Summary
Le présent protocole décrit une méthode simple pour isoler les préadipocytes du tissu adipeux dans les embryons de poulets de chair. Cette méthode permet l’isolement avec un rendement élevé, la culture primaire et la différenciation adipogénique des préadipocytes. La coloration à l’huile Red O et la coloration lipidique/ADN ont mesuré la capacité adipogénique des cellules isolées induites par des milieux de différenciation.
Abstract
Les préadipocytes primaires sont un système expérimental précieux pour comprendre les voies moléculaires qui contrôlent la différenciation et le métabolisme des adipocytaires. Les embryons de poulet offrent la possibilité d’isoler les préadipocytes dès le stade le plus précoce du développement adipeux. Cette cellule primaire peut être utilisée pour identifier les facteurs influençant la prolifération des préadipoocytes et la différenciation adipogénique, ce qui en fait un modèle précieux pour les études liées à l’obésité infantile et au contrôle des dépôts de graisse excessifs chez la volaille. La croissance rapide du tissu adipeux postnatal gaspille efficacement les aliments en les allouant loin de la croissance musculaire chez les poulets de chair. Par conséquent, les méthodes permettant de comprendre les premiers stades du développement du tissu adipeux peuvent fournir des indices pour réguler cette tendance et identifier des moyens de limiter l’expansion adipeuse tôt dans la vie. La présente étude a été conçue pour développer une méthode efficace d’isolement, de culture primaire et de différenciation adipogénique des préadipocytes isolés du développement du tissu adipeux d’embryons de poussins de poulets de chair commerciaux (type viande). La procédure a été optimisée pour produire des cellules avec une viabilité élevée (~ 98%) et une capacité accrue à se différencier en adipocytes matures. Cette méthode simple d’isolement, de culture et de différenciation des préadipocytes embryonnaires soutient les analyses fonctionnelles de la croissance et du développement des graisses au début de la vie.
Introduction
L’obésité est une menace pour la santé mondiale des adultes et des enfants. Les enfants en surpoids ou obèses sont environ cinq fois plus susceptibles d’être obèses à l’âge adulte, ce qui les expose à un risque considérablement accru de maladie cardiovasculaire, de diabète et de nombreuses autres comorbidités. Environ 13,4% des enfants américains âgés de 2 à 5 ans souffrent d’obésité1, ce qui illustre que la tendance à accumuler un excès de graisse corporelle peut être déclenchée très tôt dans la vie. Pour des raisons très différentes, l’accumulation d’excès de tissu adipeux est une préoccupation pour les poulets de chair (type viande). Les poulets de chair modernes sont incroyablement efficaces, mais accumulent toujours plus de lipides que ce qui est physiologiquement nécessaire 2,3. Cette tendance commence peu de temps après l’éclosion et gaspille efficacement les aliments, le composant de production le plus coûteux, en les allouant loin de la croissance musculaire. Par conséquent, tant pour les enfants que pour les poulets de chair, bien que pour des raisons très différentes, il est nécessaire de comprendre les facteurs qui influencent le développement du tissu adipeux et d’identifier des moyens de limiter l’expansion adipeuse tôt dans la vie.
Les adipocytes se forment à partir de préadipocytes, des cellules souches dérivées du tissu adipeux qui subissent une différenciation pour développer des cellules graisseuses matures stockant les lipides. En conséquence, les préadipocytes in vitro sont un modèle expérimental précieux pour les études sur l’obésité. Ces cellules, isolées de la fraction vasculaire stromale des dépôts adipeux, peuvent fournir une compréhension fondamentale des voies moléculaires contrôlant la différenciation et le métabolisme des adipocytaires 4,5. Les embryons de poussins sont un modèle expérimental favorable dans les études de développement, car la culture des œufs selon le calendrier souhaité facilite la manipulation expérimentale, car elle permet d’obtenir des embryons sans le sacrifice de la mère pour observer une série de stades de développement des embryons. De plus, des procédures chirurgicales compliquées et de longues périodes de temps ne sont pas nécessaires pour obtenir des embryons par rapport à des modèles animaux plus grands. Par conséquent, l’embryon de poussin présente une opportunité d’obtenir des préadipocytes dès les premiers stades du développement du tissu adipeux. Le tissu adipeux sous-cutané devient visible chez le poussin vers le jour embryonnaire 12 (E12) comme un dépôt clairement défini situé autour de la cuisse. Ce dépôt est enrichi en préadipocytes hautement prolifératifs qui subissent activement une différenciation sous les signaux de développement pour former des adipocytes matures 6,7. Le processus de différenciation adipogène est comparable entre les poulets et les humains. Par conséquent, les préadipocytes isolés à partir d’embryons de poussins peuvent être utilisés comme modèle à double usage pour des études pertinentes pour les humains et la volaille. Cependant, le rendement des préadipocytes diminue avec le vieillissement à mesure que les cellules se développent en adipocytes matures5.
Le présent protocole optimise l’isolement des préadipocytes du tissu adipeux au cours du stade (E16-E18) auquel la différenciation adipogénique et l’hypertrophie adipocytaire sont à leur apogée chez les embryons de poussins de poulet de chair8. Cette procédure peut évaluer les effets des facteurs auxquels l’embryon en développement est exposé in ovo, tels que le régime alimentaire de la poule, sur le développement des adipocytes et le potentiel adipogène ex vivo. Il peut également tester l’impact de diverses manipulations (par exemple, l’hypoxie, les ajouts de nutriments, les agonistes pharmacologiques et les antagonistes) sur l’adipogenèse ou les divers 'omes (par exemple, transcriptome, métabolome, méthylome) des progéniteurs adipocytaires. En tant que représentation du stade le plus précoce de la formation adipeuse, les cellules obtenues à l’aide de ce protocole sont des modèles précieux pour les études pertinentes pour la volaille et les humains.
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Protocol
Toutes les procédures animales ont été approuvées par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université du Tennessee. Des œufs de poulet de chair commerciaux fraîchement fécondés (Cobb 500) ont été obtenus dans un couvoir local. Les œufs ont été incubés à 38 °C avec une humidité relative de 60 % jusqu’à dissection aux jours embryonnaires 16-18 (E16-E18). Le tissu adipeux a été prélevé dans le dépôt sous-cutané (fémoral).
1. Préparation à l’isolement et à la culture
- Préparez la culture et les instruments.
- Avant de commencer les dissections, installez une zone de travail dans la hotte à écoulement laminaire. Désinfectez la zone de travail et tous les instruments en tamponnant avec de l’éthanol à 70%. Effectuer toutes les procédures en utilisant des matériaux stériles.
REMARQUE: Toujours écouvillonner les récipients et les instruments avec de l’éthanol à 70% avant de les replacer dans la hotte de culture cellulaire. Il est recommandé de placer un stérilisateur d’instruments de paillasse dans le capot afin que les instruments puissent être facilement stérilisés entre les embryons.
ATTENTION: Lorsque vous utilisez un stérilisateur d’instrument, refroidissez correctement l’instrument chaud pour éviter les brûlures et les lésions tissulaires. Un temps de refroidissement minimum de 3 min est recommandé. Écouvillon avec de l’éthanol à 70% avant utilisation. - Assemblez les instruments et récipients suivants dans le capot: pinces droites (120 mm), pinces à épiler (110 mm), deux paires de pinces incurvées (100 mm), deux paires de ciseaux droits (140 mm), ciseaux chirurgicaux incurvés (115 mm), passoire à tissu (maille en nylon de 250 μm), crépine à cellules (maille en nylon de 40 μm), tubes centrifuges coniques (15 mL et 50 mL), boîtes de Petri (60 mm et 100 mm), petit bécher (100 mL), pulvérisation d’éthanol à 70 % et gaze stérile, serviette en papier et essuie-glace de paillasse (voir tableau des matériaux).
- Avant de commencer les dissections, installez une zone de travail dans la hotte à écoulement laminaire. Désinfectez la zone de travail et tous les instruments en tamponnant avec de l’éthanol à 70%. Effectuer toutes les procédures en utilisant des matériaux stériles.
- Préparez la solution enzymatique, les supports de collecte et les supports de culture en suivant les étapes ci-dessous.
REMARQUE: Préparer les solutions à l’avance et conserver à 4 °C jusqu’à utilisation. Les supports doivent être placés sur de la glace avant le prélèvement de tissus. Tous les réactifs utilisés à cette étape sont répertoriés dans le tableau des matériaux.- Préparer les milieux utilisés à la fois pour la collecte du tissu adipeux et la préparation de la solution enzymatique en complétant le DMEM/F12 (milieu Eagle modifié de Dulbecco avec 2,50 mM de L-glutamine et 15 mM de tampon HEPES) avec 2,5 μg/mL d’amphotéricine B et 1x pénicilline/streptomycine (P/S), 100 U/mL. Conserver à 4 °C jusqu’à utilisation.
REMARQUE: Ce support reste stable pendant 1 an lorsqu’il est stocké à 4 ° C. - Préparer la solution de stérilisation en diluant la bétadine à 20 % (v/v) dans 1x PBS (solution saline tamponnée au phosphate ayant un pH de 7,4, sans rouge de calcium, de magnésium ou de phénol) avec 2,5 μg/mL d’amphotéricine B. Conserver à 4 °C jusqu’à utilisation.
REMARQUE: La solution est stable pendant 2 ans lorsqu’elle est stockée à 4 ° C. - Préparer une solution enzymatique en dissolvant la collagénase de type 1 (1 mg/mL) dans du DMEM/F12 avec 2,5 μg/mL d’amphotéricine B et 1x P/S (étape 1.2.1). Faites une solution de collagénase fraîche et maintenez-la sur de la glace pendant les dissections. Environ 10 min avant utilisation, préchauffer en incubant cette solution à 37 °C au bain-marie pour initier son activité enzymatique.
REMARQUE: Environ 1 mL de solution de collagénase (1 mg / mL) est nécessaire pour 100 mg de tissu adipeux. - Préparer les milieux de croissance utilisés pour le placage et la propagation en complétant les milieux DMEM/F12 avec 1x P/S et 10% FBS. Conserver à 4 °C jusqu’à utilisation.
REMARQUE: La solution est stable pendant 1 an lorsqu’elle est stockée à 4 ° C. - Préparer la solution de lavage en complétant 1x PBS avec 2,5 μg/mL d’amphotéricine B. Ajuster la solution au pH souhaité de 7,4. Conserver à 4 °C jusqu’à utilisation.
REMARQUE: La solution est stable pendant 2 ans lorsqu’elle est stockée à 4 ° C.
- Préparer les milieux utilisés à la fois pour la collecte du tissu adipeux et la préparation de la solution enzymatique en complétant le DMEM/F12 (milieu Eagle modifié de Dulbecco avec 2,50 mM de L-glutamine et 15 mM de tampon HEPES) avec 2,5 μg/mL d’amphotéricine B et 1x pénicilline/streptomycine (P/S), 100 U/mL. Conserver à 4 °C jusqu’à utilisation.
2. Collecte et digestion des tissus adipeux
- Euthanasier l’embryon.
- Le jour embryonnaire 16, retirez les œufs de l’incubateur. La principale source potentielle de contamination microbienne est la surface de l’œuf; par conséquent, écouvillonnez les œufs avec une gaze stérile imbibée d’éthanol à 70% avant de les craquer. Après l’écouvillonnage, placez l’œuf verticalement avec l’extrémité pointue vers le bas sur un petit bécher (100 ml) tapissé d’essuie-tout pour amortir l’œuf du verre.
- À l’aide de la poignée de la pince, cassez un œuf en tapotant l’extrémité émoussée de l’œuf. Retirez soigneusement la coquille d’œuf pour créer une ouverture suffisamment grande pour retirer l’embryon (étape 2.1.3). Déchirez doucement la membrane blanche de la coquille pour exposer l’embryon (Figure 1A). Percer soigneusement l’amnion à l’aide d’une pince à épiler stérile (Figure 1B).
REMARQUE: Le sac amniotique est une membrane transparente remplie de liquide amniotique qui entoure l’embryon. - Retirez l’embryon de l’œuf en saisissant légèrement le cou de l’embryon à l’aide d’une pince droite. Coupez le sac vitellin pour le déconnecter de l’embryon et transférez l’embryon dans une boîte de Petri de 100 mm.
- Décapiter immédiatement à l’aide de ciseaux chirurgicaux et de pinces.
- Effectuer la collecte de tissu adipeux.
- Écouvillonnez le corps de l’embryon avec 70% d’éthanol et frottez doucement la surface de la peau avec une gaze stérile pour enlever les plumes, car elles peuvent interférer avec la filtration à des étapes ultérieures après la digestion. Utilisez des essuie-glaces de paillasse pour empêcher la peau et les plumes de toucher les tissus collectés.
- Coupez la peau entre les jambes et la région abdominale pour révéler la paire de dépôts adipeux fémoraux.
- Tenez la peau autour de la jambe à l’aide d’une pince incurvée d’une seule main. Retirez doucement la graisse sous-cutanée fémorale avec l’autre main, à l’aide d’une pince incurvée pour éloigner doucement le dépôt de la jambe.
REMARQUE: Il y a relativement peu de tissu conjonctif qui adhère au coussinet adipeux à la jambe, et l’ensemble du coussinet adipeux doit être amovible en une seule pièce en utilisant uniquement des pinces. Cela peut être facilité en maintenant la pince vers l’arrière afin que les parties incurvées (plutôt que les extrémités) serrent le coussinet de graisse pour l’enlever.- Si nécessaire, coupez le tampon de graisse avec des ciseaux incurvés. Répétez avec l’autre coussinet de graisse et des embryons supplémentaires au besoin.
REMARQUE: Un total de 80 mg de graisse sous-cutanée peut être obtenu à partir de la plupart des embryons à E16 (Figure 1C). Cela donne généralement ~ 1 x 106 cellules, suffisant pour plaquer une fiole T-25. Il pourrait être utile à cette étape de peser les coussinets de graisse de quelques embryons pour évaluer la quantité de matière première, car le poids des coussinets de graisse peut varier d’une lignée de poulets de chair spécifique et en raison de facteurs incontrôlables, tels que l’âge et le régime alimentaire des poules reproductrices. La graisse sous-cutanée était systématiquement prélevée sur cinq œufs afin d’assurer un rendement adéquat en cellules pour le placage dans plusieurs flacons.
- Si nécessaire, coupez le tampon de graisse avec des ciseaux incurvés. Répétez avec l’autre coussinet de graisse et des embryons supplémentaires au besoin.
- Transférer les tissus dans environ 5 mL de milieux de collecte dans un tube de 15 mL et répéter la dissection pour les œufs restants.
- Rincez brièvement les coussinets de graisse collectés en les transférant dans une boîte de Petri de 60 mm contenant une solution de stérilisation et en faisant tourbillonner le plat plusieurs fois.
- Rincez la solution de stérilisation en transférant les tampons graisseux dans une boîte de Petri de 60 mm contenant 1x PBS. Tourbillonnez doucement. Répétez cette étape en transférant dans une deuxième boîte de Petri de 60 mm contenant 1x PBS.
- Effectuez la digestion enzymatique et l’isolement des préadipocytes en suivant les étapes ci-dessous.
- Transférer les tissus adipeux dans un tube de 15 mL contenant environ 1 mL de solution enzymatique préchauffée pour 100 mg de tissu. Immerger une paire de longs ciseaux droits dans le tube et hacher finement les tissus adipeux de la solution en aussi petits morceaux que possible (~1 mm3) (Figure 2A).
REMARQUE: Le rendement cellulaire sera réduit si les tissus ne sont pas complètement hachés. - Transférer le tissu haché et la solution enzymatique dans une fiole autoclavée de 25 mL. Envelopper la fiole avec un film de paraffine. Placer sur un agitateur orbital à l’intérieur d’un incubateur et agiter à 37 °C pendant l’étape de digestion.
REMARQUE: Vous pouvez également utiliser un bain-marie secouant. Avec l’une ou l’autre approche, la vitesse doit être suffisante pour empêcher les morceaux de tissu de se déposer au fond de la fiole, mais ne doit pas être si rapide que les morceaux sont propulsés vers le haut de la fiole et collent au verre, ou que le liquide s’accumule sur le couvercle du film de paraffine. - Après ~30 min, couper l’extrémité d’une pointe de pipette de 1 mL à un diamètre d’environ 3 mm. Pipettez le mélange de tissus de haut en bas plusieurs fois pour aider à libérer les cellules du tissu adipeux. Remettre la fiole dans l’incubateur/bain-marie et reprendre l’agitation.
- Après 15 minutes supplémentaires, vérifiez l’exhaustivité de la digestion dans la fiole. Après avoir retiré la fiole du shaker, une couche de cellules blanchâtres se formera au sommet de la couche de liquide. S’il reste encore des fragments de tissu, coupez l’extrémité d’une autre pointe de pipette et pipettez doucement le mélange de haut en bas, puis continuez à agiter pendant 15 minutes supplémentaires.
REMARQUE: Le mélange de tissus / collagénases complètement digéré ressemble à du chyme laiteux. En règle générale, les tissus sont suffisamment digérés après 1 h de secousses douces. S’il reste de nombreux fragments à ce stade, cela peut indiquer un problème avec l’enzyme collagénase utilisée. Une secousse constante peut augmenter le rendement; cependant, une exposition prolongée à l’enzyme et le stress physique peuvent également endommager les cellules. - Après la digestion, pipetter doucement de haut en bas pour bien mélanger. Filtrer à travers une passoire tissulaire de 250 μm dans un tube de 15 mL par pipetage pour éliminer les morceaux de tissu non digéré et les débris.
- Rincez la fiole avec 4 mL de milieu de croissance par pipetage pour éliminer les cellules qui peuvent adhérer au verre et filtrez dans le même tube de 15 mL. Rincez la passoire avec un milieu de croissance supplémentaire par pipetage pour desserrer les cellules piégées, jusqu’à un volume total de 14 mL.
- Pastillez la fraction cellulaire par centrifugation à 300 x g pendant 5 min à RT (7 min pour un tube de 50 mL).
REMARQUE: Toujours écouvillonner les tubes avec 70% d’éthanol avant de retourner à la hotte de culture cellulaire. - Aspirer le surnageant. Veillez à ne pas déloger la pastille de cellule. Remettre doucement la pastille dans 1 mL de tampon de lyse des globules rouges (voir Tableau des matériaux) en pipetant de haut en bas, et incuber pendant 5 min à TA. La solution deviendra rougeâtre à mesure que les globules rouges seront lysés (Figure 2B).
REMARQUE: Placez le tampon de lyse RBC à RT avant utilisation. Les poulets ont nucléé les globules rouges9, et ils se fixent à des boîtes de culture tissulaire avec des préadipocytes. Le tampon de lyse RBC est utilisé pour lyser ces cellules afin d’éviter qu’elles n’interfèrent avec un nombre précis de cellules. - Ajouter 5 mL de milieu de croissance au tube contenant les cellules pour diluer le tampon de lyse et mélanger doucement en pipetant de haut en bas. À l’aide d’une pipette, filtrer à travers une passoire cellulaire de 40 μm dans un nouveau tube de 50 mL et rincer la crépine avec 5 mL supplémentaires de milieu de croissance.
- Cellules à granulés par centrifugation à 300 x g pendant 7 min à RT. Aspirer soigneusement le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule restante dans 1 mL de milieu de croissance en pipetant de haut en bas.
- Utilisez un hémocytomètre, un compteur de cellules et une coloration Trypan Blue pour compter les cellules et déterminer la viabilité cellulaire. Prélever 10 μL d’échantillon et mélanger avec 10 μL de Trypan Blue par pipetage. Chargez 10 μL du mélange sur l’hématocytomètre et mesurez10.
REMARQUE: Les vitesses de centrifugation peuvent être augmentées à 600 x g si suffisamment de pastilles de cellules ne sont pas facilement visibles après la rotation initiale.
- Utilisez un hémocytomètre, un compteur de cellules et une coloration Trypan Blue pour compter les cellules et déterminer la viabilité cellulaire. Prélever 10 μL d’échantillon et mélanger avec 10 μL de Trypan Blue par pipetage. Chargez 10 μL du mélange sur l’hématocytomètre et mesurez10.
- Transférer les tissus adipeux dans un tube de 15 mL contenant environ 1 mL de solution enzymatique préchauffée pour 100 mg de tissu. Immerger une paire de longs ciseaux droits dans le tube et hacher finement les tissus adipeux de la solution en aussi petits morceaux que possible (~1 mm3) (Figure 2A).
3. Ensemencement et culture de préadipocytes
- Semez ~1 x 106 cellules dans 4 mL de milieu de croissance préchauffé dans une fiole T-25. Suivez la même densité de placage si vous utilisez d’autres types de récipients de culture. Placer dans l’incubateur de culture tissulaire et laisser s’attacher pendant la nuit.
REMARQUE: Les cellules sont cultivées dans un incubateur à 38 ° C avec une atmosphère humidifiée de 5% de CO2. La température optimale pour la croissance des cellules aviaires11 est de 38 °C, et elles se développent lentement à 37 °C. - Le lendemain, aspirez les milieux et lavez doucement les cellules avec 1x PBS par pipetage pour éliminer les cellules non attachées ou mortes. Remplacer par 4 mL de milieux de croissance frais. Vérifiez les cellules au microscope. Les cellules doivent être de forme filiforme, comme des fibroblastes (Figure 2A).
REMARQUE: En règle générale, les préadipocytes se fixent assez rapidement (en quelques heures). Le succès ou l’échec de l’isolement cellulaire peut être confirmé à ce moment (après 24 h). - Remplacer par 4 mL de milieux de croissance frais tous les 2 jours et sous-cultiver ou cryoconserver les cellules lorsqu’elles atteignent une confluence de 70 % à 80 % (figure 3C).
4. Subculturation et cryoconservation
- Aspirer les vieux milieux et laver doucement les cellules avec 4 mL de 1x PBS par pipetage. Aspirer le PBS, ajouter 2 mL de trypsine à 0,1 % pour couvrir la surface cellulaire dans une fiole T-25 (ajuster le volume en conséquence pour les autres récipients de culture), puis incuber pendant 3-4 min à 38 °C.
REMARQUE: Observez si les cellules sont détachées de la plaque de culture. Tapotez doucement la plaque de culture pour faciliter le détachement cellulaire. L’incubation de cellules avec de la trypsine pendant trop longtemps endommagera les cellules. - Ajouter un volume équivalent de milieu de croissance préchauffé pour inhiber la réaction de la trypsine. Pipette sur la surface de la cellule plusieurs fois, en inclinant la plaque pour desserrer les cellules restantes.
- Transférer la suspension de la cellule dans un tube de 15 mL et centrifuger à 300 x g pendant 5 min à RT (7 min pour un tube de 50 mL). Aspirer le surnageant.
- En cas de sous-culture, remettre en suspension la pastille dans 1 mL de milieu de croissance en pipetant de haut en bas. Compter les cellules comme décrit à l’étape 2.3.9.1, puis recoller en utilisant la même densité de placage que celle utilisée initialement à l’étape 3.1.
- En cas de cryoconservation, préparer 4 mL de milieu de congélation pour une fiole T-25 avec une confluence de 90 %.
REMARQUE : Le support de congélation se compose de 10 % de DMSO, de 30 % de FBS et de 60 % de DMEM/F12. - Remettre en suspension la pastille de cellule dans un milieu de congélation et transférer 1 mL de milieu de congélation dans un produit cryovial. Congelez lentement les cryoviales jusqu’à -1 °C/min à l’aide d’un récipient de congélation. Placez le récipient dans un congélateur à -80 °C pendant la nuit, puis transférez-le dans de l’azote liquide pour un stockage à long terme.
REMARQUE: Les préadipocytes correctement cryoconservés maintiennent leur viabilité pendant au moins 3 ans et fonctionnent généralement comme des cellules fraîchement isolées lorsqu’ils sont décongelés et plaqués.
5. Différenciation adipogénique
REMARQUE: Des plaques revêtues de gélatine à 2% peuvent être utilisées pour améliorer l’adhérence des cellules.
- Préparer une solution de gélatine à 2 % (p/v) (voir tableau des matériaux) dans de l’eau distillée. Autoclave à 121 °C, 15 psi pendant 30 min pour stériliser. Surface de culture enrobée avec 5-10 μL de solution de gélatine/cm2 (c.-à-d. 100-200 μg/cm2). Tourbillonnez doucement pour recouvrir uniformément la surface.
- Vérifiez les plaques pour un étalement uniforme de la solution de gélatine, car certaines régions peuvent rester non revêtues au départ. Laisser la plaque enduite de gélatine rester à RT pendant au moins 1 h. Retirer tout le volume de solution de gélatine des puits.
REMARQUE: Cela laissera une fine couche de gélatine au fond des puits / plats. La solution de gélatine peut être réutilisée plusieurs fois (au moins 10 fois) sans altérer l’adhérence et la croissance des cellules. Laissez les plats enduits de gélatine rester dans la hotte de culture tissulaire pendant au moins 30 minutes avant de plaquer les cellules. - Induire les préadipocytes de poulet à subir une différenciation adipogénique en complétant les milieux de croissance avec des acides gras. Pour préparer un milieu de différenciation adipogène (SMA), complétez le DMEM/F12 avec 10 % de sérum de poulet, 1x acide linoléique-acide oléique-albumine (9,4 μg/mL) et 1x P/S (voir tableau des matériaux). Rendre ADM frais et chaud avant utilisation.
REMARQUE: Les préadipocytes de poulet sont généralement induits à subir une différenciation adipogène en complétant les milieux avec des acides gras plutôt que des cocktails hormonaux généralement utilisés pour les adipocytes d’autres espèces12. - Induire la différenciation en remplaçant les milieux de croissance par des milieux de différenciation adipogéniques lorsque les cellules atteignent environ 90% de confluence. Maintenir les cellules dans ce milieu, en les remplaçant tous les 2 jours. Évaluez visuellement la différenciation au microscope (20x) en fonction de la formation de gouttelettes lipidiques, qui deviennent facilement visibles dans les 48 heures suivant l’induction de la différenciation.
6. Évaluation de l’adipogenèse
- Effectuez la coloration Oil Red O en suivant les étapes ci-dessous.
- Plaquez les cellules dans une plaque à six puits et induisez une différenciation adipogène à ~ 90% de confluence.
- Préparez une solution de travail d’Huile Rouge O en combinant six parties de la solution mère Huile Rouge O avec quatre parties d’eau distillée dans un tube de 50 mL. Mélanger doucement en pipetant de haut en bas et laisser reposer pendant 10 min à TA, puis filtrer à travers un papier filtre de grade 1 (voir Tableau des matériaux) à l’intérieur de l’entonnoir en versant lentement la solution dans un tube de 50 mL.
REMARQUE: La solution mère d’huile Red O est obtenue en dissolvant 0,7 g d’huile Rouge O (voir tableau des matériaux) dans 200 mL d’isopropanol à 100% dans une bouteille autoclavée. Bien mélanger et laisser reposer pendant 20 min. Conserver à 4 °C et tenir à l’abri de la lumière jusqu’à utilisation. Ceci est stable pendant 1 an. La solution de travail peut être utilisée pendant 3 h; cependant, il est recommandé de l’utiliser dans les 2 h. - Retirez le média et lavez doucement les puits deux fois avec 2 mL de PBS préchauffé 1x à l’aide d’une pipette. Retirez complètement le PBS en le faisant sauter. Fixez les cellules avec 2 mL de formol tamponné à 10% et enveloppez la plaque avec un film de paraffine. Laisser à TA pendant au moins 1 h et jusqu’à 2 jours avant la coloration.
REMARQUE: Pour obtenir 1 L de solution de formol tamponnée à 10 %, mélanger 100 mL de formaldéhyde à 37 %, 4,09 g de NaH2PO4, 6,5 g de Na2HPO4 (voir tableau des matériaux) et 900 mL d’eau distillée. Ne pas pipeter le formol directement sur les cellules. Distribuer doucement sur le flanc près du fond du puits. - Retirer le formol et laver doucement les puits avec 2 mL d’eau distillée. Remplacer par 2 mL d’isopropanol à 60 %. Après 5 min, retirez l’isopropanol et laissez les puits sécher complètement pendant environ 10 min. Effectuez toutes les étapes de coloration à RT.
- Ajouter 1 mL de solution de travail Oil Red O aux cellules et incuber pendant 10 à 20 min à TA. Enlever la tache en pipetant et laver cinq fois en trempant dans l’eau du robinet jusqu’à ce qu’aucun excès de tache ne soit visible. Après le rinçage final, ajoutez 1 mL d’eau aux cellules avant de visualiser la coloration et de recueillir des images au microscope.
- Pour quantifier l’accumulation de lipides par plat, retirez l’eau et extrayez le colorant Oil Red O des cellules en ajoutant 1 à 2 mL d’isopropanol à 100% qui est suffisant pour recouvrir complètement les cellules d’une plaque de six puits. Incuber en secouant doucement sur un agitateur à plaque pendant 10 min à RT.
- Transférer 200 μL de l’extraction dans un puits de la plaque d’essai de 96 puits. Quantifier la quantité relative de tache à l’aide d’un lecteur de plaque spectrophotomètre pour mesurer l’absorbance à 495 nm.
- Effectuer le test de coloration des gouttelettes lipidiques intracellulaires et du noyau.
- Les cellules de plaque dans les plaques noires de fond de 96 puits et induisent une différenciation adipogène comme décrit à l’étape 5.3.
- Pour colorer les cellules, ajouter 200 μL de la solution de coloration contenant une coloration lipidique fluorescente et une coloration fluorescente de l’ADN (voir tableau des matériaux) dans 1x PBS par puits. Après avoir calculé le volume total de la tache nécessaire, ajouter deux gouttes de la tache d’ADN et 25 μL de la tache lipidique par mL de PBS préchauffé 1x à l’aide d’un tube enveloppé de papier d’aluminium pour protéger la solution de la lumière. Incuber à RT pendant 20 min et protéger de la lumière.
- Lisez la fluorescence à l’aide d’un lecteur de plaques fluorescentes (voir Tableau des matériaux). Détecter la tache lipidique (Excitation: 485 nm / Émission: 572 nm) à l’aide d’un filtre rouge et la tache d’ADN (Excitation: 359 nm / Emission: 450 nm) à travers un filtre bleu / cyan.
REMARQUE: La coloration peut également être visualisée et les images capturées sous un microscope fluorescent. - Normaliser les intensités de coloration lipidique par rapport aux intensités de coloration de l’ADN pour quantifier l’accumulation de lipides par rapport à la cellule numéro13.
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Representative Results
Les préadipocytes primaires sont morphologiquement similaires aux fibroblastes, avec des formes irrégulières en forme d’étoile et un noyau central (Figure 2A-C). Les cellules adhèrent facilement au plastique de culture tissulaire et commencent à proliférer peu de temps après la fixation. Ils se différencient et accumulent rapidement des gouttelettes lipidiques (Figure 3D) lorsqu’ils sont fournis avec des acides gras dans le milieu. La viabilité (98 %, selon l’exclusion des colorants) rapportée dans les isolements représentés ici est typique. Bien que les cellules soient assez robustes, une manipulation agressive pendant l’isolement entraîne des dommages cellulaires (Figure 3E), produisant des cellules qui se fixent mal et ne parviennent pas à proliférer. Malgré les procédures incorporées pour prévenir la contamination microbienne, le transfert de matières non stériles peut avoir lieu (figure 3F). En raison de leur taux de croissance rapide, les préadipocytes embryonnaires de poussin consomment du glucose dans le milieu à des taux élevés. Les supports doivent être changés toutes les 48 heures pour maintenir leur approvisionnement en énergie.
Les résultats représentatifs présentés ici illustrent le potentiel adipogène des préadipocytes embryonnaires de poussin. Ces cellules s’accumulent rapidement pour développer des gouttelettes lipidiques dans des conditions adipogènes, et l’accumulation progresse au fil du temps (Figure 4 et Figure 5). Deux méthodes ont été présentées qui peuvent être utilisées pour mieux visualiser et quantifier le degré d’accumulation de lipides dans ces cellules, qui est un reflet direct de l’adipogenèse. La coloration des lipides avec de l’huile rouge O est une méthode peu coûteuse pour visualiser et quantifier l’accumulation de gouttelettes lipidiques (Figure 4). Un microscope optique est utilisé pour collecter des images, et les cellules colorées peuvent être maintenues sur la paillasse jusqu’à ce que les images soient collectées. L’accumulation de lipides dans chaque boîte de cellules peut être quantifiée comme décrit en extrayant la tache et en lisant l’absorbance à 495 nm à l’aide d’un spectrophotomètre. En utilisant la combinaison des taches lipidiques et d’ADN sélectionnées, il a été possible de quantifier l’accumulation de lipides par rapport au nombre de cellules, ce qui compense les cellules non adipogènes qui peuvent persister en culture (Figure 5). Si des mesures sont prises sur plusieurs points temporels (Figure 5B-C), cette combinaison permet d’évaluer à la fois l’adipogenèse et la prolifération, par exemple en réponse à l’ajout d’hormones ou de peptides.
Figure 1: Prélèvement de tissu adipeux. (A) Lors de la rupture de la coquille d’œuf, la membrane de la coquille blanche a été révélée. (B) Percer l’amnion à l’aide d’une pince à épiler stérile. (C) Un total d’environ 80 mg de graisse sous-cutanée fémorale peut être obtenu à partir de E16. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Fragments de tissu pour la digestion enzymatique et granulés cellulaires après digestion. (A) Tissu adipeux haché en solution enzymatique (~1 mm3). (B) Les flèches indiquent les pastilles cellulaires après la lyse des globules rouges. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Comparaisons de la morphologie cellulaire de préadipocytes primaires isolés. (A) Préadipocytes 24 h après l’isolement. (B) Préadipocytes à 48 h après l’isolement. (C) Préadipocytes à 80% de confluence à 72 h après l’isolement. (D) Préadipocytes après 48 h d’induction adipogénique au passage 4, des gouttelettes lipidiques sont visibles. L’encart indique l’image agrandie des gouttelettes lipidiques. (E) Image représentative des cellules endommagées. (F) La flèche indique les points de nage noirs dans la culture contaminée. Barres d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4 : Évaluation de l’accumulation de lipides par coloration à l’huile Rouge O. (A) Images représentatives de la coloration huile Rouge O des préadipocytes E16 après 24 h, 48 h et 72 h de différenciation adipogénique ex vivo. Barres d’échelle = 100 μm. (B) Quantification des gouttelettes lipidiques mesurées par élution de la coloration Oil Red O. Les valeurs sont exprimées en moyenne ± SD. a,b,c P < 0,05 par ANOVA unidirectionnelle avec le test HSD posthoc de Tukey. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Évaluation de la différenciation adipocytaire par coloration lipidique/coloration ADN. (A) Images représentatives de la coloration lipidique (rouge) et de la coloration ADN (bleu) des préadipocytes E16 après 24 h, 48 h et 72 h de différenciation adipogénique ex vivo. Barres d’échelle = 150 μm. (B) Une coloration lipidique (excitation: 485 nm / émission: 572 nm) a été réalisée pour évaluer l’accumulation de lipides dans les préadipocytes différenciés. (C) Une coloration de l’ADN (excitation: 359 nm / émission: 450 nm) a été effectuée pour évaluer les variations du nombre de cellules. (D) Le rapport entre la coloration lipidique et la coloration de l’ADN. L’accumulation de lipides est normalisée à la teneur en ADN. Les valeurs sont exprimées en moyenne ± SD. a,b,c P < 0,05 par ANOVA unidirectionnelle avec le test HSD posthoc de Tukey. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Âge (n=) | x106 cellules/100 mg de tissu | Viabilité (%) |
| E12 (4) | 0,97 ± 0,115 a,b | 98,5 ± 0,58 a |
| E14 (4) | 1,22 ± 0,232 a,b | 98,3 ± 0,96 a,b |
| E16 (21) | 1,61 ± 1,717 a | 97,6 ± 1,58 a |
| E17 (4) | 0,81 ± 0,282 a,b | 96,8 ± 2,63 a,b |
| E18 (7) | 0,72 ± 0,611 a,b | 95,9 ± 1,81 a,b |
| E20 (4) | 0,94 ± 0,171 a,b | 97,8 ± 0,8 a,b |
| D4 (9) | 0,24 ± 0,164 a,b | 93,6 ± 4,28 b |
| D5 (4) | 0,25 ± 0,073 a,b | 98,5 ± 0,71 a,b |
| D7 (10) | 0,17 ± 0,162 b | 96,8 ± 3,49 a,b |
| D14 (4) | 0,25 ± 0,051 a,b | 99,0 ± 0,00 a,b |
Tableau 1 : Nombre moyen de cellules et viabilité des cellules isolées provenant de poussins embryonnaires et postérieurs à l’éclosion.
Les valeurs sont exprimées en moyenne ± SD. a,b P < 0,05 par ANOVA unidirectionnelle avec le test HSD de Tukey posthoc.
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Discussion
Bien que plusieurs protocoles bien décrits aient rapporté l’isolement des préadipocytes 14,15,16,17, l’isolement des préadipocytes embryonnaires a été optimisé, ce qui peut être utilisé pour les analyses fonctionnelles de la croissance et du développement des graisses au début de la vie chez les poussins de poulet de chair. Ce protocole produit des progéniteurs adipocytaires embryonnaires à haute viabilité avec un potentiel de différenciation élevé. De plus, la procédure présentée pour isoler les préadipocytes ne se limite pas aux embryons, mais peut être utilisée chez les poussins post-éclosion. Cependant, il a été optimisé pour une utilisation avec des embryons E16, et les rendements des poussins après l’éclosion sont considérablement plus faibles (tableau 1), probablement en raison de l’augmentation de la quantité relative de tissu conjonctif à mesure que les poussins grandissent rapidement.
Le succès de l’isolement cellulaire est finalement évalué en observant la forme et le nombre de cellules attachées (Figure 3A). Un faible nombre de cellules ou de cellules endommagées peut être observé lorsque les fractions tissulaires sont digérées trop longtemps, en particulier lorsque la dissociation tissulaire progresse pendant plus de 1,5 h (figure 3E). Par conséquent, il est recommandé de ne pas dépasser 1,5 h de digestion. D’autre part, si le fragment de tissu reste clairement après une heure de digestion, le temps digestif ou la quantité doit être augmenté. La quantité de tissu adipeux obtenue peut également varier en fonction de la souche génétique du poulet. Si ce protocole est utilisé pour isoler des cellules d’autres âges ou espèces, la quantité de collagénase et le temps de digestion devront probablement être modifiés.
Une limitation courante de la culture cellulaire primaire est que les cellules isolées commencent à perdre leur potentiel adipogène après plusieurs passages en culture; il est donc important d’induire une différenciation dans les quelques jours suivant l’isolement pour s’assurer que les préadipocytes embryonnaires ne perdent pas leur capacité adipogénique. Les précurseurs adipogéniques d’embryons se différencient facilement en adipocytes matures dans la formulation de milieu décrite ci-dessus, sans avoir besoin de confluence ou d’induction hormonale. Les cellules jusqu’au passage 4 (10-14 jours) sont facilement différenciées dans les 48 h suivant l’incitation (Figure 3D).
Le contrôle de la contamination cellulaire en culture cellulaire primaire est un autre défi, où la contamination fongique est la plus courante. L’utilisation de l’amphotéricine B, telle que décrite, est généralement efficace pour prévenir la croissancefongique 18,19. Il peut être inclus à de faibles concentrations dans les milieux de culture sans effets notables sur la viabilité ou le potentiel adipogène. Des contaminants microbiens non identifiables ont été observés sous la forme de points nageurs noirs apparaissant quelques jours après l’isolement cellulaire (figure 3F). Ceux-ci ont affecté négativement la croissance cellulaire et étaient impossibles à éliminer une fois que cette infection s’est produite20. On ne sait pas si ces contaminants étaient une espèce microbienne inconnue trouvée dans ou sur les œufs ou provenant d’une autre source. Ce protocole tente de minimiser le risque de contamination en extrayant les embryons de manière aseptique de l’œuf21. L’utilisation d’un stérilisateur d’instrument à base de chaleur dans la hotte pendant la dissection aide également à minimiser le risque de contamination, en particulier lorsque plusieurs embryons sont disséqués.
Une considération dans le processus est la diminution de l’adhésion cellulaire à la plaque de culture tissulaire pendant la différenciation, résultant de changements physiques à mesure que les cellules forment et dilatent les gouttelettes lipidiques. Bien que contenues dans les cellules, les gouttelettes lipidiques sont flottantes et, lorsqu’elles sont grandes, semblent agir comme des ballons qui ont tendance à favoriser le soulèvement des cellules de la surface. Ainsi, des précautions doivent être prises dans la manipulation des préadipocytes tout en induisant une différenciation, et en particulier lors de l’évaluation de l’adipogenèse. Bien que le protocole présenté ici ne modifie pas la surface de culture, l’adhérence cellulaire peut être améliorée lors du placage de cellules sur des plats recouverts de gélatine à 2%. Il est également important de confirmer que le pH des solutions de lavage est de 7,4 et d’utiliser une solution pbS préchauffée lors du lavage des cellules et du mélange avec la tache d’ADN pour réduire le stress dû au froid.
En utilisant plusieurs embryons, un nombre suffisant de cellules peut être isolé pour produire des répliques expérimentales sans avoir besoin de multiples passages, d’expansion et de risque de perte de potentiel adipogène des cellules. L’ARN peut être facilement isolé à partir d’adipocytes d’embryons de poussins pré- et différenciés isolés à l’aide de méthodes commerciales à base de phénol ou de membrane pour les études d’expression génique. Un ARN suffisant peut être obtenu à partir d’un seul puits d’une plaque de six puits pour une utilisation dans la synthèse de l’ADNc et la qPCR ou l’ARNiq de suivi.
En résumé, l’accessibilité des dépôts adipeux dans l’embryon de poussin pour isoler un modèle cellulaire est très pertinente pour la volaille et les humains. Ce protocole est relativement simple à réaliser, et il donne un pourcentage élevé de cellules viables qui peuvent être facilement induites à subir une différenciation adipogénique in vitro. Les œufs de poule fécondés peuvent être obtenus à partir de diverses sources commerciales pour un coût minimal, ce qui fait de ces cellules un modèle facilement disponible pour une utilisation pratique.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs remercient UT AgResearch et le Département des sciences animales d’avoir soutenu et optimisé ce protocole. Ce travail a été financé par une subvention de l’USDA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Pipette | Eppendorf | Z683825 | Single Channel Pipette, 100 - 1000 µL |
| 1 mL Pipette Tip | Fisher Scientific | 02-707-402 | |
| 100% Isopropanol | Fisher Scientific | A426P4 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010023 | |
| 25 mL Flask | Pyrex | 4980-25 | |
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | F75P-1GAL | |
| 6-Well Plate | Falcon | 353046 | Tissue Culture-treated |
| 96-Well Assay Plate | Costar | 3632 | |
| 96-Well Plate, Black Bottom | Costar | 3603 | Tissue Culture-treated |
| AdipoRed | Lonza | PT-7009 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290026 | |
| Bench Top Wiper (Kimtechwiper) | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Betadine | Up & Up | NDC 1167300334 | 20% Working Solution |
| Cell Counter | Corning | 6749 | |
| Cell Strainer, 40 µm | SPL | 93040 | |
| Centrifugaton | Eppendorf | 5702 | |
| Chicken Serum | Gibco | 16110082 | |
| Conical Centrifuge Tubes, 15 mL | VWR | 10025-690 | |
| Conical Centrifuge Tubes, 50 mL | Falcon | 352098 | |
| Cryovial | Nunc | 343958 | |
| Curved Forceps, 100 mm | Roboz Surgical | RS-5137 | |
| Curved Surgical Scissors, 115 mm | Roboz Surgical | RS-6839 | |
| Distilled Water | Millipore | SYNSV0000 | Despensed as needed |
| DMEM/F12 | HyClone | SH30023.01 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | 70% Working Solution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10437028 | |
| Fluorescent Microscope | EVOS | M7000 | |
| Fluorescent Plate Reader | Biotek | Synergy H1 | |
| Foil | Reynolds | Reynolds Wrap Heavy Duty Aluminum Foil, 125 SQ. FT. | |
| Freezing Container | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| Gelatin | Millipore | 4055 | 2% Working Solution |
| Hematocytometer (Counting Chamber) | Corning | 480200 | 0.1 mm deep |
| Incubator | Fisher Scientific | 6845 | |
| Instrument Sterilizer | VWR | B1205 | |
| Linoleic Acid-Oleic Acid-Albumin | Sigma | L9655 | 1x Working Solution |
| Microscope | Evos | AMEX1000 | |
| Multi-Channel Pipette | Thermo Scientific | 4661070 | 12-Channel Pipetters, 30 - 300 µL |
| Na2HPO4 | Sigma | S-7907 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S-3139 | |
| NucBlue | Invitrogen | R37605 | |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | |
| Orbital Shaker | IKA | KS130BS1 | |
| Paper Towel | Tork | RK8002 | |
| Parafilm | Parafilm M | PM996 | |
| Penicillin/Steptomycin (P/S) | Gibco | 15140122 | 1x Working Solution |
| Petri dishes, 100 mm | Falcon | 351029 | |
| Petri dishes, 60 mm | Falcon | 351007 | |
| Plate Shaker | VWR | 200 | |
| RBC Lysis Buffer | Roche | 11814389001 | |
| Reagent Reservior | VWR | 89094-680 | |
| Small Beaker, 100 mL | Pyrex | 1000-100 | |
| Spectrophotometer Plate Reader | Biotek | Synergy H1 | |
| Sterile Gauze | McKesson | 762703 | |
| Straight Forceps, 120 mm | Roboz Surgical | RS-4960 | |
| Straight Scissors, 140 mm | Roboz Surgical | RS-6762 | |
| T-25 Flask | Corning | 430639 | Tissue Culture-treated |
| Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Tissue Strainer, 250 µm | Pierce | 87791 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250061 | |
| Trypsin | Gibco | 15400054 | 0.1% Working Solution |
| Tweezers, 110 mm | Roboz Surgical | RS-5035 | |
| Type 1 Collagenase | Gibco | 17100017 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | 15-462-10 | |
| Whatman Grade 1 Filter Paper | Whatman | 1001-110 |
References
- Fryar, C. D., Carroll, M. D., Ogden, C. L. Prevalence of overweight, obesity, and severe obesity among children and adolescents aged 2-19 years: United States, 1963-1965 through 2015-2016. , (2018).
- Siegel, P. B. Evolution of the modern broiler and feed efficiency. Annual Review of Animal Biosciences. 2 (1), 375-385 (2014).
- Zuidhof, M. J., Schneider, B. L., Carney, V. L., Korver, D., Robinson, F. Growth, efficiency, and yield of commercial broilers from 1957, 1978, and 2005. Poultry Science. 93 (12), 2970-2982 (2014).
- Poulos, S. P., Dodson, M. V., Hausman, G. J. Cell line models for differentiation: preadipocytes and adipocytes. Experimental Biology and Medicine. 235 (10), 1185-1193 (2010).
- Vilaboa, S. D. -A., Navarro-Palou, M., Llull, R. Age influence on stromal vascular fraction cell yield obtained from human lipoaspirates. Cytotherapy. 16 (8), 1092-1097 (2014).
- Speake, B. K., Noble, R. C., McCartney, R. J. Tissue-specific changes in lipid composition and lipoprotein lipase activity during the development of the chick embryo. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Lipids and Lipid Metabolism. 1165 (3), 263-270 (1993).
- Chen, P., Suh, Y., Choi, Y. M., Shin, S., Lee, K. Developmental regulation of adipose tissue growth through hyperplasia and hypertrophy in the embryonic Leghorn and broiler. Poultry Science. 93 (7), 1809-1817 (2014).
- Farkas, K., Ratchford, I. A., Noble, R. C., Speake, B. K. Changes in the size and docosahexaenoic acid content of adipocytes during chick embryo development. Lipids. 31 (3), 313-321 (1996).
- Claver, J. A., Quaglia, A. I. Comparative morphology, development, and function of blood cells in nonmammalian vertebrates. Journal of Exotic Pet Medicine. 18 (2), 87-97 (2009).
- Corning Cell Counter Demo Video. , Available from: https://www.youtube.com/watch?v=JWjckEHO6Wg (2022).
- Nema, R., Khare, S. An animal cell culture: Advance technology for modern research. Advances in Bioscience and Biotechnology. 3 (3), 219-226 (2012).
- Regassa, A., Kim, W. K. Effects of oleic acid and chicken serum on the expression of adipogenic transcription factors and adipogenic differentiation in hen preadipocytes. Cell Biology International. 37 (9), 961-971 (2013).
- Temkin, A. M. Effects of crude oil/dispersant mixture and dispersant components on PPAR γ activity in vitro and in vivo: identification of dioctyl sodium sulfosuccinate (DOSS; CAS# 577-11-7) as a probable obesogen. Environmental Health Perspectives. 124, 112-119 (2016).
- Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. Adipose Tissue Protocols. , Springer. 201-219 (2008).
- Lee, M. J., Wu, Y., Fried, S. K. A modified protocol to maximize differentiation of human preadipocytes and improve metabolic phenotypes. Obesity. 20 (12), 2334-2340 (2012).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).
- Akbar, N., Pinnick, K. E., Paget, D., Choudhury, R. P. Isolation and characterization of human adipocyte-derived extracellular vesicles using filtration and ultracentrifugation. Journal of Visualized Experiments. (170), e61979 (2021).
- Perlman, D., Giuffre, N. A., Brindle, S. A. Use of Fungizone in control of fungi and yeasts in tissue culture. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 106 (4), 880-883 (1961).
- Kuhlmann, I. The prophylactic use of antibiotics in cell culture. Cytotechnology. 19 (2), 95-105 (1995).
- Yang, X., et al. Black swimming dots in cell culture: the identity, detection method and judging criteria. bioRxiv. , 366906 (2018).
- Freshney, R. I. Culture of animal cells: a manual of basic technique and specialized applications. , John Wiley & Sons. 163-186 (2015).
