Summary
Detta protokoll beskriver en enkel metod för att isolera preadipocyter från fettvävnad i broilerembryon. Denna metod möjliggör isolering med högt utbyte, primärkultur och adipogen differentiering av preadipocyter. Oil Red O-färgning och lipid / DNA-fläck mätte den adipogena förmågan hos isolerade celler inducerade med differentieringsmedier.
Abstract
Primära preadipocyter är ett värdefullt experimentellt system för att förstå de molekylära vägar som styr adipocytdifferentiering och metabolism. Kycklingembryon ger möjlighet att isolera preadipocyter från det tidigaste stadiet av fettutveckling. Denna primära cell kan användas för att identifiera faktorer som påverkar preadipocytproliferation och adipogen differentiering, vilket gör dem till en värdefull modell för studier relaterade till barnfetma och kontroll av överflödig fettavsättning hos fjäderfä. Den snabba tillväxten av postnatal fettvävnad slösar effektivt bort foder genom att fördela det bort från muskeltillväxt hos slaktkycklingar. Därför kan metoder för att förstå de tidigaste stadierna av fettvävnadsutveckling ge ledtrådar för att reglera denna tendens och identifiera sätt att begränsa fettutvidgningen tidigt i livet. Den aktuella studien utformades för att utveckla en effektiv metod för isolering, primärkultur och adipogen differentiering av preadipocyter isolerade från att utveckla fettvävnad av kommersiella kycklingembryon av kötttyp. Förfarandet har optimerats för att ge celler med hög livskraft (~ 98%) och ökad kapacitet att differentiera till mogna adipocyter. Denna enkla metod för embryonal preadipocytisolering, kultur och differentiering stöder funktionella analyser av fetttillväxt och utveckling i början av livet.
Introduction
Fetma är ett globalt hälsohot mot både vuxna och barn. Barn som är överviktiga eller feta är ungefär fem gånger mer benägna att vara överviktiga som vuxna, vilket placerar dem i signifikant ökad risk för hjärt-kärlsjukdom, diabetes och många andra comorbiditeter. Cirka 13.4% av amerikanska barn i åldern 2-5 år har fetma1, vilket illustrerar att tendensen att ackumulera överflödigt kroppsfett kan sättas i rörelse mycket tidigt i livet. Av mycket olika skäl är ackumuleringen av överskott av fettvävnad ett problem för slaktkycklingar (kötttyp). Moderna broilers är otroligt effektiva men ackumulerar fortfarande mer lipid än vad som är fysiologiskt nödvändigt 2,3. Denna tendens börjar strax efter luckan och slösar effektivt bort foder, den dyraste produktionskomponenten, genom att fördela den bort från muskeltillväxt. För både barn och slaktkycklingar, om än av mycket olika skäl, finns det därför ett behov av att förstå faktorer som påverkar fettvävnadsutvecklingen och identifiera sätt att begränsa fettutvidgningen tidigt i livet.
Adipocyter bildas från preadipocyter, fettvävnadsderiverade stamceller som genomgår differentiering för att utveckla mogna, lipidlagrande fettceller. Följaktligen är preadipocyter in vitro en värdefull experimentell modell för fetmastudier. Dessa celler, isolerade från den stromala vaskulära fraktionen av fettdepåer, kan ge en grundläggande förståelse för molekylära vägar som styr adipocytdifferentiering och metabolism 4,5. Kycklingembryon är en gynnsam experimentell modell i utvecklingsstudier eftersom odling av ägg enligt önskat schema underlättar experimentell manipulation, eftersom det gör det möjligt att erhålla embryon utan moderns offer för att observera en serie utvecklingsstadier av embryon. Dessutom krävs inte komplicerade kirurgiska ingrepp och långa tidsperioder för att få embryon i förhållande till större djurmodeller. Därför ger kycklingembryomet en möjlighet att erhålla preadipocyter från de tidigaste stadierna av fettvävnadsutveckling. Subkutan fettvävnad blir synlig i kycklingen runt embryonal dag 12 (E12) som en tydligt definierad depå belägen runt låret. Denna depå är berikad med mycket proliferativa preadipocyter som aktivt genomgår differentiering under utvecklingssignaler för att bilda mogna adipocyter 6,7. Processen med adipogen differentiering är jämförbar mellan kycklingar och människor. Därför kan preadipocyter isolerade från kycklingembryon användas som en dubbelfunktionsmodell för studier som är relevanta för människor och fjäderfä. Utbytet av preadipocyter minskar emellertid med åldrande när celler växer till mogna adipocyter5.
Det nuvarande protokollet optimerar isoleringen av preadipocyter från fettvävnad under scenen (E16-E18) vid vilken adipogen differentiering och adipocythypertrofi är på topp i broiler chick embryon8. Denna procedur kan bedöma effekterna av faktorer som det utvecklande embryot exponeras för i ovo, såsom hönsdieten, på adipocytutveckling och adipogen potential ex vivo. Det kan också testa effekterna av olika manipuleringar (t.ex. hypoxi, näringstillsatser, farmakologiska agonister och antagonister) på adipogenes eller de olika omerna (t.ex. transkriptom, metabolom, metylom) hos adipocytprofäder. Som en representation av det tidigaste stadiet av fettbildning är celler erhållna med hjälp av detta protokoll värdefulla modeller för studier som är relevanta för fjäderfä och människor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurprocedurer godkändes av University of Tennessee Institutional Animal Care and Use Committee. Nybefruktade kommersiella slaktkycklingägg (Cobb 500) erhölls från ett lokalt kläckeri. Ägg inkuberades vid 38 °C med 60 % relativ fuktighet fram till dissektioner vid embryonala dagar 16-18 (E16-E18). Fettvävnad samlades in från den subkutana (lårbensdepån).
1. Förberedelse för isolering och kultur
- Förbered kulturhuven och instrumenten.
- Innan du börjar dissektioner, sätt upp ett arbetsområde i laminärflödeshuven. Desinficera arbetsområdet och alla instrument genom att svabba med 70% etanol. Utför alla procedurer med sterila material.
OBS: Svabba alltid behållarna och instrumenten med 70% etanol innan du placerar dem tillbaka i cellodlingshuven. Det rekommenderas att placera en bänkinstrumentsterilisator i huven så att instrument lätt kan steriliseras mellan embryon.
VARNING: När du använder en instrumentsterilisator, kyla ner det heta instrumentet ordentligt för att förhindra brännskador och vävnadsskador. En minsta kyltid på 3 min rekommenderas. Swab med 70% etanol före användning. - Montera följande instrument och kärl i huven: raka pincett (120 mm), pincett (110 mm), två par böjda pincett (100 mm), två par raka saxar (140 mm), böjd kirurgisk sax (115 mm), vävnadssil (250 μm nylonnät), cellsil (40 μm nylonnät), koniska centrifugrör (15 ml och 50 ml), petriskålar (60 mm och 100 mm), liten bägare (100 ml), 70% etanolspray och steril gasväv, pappershandduk och bänktorkare (se materialtabell).
- Innan du börjar dissektioner, sätt upp ett arbetsområde i laminärflödeshuven. Desinficera arbetsområdet och alla instrument genom att svabba med 70% etanol. Utför alla procedurer med sterila material.
- Förbered enzymatisk lösning, samlingsmedia och kulturmedia enligt stegen nedan.
OBS: Förbered lösningarna i förväg och förvara vid 4 °C tills de används. Media måste placeras på is innan vävnad samlas in. Alla reagenser som används i detta steg listas i materialförteckningen.- Förbered media som används för både insamling av fettvävnad och beredning av enzymatisk lösning genom att komplettera DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium med 2,50 mM L-glutamin och 15 mM HEPES-buffert) med 2,5 μg/ml Amfotericin B och 1x penicillin/streptomycin (P/S), 100 U/ml. Förvaras vid 4 °C tills den används.
OBS: Detta medium förblir stabilt i 1 år när det förvaras vid 4 °C. - Förbered steriliseringslösningen genom att späda betadin till 20 % (v/v) i 1x PBS (fosfatbuffrad saltlösning med pH 7,4, utan kalcium, magnesium eller fenolrött) med 2,5 μg/ml amfotericin B. Förvaras vid 4 °C tills det används.
OBS: Lösningen är stabil i 2 år när den förvaras vid 4 °C. - Bered enzymatisk lösning genom att lösa upp kollagenas av typ 1 (1 mg/ml) i DMEM/F12 med 2,5 μg/ml amfotericin B och 1x P/S (steg 1.2.1). Gör färsk kollagenaslösning och håll den på is under dissektioner. Cirka 10 minuter före användning, förvärm genom att inkubera denna lösning vid 37 °C i ett vattenbad för att initiera dess enzymatiska aktivitet.
OBS: Cirka 1 ml kollagenaslösning (1 mg / ml) behövs per 100 mg fettvävnad. - Förbered tillväxtmedier som används för plätering och förökning genom att komplettera DMEM / F12-media med 1x P / S och 10% FBS. Förvaras vid 4 °C tills den används.
OBS: Lösningen är stabil i 1 år vid förvaring vid 4 °C. - Förbered tvättlösningen genom att komplettera 1x PBS med 2,5 μg/ml Amfotericin B. Justera lösningen till önskat pH 7,4. Förvaras vid 4 °C tills den används.
OBS: Lösningen är stabil i 2 år när den förvaras vid 4 °C.
- Förbered media som används för både insamling av fettvävnad och beredning av enzymatisk lösning genom att komplettera DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium med 2,50 mM L-glutamin och 15 mM HEPES-buffert) med 2,5 μg/ml Amfotericin B och 1x penicillin/streptomycin (P/S), 100 U/ml. Förvaras vid 4 °C tills den används.
2. Fettvävnadsuppsamling och matsmältning
- Avliva embryot.
- På embryonal dag 16, ta bort äggen från inkubatorn. Den primära potentiella källan till mikrobiell kontaminering är äggets yta; Svabba därför äggen med en steril gasbindning som blötläggs i 70% etanol innan de spricker. Efter svabbning, placera ägget vertikalt med den spetsiga änden ner på en liten bägare (100 ml) fodrad med pappershanddukar för att dämpa ägget från glaset.
- Använd tånghandtaget och bryt ett ägg genom att knacka på äggets trubbiga ände. Ta försiktigt bort äggskalet för att skapa en öppning som är tillräckligt stor för att ta bort embryot (steg 2.1.3). Riv försiktigt det vita skalmembranet för att exponera embryot (figur 1A). Piercera amnion försiktigt med steril pincett (figur 1B).
OBS: Fostersäcken är ett transparent membran fyllt med fostervatten som omsluter embryot. - Ta bort embryot från ägget genom att lätt greppa embryots hals med raka pincett. Skär av äggula sac för att koppla bort den från embryot och överför embryot till en 100 mm petriskål.
- Halshugga omedelbart med kirurgisk sax och pincett.
- Utför fettvävnadsuppsamlingen.
- Torka embryokroppen med 70% etanol och skrubba hudytan försiktigt med en steril gasbindning för att ta bort fjädrar, eftersom de kan störa filtreringen i senare steg efter matsmältningen. Använd bänktorkare för att förhindra att huden och fjädrarna vidrör uppsamlad vävnad.
- Skär av huden mellan benen och bukregionen för att avslöja paret av lårbensfettdepåer.
- Håll huden runt benet med böjda pincett med en hand. Ta försiktigt bort lårbenets subkutana fett med den andra handen, med böjda pincett för att försiktigt dra depån bort från benet.
OBS: Det finns relativt lite bindväv som fäster vid fettkudden till benet, och hela fettkudden ska vara avtagbar i ett stycke med endast pincett. Detta kan underlättas genom att hålla tången bakåt så att de böjda delarna (snarare än ändarna) klämmer fast fettkudden för borttagning.- Skär vid behov bort fettkudden med böjd sax. Upprepa med den andra fettkudden och ytterligare embryon efter behov.
OBS: Totalt 80 mg subkutant fett kan erhållas från de flesta embryon vid E16 (figur 1C). Detta ger vanligtvis ~ 1 x 106 celler, tillräckligt för att platta en T-25-kolv. Det kan vara användbart i detta steg att väga fettkuddar från några embryon för att bedöma mängden utgångsmaterial, eftersom fettkuddens vikter kan variera mellan specifika broilerlinjer och på grund av okontrollerbara faktorer, såsom uppfödarens höns ålder och kost. Subkutant fett samlades rutinmässigt från fem ägg för att säkerställa ett tillräckligt utbyte av celler för plätering i flera kolvar.
- Skär vid behov bort fettkudden med böjd sax. Upprepa med den andra fettkudden och ytterligare embryon efter behov.
- Överför vävnaderna till ~ 5 ml uppsamlingsmedia i ett 15 ml rör och upprepa dissektion för de återstående äggen.
- Skölj kort de uppsamlade fettkuddarna genom att överföra dem till en 60 mm petriskål som innehåller steriliseringslösning och virvla skålen några gånger.
- Skölj av steriliseringslösningen genom att överföra fettkuddar till en 60 mm petriskål som innehåller 1x PBS. Virvla försiktigt. Upprepa detta steg genom att överföra till en andra 60 mm petriskål som innehåller 1x PBS.
- Utför enzymatisk matsmältning och preadipocytisolering enligt stegen nedan.
- Överför fettvävnaderna till ett 15 ml rör som innehåller ~ 1 ml förvärmd enzymatisk lösning per 100 mg vävnad. Sänk ner en lång, rak sax i röret och finhacka fettvävnaderna i lösningen i så små bitar som möjligt (~ 1 mm3) (figur 2A).
OBS: Cellutbytet kommer att minskas om vävnaderna inte är ordentligt malet. - Överför den maleta vävnaden och den enzymatiska lösningen till en 25 ml autoklaverad kolv. Vik in kolven med paraffinfilm. Placera på en orbitalskakare inuti en kuvös och skaka vid 37 °C under matsmältningssteget.
OBS: Alternativt kan du använda ett skakvattenbad. Vid båda tillvägagångssätten bör hastigheten vara tillräcklig för att förhindra att vävnadsbitar sätter sig i botten av kolven, men får inte vara så snabb att bitar drivs till toppen av kolven och fastnar i glaset, eller att vätska ackumuleras på paraffinfilmkåpan. - Efter ~ 30 min, skär änden på en 1 ml pipettspets till en diameter på cirka 3 mm. Pipettera vävnadsblandningen upp och ner några gånger för att hjälpa till att frigöra cellerna från fettvävnaden. Sätt tillbaka kolven i inkubatorn/vattenbadet och fortsätt skaka.
- Efter ytterligare 15 minuter, kontrollera att kolven är fullständig. Efter avlägsnande av kolven från skakaren bildas ett lager av vitaktiga celler på toppen av vätskeskiktet. Om vävnadsfragment fortfarande finns kvar, skär änden från en annan pipettspets och pipettera försiktigt blandningen upp och ner och fortsätt sedan skaka i ytterligare 15 minuter.
OBS: Helt smält vävnad / kollagenasblandning ser ut som mjölkaktig chym. Typiskt smälts vävnaden tillräckligt efter 1 h av mild skakning. Om många fragment kvarstår vid denna tidpunkt kan det indikera ett problem med det kollagenasenzym som används. Konstant skakning kan öka utbytet; långvarig exponering för enzymet och den fysiska stressen kan dock också skada cellerna. - Efter matsmältningen pipetterar du försiktigt upp och ner för att blanda väl. Filtrera genom en 250 μm vävnadssil i ett 15 ml rör genom pipettering för att ta bort eventuella bitar av osmält vävnad och skräp.
- Skölj kolven med 4 ml tillväxtmedium genom pipettering för att avlägsna celler som kan fästas vid glaset och filtrera i samma 15 ml rör. Skölj silen med ytterligare tillväxtmedier genom att pipettera för att lossa eventuella fångade celler, upp till en total volym på 14 ml.
- Pelletera cellfraktionen genom centrifugering vid 300 x g i 5 min vid RT (7 min för 50 ml rör).
OBS: Svabba alltid rören med 70% etanol innan du återvänder till cellodlingshuven. - Aspirera supernatanten. Var försiktig så att du inte lossnar cellpelleten. Återsuspendera försiktigt pelleten i 1 ml lysbuffert för röda blodkroppar (se materialtabell) genom att pipettera upp och ner och inkubera i 5 minuter vid RT. Lösningen blir rödaktig när röda blodkroppar lyseras (figur 2B).
OBS: Placera RBC-lysbufferten vid RT före användning. Kycklingar har kärnbehandlade röda blodkroppar9, och de fäster vid vävnadsodlingsrätter tillsammans med preadipocyter. RBC-lysbuffert används för att lysera dessa celler för att förhindra deras störning med exakta cellantal. - Tillsätt 5 ml tillväxtmedia till röret som innehåller cellerna för att späda ut lysbufferten och blanda försiktigt genom att pipettera upp och ner. Använd en pipett och filtrera genom en 40 μm cellsil i ett nytt 50 ml rör och skölj silen med ytterligare 5 ml tillväxtmedium.
- Pelletsceller genom centrifugering vid 300 x g i 7 min vid RT. Aspirera försiktigt supernatanten och återsuspendera den återstående cellpelleten i 1 ml tillväxtmedium genom pipettering upp och ner.
- Använd en hemocytometer, cellräknare och Trypan Blue-fläck för att räkna celler och bestämma cellviabiliteten. Ta 10 μL prov och blanda med 10 μL Trypan Blue genom pipettering. Tryck 10 μL av blandningen på hematocytometern och mät10.
OBS: Centrifugeringshastigheterna kan ökas till 600 x g om tillräckligt med cellpellets inte är lätt synliga efter den första snurrningen.
- Använd en hemocytometer, cellräknare och Trypan Blue-fläck för att räkna celler och bestämma cellviabiliteten. Ta 10 μL prov och blanda med 10 μL Trypan Blue genom pipettering. Tryck 10 μL av blandningen på hematocytometern och mät10.
- Överför fettvävnaderna till ett 15 ml rör som innehåller ~ 1 ml förvärmd enzymatisk lösning per 100 mg vävnad. Sänk ner en lång, rak sax i röret och finhacka fettvävnaderna i lösningen i så små bitar som möjligt (~ 1 mm3) (figur 2A).
3. Sådd och odling av preadipocyter
- Frö ~ 1 x 106 celler i 4 ml förvärmda tillväxtmedier i en T-25-kolv. Följ samma pläteringstäthet om du använder andra typer av odlingskärl. Placera i vävnadsodlingsinkubator och låt fästa över natten.
OBS: Cellerna odlas i en 38 °C inkubator med en fuktad atmosfär på 5 %CO2. Den optimala temperaturen för tillväxt av fågelceller11 är 38 °C och de växer långsamt vid 37 °C. - Nästa dag, aspirera media och tvätta försiktigt cellerna med 1x PBS genom att pipettera för att ta bort okopplade eller döda celler. Byt ut med 4 ml färska tillväxtmedier. Kontrollera cellerna under ett mikroskop. Cellerna ska vara spindigt formade, som fibroblaster (figur 2A).
OBS: Vanligtvis fäster preadipocyter ganska snabbt (inom några timmar). Framgången eller misslyckandet med cellisolering kan bekräftas vid denna tidpunkt (efter 24 timmar). - Ersätt med 4 ml färsk tillväxtmedia var 2: e dag och subkultur- eller kryokonserveringsceller när de når 70% -80% sammanflöde (figur 3C).
4. Subkulturering och kryokonservering
- Aspirera gamla medier och tvätta försiktigt celler med 4 ml 1x PBS genom pipettering. Aspirera PBS, tillsätt 2 ml 0,1% trypsin för att täcka cellytan i en T-25-kolv (justera volymen därefter för andra odlingskärl) och inkubera sedan i 3-4 minuter vid 38 °C.
OBS: Observera om cellerna lossnar från odlingsplattan. Knacka försiktigt på odlingsplattan för att hjälpa cellavlossning. Att inkubera celler med trypsin för länge kommer att skada celler. - Tillsätt en motsvarande volym förvärmda tillväxtmedier för att hämma trypsinreaktionen. Pipettera över cellytan flera gånger och luta plattan för att lossa de återstående cellerna.
- Överför cellsuspensionen till ett 15 ml rör och centrifugera vid 300 x g i 5 minuter vid rumstemperatur (7 min för 50 ml rör). Aspirera supernatanten.
- Vid subkulturering, resuspendera pellet i 1 ml tillväxtmedium genom pipettering upp och ner. Räkna celler enligt beskrivningen i steg 2.3.9.1 och replera sedan med samma pläteringstäthet som ursprungligen användes i steg 3.1.
- Om kryokonservering, förbered 4 ml frysmedium för en T-25-kolv med 90% sammanflöde.
OBS: Frysmedia består av 10% DMSO, 30% FBS och 60% DMEM / F12. - Resuspend cellpellets i frysmedia och överför 1 ml frysmedium till en kryovial. Frys in kryotyperna långsamt till -1 °C/min med en frysbehållare. Placera behållaren i en frys på -80 °C över natten och överför den sedan till flytande kväve för långvarig lagring.
OBS: Korrekt kryokonserverade preadipocyter bibehåller sin livskraft i minst 3 år och fungerar vanligtvis som nyligen isolerade celler när de tinas och pläteras.
5. Adipogen differentiering
OBS: 2% gelatinbelagda plattor kan användas för att förbättra celladhesionen.
- Bered en 2% (w/v) gelatinlösning (se materialtabell) i destillerat vatten. Autoklav vid 121 °C, 15 psi i 30 min för att sterilisera. Täck odlingsytan med 5-10 μl gelatinlösning/cm2 (dvs. 100-200 μg/cm2). Virvla försiktigt för att jämnt belägga ytan.
- Kontrollera plattorna för jämn spridning av gelatinlösningen eftersom vissa regioner kan förbli obelagda initialt. Låt den gelatinbelagda plattan ligga kvar på RT i minst 1 timme. Ta bort hela volymen gelatinlösning från brunnarna.
OBS: Detta lämnar en tunn gelatinbeläggning i botten av brunnarna / diskarna. Gelatinlösning kan återanvändas flera gånger (minst 10 gånger) utan att förändra cellens vidhäftning och tillväxt. Låt de gelatinbelagda diskarna ligga kvar i vävnadsodlingshuven i minst 30 minuter innan du plätering av cellerna. - Inducera kycklingpreadipocyterna att genomgå adipogen differentiering genom att komplettera tillväxtmedier med fettsyror. För att förbereda adipogena differentieringsmedier (ADM), komplettera DMEM / F12 med 10% kycklingserum, 1x linolsyra-oljesyra-albumin (9,4 μg / ml) och 1x P / S (se materialtabell). Gör ADM fräscht och varmt före användning.
OBS: Kycklingpreadipocyter induceras vanligtvis att genomgå adipogen differentiering genom att komplettera media med fettsyror snarare än hormonella cocktails som vanligtvis används för adipocyter från andra arter12. - Inducera differentiering genom att ersätta tillväxtmedier med adipogena differentieringsmedier när celler når ~ 90% sammanflöde. Behåll celler i detta media, byt ut dem var 2: e dag. Bedöm differentieringen visuellt under ett mikroskop (20x) baserat på bildandet av lipiddroppar, som blir lätt synliga inom 48 timmar efter inducerande differentiering.
6. Bedömning av adipogenes
- Utför Oil Red O-färgning enligt stegen nedan.
- Platta cellerna i en sexbrunnsplatta och inducera adipogen differentiering vid ~ 90% sammanflöde.
- Förbered en arbetslösning av Oil Red O genom att kombinera sex delar av Oil Red O-stamlösningen med fyra delar destillerat vatten i ett 50 ml rör. Blanda försiktigt genom att pipettera upp och ner och låt stå i 10 minuter vid RT och filtrera sedan genom ett filterpapper av grad 1 (se materialtabell) inuti tratten genom att långsamt hälla lösningen i ett 50 ml rör.
OBS: Oil Red O-stamlösning tillverkas genom att lösa upp 0,7 g Oil Red O (se materialtabell) i 200 ml 100% isopropanol i en autoklaverad flaska. Blanda väl och låt det sitta i 20 min. Förvaras vid 4 °C och håll dig borta från ljus tills den används. Detta är stabilt i 1 år. Arbetslösningen kan användas i 3 timmar; Det rekommenderas dock att använda det inom 2 timmar. - Ta bort media och tvätta försiktigt brunnarna två gånger med 2 ml förvärmd 1x PBS med en pipett. Ta bort PBS helt genom att pipettera av. Fixa celler med 2 ml 10% buffrat formalin och linda plattan med paraffinfilm. Låt stå på RT i minst 1 timme och upp till 2 dagar före färgning.
OBS: För att göra 1 liter 10% buffrad formalinlösning, blanda 100 ml 37% formaldehyd, 4,09 g NaH2PO4, 6,5 g Na2HPO4 (se materialtabell) och 900 ml destillerat vatten. Pipettera inte formalin direkt på cellerna. Dispensera försiktigt på sidoväggen nära botten av brunnen. - Ta bort formalin och tvätta försiktigt brunnarna med 2 ml destillerat vatten. Byt ut med 2 ml 60% isopropanol. Efter 5 min, ta bort isopropanol och låt brunnarna torka helt i ca 10 min. Utför alla färgningssteg på RT.
- Tillsätt 1 ml Oil Red O arbetslösning till cellerna och inkubera i 10-20 min vid RT. Ta bort fläcken genom att pipettera av och tvätta fem gånger genom att doppa i kranvatten tills ingen överflödig fläck syns. Efter den sista sköljningen, tillsätt 1 ml vatten till cellerna innan du visualiserar färgning och samlar bilder under ett mikroskop.
- För att kvantifiera lipidackumulering per skål, ta bort vatten och extrahera olja Red O-färgämne från celler genom att tillsätta 1-2 ml 100% isopropanol som är tillräckligt för att täcka celler i en brunn med sexbrunnsplatta helt. Inkubera med försiktig skakning på en plattskakare i 10 min vid RT.
- Överför 200 μL av extraktionen till en brunn av 96-brunnsanalysplattan. Kvantifiera den relativa mängden fläckar med hjälp av en spektrofotometerplattaläsare för att mäta absorbansen vid 495 nm.
- Utför färgningsanalysen av de intracellulära lipiddropparna och kärnan.
- Plattceller i svarta bottenplattor med 96 brunnar och inducera adipogen differentiering enligt beskrivningen i steg 5.3.
- För att färga cellerna, tillsätt 200 μL av färgningslösningen innehållande en fluorescerande lipidfläck och en fluorescerande DNA-fläck (se materialtabell) i 1x PBS per brunn. Efter beräkning av den totala volymen av fläcken som krävs, tillsätt två droppar av DNA-fläcken och 25 μL lipidfläcken per ml förvärmd 1x PBS med ett folieförpackat rör för att skydda lösningen från ljus. Inkubera vid RT i 20 min och skydda mot ljus.
- Läs fluorescensen med hjälp av en fluorescerande plattläsare (se materialtabell). Detektera lipidfläcken (Excitation: 485 nm / Emission: 572 nm) med ett rött filter och DNA-fläcken (Excitation: 359 nm / Emission: 450 nm) genom ett blått / cyanfilter.
OBS: Färgning kan också visualiseras och bilder tas under ett fluorescerande mikroskop. - Normalisera lipidfläckintensiteterna till DNA-fläckintensiteterna för att kvantifiera lipidackumulering i förhållande till cellnummer13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Primära preadipocyter liknar morfologiskt fibroblaster, med oregelbundna, stjärnliknande former och en central kärna (figur 2A-C). Cellerna fäster lätt vid vävnadsodlingsplast och börjar sprida sig strax efter fastsättning. De differentierar och ackumulerar snabbt lipiddroppar (figur 3D) när de förses med fettsyror i mediet. Livskraften (98%, baserat på färguteslutning) som rapporteras i de isoleringar som representeras här är typisk. Medan cellerna är ganska robusta leder aggressiv hantering under isolering till cellskador (figur 3E), vilket ger celler som fäster dåligt och inte sprider sig. Trots de förfaranden som ingår för att förhindra mikrobiell kontaminering kan överföring av icke-sterilt material ske (figur 3F). På grund av sin snabba tillväxthastighet konsumerar chick embryo preadipocyter glukos i media i höga hastigheter. Media bör bytas var 48: e timme för att upprätthålla energiförsörjningen.
De representativa resultaten som presenteras här illustrerar den adipogena potentialen hos chick embryo preadipocyter. Dessa celler ackumuleras snabbt för att utveckla lipiddroppar under adipogena förhållanden, och ackumuleringen fortskrider över tiden (figur 4 och figur 5). Två metoder har presenterats som kan användas för att bättre visualisera och kvantifiera graden av lipidackumulering i dessa celler, vilket är en direkt återspegling av adipogenes. Färgning av lipider med oil red O är en billig metod för att visualisera och kvantifiera ackumuleringen av lipiddroppar (figur 4). Ett ljusmikroskop används för att samla in bilder, och färgade celler kan hållas på bänkskivan tills bilder samlas in. Lipidackumulering i varje skål av celler kan kvantifieras enligt beskrivningen genom att extrahera fläcken och läsa absorbansen vid 495 nm med hjälp av en spektrofotometer. Med hjälp av kombinationen av de valda lipid- och DNA-fläckarna var det möjligt att kvantifiera lipidackumuleringen i förhållande till cellantalet, vilket kompenserar för icke-adipogena celler som kan kvarstå i odling (Figur 5). Om åtgärder vidtas över flera tidpunkter (figur 5B-C) gör denna kombination det möjligt att bedöma både adipogenes och proliferation, till exempel som svar på tillsatta hormoner eller peptider.
Figur 1: Fettvävnadsuppsamling. (B) Piercing av amnion med steril pincett. (C) Totalt ~ 80 mg lårbenshudfett kan erhållas från E16. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Vävnadsfragment för enzymatisk matsmältning och cellpellets efter matsmältning. (B) Pilar indikerar cellpellets efter RBC-lys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Cellmorfologiska jämförelser av isolerade primära preadipocyter. B) Preadipocyter vid 48 timmar efter isolering. (C) Preadipocyter med 80% sammanflöde vid 72 timmar efter isolering. (D) Preadipocyter efter 48 h adipogen induktion vid passage 4 är lipiddroppar synliga. Infällt indikerar den förstorade bilden av lipiddroppar. (E) Representativ bild av skadade celler. (F) Pil indikerar svarta badprickar i förorenad kultur. Skalstreck = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Utvärdering av lipidackumulering genom oljeröd O-färgning. Skalstaplar = 100 μm. (B) Kvantifiering av lipiddroppar mätt genom eluering av oil red O-färgning. Värdena uttrycks som medelvärde ± SD. a,b,c P < 0,05 med envägs ANOVA med posthoc Tukeys HSD-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Bedömning av adipocytdifferentiering med lipidfläck/DNA-fläck (A) Representativa bilder av lipidfläcken (röd) och DNA -färgningen (blå) av E16 -preadipocyter efter 24 timmar, 48 timmar och 72 timmar adipogen differentiering ex vivo. Skalstänger = 150 μm. (B) Lipidfärgning (Excitation: 485 nm / Emission: 572 nm) utfördes för att bedöma lipidackumulering i differentierade preadipocyter. (C) DNA-färgning (Excitation: 359 nm/Emission: 450 nm) utfördes för att bedöma variationer i antalet celler. (D) Förhållandet mellan lipid- och DNA-fläckar. Lipidackumulering normaliseras till DNA-innehållet. Värdena uttrycks som medelvärde ± SD . a,b,c P < 0,05 med enkelriktad ANOVA med posthoc Tukeys HSD-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Ålder (n=) | x106 celler/100 mg vävnad | Lönsamhet (%) |
| E12 (4) | 0,97 ± 0,115 a,b | 98,5 ± 0,58 a |
| E14 (4) | 1,22 ± 0,232 a,b | 98,3 ± 0,96 a,b |
| E16 (21) | 1,61 ± 1,717 a | 97,6 ± 1,58 a |
| E17 (4) | 0,81 ± 0,282 a,b | 96,8 ± 2,63 a,b |
| E18 (7) | 0,72 ± 0,611 a,b | 95,9 ± 1,81 a,b |
| E20 (4) | 0,94 ± 0,171 a,b | 97,8 ± 0,8 a,b |
| D4 (9) | 0,24 ± 0,164 a,b | 93,6 ± 4,28 b |
| D5 (4) | 0,25 ± 0,073 a,b | 98,5 ± 0,71 a,b |
| D7 (10) | 0,17 ± 0,162 b | 96,8 ± 3,49 a,b |
| D14 (4) | 0,25 ± 0,051 a,b | 99,0 ± 0,00 a,b |
Tabell 1: Genomsnittligt cellantal och viabilitet för isolerade celler från embryon och kycklingar efter kläckning.
Värdena uttrycks som medelvärde ± SD. a,b P < 0,05 med enkelriktad ANOVA med posthoc Tukeys HSD-test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Även om flera väl beskrivna protokoll har rapporterat isolering av preadipocyter 14,15,16,17, har isolering för embryonala preadipocyter optimerats, vilket kan användas för funktionella analyser av fetttillväxt och utveckling i början av livet hos slaktkycklingar. Detta protokoll ger embryonala adipocytprogenitorer med hög differentieringspotential med hög livskraft. Dessutom är det presenterade förfarandet för isolering av preadipocyter inte begränsat till embryon utan kan användas i kycklingar efter kläckning. Det har dock optimerats för användning med E16-embryon, och avkastningen från kycklingar efter kläckning är betydligt lägre (tabell 1), troligen på grund av ökningar av den relativa mängden bindväv när kycklingar växer snabbt.
Framgången för cellisolering utvärderas slutligen genom att observera formen och antalet bifogade celler (figur 3A). Lågt cellantal eller skadade celler kan observeras när vävnadsfraktionerna smälts för länge, särskilt när vävnadsdissociation fortskrider i mer än 1,5 h (figur 3E). Därför rekommenderas att 1,5 h av matsmältningen inte överskrids. Å andra sidan, om vävnadsfragmentet förblir tydligt efter en timmes matsmältning, bör matsmältningstiden eller mängden ökas. Den erhållna fettvävnadsmängden kan också varieras beroende på kycklingens genetiska stam. Om detta protokoll används för att isolera celler i andra åldrar eller arter, kommer både mängden kollagenas och matsmältningstiden sannolikt att behöva modifieras.
En vanlig begränsning av primär cellodling är att isolerade celler börjar förlora adipogen potential efter flera passager i odling; Därför är det viktigt att inducera differentiering inom några dagar efter isolering för att säkerställa att de embryonala preadipocyterna inte förlorar sin adipogena förmåga. Adipogena prekursorer av embryon differentieras lätt till mogna adipocyter i den medieformulering som beskrivs ovan, utan behov av sammanflöde eller hormonell induktion. Cellerna upp till passage 4 (10-14 dagar) differentieras lätt inom 48 timmar efter inducering (figur 3D).
Att kontrollera cellkontaminering i primär cellodling är en annan utmaning, där svampkontaminering är den vanligaste. Användningen av Amphotericin B, som beskrivits, är i allmänhet effektiv för att förhindra svamptillväxt18,19. Det kan inkluderas i låga koncentrationer i odlingsmedierna utan märkbara effekter på livskraft eller adipogen potential. Oidentifierbara mikrobiella föroreningar har observerats i form av svarta simprickar som uppträder några dagar efter cellisolering (figur 3F). Dessa påverkade celltillväxten negativt och var omöjliga att ta bort när denna infektion inträffade20. Huruvida dessa föroreningar var en okänd mikrobiell art som hittades i eller på ägg eller uppstod från en annan källa är okänt. Detta protokoll försöker minimera risken för kontaminering genom att extrahera embryon aseptiskt från ägget21. Att använda en värmebaserad instrumentsterilisator i huven under dissektion hjälper också till att minimera risken för kontaminering, särskilt när flera embryon dissekeras.
En faktor i processen är minskad celladhesion till vävnadsodlingsplattan under differentiering, till följd av fysiska förändringar när celler bildar och expanderar lipiddroppar. Även om de finns i cellerna är lipiddroppar flytande och, när de är stora, verkar de fungera som ballonger som tenderar att främja celler som lyfter från ytan. Således bör försiktighet iakttas vid hantering av preadipocyter samtidigt som differentiering induceras, och särskilt när adipogenes bedöms. Även om protokollet som presenteras här inte modifierar odlingsytan, kan celladhesion förbättras vid plätering av celler på rätter belagda med 2% gelatin. Det är också viktigt att bekräfta att pH-värdet för tvättlösningar är 7,4 och att använda förvärmd PBS-lösning när du tvättar celler och blandar med DNA-fläcken för att minska kall stress.
Med hjälp av flera embryon kan tillräckligt många celler isoleras för att ge experimentella replikat utan behov av flera passager, expansion och risken för att celler förlorar sin adipogena potential. RNA kan enkelt isoleras från både pre- och differentierade chick embryo adipocyter isolerade med fenol- eller membranbaserade kommersiella metoder för genuttrycksstudier. Tillräckligt med RNA kan erhållas från en enda brunn av en sexbrunnsplatta för användning i cDNA-syntes och uppföljning av qPCR eller RNAseq.
Sammanfattningsvis är tillgängligheten av fettdepåer i kycklingembryot för att isolera en cellmodell mycket relevant för både fjäderfä och människor. Detta protokoll är relativt enkelt att utföra, och det ger en hög andel livskraftiga celler som lätt kan induceras att genomgå adipogen differentiering in vitro. Befruktade kycklingägg kan erhållas från olika kommersiella källor till minimal kostnad, vilket gör dessa celler till en lättillgänglig modell för praktisk användning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar UT AgResearch och Institutionen för husdjursvetenskap för att stödja och optimera detta protokoll. Detta arbete finansierades av USDA-bidrag.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Pipette | Eppendorf | Z683825 | Single Channel Pipette, 100 - 1000 µL |
| 1 mL Pipette Tip | Fisher Scientific | 02-707-402 | |
| 100% Isopropanol | Fisher Scientific | A426P4 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010023 | |
| 25 mL Flask | Pyrex | 4980-25 | |
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | F75P-1GAL | |
| 6-Well Plate | Falcon | 353046 | Tissue Culture-treated |
| 96-Well Assay Plate | Costar | 3632 | |
| 96-Well Plate, Black Bottom | Costar | 3603 | Tissue Culture-treated |
| AdipoRed | Lonza | PT-7009 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290026 | |
| Bench Top Wiper (Kimtechwiper) | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Betadine | Up & Up | NDC 1167300334 | 20% Working Solution |
| Cell Counter | Corning | 6749 | |
| Cell Strainer, 40 µm | SPL | 93040 | |
| Centrifugaton | Eppendorf | 5702 | |
| Chicken Serum | Gibco | 16110082 | |
| Conical Centrifuge Tubes, 15 mL | VWR | 10025-690 | |
| Conical Centrifuge Tubes, 50 mL | Falcon | 352098 | |
| Cryovial | Nunc | 343958 | |
| Curved Forceps, 100 mm | Roboz Surgical | RS-5137 | |
| Curved Surgical Scissors, 115 mm | Roboz Surgical | RS-6839 | |
| Distilled Water | Millipore | SYNSV0000 | Despensed as needed |
| DMEM/F12 | HyClone | SH30023.01 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | 70% Working Solution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10437028 | |
| Fluorescent Microscope | EVOS | M7000 | |
| Fluorescent Plate Reader | Biotek | Synergy H1 | |
| Foil | Reynolds | Reynolds Wrap Heavy Duty Aluminum Foil, 125 SQ. FT. | |
| Freezing Container | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| Gelatin | Millipore | 4055 | 2% Working Solution |
| Hematocytometer (Counting Chamber) | Corning | 480200 | 0.1 mm deep |
| Incubator | Fisher Scientific | 6845 | |
| Instrument Sterilizer | VWR | B1205 | |
| Linoleic Acid-Oleic Acid-Albumin | Sigma | L9655 | 1x Working Solution |
| Microscope | Evos | AMEX1000 | |
| Multi-Channel Pipette | Thermo Scientific | 4661070 | 12-Channel Pipetters, 30 - 300 µL |
| Na2HPO4 | Sigma | S-7907 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S-3139 | |
| NucBlue | Invitrogen | R37605 | |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | |
| Orbital Shaker | IKA | KS130BS1 | |
| Paper Towel | Tork | RK8002 | |
| Parafilm | Parafilm M | PM996 | |
| Penicillin/Steptomycin (P/S) | Gibco | 15140122 | 1x Working Solution |
| Petri dishes, 100 mm | Falcon | 351029 | |
| Petri dishes, 60 mm | Falcon | 351007 | |
| Plate Shaker | VWR | 200 | |
| RBC Lysis Buffer | Roche | 11814389001 | |
| Reagent Reservior | VWR | 89094-680 | |
| Small Beaker, 100 mL | Pyrex | 1000-100 | |
| Spectrophotometer Plate Reader | Biotek | Synergy H1 | |
| Sterile Gauze | McKesson | 762703 | |
| Straight Forceps, 120 mm | Roboz Surgical | RS-4960 | |
| Straight Scissors, 140 mm | Roboz Surgical | RS-6762 | |
| T-25 Flask | Corning | 430639 | Tissue Culture-treated |
| Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Tissue Strainer, 250 µm | Pierce | 87791 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250061 | |
| Trypsin | Gibco | 15400054 | 0.1% Working Solution |
| Tweezers, 110 mm | Roboz Surgical | RS-5035 | |
| Type 1 Collagenase | Gibco | 17100017 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | 15-462-10 | |
| Whatman Grade 1 Filter Paper | Whatman | 1001-110 |
References
- Fryar, C. D., Carroll, M. D., Ogden, C. L. Prevalence of overweight, obesity, and severe obesity among children and adolescents aged 2-19 years: United States, 1963-1965 through 2015-2016. , (2018).
- Siegel, P. B. Evolution of the modern broiler and feed efficiency. Annual Review of Animal Biosciences. 2 (1), 375-385 (2014).
- Zuidhof, M. J., Schneider, B. L., Carney, V. L., Korver, D., Robinson, F. Growth, efficiency, and yield of commercial broilers from 1957, 1978, and 2005. Poultry Science. 93 (12), 2970-2982 (2014).
- Poulos, S. P., Dodson, M. V., Hausman, G. J. Cell line models for differentiation: preadipocytes and adipocytes. Experimental Biology and Medicine. 235 (10), 1185-1193 (2010).
- Vilaboa, S. D. -A., Navarro-Palou, M., Llull, R. Age influence on stromal vascular fraction cell yield obtained from human lipoaspirates. Cytotherapy. 16 (8), 1092-1097 (2014).
- Speake, B. K., Noble, R. C., McCartney, R. J. Tissue-specific changes in lipid composition and lipoprotein lipase activity during the development of the chick embryo. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Lipids and Lipid Metabolism. 1165 (3), 263-270 (1993).
- Chen, P., Suh, Y., Choi, Y. M., Shin, S., Lee, K. Developmental regulation of adipose tissue growth through hyperplasia and hypertrophy in the embryonic Leghorn and broiler. Poultry Science. 93 (7), 1809-1817 (2014).
- Farkas, K., Ratchford, I. A., Noble, R. C., Speake, B. K. Changes in the size and docosahexaenoic acid content of adipocytes during chick embryo development. Lipids. 31 (3), 313-321 (1996).
- Claver, J. A., Quaglia, A. I. Comparative morphology, development, and function of blood cells in nonmammalian vertebrates. Journal of Exotic Pet Medicine. 18 (2), 87-97 (2009).
- Corning Cell Counter Demo Video. , Available from: https://www.youtube.com/watch?v=JWjckEHO6Wg (2022).
- Nema, R., Khare, S. An animal cell culture: Advance technology for modern research. Advances in Bioscience and Biotechnology. 3 (3), 219-226 (2012).
- Regassa, A., Kim, W. K. Effects of oleic acid and chicken serum on the expression of adipogenic transcription factors and adipogenic differentiation in hen preadipocytes. Cell Biology International. 37 (9), 961-971 (2013).
- Temkin, A. M. Effects of crude oil/dispersant mixture and dispersant components on PPAR γ activity in vitro and in vivo: identification of dioctyl sodium sulfosuccinate (DOSS; CAS# 577-11-7) as a probable obesogen. Environmental Health Perspectives. 124, 112-119 (2016).
- Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. Adipose Tissue Protocols. , Springer. 201-219 (2008).
- Lee, M. J., Wu, Y., Fried, S. K. A modified protocol to maximize differentiation of human preadipocytes and improve metabolic phenotypes. Obesity. 20 (12), 2334-2340 (2012).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).
- Akbar, N., Pinnick, K. E., Paget, D., Choudhury, R. P. Isolation and characterization of human adipocyte-derived extracellular vesicles using filtration and ultracentrifugation. Journal of Visualized Experiments. (170), e61979 (2021).
- Perlman, D., Giuffre, N. A., Brindle, S. A. Use of Fungizone in control of fungi and yeasts in tissue culture. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 106 (4), 880-883 (1961).
- Kuhlmann, I. The prophylactic use of antibiotics in cell culture. Cytotechnology. 19 (2), 95-105 (1995).
- Yang, X., et al. Black swimming dots in cell culture: the identity, detection method and judging criteria. bioRxiv. , 366906 (2018).
- Freshney, R. I. Culture of animal cells: a manual of basic technique and specialized applications. , John Wiley & Sons. 163-186 (2015).
