медленно до -1 °C/мин с помощью морозильного контейнера. Поместите контейнер в морозильную камеру с температурой -80 °C на ночь, а затем переложите его в жидкий азот для длительного хранения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Правильно криоконсервированные преадипоциты сохраняют свою жизнеспособность в течение не менее 3 лет и обычно работают как свежеизолированные клетки при размораживании и покрытии.
5. Адипогенная дифференциация
ПРИМЕЧАНИЕ: 2% пластины с желатиновым покрытием могут быть использованы для усиления адгезии клеток.
- Готовят 2% (мас./об.) раствор желатина (см. Таблицу материалов) в дистиллированной воде. Автоклав при 121 °C, 15 фунтов на кв. дюйм в течение 30 мин для стерилизации. Покрыть поверхность культуры 5-10 мкл раствора желатина/см2 (т.е. 100-200 мкг/см2). Осторожно закрутите, чтобы равномерно покрыть поверхность.
- Проверьте пластины на равномерное распределение раствора желатина, так как некоторые области могут оставаться непокрытыми изначально. Дайте пластине, покрытой желатином, оставаться на RT в течение не менее 1 ч. Удалите весь объем желатинового раствора из лунок.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это оставит тонкий желатиновый слой на дне колодцев / блюд. Раствор желатина можно повторно использовать несколько раз (по меньшей мере, 10 раз) без изменения адгезии и роста клеток. Дайте посуде, покрытой желатином, оставаться в вытяжке для культивирования тканей в течение не менее 30 минут, прежде чем покрывать клетки. - Индуцировать куриные преадипоциты к адипогенной дифференцировке путем дополнения питательных сред жирными кислотами. Для получения адипогенной дифференцировочной среды (АДМ) добавляют DMEM/F12 10% куриной сывороткой, 1x линолевой кислотой-олеиновой кислотой-альбумином (9,4 мкг/мл) и 1x P/S (см. Таблицу материалов). Сделайте АДМ свежим и теплым перед использованием.
ПРИМЕЧАНИЕ: Куриные преадипоциты обычно индуцируются для адипогенной дифференцировки путем дополнения сред жирными кислотами, а не гормональными коктейлями, обычно используемыми для адипоцитов других видов12. - Индуцировать дифференцировку путем замены питательных сред адипогенными дифференцировочными средами, когда клетки достигают ~ 90% слияния. Поддерживайте клетки в этой среде, заменяя их каждые 2 дня. Оцените дифференцировку визуально под микроскопом (20x) на основе образования липидных капель, которые становятся легко видимыми в течение 48 ч после индуцирования дифференцировки.
6. Оценка адипогенеза
- Выполните окрашивание маслом Red O, выполнив следующие действия.
- Обложите клетки шестилуночной пластиной и индуцируйте адипогенную дифференцировку при слиянии ~90%.
- Приготовьте рабочий раствор Oil Red O, объединив шесть частей раствора Oil Red O с четырьмя частями дистиллированной воды в пробирке объемом 50 мл. Осторожно перемешайте, пипеткой вверх и вниз и дайте постоять в течение 10 минут на RT, а затем процедите фильтровальную бумагу класса 1 (см. Таблицу материалов) внутри воронки, медленно налив раствор в трубку объемом 50 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор масла Red O получают путем растворения 0,7 г Oil Red O (см. Таблицу материалов) в 200 мл 100% изопропанола в автоклавном флаконе. Хорошо перемешать и дать постоять 20 мин. Хранить при температуре 4 °C и хранить вдали от света до использования. Это стабильно в течение 1 года. Рабочий раствор можно использовать в течение 3 ч; однако рекомендуется использовать его в течение 2 ч. - Удалите среду и осторожно промыте лунки дважды 2 мл предварительно нагретого 1x PBS с помощью пипетки. Полностью удалите PBS путем пипетки. Зафиксируйте клетки 2 мл 10% буферизованного формалина и оберните пластину парафиновой пленкой. Оставить на РТ не менее чем на 1 ч и до 2 дней до окрашивания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы получить 1 л 10% буферного раствора формалина, смешайте 100 мл 37% формальдегида, 4,09 г2PO4, 6,5 г Na2HPO4 (см. Таблицу материалов) и 900 мл дистиллированной воды. Не пипетка формалина непосредственно на клетки. Аккуратно нанесите на боковину у дна колодца. - Удалите формалин и аккуратно промойте колодцы 2 мл дистиллированной воды. Заменить 2 мл 60% изопропанола. Через 5 мин удалить изопропанол и дать лункам полностью высохнуть около 10 мин. Выполните все этапы окрашивания на RT.
- Добавьте 1 мл рабочего раствора Oil Red O к клеткам и инкубируйте в течение 10-20 мин при RT. Удалите пятно путем пипетки и промойте пять раз, окунув в водопроводную воду, пока не будет видно лишнего пятна. После окончательного ополаскивания добавьте 1 мл воды в клетки перед визуализацией окрашивания и сбора изображений под микроскопом.
- Чтобы количественно оценить накопление липидов на чашку, удалите воду и извлеките краситель Oil Red O из клеток, добавив 1-2 мл 100% изопропанола, который достаточен для полного покрытия клеток в колодце из шестилуночной пластины. Инкубировать с легким встряхиванием на пластинчатом шейкере в течение 10 мин на RT.
- Переложите 200 мкл экстракции в скважину из 96-луночной пробирной пластины. Количественно оцените относительное количество пятна с помощью считывателя пластин спектрофотометра для измерения поглощения при 495 нм.
- Выполняют окрашивание внутриклеточных липидных капель и ядра.
- Пластинчатые ячейки в черных нижних 96-луночных пластинах индуцируют адипогенную дифференцировку, как описано на этапе 5.3.
- Чтобы окрасить клетки, добавьте 200 мкл окрашивающего раствора, содержащего флуоресцентное липидное пятно и флуоресцентное пятно ДНК (см. Таблицу материалов) в 1x PBS на лунку. После расчета общего объема требуемого пятна добавьте две капли пятна ДНК и 25 мкл липидного пятна на мл предварительно нагретого 1x PBS с использованием обернутой фольгой трубки для защиты раствора от света. Инкубировать на RT в течение 20 мин и защищать от света.
- Считывание флуоресценции с помощью флуоресцентного пластинчатого считывателя (см. Таблицу материалов). Обнаружение липидного пятна (Возбуждение: 485 нм/Излучение: 572 нм) с помощью красного фильтра и пятна ДНК (Возбуждение: 359 нм/Излучение: 450 нм) через синий/голубой фильтр.
ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашивание также может быть визуализировано и изображения получены под флуоресцентным микроскопом. - Нормализуйте интенсивность липидных пятен до интенсивности пятен ДНК для количественной оценки накопления липидов относительно клеточного номера13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Первичные преадипоциты морфологически похожи на фибробласты, с неправильными, звездообразными формами и центральным ядром (рисунок 2A-C). Клетки легко прилипают к пластике тканевой культуры и начинают размножаться вскоре после прикрепления. Они быстро дифференцируют и накапливают липидные капли (рисунок 3D) при поступлении жирных кислот в среде. Жизнеспособность (98%, основанная на исключении красителя), о которой сообщается в представленных здесь изоляциях, является типичной. В то время как клетки довольно надежны, агрессивное обращение во время изоляции приводит к повреждению клеток (рисунок 3E), что приводит к образованию клеток, которые плохо прикрепляются и не пролиферируют. Несмотря на процедуры, включенные для предотвращения микробного загрязнения, может происходить перенос нестерильного материала (рисунок 3F). Из-за их быстрой скорости роста преадипоциты эмбриона цыпленка потребляют глюкозу в средах с высокой скоростью. Носители должны меняться каждые 48 часов, чтобы поддерживать их подачу энергии.
Репрезентативные результаты, представленные здесь, иллюстрируют адипогенный потенциал преадипоцитов эмбриона цыпленка. Эти клетки быстро накапливаются для выработки липидных капель в адипогенных условиях, и накопление прогрессирует с течением времени (рисунок 4 и рисунок 5). Были представлены два метода, которые могут быть использованы для лучшей визуализации и количественной оценки степени накопления липидов в этих клетках, что является прямым отражением адипогенеза. Окрашивание липидов маслом Red O является недорогим методом визуализации и количественной оценки накопления липидных капель (рисунок 4). Для сбора изображений используется световой микроскоп, а окрашенные клетки можно держать на столешнице до тех пор, пока не будут собраны изображения. Накопление липидов в каждой чашке клеток может быть количественно определено, как описано, путем извлечения пятна и считывания поглощения при 495 нм с помощью спектрофотометра. Используя комбинацию выбранных липидных и ДНК-пятен, удалось количественно оценить накопление липидов относительно числа клеток, что компенсирует неадипогенные клетки, которые могут сохраняться в культуре (рисунок 5). Если меры принимаются в течение нескольких временных точек (рисунок 5B-C), эта комбинация позволяет оценить как адипогенез, так и пролиферацию, например, в ответ на добавленные гормоны или пептиды.
Рисунок 1: Сбор жировой ткани. (А) При разрушении яичной скорлупы была выявлена белая оболочка скорлупы. (Б) Прокалывание амниона стерильным пинцетом. (C) В общей сложности ~ 80 мг бедренного подкожного жира может быть получено из E16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Фрагменты ткани для ферментативного пищеварения и гранулы клеток после пищеварения. (А) Измельченная жировая ткань в ферментативном растворе (~1 мм3). (B) Стрелки указывают на гранулы клеток после лизиса эритроцитов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Сравнение морфологии клеток изолированных первичных преадипоцитов. (А) Преадипоциты через 24 ч после выделения. (B) Преадипоциты через 48 ч после выделения. (C) Преадипоциты с 80% стечением через 72 ч после выделения. (D) В преадипоцитах после 48 ч адипогенной индукции в проходе 4 видны липидные капли. Вставка указывает на увеличенное изображение липидных капель. (E) Репрезентативное изображение поврежденных клеток. (F) Стрелка указывает на черные плавательные точки в загрязненной культуре. Шкала = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Оценка накопления липидов окрашиванием Oil Red O. (A) Репрезентативные изображения окрашивания Oil Red O преадипоцитов E16 через 24 ч, 48 ч и 72 ч адипогенной дифференцировки ex vivo. Шкала стержней = 100 мкм. (B) Количественная оценка липидных капель, измеренная путем элюирования окрашивания Oil Red O. Значения выражаются как среднее ± SD. a,b,c P < 0,05 односторонним ANOVA с тестом HSD Posthoc Tukey. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Оценка дифференцировки адипоцитов липидным окрашиванием/окрашиванием ДНК. (A) Репрезентативные изображения липидного пятна (красного) и ДНК (синего) окрашивания преадипоцитов E16 через 24 ч, 48 ч и 72 ч адипогенной дифференцировки ex vivo. Шкала баров = 150 мкм. (B) Липидное окрашивание (Возбуждение: 485 нм/Эмиссия: 572 нм) проводили для оценки накопления липидов в дифференцированных преадипоцитах. (C) Окрашивание ДНК (Возбуждение: 359 нм/Излучение: 450 нм) проводили для оценки вариаций в количестве клеток. D) Соотношение липидного и ДНК-пятен. Накопление липидов нормализуется до содержания ДНК. Значения выражаются как среднее ± SD. a,b,c P < 0,05 односторонним ANOVA с тестом HSD Posthoc Tukey. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Возраст (n=) | x106 клеток/100 мг ткани | Жизнеспособность (%) |
| Е12 (4) | 0.97 ± 0.115 a,b | 98.5 ± 0.58 a |
| Е14 (4) | 1.22 ± 0.232 a,b | 98.3 ± 0.96 a,b |
| Е16 (21) | 1.61 ± 1.717 а | 97.6 ± 1.58 a |
| Е17 (4) | 0.81 ± 0.282 a,b | 96.8 ± 2.63 a,b |
| Е18 (7) | 0,72 ± 0,611 а,b | 95.9 ± 1.81 a,b |
| Е20 (4) | 0.94 ± 0.171 a,b | 97.8 ± 0.8 a,b |
| Д4 (9) | 0,24 ± 0,164 а,b | 93.6 ± 4.28 b |
| Д5 (4) | 0.25 ± 0.073 a,b | 98.5 ± 0.71 a,b |
| Д7 (10) | 0,17 ± 0,162 б | 96.8 ± 3.49 a,b |
| Д14 (4) | 0.25 ± 0.051 a,b | 99.0 ± 0.00 a,b |
Таблица 1: Среднее количество клеток и жизнеспособность изолированных клеток эмбриональных и поствылупившихся птенцов.
Значения выражаются как среднее ± SD. a,b P < 0,05 односторонним ANOVA с тестом HSD Posthoc Tukey.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хотя в нескольких хорошо описанных протоколах сообщалось об выделении преадипоцитов 14,15,16,17, изоляция для эмбриональных преадипоцитов была оптимизирована, что может быть использовано для функционального анализа роста и развития жира в раннем возрасте у цыплят бройлеров. Этот протокол дает высокожизнеспособные предшественники эмбриональных адипоцитов с высоким потенциалом дифференцировки. Более того, представленная процедура выделения преадипоцитов не ограничивается эмбрионами, а может быть использована у птенцов после вылупления. Тем не менее, он был оптимизирован для использования с эмбрионами E16, и выходы птенцов после вылупления значительно ниже (таблица 1), вероятно, из-за увеличения относительного количества соединительной ткани по мере быстрого роста цыплят.
Успех изоляции клеток в конечном итоге оценивается путем наблюдения за формой и количеством прикрепленных клеток (рисунок 3А). Низкое количество клеток или поврежденные клетки могут наблюдаться, когда тканевые фракции перевариваются слишком долго, особенно когда диссоциация тканей прогрессирует более 1,5 ч (рисунок 3E). Поэтому рекомендуется не превышать 1,5 ч пищеварения. С другой стороны, если фрагмент ткани остается четко после часа пищеварения, время пищеварения или количество должно быть увеличено. Полученное количество жировой ткани также может варьироваться в зависимости от генетического штамма курицы. Если этот протокол используется для изоляции клеток других возрастов или видов, как количество коллагеназы, так и время пищеварения, вероятно, должны быть изменены.
Общим ограничением первичной клеточной культуры является то, что изолированные клетки начинают терять адипогенный потенциал после нескольких проходов в культуре; таким образом, важно индуцировать дифференцировку в течение нескольких дней после выделения, чтобы эмбриональные преадипоциты не теряли свою адипогенную способность. Адипогенные предшественники эмбрионов легко дифференцируются в зрелые адипоциты в описанной выше среде композиции, без необходимости слияния или гормональной индукции. Клетки до прохождения 4 (10-14 дней) легко дифференцируются в течение 48 ч после индукции (рисунок 3D).
Контроль клеточного загрязнения в первичной клеточной культуре является еще одной проблемой, где грибковое загрязнение является наиболее распространенным. Применение амфотерицина В, как описано, в целом эффективно для предотвращения роста грибков18,19. Он может быть включен в низких концентрациях в питательных средах без заметного влияния на жизнеспособность или адипогенный потенциал. Неидентифицируемые микробные загрязнители наблюдались в виде черных плавательных точек, появляющихся через несколько дней после изоляции клеток (рисунок 3F). Они отрицательно влияли на рост клеток и были невозможны для удаления после того, как эта инфекция произошла20. Были ли эти загрязнители неизвестными микробными видами, обнаруженными в яйцах или на них, или возникли из другого источника, неизвестно. Этот протокол пытается свести к минимуму риск загрязнения путем асептического извлечения эмбрионов из яйцеклетки21. Использование стерилизатора инструментов на тепловой основе в вытяжке во время рассечения также помогает свести к минимуму вероятность загрязнения, особенно при рассечении нескольких эмбрионов.
Одним из соображений в этом процессе является снижение адгезии клеток к тканевой культуральной пластине во время дифференцировки, в результате физических изменений по мере того, как клетки образуют и расширяют липидные капли. Хотя липидные капли содержатся в клетках, они плавучие и, когда они большие, по-видимому, действуют как баллоны, которые, как правило, способствуют подъему клеток с поверхности. Таким образом, следует проявлять осторожность при обращении с преадипоцитами при индуцировании дифференцировки, и особенно при оценке адипогенеза. Хотя протокол, представленный здесь, не изменяет поверхность культуры, клеточная адгезия может быть усилена при покрытии клеток на чашках, покрытых 2% желатином. Также важно подтвердить, что рН моющих растворов составляет 7,4 и использовать предварительно подогретый раствор PBS при промывке клеток и смешивании с пятном ДНК для уменьшения холодового стресса.
Используя несколько эмбрионов, достаточное количество клеток может быть выделено для получения экспериментальных реплик без необходимости многократных проходов, расширения и риска потери клетками своего адипогенного потенциала. РНК может быть легко выделена как из пред-, так и из дифференцированных адипоцитов эмбриона цыпленка, выделенных с использованием фенол- или мембранных коммерческих методов для исследований экспрессии генов. Достаточная РНК может быть получена из одной лунки шестилуночной пластины для использования в синтезе кДНК и последующем qPCR или RNAseq.
Таким образом, доступность жировых депо в эмбрионе цыпленка для выделения клеточной модели очень актуальна как для домашней птицы, так и для человека. Этот протокол относительно прост в выполнении, и он дает высокий процент жизнеспособных клеток, которые могут быть легко индуцированы для прохождения адипогенной дифференцировки in vitro. Оплодотворенные куриные яйца могут быть получены из различных коммерческих источников с минимальными затратами, что делает эти клетки легкодоступной моделью для практического использования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы благодарят UT AgResearch и Департамент наук о животных за поддержку и оптимизацию этого протокола. Эта работа финансировалась за счет гранта Министерства сельского хозяйства США.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Pipette | Eppendorf | Z683825 | Single Channel Pipette, 100 - 1000 µL |
| 1 mL Pipette Tip | Fisher Scientific | 02-707-402 | |
| 100% Isopropanol | Fisher Scientific | A426P4 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010023 | |
| 25 mL Flask | Pyrex | 4980-25 | |
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | F75P-1GAL | |
| 6-Well Plate | Falcon | 353046 | Tissue Culture-treated |
| 96-Well Assay Plate | Costar | 3632 | |
| 96-Well Plate, Black Bottom | Costar | 3603 | Tissue Culture-treated |
| AdipoRed | Lonza | PT-7009 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290026 | |
| Bench Top Wiper (Kimtechwiper) | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Betadine | Up & Up | NDC 1167300334 | 20% Working Solution |
| Cell Counter | Corning | 6749 | |
| Cell Strainer, 40 µm | SPL | 93040 | |
| Centrifugaton | Eppendorf | 5702 | |
| Chicken Serum | Gibco | 16110082 | |
| Conical Centrifuge Tubes, 15 mL | VWR | 10025-690 | |
| Conical Centrifuge Tubes, 50 mL | Falcon | 352098 | |
| Cryovial | Nunc | 343958 | |
| Curved Forceps, 100 mm | Roboz Surgical | RS-5137 | |
| Curved Surgical Scissors, 115 mm | Roboz Surgical | RS-6839 | |
| Distilled Water | Millipore | SYNSV0000 | Despensed as needed |
| DMEM/F12 | HyClone | SH30023.01 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | 70% Working Solution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10437028 | |
| Fluorescent Microscope | EVOS | M7000 | |
| Fluorescent Plate Reader | Biotek | Synergy H1 | |
| Foil | Reynolds | Reynolds Wrap Heavy Duty Aluminum Foil, 125 SQ. FT. | |
| Freezing Container | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| Gelatin | Millipore | 4055 | 2% Working Solution |
| Hematocytometer (Counting Chamber) | Corning | 480200 | 0.1 mm deep |
| Incubator | Fisher Scientific | 6845 | |
| Instrument Sterilizer | VWR | B1205 | |
| Linoleic Acid-Oleic Acid-Albumin | Sigma | L9655 | 1x Working Solution |
| Microscope | Evos | AMEX1000 | |
| Multi-Channel Pipette | Thermo Scientific | 4661070 | 12-Channel Pipetters, 30 - 300 µL |
| Na2HPO4 | Sigma | S-7907 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S-3139 | |
| NucBlue | Invitrogen | R37605 | |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | |
| Orbital Shaker | IKA | KS130BS1 | |
| Paper Towel | Tork | RK8002 | |
| Parafilm | Parafilm M | PM996 | |
| Penicillin/Steptomycin (P/S) | Gibco | 15140122 | 1x Working Solution |
| Petri dishes, 100 mm | Falcon | 351029 | |
| Petri dishes, 60 mm | Falcon | 351007 | |
| Plate Shaker | VWR | 200 | |
| RBC Lysis Buffer | Roche | 11814389001 | |
| Reagent Reservior | VWR | 89094-680 | |
| Small Beaker, 100 mL | Pyrex | 1000-100 | |
| Spectrophotometer Plate Reader | Biotek | Synergy H1 | |
| Sterile Gauze | McKesson | 762703 | |
| Straight Forceps, 120 mm | Roboz Surgical | RS-4960 | |
| Straight Scissors, 140 mm | Roboz Surgical | RS-6762 | |
| T-25 Flask | Corning | 430639 | Tissue Culture-treated |
| Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Tissue Strainer, 250 µm | Pierce | 87791 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250061 | |
| Trypsin | Gibco | 15400054 | 0.1% Working Solution |
| Tweezers, 110 mm | Roboz Surgical | RS-5035 | |
| Type 1 Collagenase | Gibco | 17100017 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | 15-462-10 | |
| Whatman Grade 1 Filter Paper | Whatman | 1001-110 |
References
- Fryar, C. D., Carroll, M. D., Ogden, C. L. Prevalence of overweight, obesity, and severe obesity among children and adolescents aged 2-19 years: United States, 1963-1965 through 2015-2016. , (2018).
- Siegel, P. B. Evolution of the modern broiler and feed efficiency. Annual Review of Animal Biosciences. 2 (1), 375-385 (2014).
- Zuidhof, M. J., Schneider, B. L., Carney, V. L., Korver, D., Robinson, F. Growth, efficiency, and yield of commercial broilers from 1957, 1978, and 2005. Poultry Science. 93 (12), 2970-2982 (2014).
- Poulos, S. P., Dodson, M. V., Hausman, G. J. Cell line models for differentiation: preadipocytes and adipocytes. Experimental Biology and Medicine. 235 (10), 1185-1193 (2010).
- Vilaboa, S. D. -A., Navarro-Palou, M., Llull, R. Age influence on stromal vascular fraction cell yield obtained from human lipoaspirates. Cytotherapy. 16 (8), 1092-1097 (2014).
- Speake, B. K., Noble, R. C., McCartney, R. J. Tissue-specific changes in lipid composition and lipoprotein lipase activity during the development of the chick embryo. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Lipids and Lipid Metabolism. 1165 (3), 263-270 (1993).
- Chen, P., Suh, Y., Choi, Y. M., Shin, S., Lee, K. Developmental regulation of adipose tissue growth through hyperplasia and hypertrophy in the embryonic Leghorn and broiler. Poultry Science. 93 (7), 1809-1817 (2014).
- Farkas, K., Ratchford, I. A., Noble, R. C., Speake, B. K. Changes in the size and docosahexaenoic acid content of adipocytes during chick embryo development. Lipids. 31 (3), 313-321 (1996).
- Claver, J. A., Quaglia, A. I. Comparative morphology, development, and function of blood cells in nonmammalian vertebrates. Journal of Exotic Pet Medicine. 18 (2), 87-97 (2009).
- Corning Cell Counter Demo Video. , Available from: https://www.youtube.com/watch?v=JWjckEHO6Wg (2022).
- Nema, R., Khare, S. An animal cell culture: Advance technology for modern research. Advances in Bioscience and Biotechnology. 3 (3), 219-226 (2012).
- Regassa, A., Kim, W. K. Effects of oleic acid and chicken serum on the expression of adipogenic transcription factors and adipogenic differentiation in hen preadipocytes. Cell Biology International. 37 (9), 961-971 (2013).
- Temkin, A. M. Effects of crude oil/dispersant mixture and dispersant components on PPAR γ activity in vitro and in vivo: identification of dioctyl sodium sulfosuccinate (DOSS; CAS# 577-11-7) as a probable obesogen. Environmental Health Perspectives. 124, 112-119 (2016).
- Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. Adipose Tissue Protocols. , Springer. 201-219 (2008).
- Lee, M. J., Wu, Y., Fried, S. K. A modified protocol to maximize differentiation of human preadipocytes and improve metabolic phenotypes. Obesity. 20 (12), 2334-2340 (2012).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).
- Akbar, N., Pinnick, K. E., Paget, D., Choudhury, R. P. Isolation and characterization of human adipocyte-derived extracellular vesicles using filtration and ultracentrifugation. Journal of Visualized Experiments. (170), e61979 (2021).
- Perlman, D., Giuffre, N. A., Brindle, S. A. Use of Fungizone in control of fungi and yeasts in tissue culture. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 106 (4), 880-883 (1961).
- Kuhlmann, I. The prophylactic use of antibiotics in cell culture. Cytotechnology. 19 (2), 95-105 (1995).
- Yang, X., et al. Black swimming dots in cell culture: the identity, detection method and judging criteria. bioRxiv. , 366906 (2018).
- Freshney, R. I. Culture of animal cells: a manual of basic technique and specialized applications. , John Wiley & Sons. 163-186 (2015).
