Summary
Den nåværende protokollen beskriver en enkel metode for å isolere preadipocytter fra fettvev i broiler embryoer. Denne metoden muliggjør isolasjon med høyt utbytte, primærkultur og adipogene differensiering av preadipocytter. Oljerød O-farging og lipid/DNA-flekk målte den adipogene evnen til isolerte celler indusert med differensieringsmedier.
Abstract
Primære preadipocytter er et verdifullt eksperimentelt system for å forstå de molekylære veiene som styrer adipocytdifferensiering og metabolisme. Kyllingembryoer gir muligheten til å isolere preadipocytter fra det tidligste stadiet av fettutvikling. Denne primære cellen kan brukes til å identifisere faktorer som påvirker preadipocyttproliferasjon og adipogene differensiering, noe som gjør dem til en verdifull modell for studier relatert til barndommen fedme og kontroll av overflødig fettavsetning i fjærfe. Den raske veksten av postnatal fettvev kaster effektivt bort fôr ved å tildele det bort fra muskelvekst hos kyllingekyllinger. Derfor kan metoder for å forstå de tidligste stadiene av fettvevsutvikling gi ledetråder for å regulere denne tendensen og identifisere måter å begrense fettutvidelse tidlig i livet. Den nåværende studien ble designet for å utvikle en effektiv metode for isolasjon, primærkultur og adipogene differensiering av preadipocytter isolert fra å utvikle fettvev av kommersielle broilere (kjøtttype) kyllingembryoer. Prosedyren er optimalisert for å gi celler med høy levedyktighet (~ 98%) og økt kapasitet til å skille seg ut i modne adipocytter. Denne enkle metoden for embryonal preadipocyttisolasjon, kultur og differensiering støtter funksjonelle analyser av fettvekst og utvikling tidlig i livet.
Introduction
Fedme er en global helsetrussel for både voksne og barn. Barn som er overvektige eller overvektige er omtrent fem ganger mer sannsynlig å være overvektige som voksne, noe som gir dem betydelig økt risiko for kardiovaskulær sykdom, diabetes og mange andre komorbiditeter. Omtrent 13,4% av amerikanske barn i alderen 2-5 har fedme1, noe som illustrerer at tendensen til å akkumulere overflødig kroppsfett kan settes i gang veldig tidlig i livet. Av svært forskjellige grunner er opphopning av overflødig fettvev en bekymring for broiler (kjøtttype) kyllinger. Moderne broilere er utrolig effektive, men akkumulerer fortsatt mer lipid enn det som er fysiologisk nødvendig 2,3. Denne tendensen begynner kort tid etter luke og kaster effektivt bort fôr, den dyreste produksjonskomponenten, ved å tildele den bort fra muskelvekst. Derfor, for både barn og kyllingekyllinger, om enn av svært forskjellige grunner, er det behov for å forstå faktorer som påvirker fettvevsutvikling og identifisere måter å begrense fettutvidelse tidlig i livet.
Adipocytter dannes fra preadipocytter, fettvevsavledede stamceller som gjennomgår differensiering for å utvikle modne, lipidlagring av fettceller. Følgelig er preadipocytter in vitro en verdifull eksperimentell modell for fedmestudier. Disse cellene, isolert fra den stromale vaskulære brøkdelen av fettdepoter, kan gi en grunnleggende forståelse av molekylære veier som kontrollerer adipocytdifferensiering og metabolisme 4,5. Chick embryoer er en gunstig eksperimentell modell i utviklingsstudier fordi dyrking av egg på ønsket tidsplan gjør eksperimentell manipulasjon enklere, da det gjør det mulig å skaffe embryoer uten mors offer for å observere en rekke utviklingsstadier av embryoer. Videre er det ikke nødvendig med kompliserte kirurgiske prosedyrer og lange tidsperioder for å oppnå embryoer i forhold til større dyremodeller. Derfor presenterer kyllingembryoen en mulighet til å oppnå preadipocytter fra de tidligste stadiene av fettvevsutvikling. Subkutant fettvev blir synlig hos kyllingen rundt embryonal dag 12 (E12) som et klart definert depot som ligger rundt låret. Dette depotet er beriket i svært proliferative preadipocytter som aktivt gjennomgår differensiering under utviklingssignaler for å danne modne adipocytter 6,7. Prosessen med adipogene differensiering er sammenlignbar mellom kyllinger og mennesker. Derfor kan preadipocytter isolert fra kyllingembryoer brukes som en dual-purpose modell for studier som er relevante for mennesker og fjærfe. Imidlertid avtar utbyttet av preadipocytter med aldring etter hvert som cellene vokser til modne adipocytter5.
Den nåværende protokollen optimaliserer isolasjonen av preadipocytter fra fettvev i løpet av scenen (E16-E18) der adipogene differensiering og adipocytthypertrofi er på topp i broiler chick embryoer8. Denne prosedyren kan vurdere effekten av faktorer som det utviklende embryoet er utsatt for i ovo, for eksempel hønediett, på adipocyttutvikling og adipogene potensielle ex vivo. Det kan også teste virkningen av ulike manipulasjoner (f.eks. hypoksi, næringstilsetninger, farmakologiske agonister og antagonister) på adipogenese eller de forskjellige 'omes (f.eks. transkripsjonom, metabolom, metylom) av adipocyttgenitorer. Som en representasjon av det tidligste stadiet av fettdannelse, er celler oppnådd ved hjelp av denne protokollen verdifulle modeller for studier som er relevante for fjærfe og mennesker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreprosedyrer ble godkjent av University of Tennessee Institutional Animal Care and Use Committee. Nybefruktede kommersielle broileregg (Cobb 500) ble hentet fra et lokalt klekkeri. Egg ble inkubert ved 38 °C med 60 % relativ luftfuktighet frem til disseksjoner på embryonale dager 16-18 (E16-E18). Fettvev ble samlet inn fra det subkutane (femorale) depotet.
1. Forberedelse til isolasjon og kultur
- Forbered kulturhetten og instrumentene.
- Før du starter disseksjoner, sett opp et arbeidsområde i laminærstrømningshetten. Desinfiser arbeidsområdet og alle instrumentene ved å swabbing med 70% etanol. Utfør alle prosedyrer ved hjelp av sterile materialer.
MERK: Vattpinne alltid beholderne og instrumentene med 70 % etanol før du setter dem tilbake i cellekulturhetten. Det anbefales å plassere en sterilisator for benkeplater i hetten slik at instrumentene lett kan steriliseres mellom embryoer.
FORSIKTIG: Når du bruker en instrumentsterilisator, må du kjøle ned det varme instrumentet på riktig måte for å unngå brannskader og vevskader. En minimum kjøletid på 3 min anbefales. Vattpinne med 70% etanol før bruk. - Monter følgende instrumenter og kar i hetten: rette tang (120 mm), pinsett (110 mm), to par buede tang (100 mm), to par rett saks (140 mm), buet kirurgisk saks (11 5 mm), vevssil (250 μm nylonnett), cellesil (40 μm nylonnett), koniske sentrifugerør (15 ml og 50 ml), Petri-retter (60 mm og 100 mm), lite beger (100 ml), 70 % etanolspray og steril gasbind, papirhåndkle og benkvisker (se Materialbord).
- Før du starter disseksjoner, sett opp et arbeidsområde i laminærstrømningshetten. Desinfiser arbeidsområdet og alle instrumentene ved å swabbing med 70% etanol. Utfør alle prosedyrer ved hjelp av sterile materialer.
- Forbered enzymatisk løsning, innsamlingsmedier og kulturmedier ved å følge trinnene nedenfor.
MERK: Klargjør løsningene på forhånd og oppbevar dem ved 4 °C til bruk. Media må plasseres på is før vevsinnsamling. Alle reagenser som brukes i dette trinnet er oppført i materiallisten.- Forbered medier som brukes til både innsamling av fettvev og fremstilling av enzymatisk løsning ved å supplere DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium med 2,50 mM L-glutamin og 1 5 mM HEPES buffer) med 2,5 μg/ml amfotericin B og 1x penicillin/streptomycin (P/S), 100 U/ml. Oppbevars ved 4 °C til bruk.
MERK: Dette mediet forblir stabilt i 1 år når det oppbevares ved 4 °C. - Forbered steriliseringsløsningen ved å fortynne Betadine til 20 % (v/v) i 1x PBS (fosfatbufret saltvann med pH 7,4, uten kalsium, magnesium eller fenolrød) med 2,5 μg/ml amphotericin B. Oppbevares ved 4 °C til bruk.
MERK: Oppløsningen er stabil i 2 år når den oppbevares ved 4 °C. - Forbered enzymatisk oppløsning ved å oppløse type 1 kollagen (1 mg/ml) i DMEM/F12 med 2,5 μg/ml amphotericin B og 1x P/S (trinn 1.2.1). Lag fersk kollagenoppløsning og vedlikehold den på is under disseksjoner. Ca. 10 min før bruk, forvarm ved å inkubere denne oppløsningen ved 37 °C i et vannbad for å initiere sin enzymatiske aktivitet.
MERK: Omtrent 1 ml kollagenoppløsning (1 mg/ml) er nødvendig per 100 mg fettvev. - Forbered vekstmedier som brukes til plating og forplantning ved å supplere DMEM / F12-medier med 1x P / S og 10% FBS. Oppbevars ved 4 °C til bruk.
MERK: Oppløsningen er stabil i 1 år når den oppbevares ved 4 °C. - Forbered vaskeløsningen ved å supplere 1x PBS med 2,5 μg/ml amfotericin B. Juster oppløsningen til ønsket pH 7.4. Oppbevars ved 4 °C til bruk.
MERK: Oppløsningen er stabil i 2 år når den oppbevares ved 4 °C.
- Forbered medier som brukes til både innsamling av fettvev og fremstilling av enzymatisk løsning ved å supplere DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium med 2,50 mM L-glutamin og 1 5 mM HEPES buffer) med 2,5 μg/ml amfotericin B og 1x penicillin/streptomycin (P/S), 100 U/ml. Oppbevars ved 4 °C til bruk.
2. Fettvevsinnsamling og fordøyelse
- Euthanize embryoet.
- På embryonal dag 16, fjern eggene fra inkubatoren. Den primære potensielle kilden til mikrobiell forurensning er eggets overflate; Derfor, vattpinne eggene med en steril gasbind gjennomvåt i 70% etanol før du sprekker dem. Etter swabbing, plasser egget vertikalt med den spisse enden ned på et lite beger (100 ml) foret med papirhåndklær for å dempe egget fra glasset.
- Bruk tanghåndtaket til å bryte et egg ved å trykke på den stumpe enden av egget. Fjern eggeskallet forsiktig for å skape en åpning som er tilstrekkelig stor til å fjerne embryoet (trinn 2.1.3). Riv forsiktig den hvite skallmembranen for å eksponere embryoet (figur 1A). Pierce amnion forsiktig ved hjelp av sterile pinsett (Figur 1B).
MERK: Fostersekken er en gjennomsiktig membran fylt med fostervann som omslutter embryoet. - Fjern embryoet fra egget ved å gripe embryoets nakke lett ved hjelp av rette tang. Kutt eggeplommesekken for å koble den fra embryoet, og overfør embryoet til en 100 mm Petri-tallerken.
- Decapitate umiddelbart ved hjelp av kirurgisk saks og tang.
- Utfør fettvevssamlingen.
- Vattpinne embryokroppen med 70% etanol og skrubb hudoverflaten forsiktig med en steril gasbind for å fjerne fjær, da de kan forstyrre filtrering ved senere trinn etter fordøyelsen. Bruk benkviskere for å hindre at hud og fjær berører oppsamlet vev.
- Klipp av huden mellom bena og bukområdet for å avsløre paret femorale fettdepoter.
- Hold huden rundt benet ved hjelp av buede tang med en hånd. Fjern forsiktig lårbenets subkutane fett med den andre hånden, ved hjelp av buede tang for å forsiktig trekke depotet bort fra benet.
MERK: Det er relativt lite bindevev som fester seg til fettputen til benet, og hele fettputen skal være avtagbar i ett stykke ved hjelp av bare tang. Dette kan forenkles ved å holde tangene bakover slik at de buede delene (i stedet for endene) klemmer fettputen for fjerning.- Om nødvendig, kutt fettputen bort med buet saks. Gjenta med den andre fettputen og ekstra embryoer etter behov.
MERK: Totalt 80 mg subkutant fett kan fås fra de fleste embryoer på E16 (figur 1C). Dette gir vanligvis ~ 1 x 106 celler, tilstrekkelig til å plate en T-25 kolbe. Det kan være nyttig på dette trinnet å veie fettputer fra noen få embryoer for å vurdere mengden startmateriale, da fettputevekter kan variere på tvers av spesifikke broilerlinjer, og på grunn av ukontrollerbare faktorer, for eksempel oppdretterhønsalder og diett. Subkutant fett ble rutinemessig samlet inn fra fem egg for å sikre et tilstrekkelig utbytte av celler for plating i flere kolber.
- Om nødvendig, kutt fettputen bort med buet saks. Gjenta med den andre fettputen og ekstra embryoer etter behov.
- Overfør vevet til ~ 5 ml oppsamlingsmedier i et 15 ml rør og gjenta disseksjonen for de resterende eggene.
- Skyll kort de oppsamlede fettputene ved å overføre dem til en 60 mm Petri-tallerken som inneholder steriliseringsløsning og virvle parabolen et par ganger.
- Skyll av steriliseringsløsningen ved å overføre fettputer til en 60 mm Petri-tallerken som inneholder 1x PBS. Virvle forsiktig. Gjenta dette trinnet ved å overføre til en annen 60 mm Petri-tallerken som inneholder 1x PBS.
- Utfør enzymatisk fordøyelse og preadipocyttisolasjon ved å følge trinnene nedenfor.
- Overfør fettvevet til et 15 ml rør som inneholder ~1 ml forvarmet enzymatisk oppløsning per 100 mg vev. Senk et par lange, rette saks i røret og hakk fettvevet i oppløsningen i så små biter som mulig (~1 mm3) (figur 2A).
MERK: Celleutbyttet reduseres hvis vevet ikke blir grundig hakket. - Overfør hakket vev og enzymatisk løsning til en 25 ml autoklavert kolbe. Pakk kolben med parafinfilm. Plasser på en orbital shaker inne i en inkubator og rist ved 37 °C under fordøyelsestrinnet.
MERK: Alternativt kan du bruke et ristende vannbad. Med begge tilnærmingene bør hastigheten være tilstrekkelig til å forhindre at vevsstykker legger seg til bunnen av kolben, men må ikke være så raske at stykker drives til toppen av kolben og holder seg til glasset, eller at væske akkumuleres på paraffinfilmdekselet. - Etter ~30 min, kutt enden av en 1 ml pipettespiss til en diameter på ca. 3 mm. Pipette vevsblandingen opp og ned et par ganger for å frigjøre cellene fra fettvevet. Returner kolben til inkubatoren/vannbadet og fortsett å riste.
- Etter ytterligere 15 min, kontroller kolben for fullstendig fordøyelse. Etter å ha fjernet kolben fra shakeren, dannes et lag med hvite celler på toppen av væskelaget. Hvis vevsfragmenter fortsatt forblir, kutt enden fra en annen pipettespiss og rør blandingen forsiktig opp og ned, og fortsett å riste i ytterligere 15 minutter.
MERK: Helt fordøyd vev/kollagenaseblanding ser ut som melkeaktig chyme. Vanligvis fordøyes vevet tilstrekkelig etter 1 time med mild risting. Hvis mange fragmenter forblir på dette punktet, kan det indikere et problem med kollagenaseenzymet som brukes. Konstant risting kan øke utbyttet; Imidlertid kan langvarig eksponering for enzymet og det fysiske stresset også skade cellene. - Etter fordøyelsen, pipette forsiktig opp og ned for å blande godt. Filtrer gjennom en 250 μm vevsil i et 15 ml rør ved pipettering for å fjerne biter av ufordøyd vev og rusk.
- Skyll kolben med 4 ml vekstmedier ved å pipettere for å fjerne celler som kan festes til glasset, og filtrer inn i det samme 15 ml røret. Skyll silen med ekstra vekstmedier ved å pipettere for å løsne eventuelle fanget celler, opp til et totalt volum på 14 ml.
- Pellet cellefraksjonen ved sentrifugering ved 300 x g i 5 min ved RT (7 min for 50 ml rør).
MERK: Vattpinne alltid rørene med 70 % etanol før du går tilbake til cellekulturhetten. - Aspirer supernatanten. Vær forsiktig så du ikke løsner cellepellet. Resuspend pellet forsiktig i 1 ml rød blodcelle lysis buffer (se Tabell over materialer) ved pipettering opp og ned, og inkubere i 5 min ved RT. Oppløsningen blir rødaktig når røde blodlegemer lyser (figur 2B).
MERK: Plasser RBC lysis-bufferen på RT før bruk. Kyllinger har nukleerte røde blodlegemer9, og de festes til vevskulturretter sammen med preadipocytter. RBC lysis buffer brukes til å lyse disse cellene for å forhindre forstyrrelser i nøyaktige celletall. - Tilsett 5 ml vekstmedier i røret som inneholder cellene for å fortynne lysisbufferen og bland forsiktig ved å pipettere opp og ned. Bruk en pipette til å filtrere gjennom en 40 μm cellesil inn i et nytt 50 ml rør og skyll silen med ytterligere 5 ml vekstmedier.
- Pelletsceller ved sentrifugering ved 300 x g i 7 min ved RT. Aspirer forsiktig supernatanten og resuspend den gjenværende cellepelleten i 1 ml vekstmedier ved å pipettere opp og ned.
- Bruk et hemocytometer, en celleteller og en Trypan Blue-flekk til å telle celler og bestemme cellens levedyktighet. Ta 10 μL prøve og bland med 10 μL Trypan Blue ved pipettering. Last 10 μL av blandingen på hematocytometeret og mål10.
MERK: Sentrifugeringshastighetene kan økes til 600 x g hvis tilstrekkelige cellepellets ikke er lett synlige etter det første spinnet.
- Bruk et hemocytometer, en celleteller og en Trypan Blue-flekk til å telle celler og bestemme cellens levedyktighet. Ta 10 μL prøve og bland med 10 μL Trypan Blue ved pipettering. Last 10 μL av blandingen på hematocytometeret og mål10.
- Overfør fettvevet til et 15 ml rør som inneholder ~1 ml forvarmet enzymatisk oppløsning per 100 mg vev. Senk et par lange, rette saks i røret og hakk fettvevet i oppløsningen i så små biter som mulig (~1 mm3) (figur 2A).
3. Såing og kultur av preadipocytter
- Frø ~1 x 106 celler i 4 ml forvarmede vekstmedier i en T-25 kolbe. Følg samme platingtetthet ved bruk av andre typer kulturfartøy. Plasser i vev kultur inkubator og la feste over natten.
MERK: Cellene dyrkes i en inkubator på 38 °C med en fuktig atmosfære på 5 % CO2. Den optimale temperaturen for veksten av fugleceller11 er 38 °C, og de vokser sakte ved 37 °C. - Neste dag, aspirere medier og forsiktig vaske cellene med 1x PBS ved pipettering for å fjerne unattached eller døde celler. Erstatt med 4 ml ferske vekstmedier. Kontroller cellene under et mikroskop. Celler skal være spindly formet, som fibroblaster (figur 2A).
MERK: Vanligvis festes preadipocytter ganske raskt (innen få timer). Suksessen eller feilen i celleisolasjon kan bekreftes på dette tidspunktet (etter 24 timer). - Erstatt med 4 ml ferske vekstmedier annenhver dag og subkultur eller kryopreservere celler når de når 70% -80% samløp (figur 3C).
4. Subkulturering og kryopreservering
- Aspirer gamle medier og vask forsiktig celler med 4 ml 1x PBS ved pipettering. Aspirat PBS, tilsett 2 ml 0,1% trypsin for å dekke celleoverflaten i en T-25 kolbe (juster volumet tilsvarende for andre kulturfartøy), og inkuber deretter i 3-4 min ved 38 °C.
MERK: Vær oppmerksom på om cellene løsnes fra kulturplaten. Trykk forsiktig på kulturplaten for å hjelpe til med celleavløsning. Inkubering av celler med trypsin for lenge vil skade celler. - Legg til et tilsvarende volum av forhåndsvarmede vekstmedier for å hemme trypsinreaksjonen. Pipette over celleoverflaten flere ganger, vippe platen for å løsne de resterende cellene.
- Overfør celleopphenget til et 15 ml rør og sentrifuge ved 300 x g i 5 minutter ved RT (7 min for 50 ml rør). Aspirer supernatanten.
- Ved subkulturering, resuspend pellet i 1 ml vekstmedier ved pipettering opp og ned. Tell celler som beskrevet i trinn 2.3.9.1, og skriv deretter inn på nytt med samme platingtetthet som først ble brukt i trinn 3.1.
- Hvis kryopreservering, forberede 4 ml frysemedier for en T-25 kolbe med 90% samløp.
MERK: Frysemedier består av 10% DMSO, 30% FBS og 60% DMEM / F12. - Resuspendcellepellet i frysende medier og overfør 1 ml frysemedier til en kryovial. Frys kryovariene langsomt til -1 °C/min med en frysebeholder. Plasser beholderen i en -80 °C fryser over natten og overfør den deretter til flytende nitrogen for langvarig lagring.
MERK: Riktig kryopreserverte preadipocytter opprettholder sin levedyktighet i minst 3 år og fungerer vanligvis som nyisolerte celler når de tines og belagt.
5. Abogen differensiering
MERK: 2% gelatinbelagte plater kan brukes til å forbedre celleadhesjon.
- Forbered en 2% (m/v) gelatinoppløsning (se Materialbord) i destillert vann. Autoklav ved 121 °C, 15 psi i 30 minutter for sterilisering. Frakkkulturoverflate med 5-10 μL gelatinoppløsning/cm2 (dvs. 100-200 μg/cm2). Virvle forsiktig for å jevnt belegge overflaten.
- Kontroller plater for jevn spredning av gelatinoppløsningen siden noen regioner kan forbli ubestrøket i utgangspunktet. La den gelatinbelagte platen forbli på RT i minst 1 time. Fjern hele volumet av gelatinoppløsning fra brønnene.
MERK: Dette vil etterlate en tynn gelatinjakke på bunnen av brønnene / rettene. Gelatinoppløsning kan gjenbrukes flere ganger (minst 10 ganger) uten å endre celleadhesjon og vekst. La de gelatinbelagte rettene forbli i vevskulturhetten i minst 30 minutter før du plating cellene. - Induser kyllingpreadipocyttene til å gjennomgå adipogene differensiering ved å supplere vekstmedier med fettsyrer. For å forberede adipogene differensieringsmedier (ADM), supplere DMEM/F12 med 10 % kyllingserum, 1x linolsyre-oljesyre-albumin (9,4 μg/ml) og 1x P/S (se materialfortegnelse). Gjør ADM frisk og varm før bruk.
MERK: Kyllingpreadipocytter blir ofte indusert til å gjennomgå adipogene differensiering ved å supplere medier med fettsyrer i stedet for hormonelle cocktailer som vanligvis brukes til adipocytter fra andre arter12. - Induser differensiering ved å erstatte vekstmedier med adipogene differensieringsmedier når cellene når ~ 90% samløp. Oppretthold celler i dette mediet, og erstatt dem annenhver dag. Vurder differensiering visuelt under et mikroskop (20x) basert på dannelsen av lipiddråper, som blir lett synlig innen 48 timer etter å ha indusert differensiering.
6. Vurdering av adipogenese
- Utfør oljerød O-farging ved å følge trinnene nedenfor.
- Plate cellene i en seks-brønns plate og indusere adipogene differensiering på ~ 90% samløp.
- Forbered en arbeidsløsning av Oil Red O ved å kombinere seks deler av oljerød O-lagerløsningen med fire deler destillert vann i et 50 ml rør. Bland forsiktig ved å pipettere opp og ned og la stå i 10 minutter ved RT, og filtrer deretter gjennom et filterpapir av grad 1 (se Materialbord) inne i trakten ved å sakte helle oppløsningen i et 50 ml rør.
MERK: Oljerød O lagerløsning er laget ved å oppløse 0,7 g oljerød O (se materialtabellen) i 200 ml 100% isopropanol i en autoklavert flaske. Bland godt og la det sitte i 20 min. Oppbevars ved 4 °C og holdes borte fra lyset til bruk. Dette er stabilt i 1 år. Arbeidsløsningen kan brukes i 3 timer; Det anbefales imidlertid å bruke det innen 2 timer. - Fjern medier og vask brønnene forsiktig to ganger med 2 ml forvarmet 1x PBS ved hjelp av en pipette. Fjern PBS helt ved å pipettere av. Fest celler med 2 ml 10% bufret formalin og pakk platen med parafinfilm. La det stå i RT i minst 1 time og opptil 2 dager før farging.
MERK: For å lage 1 L av 10% bufret formalinløsning, bland 100 ml 37% formaldehyd, 4,09 g NaH2PO4, 6,5 g Na2HPO4 (se Materialtabell) og 900 ml destillert vann. Ikke pipette formalin direkte på cellene. Dispenser forsiktig på sideveggen nær bunnen av brønnen. - Fjern formalin og vask forsiktig brønnene med 2 ml destillert vann. Erstatt med 2 ml 60% isopropanol. Etter 5 min, fjern isopropanol og la brønnene tørke helt i ca 10 min. Utfør alle fargingstrinnene på RT.
- Tilsett 1 ml oljerød O arbeidsløsning i celler og inkuber i 10-20 min ved RT. Fjern flekken ved å pipettere av og vask fem ganger ved å dyppe i vann fra springen til det ikke er sett overflødig flekk. Etter den endelige skyllingen, tilsett 1 ml vann til celler før du visualiserer farging og innsamling av bilder under et mikroskop.
- For å kvantifisere lipidakkumulering per tallerken, fjern vann og trekk oljerød o fargestoff fra celler ved å legge til 1-2 ml 100% isopropanol som er tilstrekkelig til å dekke celler i en brønn på seks brønnplate helt. Inkuber med skånsom risting på en tallerken shaker i 10 min på RT.
- Overfør 200 μL av ekstraksjonen til en brønn av den 96-brønns analyseplaten. Kvantifisere den relative mengden flekk ved hjelp av en spektrofotometerplateleser for å måle absorbans ved 495 nm.
- Utfør fargingsanalysen av de intracellulære lipiddråpene og kjernen.
- Plateceller i svart bunn 96-brønnsplater og indusere adipogene differensiering som beskrevet i trinn 5.3.
- For å flekke cellene, tilsett 200 μL av fargeløsningen som inneholder en fluorescerende lipidflekk og en fluorescerende DNA-flekk (se Materialtabell) i 1x PBS per brønn. Etter å ha beregnet det totale volumet av flekken som kreves, legg til to dråper DNA-flekk og 25 μL lipidflekk per ml forvarmet 1x PBS ved hjelp av et foliepakket rør for å beskytte løsningen mot lys. Inkuber på RT i 20 min og beskytt mot lys.
- Les fluorescensen ved hjelp av en fluorescerende plateleser (se Materialfortegnelse). Oppdag lipidflekken (Eksitasjon: 485 nm/Utslipp: 572 nm) ved hjelp av et rødt filter og DNA-flekken (Eksitasjon: 359 nm/Utslipp: 450 nm) gjennom et blått/cyan filter.
MERK: Farging kan også visualiseres og bilder tatt under et fluorescerende mikroskop. - Normaliser lipidflekkintensitetene til DNA-flekkintensitetene for å kvantifisere lipidakkumulering i forhold til celle nummer13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Primære preadipocytter er morfologiske lik fibroblaster, med uregelmessige, stjernelignende former og en sentral kjerne (figur 2A-C). Cellene holder seg lett til vevskulturplast og begynner å spre seg kort tid etter vedlegg. De skiller raskt og akkumulerer lipiddråper (figur 3D) når de leveres med fettsyrer i media. Levedyktigheten (98%, basert på fargestoffekskludering) rapportert i isolasjonene som er representert her, er typisk. Mens cellene er ganske robuste, fører aggressiv håndtering under isolasjon til celleskade (figur 3E), noe som gir celler som fester seg dårlig og ikke klarer å spre seg. Til tross for prosedyrene som er inkorporert for å forhindre mikrobiell kontaminering, kan overføring av ikke-sterilt materiale forekomme (figur 3F). På grunn av deres raske vekstrate bruker kyllingembryopreadipocytter glukose i media ved høye priser. Media bør endres hver 48.
De representative resultatene som presenteres her illustrerer det adipogene potensialet til kyllingembryopreadipocytter. Disse cellene akkumuleres raskt for å utvikle lipiddråper under adipogene forhold, og akkumuleringen utvikler seg over tid (figur 4 og figur 5). Det er presentert to metoder som kan brukes til bedre å visualisere og kvantifisere graden av lipidakkumulering i disse cellene, som er en direkte refleksjon av adipogenese. Farging av lipider med oljerød O er en rimelig metode for å visualisere og kvantifisere opphopningen av lipiddråper (figur 4). Et lysmikroskop brukes til å samle bilder, og fargede celler kan holdes på benken til bilder samles inn. Lipidakkumulering i hver tallerken med celler kan kvantifiseres som beskrevet ved å trekke ut flekken og lese absorbansen ved 495 nm ved hjelp av et spektrofotometer. Ved hjelp av kombinasjonen av de valgte lipid- og DNA-flekkene var det mulig å kvantifisere lipidakkumuleringen i forhold til cellenummer, som kompenserer for ikke-adipogene celler som kan vedvare i kulturen (figur 5). Hvis det treffes tiltak over flere tidspunkter (figur 5B-C), gjør denne kombinasjonen det mulig å vurdere både adipogenese og spredning, for eksempel som svar på tilsatte hormoner eller peptider.
Figur 1: Fettvevssamling. (A) Ved brudd på eggeskallet ble den hvite skallmembranen avslørt. (B) Piercing amnion ved hjelp av sterile pinsett. (C) Totalt ~80 mg låral subkutant fett kan fås fra E16. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Vevsfragmenter for enzymatisk fordøyelse og cellepellet etter fordøyelsen. (A) Hakket fettvev i enzymatisk oppløsning (~1 mm3). (B) Piler indikerer cellepellets etter RBC lysis. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Sammenligninger av cellemorfologi av isolerte primære preadipocytter. (A) Preadipocytter ved 24 timer etter isolasjon. (B) Preadipocytter ved 48 timer etter isolasjon. (C) Preadipocytter med 80 % samløp ved 72 timer etter isolasjon. (D) Preadipocytter etter 48 h adipogene induksjon ved passasje 4, lipiddråper er synlige. Innfelt angir det forstørrede bildet av lipiddråper. (E) Representativt bilde av skadede celler. (F) Pilen indikerer svarte svømme prikker i forurenset kultur. Skalastenger = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Evaluering av lipidakkumulering ved oljerød O-farging. (A) Representative bilder av oljerød O-farging av E16 preadipocytter etter 24 timer, 48 timer og 72 timer adipogene differensiering ex vivo. Skalastenger = 100 μm. (B) Kvantifisering av lipiddråper målt ved elution av oljerød O-farging. Verdier uttrykkes som gjennomsnittlig ± SD. a,b,c P < 0,05 ved enveis ANOVA med posthoc Tukeys HSD-test. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Vurdering av adipocytdifferensiering ved lipidflekk/DNA-flekk. (A) Representative bilder av lipidflekken (rød) og DNA(blå) farging av E16 preadipocytter etter 24 timer, 48 timer og 72 t adipogene differensiering ex vivo. Skalastenger = 150 μm. (B) Lipidfarging (Eksitasjon: 485 nm/Utslipp: 572 nm) ble utført for å vurdere lipidakkumulering i differensierte preadipocytter. (C) DNA-farging (Eksitasjon: 359 nm/Utslipp: 450 nm) ble utført for å vurdere variasjoner i antall celler. (D) Forholdet mellom lipid og DNA-flekk. Lipidakkumulering normaliseres til DNA-innholdet. Verdier uttrykkes som gjennomsnittlig ± SD. a,b,c P < 0,05 ved enveis ANOVA med posthoc Tukeys HSD-test. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Alder (n=) | x106 celler/100 mg vev | Levedyktighet (%) |
| E12 (4) | 0,97 ± 0,115 a,b | 98,5 ± 0,58 a |
| E14 (4) | 1.22 ± 0.232 a,b | 98,3 ± 0,96 a,b |
| E16 (21) | 1,61 ± 1,717 a | 97,6 ± 1,58 a |
| E17 (4) | 0,81 ± 0,282 a,b | 96,8 ± 2,63 a,b |
| E18 (7) | 0,72 ± 0,611 a,b | 95,9 ± 1,81 a,b |
| E20 (4) | 0,94 ± 0,171 a,b | 97,8 ± 0,8 a,b |
| D4 (9) | 0,24 ± 0,164 a,b | 93,6 ± 4,28 b |
| D5 (4) | 0,25 ± 0,073 a,b | 98,5 ± 0,71 a,b |
| D7 (10) | 0,17 ± 0,162 b | 96,8 ± 3,49 a,b |
| D14 (4) | 0,25 ± 0,051 a,b | 99,0 ± 0,00 a,b |
Tabell 1: Gjennomsnittlig cellenummer og levedyktighet for isolerte celler fra embryo- og postlukekyllinger.
Verdiene uttrykkes som gjennomsnittlige ± SD. a,b P < 0,05 ved enveis ANOVA med posthoc Tukeys HSD-test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selv om flere godt beskrevne protokoller har rapportert isolering av preadipocytter 14,15,16,17, isolasjon for embryonale preadipocytter har blitt optimalisert, som kan brukes til funksjonelle analyser av tidlig liv fett vekst og utvikling i broiler kyllinger. Denne protokollen gir høy levedyktighet embryonale adipocytt forfedre med høyt differensieringspotensial. Videre er den presenterte prosedyren for å isolere preadipocytter ikke begrenset til embryoer, men kan brukes i post-hatch kyllinger. Det er imidlertid optimalisert for bruk med E16-embryoer, og utbyttet fra kyllinger etter luke er betydelig lavere (tabell 1), sannsynligvis på grunn av økning i den relative mengden bindevev etter hvert som kyllinger vokser raskt.
Suksessen til celleisolasjon evalueres til slutt ved å observere formen og antallet tilknyttede celler (figur 3A). Lavt cellenummer eller skadede celler kan observeres når vevsfraksjonene fordøyes for lenge, spesielt når vevsdissosiasjonen utvikler seg i mer enn 1,5 timer (figur 3E). Derfor anbefales det at 1,5 timers fordøyelse ikke overskrides. På den annen side, hvis vevsfragmentet forblir tydelig etter en times fordøyelse, bør fordøyelsestiden eller mengden økes. Den oppnådde fettvevsmengden kan også varieres avhengig av kyllingens genetiske stamme. Hvis denne protokollen brukes til å isolere celler i andre aldre eller arter, må både mengden kollagen og fordøyelsestid sannsynligvis endres.
En vanlig begrensning av primærcellekulturen er at isolerte celler begynner å miste fettpotensial etter flere passasjer i kulturen; Dermed er det viktig å indusere differensiering innen få dager etter isolasjon for å sikre at embryonale preadipocytter ikke mister sin adipogene evne. Adipogene forløpere av embryoer skiller seg lett ut i modne adipocytter i medieformuleringen beskrevet ovenfor, uten behov for sammenfall eller hormonell induksjon. Cellene opp til passasje 4 (10-14 dager) er lett differensiert innen 48 timer etter induksjon (figur 3D).
Å kontrollere celleforurensning i primærcellekulturen er en annen utfordring, der soppforurensning er den vanligste. Bruken av amfotericin B, som beskrevet, er generelt effektiv for å forhindre soppvekst18,19. Det kan inkluderes ved lave konsentrasjoner i kulturmediene uten merkbare effekter på levedyktighet eller fettpotensial. Uidentifiserbare mikrobielle forurensninger er observert i form av svarte svømme prikker som vises noen dager etter celleisolasjon (figur 3F). Disse påvirket celleveksten negativt og var umulige å fjerne når denne infeksjonen skjedde20. Hvorvidt disse forurensningene var en ukjent mikrobiell art som finnes i eller på egg eller oppsto fra en annen kilde, er ukjent. Denne protokollen forsøker å minimere risikoen for forurensning ved å trekke ut embryoer aseptisk fra egg21. Bruk av en varmebasert instrumentsterilisator i hetten under disseksjon bidrar også til å minimere potensialet for forurensning, spesielt når flere embryoer dissekeres.
En vurdering i prosessen er redusert celleadhesjon til vevskulturplate under differensiering, som følge av fysiske endringer når celler dannes og utvider lipiddråper. Selv om de finnes i cellene, er lipiddråper oppdrift og, når de er store, ser ut til å fungere som ballonger som har en tendens til å fremme celler som løfter fra overflaten. Det bør derfor utvises forsiktighet ved håndtering av preadipocytter under indusert differensiering, og spesielt når adipogenese vurderes. Mens protokollen som presenteres her ikke endrer kulturoverflaten, kan celleadhesjonen forbedres når du plating celler på retter belagt med 2% gelatin. Det er også viktig å bekrefte pH for vaskeløsninger som skal være 7,4 og bruke forvarmet PBS-løsning når du vasker celler og blander med DNA-flekken for å redusere kaldt stress.
Ved hjelp av flere embryoer kan tilstrekkelig antall celler isoleres for å gi eksperimentelle repliker uten behov for flere passasjer, ekspansjon og risikoen for at celler mister sitt adipogene potensial. RNA kan lett isoleres fra både pre- og differensierte kyllingebryoapcytter isolert ved hjelp av fenol- eller membranbaserte kommersielle metoder for genuttrykksstudier. Tilstrekkelig RNA kan fås fra en enkelt brønn av en seks-brønns plate for bruk i cDNA syntese og oppfølging qPCR eller RNAseq.
Oppsummert er tilgjengeligheten av fettdepoter i kyllingembryoet for å isolere en cellemodell svært relevant for både fjærfe og mennesker. Denne protokollen er relativt enkel å utføre, og den gir en høy prosentandel levedyktige celler som lett kan induseres til å gjennomgå adipogene differensiering in vitro. Befruktede kyllingegg kan fås fra ulike kommersielle kilder for minimal kostnad, noe som gjør disse cellene til en lett tilgjengelig modell for praktisk bruk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker UT AgResearch og Institutt for dyrevitenskap for å støtte og optimalisere denne protokollen. Dette arbeidet ble finansiert av USDA grant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Pipette | Eppendorf | Z683825 | Single Channel Pipette, 100 - 1000 µL |
| 1 mL Pipette Tip | Fisher Scientific | 02-707-402 | |
| 100% Isopropanol | Fisher Scientific | A426P4 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010023 | |
| 25 mL Flask | Pyrex | 4980-25 | |
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | F75P-1GAL | |
| 6-Well Plate | Falcon | 353046 | Tissue Culture-treated |
| 96-Well Assay Plate | Costar | 3632 | |
| 96-Well Plate, Black Bottom | Costar | 3603 | Tissue Culture-treated |
| AdipoRed | Lonza | PT-7009 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290026 | |
| Bench Top Wiper (Kimtechwiper) | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Betadine | Up & Up | NDC 1167300334 | 20% Working Solution |
| Cell Counter | Corning | 6749 | |
| Cell Strainer, 40 µm | SPL | 93040 | |
| Centrifugaton | Eppendorf | 5702 | |
| Chicken Serum | Gibco | 16110082 | |
| Conical Centrifuge Tubes, 15 mL | VWR | 10025-690 | |
| Conical Centrifuge Tubes, 50 mL | Falcon | 352098 | |
| Cryovial | Nunc | 343958 | |
| Curved Forceps, 100 mm | Roboz Surgical | RS-5137 | |
| Curved Surgical Scissors, 115 mm | Roboz Surgical | RS-6839 | |
| Distilled Water | Millipore | SYNSV0000 | Despensed as needed |
| DMEM/F12 | HyClone | SH30023.01 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | 70% Working Solution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10437028 | |
| Fluorescent Microscope | EVOS | M7000 | |
| Fluorescent Plate Reader | Biotek | Synergy H1 | |
| Foil | Reynolds | Reynolds Wrap Heavy Duty Aluminum Foil, 125 SQ. FT. | |
| Freezing Container | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| Gelatin | Millipore | 4055 | 2% Working Solution |
| Hematocytometer (Counting Chamber) | Corning | 480200 | 0.1 mm deep |
| Incubator | Fisher Scientific | 6845 | |
| Instrument Sterilizer | VWR | B1205 | |
| Linoleic Acid-Oleic Acid-Albumin | Sigma | L9655 | 1x Working Solution |
| Microscope | Evos | AMEX1000 | |
| Multi-Channel Pipette | Thermo Scientific | 4661070 | 12-Channel Pipetters, 30 - 300 µL |
| Na2HPO4 | Sigma | S-7907 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S-3139 | |
| NucBlue | Invitrogen | R37605 | |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | |
| Orbital Shaker | IKA | KS130BS1 | |
| Paper Towel | Tork | RK8002 | |
| Parafilm | Parafilm M | PM996 | |
| Penicillin/Steptomycin (P/S) | Gibco | 15140122 | 1x Working Solution |
| Petri dishes, 100 mm | Falcon | 351029 | |
| Petri dishes, 60 mm | Falcon | 351007 | |
| Plate Shaker | VWR | 200 | |
| RBC Lysis Buffer | Roche | 11814389001 | |
| Reagent Reservior | VWR | 89094-680 | |
| Small Beaker, 100 mL | Pyrex | 1000-100 | |
| Spectrophotometer Plate Reader | Biotek | Synergy H1 | |
| Sterile Gauze | McKesson | 762703 | |
| Straight Forceps, 120 mm | Roboz Surgical | RS-4960 | |
| Straight Scissors, 140 mm | Roboz Surgical | RS-6762 | |
| T-25 Flask | Corning | 430639 | Tissue Culture-treated |
| Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Tissue Strainer, 250 µm | Pierce | 87791 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250061 | |
| Trypsin | Gibco | 15400054 | 0.1% Working Solution |
| Tweezers, 110 mm | Roboz Surgical | RS-5035 | |
| Type 1 Collagenase | Gibco | 17100017 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | 15-462-10 | |
| Whatman Grade 1 Filter Paper | Whatman | 1001-110 |
References
- Fryar, C. D., Carroll, M. D., Ogden, C. L. Prevalence of overweight, obesity, and severe obesity among children and adolescents aged 2-19 years: United States, 1963-1965 through 2015-2016. , (2018).
- Siegel, P. B. Evolution of the modern broiler and feed efficiency. Annual Review of Animal Biosciences. 2 (1), 375-385 (2014).
- Zuidhof, M. J., Schneider, B. L., Carney, V. L., Korver, D., Robinson, F. Growth, efficiency, and yield of commercial broilers from 1957, 1978, and 2005. Poultry Science. 93 (12), 2970-2982 (2014).
- Poulos, S. P., Dodson, M. V., Hausman, G. J. Cell line models for differentiation: preadipocytes and adipocytes. Experimental Biology and Medicine. 235 (10), 1185-1193 (2010).
- Vilaboa, S. D. -A., Navarro-Palou, M., Llull, R. Age influence on stromal vascular fraction cell yield obtained from human lipoaspirates. Cytotherapy. 16 (8), 1092-1097 (2014).
- Speake, B. K., Noble, R. C., McCartney, R. J. Tissue-specific changes in lipid composition and lipoprotein lipase activity during the development of the chick embryo. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Lipids and Lipid Metabolism. 1165 (3), 263-270 (1993).
- Chen, P., Suh, Y., Choi, Y. M., Shin, S., Lee, K. Developmental regulation of adipose tissue growth through hyperplasia and hypertrophy in the embryonic Leghorn and broiler. Poultry Science. 93 (7), 1809-1817 (2014).
- Farkas, K., Ratchford, I. A., Noble, R. C., Speake, B. K. Changes in the size and docosahexaenoic acid content of adipocytes during chick embryo development. Lipids. 31 (3), 313-321 (1996).
- Claver, J. A., Quaglia, A. I. Comparative morphology, development, and function of blood cells in nonmammalian vertebrates. Journal of Exotic Pet Medicine. 18 (2), 87-97 (2009).
- Corning Cell Counter Demo Video. , Available from: https://www.youtube.com/watch?v=JWjckEHO6Wg (2022).
- Nema, R., Khare, S. An animal cell culture: Advance technology for modern research. Advances in Bioscience and Biotechnology. 3 (3), 219-226 (2012).
- Regassa, A., Kim, W. K. Effects of oleic acid and chicken serum on the expression of adipogenic transcription factors and adipogenic differentiation in hen preadipocytes. Cell Biology International. 37 (9), 961-971 (2013).
- Temkin, A. M. Effects of crude oil/dispersant mixture and dispersant components on PPAR γ activity in vitro and in vivo: identification of dioctyl sodium sulfosuccinate (DOSS; CAS# 577-11-7) as a probable obesogen. Environmental Health Perspectives. 124, 112-119 (2016).
- Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. Adipose Tissue Protocols. , Springer. 201-219 (2008).
- Lee, M. J., Wu, Y., Fried, S. K. A modified protocol to maximize differentiation of human preadipocytes and improve metabolic phenotypes. Obesity. 20 (12), 2334-2340 (2012).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).
- Akbar, N., Pinnick, K. E., Paget, D., Choudhury, R. P. Isolation and characterization of human adipocyte-derived extracellular vesicles using filtration and ultracentrifugation. Journal of Visualized Experiments. (170), e61979 (2021).
- Perlman, D., Giuffre, N. A., Brindle, S. A. Use of Fungizone in control of fungi and yeasts in tissue culture. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 106 (4), 880-883 (1961).
- Kuhlmann, I. The prophylactic use of antibiotics in cell culture. Cytotechnology. 19 (2), 95-105 (1995).
- Yang, X., et al. Black swimming dots in cell culture: the identity, detection method and judging criteria. bioRxiv. , 366906 (2018).
- Freshney, R. I. Culture of animal cells: a manual of basic technique and specialized applications. , John Wiley & Sons. 163-186 (2015).
