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Neuroscience

युवा वयस्क और वृद्ध गेरबिल कोक्ली में इम्यूनोलेबलिंग और गिनती रिबन सिनैप्स

Published: April 21, 2022 doi: 10.3791/63874
Automatic Translation
1, 1, 1
1Cluster of Excellence "Hearing4all" and Research Centre Neurosensory Science, Department of Neuroscience, School of Medicine and Health Science, Carl von Ossietzky University Oldenburg

Summary

अभिवाही अन्तर्ग्रथनी संरचनाओं और बालों की कोशिकाओं को इम्यूनोलेबलिंग करके युवा वयस्क और वृद्ध गेरबिल कोक्ली को संसाधित करने के लिए एक प्रोटोकॉल, वृद्ध ऊतक में ऑटोफ्लोरेसेंस को बुझाना, कोक्ली की लंबाई का विच्छेदन और अनुमान लगाना, और कॉन्फोकल इमेजिंग के साथ प्राप्त छवि ढेर में सिनैप्स की मात्रा निर्धारित करना प्रस्तुत किया गया है।

Abstract

आंतरिक बाल कोशिकाओं और अभिवाही श्रवण तंत्रिका तंतुओं को जोड़ने वाले रिबन सिनैप्स का नुकसान उम्र से संबंधित सुनवाई हानि का एक कारण माना जाता है। रिबन सिनैप्स के नुकसान का पता लगाने के लिए सबसे आम तरीका इम्यूनोलेबलिंग है क्योंकि यह एक व्यक्तिगत कोक्लीआ में कई टोनोटोपिक स्थानों से मात्रात्मक नमूने की अनुमति देता है। हालांकि, ब्याज की संरचनाएं बोनी कोक्लीआ के अंदर गहरी दफन हैं। गेरबिल्स का उपयोग उम्र से संबंधित सुनवाई हानि के लिए एक पशु मॉडल के रूप में किया जाता है। यहां, निर्धारण के लिए नियमित प्रोटोकॉल, इम्यूनोलेबलिंग गेरबिल कोक्लियर पूरे माउंट, कॉन्फोकल इमेजिंग, और रिबन सिनैप्स संख्या और वॉल्यूम की मात्रा निर्धारित करने का वर्णन किया गया है। इसके अलावा, मूल्यवान उम्र बढ़ने वाले व्यक्तियों से अच्छी सामग्री प्राप्त करने से जुड़ी विशेष चुनौतियों पर प्रकाश डाला गया है।

गेरबिल्स को इच्छामृत्यु दी जाती है और या तो कार्डियोवैस्कुलर रूप से सुगंधित किया जाता है, या उनके टिम्पैनिक बुले को सावधानीपूर्वक खोपड़ी से विच्छेदित किया जाता है। कोक्ली को शीर्ष और आधार पर खोला जाता है और सीधे फिक्सेटिव में स्थानांतरित किया जाता है। प्रारंभिक विधि के बावजूद, कोक्ली को पोस्टफिक्स किया जाता है और बाद में डिकैल्सीफाइड किया जाता है। ऊतक को तब पूर्व और पोस्टसिनेप्टिक संरचनाओं और बालों की कोशिकाओं के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ लेबल किया जाता है। अगला, कोक्ली को माध्यमिक प्रतिदीप्ति-टैग किए गए एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन किया जाता है जो उनके संबंधित प्राथमिक लोगों के खिलाफ विशिष्ट होते हैं। वृद्ध गेरबिल्स के कोक्ली को तब पुराने जानवरों के ऊतकों की आम तौर पर पर्याप्त पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति को कम करने के लिए एक ऑटोफ्लोरेसेंस क्वेंचर के साथ इलाज किया जाता है।

अंत में, कोक्ली को 6-11 खंडों में विच्छेदित किया जाता है। पूरे कोक्लियर लंबाई का पुनर्निर्माण इस तरह किया जाता है कि विशिष्ट कोक्लियर स्थानों को व्यक्तियों के बीच मज़बूती से निर्धारित किया जा सकता है। कॉन्फोकल छवि ढेर, क्रमिक रूप से अधिग्रहित, चुने हुए स्थानों पर बाल कोशिकाओं और सिनैप्स की कल्पना करने में मदद करते हैं। कॉन्फोकल स्टैक को डीकॉन्वोल्व्ड किया जाता है, और सिनैप्स को या तो इमेजजे का उपयोग करके मैन्युअल रूप से गिना जाता है, या मैटलैब में कस्टम-लिखित छवि विश्लेषण प्रक्रियाओं के साथ सिनैप्टिक संरचनाओं का अधिक व्यापक परिमाणीकरण किया जाता है।

Introduction

उम्र से संबंधित सुनवाई हानि दुनिया की सबसे प्रचलित बीमारियों में से एक है जो 65 वर्ष और उससे अधिक उम्र की दुनिया की एक तिहाई से अधिक आबादी को प्रभावित करतीहै। अंतर्निहित कारण अभी भी बहस के अधीन हैं और सक्रिय रूप से जांच की जा रही है, लेकिन अभिवाही श्रवण तंत्रिका तंतुओं के साथ आंतरिक बाल कोशिकाओं (आईएचसी) को जोड़ने वाले विशेष सिनैप्स का नुकसान शामिल हो सकता है2. इन रिबन सिनैप्स में एक प्रीसिनेप्टिक संरचना होती है जिसमें न्यूरोट्रांसमीटर ग्लूटामेट से भरे पुटिकाएं होती हैं, साथ ही पोस्टसिनेप्टिक α-एमिनो-3-हाइड्रॉक्सी-5-मिथाइल-4-आइसोक्साज़ोलेप्रोपियोनिक एसिड (एएमपीए) ग्लूटामेट रिसेप्टर्स 3,4,5 होते हैं। गेरबिल में, ~ 20 अभिवाही श्रवण तंत्रिका फाइबर एक आईएचसी 6,7,8 से संपर्क करते हैं। मोडिओलस का सामना करने वाले आईएचसी पर फाइबर बड़े सिनैप्टिक रिबन का विरोध करते हैं, जबकि आईएचसी के स्तंभ पक्ष पर जुड़ने वाले फाइबर छोटे सिनैप्टिक रिबन का सामना करते हैं (यानी, बिल्लियों9, गेरबिल7, गिनी सूअरों10, और चूहोंमें 3,11,12,13,14)। इसके अलावा, गेरबिल में, प्रीसिनेप्टिक रिबन और पोस्टसिनेप्टिक ग्लूटामेट पैच का आकार सकारात्मक रूप से 7,14 से संबंधित है। फाइबर जो आईएचसी के मोडियोलर पक्ष पर बड़े रिबन का विरोध करते हैं, कैलिबर में छोटे होते हैं और कम सहज दर और उच्च थ्रेसहोल्ड15 होते हैं। इस बात के प्रमाण हैं कि कम सहज दर फाइबर उच्च-सहज कम-थ्रेशोल्ड फाइबर की तुलना में शोर एक्सपोजर10 और ओटोटॉक्सिक ड्रग्स16 के लिए अधिक संवेदनशील हैं, जो आईएचसी15 के स्तंभ पक्ष पर स्थित हैं।

रिबन सिनैप्स का नुकसान कोक्लियर तंत्रिका आयु से संबंधित सुनवाई हानि में जल्द से जल्द अपक्षयी घटना है, जबकि सर्पिल नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं और उनके अभिवाही श्रवण तंत्रिका तंतुओं का नुकसान17,18 से पीछे है। इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल सहसंबंध में श्रवण ब्रेनस्टेम प्रतिक्रियाओं17 और यौगिक एक्शन पोटेंशिअल8 की रिकॉर्डिंग शामिल है; हालाँकि, ये सिनैप्स हानि की सूक्ष्मता को प्रतिबिंबित नहीं करते हैं, क्योंकि कम सहज दर फाइबर इन उपायों में योगदान नहीं करते हैं16. अधिक आशाजनक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल मैट्रिक्स द्रव्यमान क्षमता-व्युत्पन्न तंत्रिका सूचकांक19 और पेरिस्टिमुलस समय प्रतिक्रिया20 हैं। हालांकि, ये केवल विश्वसनीय हैं यदि जानवर के पास श्रवण तंत्रिका फाइबर हानि से परे कोई अन्य कोक्लियर विकृति नहीं है, जो शेष श्रवण तंत्रिका तंतुओं की गतिविधि को प्रभावित करती है8. इसके अलावा, गेरबिल में व्यवहारिक रूप से मूल्यांकन किए गए थ्रेसहोल्ड को सिनैप्स संख्या21 के साथ सहसंबद्ध नहीं किया गया था। इसलिए, जीवित रिबन सिनैप्स की विश्वसनीय मात्रा का ठहराव और, इस प्रकार, कार्यात्मक श्रवण तंत्रिका तंतुओं की संख्या केवल कॉक्लियर ऊतक की प्रत्यक्ष परीक्षा द्वारा संभव है।

मंगोलियाई गेरबिल (मेरियोनेस अनगुइकुलेटस) उम्र से संबंधित सुनवाई हानि का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त पशु मॉडल है। इसका एक छोटा जीवन काल है, मनुष्यों के समान कम आवृत्ति वाली सुनवाई है, बनाए रखना आसान है, और उम्र से संबंधित सुनवाई हानि 2,22,23,24 से संबंधित मानव विकृतियों के लिए समानताएं दिखाता है। गेरबिल को वृद्ध माना जाता है जब वे 36 महीने की उम्र तक पहुंचते हैं, जो उनके औसत जीवन काल22 के अंत के करीब है। महत्वपूर्ण रूप से, रिबन सिनैप्स की उम्र से संबंधित हानि को शांत वातावरण 8,21 में उठाए गए और वृद्ध गेरबिल में प्रदर्शित किया गया है।

यहां, युवा वयस्कों से वृद्ध तक, विभिन्न उम्र के गेरबिल्स से इम्यूनोलेबल, विच्छेदन और विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। प्रीसिनैप्स (सीटीबीपी 2), पोस्टसिनेप्टिक ग्लूटामेट रिसेप्टर पैच (ग्लूए 2), और आईएचसी (मायोवीआईआईए) के घटकों के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है। एक ऑटोफ्लोरेसेंस क्वेंचर लागू किया जाता है जो वृद्ध कोक्ली में पृष्ठभूमि को कम करता है और प्रतिदीप्ति संकेत को बरकरार रखता है। इसके अलावा, संवेदी उपकला और स्ट्रिया संवहनी दोनों की जांच करने के लिए कोक्लीआ को विच्छेदन करने का विवरण दिया गया है। कोक्लियर लंबाई को विशिष्ट सर्वोत्तम आवृत्तियों के अनुरूप अलग-अलग कोक्लियर स्थानों के चयन को सक्षम करने के लिए मापा जाता है25. अन्तर्ग्रथन संख्याओं का परिमाणीकरण स्वतंत्र रूप से उपलब्ध सॉफ़्टवेयर इमेजजे26 के साथ किया जाता है। व्यक्तिगत एचसी के भीतर अन्तर्ग्रथन वॉल्यूम और स्थानों का अतिरिक्त परिमाणीकरण मैटलैब में लिखे गए सॉफ़्टवेयर कस्टम के साथ किया जाता है। इस सॉफ़्टवेयर को सार्वजनिक रूप से उपलब्ध नहीं कराया गया है, क्योंकि लेखकों के पास पेशेवर प्रलेखन और समर्थन प्रदान करने के लिए संसाधनों की कमी है।

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Protocol

सभी प्रोटोकॉल और प्रक्रियाओं को लोअर सैक्सोनी, जर्मनी के प्रासंगिक अधिकारियों द्वारा अनुमोदित किया गया था, परमिट संख्या एजेड 33.19-42502-04-15/1828 और 33.19-42502-04-15/1990 के साथ। यह प्रोटोकॉल दोनों लिंगों के मंगोलियाई गेरबिल्स (एम। युवा वयस्क 3-12 महीने की उम्र को संदर्भित करता है, जबकि गेरबिल को 36 महीने और उससे अधिक उम्र का माना जाता है। जब अन्यथा नहीं कहा जाता है, तो बफर और समाधान तैयार किए जा सकते हैं और फ्रिज में कई महीनों (4-8 डिग्री सेल्सियस) तक संग्रहीत किए जा सकते हैं। उपयोग करने से पहले, सुनिश्चित करें कि बफ़र्स और समाधान अवक्षेपित नहीं हुए हैं।

1. निर्धारण और अंग संग्रह

नोट: यदि केवल कोक्ली की आवश्यकता होती है, तो विसर्जन द्वारा निर्धारण की कुछ हद तक सरल प्रक्रिया को पूरा करने की सिफारिश की जाती है। हालांकि, यदि एक अच्छी तरह से संरक्षित मस्तिष्क की भी आवश्यकता होती है, तो ट्रांसकार्डियल छिड़काव एकमात्र विकल्प है। दोनों मामलों में फिक्सेटिव फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) है। यह ताजा बनाया जाना चाहिए लेकिन उपयोग तक जमे हुए संग्रहीत किया जा सकता है। विसर्जन द्वारा निर्धारण के लिए ट्रांसकार्डियल छिड़काव या ~ 50-100 एमएल प्रति कोक्लीआ के लिए ~ 300 एमएल के विभाज्य का उपयोग करें।

सावधानी: पीएफए एक खतरनाक पदार्थ है; सामान्य प्रयोगशाला सुरक्षा प्रक्रियाओं के अनुसार इसे संभालें।

  1. ट्रांसकार्डियल छिड़काव द्वारा निर्धारण
    1. छिड़काव सेटअप फ्लश जब तक ट्यूबिंग किसी भी हवा के बुलबुले से स्पष्ट है। रक्त के थक्के को रोकने के लिए हेपरिन युक्त पीबीएस (पीबीएस के 100 एमएल में 0.2 एमएल) के साथ छिड़काव ट्यूबिंग भरें। एक बार टयूबिंग पीबीएस से भरजाने के बाद प्रवाह को रोकें और द्रव भंडारण की बोतल अभी खाली हो गई है; इसमें 200 एमएल पिघला हुआ पीएफए डालें।
      नोट: सेटअप अब जानवर के लिए तैयार है। ट्यूबिंग में शेष पीबीएस रक्त को बाहर निकालने के लिए पर्याप्त है और प्रवाह फिर से शुरू होने के बाद स्वचालित रूप से फिक्सेटिव द्वारा पीछा किया जाएगा।
    2. सुनिश्चित करें कि पीएफए के बहिर्वाह के लिए एक अपशिष्ट संग्रह प्रणाली है। एक ताजा प्रवेशनी (19 जी) का उपयोग करें और बड़ी कैंची, संदंश (एक चपटा टिप के साथ), हेमोस्टैट, स्केलपेल या तेज प्रवेशनी, और पिन के साथ एक रबर चटाई आसान है।
    3. एमएल, 0.3 एमएल प्रति जानवर, शरीर के वजन सीमा: 50-120 ग्राम) के इंट्रापेरिटोनियल ओवरडोज के साथ गेरबिल को इच्छामृत्यु दें। जानवर को वापस पिंजरे में डाल दो। जब श्वसन गिरफ्तारी इस तरह से सेट हो जाती है कि श्वास 30 एस या उससे अधिक के अंतराल के साथ अनियमित हो जाता है, तो गेरबिल को रबर की चटाई पर अपनी पीठ पर रखें और पिन के साथ अग्र-पंजे और एक हिंद-पंजा दोनों को ठीक करें (छिड़काव की सफलता के बेहतर निर्णय के लिए स्थानांतरित करने के लिए एक हिंद-पंजा मुक्त छोड़ दें; चरण 1.1.7 के बाद नोट देखें)।
    4. वक्ष गुहा को खोलने के लिए, संदंश के साथ उरोस्थि के ऊपर त्वचा को उठाएं और कैंची के साथ उरोस्थि के नीचे लगभग 0.5 सेमी त्वचा को काट लें जब तक कि सफेद रंग का प्रोसेसस एक्सिफोइडियस दिखाई न दे। संदंश के साथ प्रोसेसस ज़िफोइडियस पर उरोस्थि पकड़ो और वक्ष गुहा में एक अच्छा दृश्य प्राप्त करने के लिए डायाफ्राम के साथ कटौती करें। पसलियों को दोनों तरफ से तब तक काटें जब तक कि हृदय तक अच्छी पहुंच न हो। सुनिश्चित करें कि अंगों को नुकसान से बचने के लिए गेरबिल के शरीर के संबंध में कैंची का कोण समानांतर और सपाट है और इस प्रकार, एक बंद संचार प्रणाली सुनिश्चित करें।
    5. उरोस्थि पर एक हेमोस्टैट दबाएं, रिबकेज को उठाएं, और रक्त प्रवाह को अवरुद्ध करने से बचने के लिए शरीर के किसी भी अंग पर हेमोस्टैट को आराम किए बिना गेरबिल के कंधे पर हेमोस्टैट रखें।
    6. द्रव प्रवाह को थोड़ा खोलें जब तक कि पीबीएस की एक बूंद प्रवेशनी (19 जी) से लगभग हर 2 एस बाहर न बह जाए। संदंश के साथ दिल पकड़ो और इसे बाईं ओर थोड़ा सा मोड़ो जैसे कि बाएं वेंट्रिकल को स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है। प्रवेशनी को बाएं वेंट्रिकल में एक कोण पर डालें जो सेप्टम को भेदने से बचता है। सुई को हाथ से या किसी अन्य हेमोस्टैट के साथ जगह में पकड़ो।
      नोट: बाएं और दाएं वेंट्रिकल्स को उनके विभिन्न रंग रंगों द्वारा विभेदित किया जा सकता है; बाएं वेंट्रिकल हृदय के ऊतकों के बाकी हिस्सों की तुलना में रंग में हल्का दिखाई देता है।
    7. धीरे-धीरे द्रव प्रवाह के दबाव को बढ़ाएं और ठीक कैंची, स्केलपेल या किसी अन्य प्रवेशनी के साथ सही आलिंद खोलें। द्रव प्रवाह को तब तक खोलें जब तक कि ड्रिप कक्ष में लगभग 2-3 बूंदें / एस नहीं देखी जाती हैं, या पंप के लिए 4 एमएल / मिनट का प्रवाह सेट करें। एक बार दिल का निर्धारण सेट हो जाने के बाद, सुनिश्चित करें कि छिड़काव प्रवेशनी बिना किसी और आयोजित किए बिना जगह में रहती है।
      नोट: सफल छिड़काव के लक्षण धीमी मांसपेशियों के संकुचन, गर्दन और छोरों का कठोर होना, यकृत पीला होना और गुलाबी फेफड़े हैं। असफल छिड़काव का संकेत फेफड़ों का सफेद होना है, जो इंगित करता है कि फुफ्फुसीय परिसंचरण सेप्टम के पंचर के कारण सुगंधित होता है।
    8. असफल छिड़काव के मामले में, प्रवेशनी को महाधमनी में आगे बढ़ाने का प्रयास करें, और इसे हेमोस्टैट के साथ जगह में दबाएं।
    9. गेरबिल को नष्ट कर दें। बुल्ले को निकालें और चरण 1.2.2 में वर्णित के रूप में इसकी हड्डी को काटें और तोड़ दें।
      नोट: यदि ऊतक पर्याप्त रूप से तय नहीं है, तो संवेदी उपकला विच्छेदन के दौरान कॉर्टी के अंग से विस्थापित हो जाएगी।
    10. यदि छिड़काव 5-10 मिनट के भीतर निर्धारण का कोई संकेत नहीं दिखाता है, तो इसे निरस्त करें और तुरंत विसर्जन द्वारा निर्धारण के लिए नीचे दी गई प्रक्रिया का पालन करें। इसके लिए, चरण 1.2.2 के रूप में कोक्लीआ का इलाज करें और 8 डिग्री सेल्सियस पर 2 डी-शेकर पर 1-2 दिनों के लिए स्क्रू कैप कंटेनरों में 4% पीएफए के लगभग 50-80 एमएल में ऊतक को पोस्टफिक्स करें।
      नोट: चूंकि छिड़काव के दौरान अंततः निर्धारण की गुणवत्ता को रेट करना मुश्किल हो सकता है, इसलिए वर्णित के रूप में कोक्ली को नियमित रूप से पोस्टफिक्स करने की सिफारिश की जाती है।
  2. ऊतक विसर्जन द्वारा निर्धारण
    1. एमएल, 0.3 एमएल प्रति जानवर, शरीर के वजन सीमा: 50-120 ग्राम) के इंट्रापेरिटोनियल ओवरडोज के साथ गेरबिल्स को इच्छामृत्यु दें। जब गेरबिल ने सांस लेना बंद कर दिया है, तो जानवर को नष्ट कर दें।
    2. बुल्ले निकालें और कोक्ली तक पहुंचने के लिए क्रमशः कैंची और संदंश के साथ इसकी हड्डी को काटें और तोड़ दें। मेलस, इंकस और अर्धवृत्ताकार नहरों को हटा दें। शीर्ष पर और बेसल मोड़ में छोटे छेद करें सावधानीपूर्वक संदंश के साथ कॉक्लियर हड्डी पर खरोंच करके। तुरंत बुल्ले को ठंडे फिक्सेटिव (कम से कम 50 एमएल) की अधिकता में स्थानांतरित करें और 2 दिनों के लिए कोमल आंदोलन (2 डी-शेकर [100 आरपीएम]) के तहत ठंड (4-8 डिग्री सेल्सियस) में ऊतक को ठीक करें।
      नोट: ऊतक को ठीक करने के बाद, कोक्ली को या तो तुरंत संसाधित किया जा सकता है या 0.05% सोडियम एजाइड के साथ पीबीएस में संग्रहीत किया जा सकता है। सावधानी: सोडियम एजाइड विषाक्त है। ध्यान दें कि भंडारण की लंबाई धुंधला होने की गुणवत्ता को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकती है। सीमित परीक्षणों ने सुझाव दिया है कि सोडियम एजाइड में ऊतक को संग्रहीत करने के 2 साल बाद इम्यूनोस्टेनिंग कमजोर दिखाई दी।

2. ऊतक की तैयारी और इम्यूनोलेबलिंग

  1. पीएच 8 पर 0.5 एम समाधान का उत्पादन करने के लिए पीबीएस में एथिलीनडियामाइनटेट्राएसेटिक एसिड (ईडीटीए) पाउडर को भंग करें। इसके लिए, एक चुंबकीय उत्तेजक पर एक बीकर रखें, इसे पीबीएस की कुल मात्रा के लगभग आधे से भरें, और ईडीटीए पाउडर की उचित मात्रा जोड़ें, जिसके परिणामस्वरूप एक अम्लीय निलंबन होता है। पीएच मीटर के साथ पीएच की निगरानी करते समय ध्यान से केंद्रित सोडियम हाइड्रॉक्साइड समाधान (एनएओएच) जोड़ें। वांछित अंतिम मात्रा में पीबीएस के साथ भरें और माइक्रोबियल संदूषण को रोकने के लिए समाधान को फ़िल्टर करें।
    नोट: ईडीटीए पाउडर केवल एक बार निलंबन एक तटस्थ पीएच मान तक पहुंचने के बाद पूरी तरह से भंग हो जाएगा।
  2. डिकैल्सिफिकेशन के लिए, कोक्ली को पीबीएस में 0.5 एम ईडीटीए के 80 एमएल में स्थानांतरित करें। 2 दिनों के लिए 2 डी-शेकर (100 आरपीएम) पर कोमल आंदोलन के तहत ठंड (4-8 डिग्री सेल्सियस) में ऊतक सेते हैं।
    नोट: डिकैल्सीफिकेशन चरण के बाद, शेष प्रसंस्करण चरणों के साथ जारी रखने से पहले ऊतक को कई दिनों तक 3 सप्ताह तक पीबीएस में संग्रहीत किया जा सकता है। स्ट्रिया संवहनी को लेबल करने वाले एंटीबॉडी के लिए, इस बिंदु पर (यानी, इम्यूनोस्टेनिंग से पहले) अपने संबंधित लक्ष्यों तक एंटीबॉडी की समान पहुंच सुनिश्चित करने के लिए कोक्ली को मोडियोलर अक्ष के साथ आधे में काटने की सलाह दी जाती है। यह एंटीबॉडी-निर्भर है और सिनैप्टिक संरचनाओं और आईएचसी को लेबल करने के लिए यहां उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी पर लागू नहीं होता है। काटने के लिए टूटने योग्य रेजरब्लेड और एक ब्लेड धारक (जैसा कि चरण 4.2 में वर्णित है) का एक टुकड़ा का उपयोग करें।
  3. 2 एमएल सुरक्षित-सील प्रतिक्रिया ट्यूबों में निम्नलिखित चरणों (चरण 3.2 तक) करें। यदि ऊतक टुकड़ा ट्यूब के अंदर फिट होने के लिए बहुत बड़ा है, तो कैंची के साथ अतिरिक्त ऊतक को ट्रिम करें। एंटीबॉडी के प्रवेश में सुधार करने के लिए, पहले 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर 2 डी-शेकर (100 आरपीएम) पर पीबीएस में 1% ट्राइटन (ट्राइटन एक्स -100) के 1 एमएल में ऊतक को पारगम्य करें। प्रत्येक 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 2 डी-शेकर (100 आरपीएम) पर पीबीएस में 0.2% ट्राइटन (ट्राइटन एक्स -100) के 1 एमएल के साथ ऊतक 3 एक्स धो लें।
  4. निरर्थक एंटीजन को अवरुद्ध करने के लिए, 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर 2 डी-शेकर (100 आरपीएम) पर अवरुद्ध समाधान (3% गोजातीय सीरम एल्बुमिन [बीएसए], 0.2% ट्राइटन, पीबीएस में) के 1 एमएल में कोक्ली सेते हैं।
    नोट: अवरुद्ध समाधान अग्रिम में तैयार किया जा सकता है लेकिन ~ 10 दिनों से पुराना नहीं होना चाहिए।
  5. अवरुद्ध समाधान के एक ही विभाज्य में निम्नलिखित प्राथमिक एंटीबॉडी को ताजा पतला करें: आईएचसी (आईजीजी पॉलीक्लोनल खरगोश) को लेबल करने के लिए एंटी-मायोविया (मायोसिन वीआईआईए), पतला 1:400; एंटी-सीटीबीपी 2 (सी-टर्मिनल बाइंडिंग प्रोटीन 2) प्रीसिनेप्टिक रिबन (आईजीजी 1 मोनोक्लोनल माउस) को लेबल करने के लिए, पतला 1:400; और पोस्टसिनेप्टिक रिसेप्टर पैच (आईजीजी 2 ए मोनोक्लोनल माउस) को लेबल करने के लिए एंटी-ग्लूए 2, पतला 1: 200। सुनिश्चित करें कि कोक्ली पूरी तरह से एंटीबॉडी समाधान (आमतौर पर 0.4 एमएल) के साथ कवर किया गया है और उन्हें 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  6. अगला, प्रत्येक 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 2 डी-शेकर (100 आरपीएम) पर पीबीएस में 0.2% ट्राइटन के साथ ऊतक 5 एक्स धो लें। अपने प्राथमिक समकक्षों की मेजबान प्रजातियों से मेल खाने के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी चुनें और फिर से उन्हें पीबीएस में 3% बीएसए, 0.2% ट्राइटन में ताजा पतला करें: बकरी एंटी-माउस (आईजीजी 1) -एलेक्सा फ्लोरोफोर (एएफ) 488, पतला 1: 1,000; बकरी विरोधी माउस (आईजीजी 2 ए) -एएफ 568, पतला 1:500; और गधा विरोधी खरगोश-एएफ 647 (आईजीजी), पतला 1: 1,000। प्रतिदीप्ति के विरंजन को रोकने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी में ट्यूब लपेटें। 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर माध्यमिक-एंटीबॉडी समाधान के 0.4 मिलीलीटर में कोक्ली सेते हैं।
    नोट: सीमित परीक्षणों ने संकेत दिया है कि प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कॉक्लियर ऊतक के इनक्यूबेशन के परिणामस्वरूप कम तापमान और कम अवधि के साथ अधिक सामान्य इनक्यूबेशन प्रक्रिया का पालन करने की तुलना में उज्ज्वल इम्यूनोस्टेनिंग हुई।
  7. कमरे के तापमान पर 2 डी-शेकर (100 आरपीएम) पर प्रत्येक 5 मिनट के लिए पीबीएस में 0.2% ट्राइटन के 1 एमएल और 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ 3 एक्स के साथ कोक्ली 2 एक्स धो लें।
    नोट: इन धोने के चरणों के बाद, कोक्ली कई दिनों तक ~ 4 डिग्री सेल्सियस पर फ्रिज में पीबीएस में रह सकता है।

3. ऑटोफ्लोरेसेंस क्वेंचर के साथ उपचार (वैकल्पिक)

नोट: मध्यम आयु वर्ग और वृद्ध गेरबिल से कोक्ली व्यापक पृष्ठभूमि ऑटोफ्लोरेसेंस दिखाते हैं। युवा वयस्क ऊतक में, एक ऑटोफ्लोरेसेंस क्वेंचर के साथ उपचार आवश्यक नहीं है। सिद्धांत रूप में, इम्यूनोस्टेनिंग प्रक्रिया से पहले ऑटोफ्लोरेसेंस क्वेंचर को लागू करना संभव है, जो तब वांछित एंटीबॉडी प्रतिदीप्ति के किसी भी अनजाने में कमी से बचा जाता है। हालांकि, निर्माता की डेटाशीट के अनुसार, डिटर्जेंट (जैसे वर्तमान प्रोटोकॉल में ट्राइटन एक्स -100) का उपयोग अब संभव नहीं है क्योंकि वे ऊतक से क्वेंचर को हटा देते हैं।

  1. चरण 4.2 में वर्णित के रूप में एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत कोक्ली को आधे में काटें।
  2. 5% समाधान प्राप्त करने के लिए 70% इथेनॉल के साथ ऑटोफ्लोरेसेंस क्वेंचर मिलाएं और 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 2 डी-शेकर पर इस समाधान में कोक्ली को सेते हैं। प्रत्येक 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 2 डी-शेकर पर पीबीएस के 1 एमएल के साथ कोक्ली 3 एक्स धो लें।
    चेतावनी: ऑटोफ्लोरेसेंस क्वेंचर खतरनाक और हानिकारक है। इस पदार्थ को संभालते समय दस्ताने पहनें।

4. अंतिम ठीक विच्छेदन

  1. स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत कोक्लीआ को विच्छेदित करें। पीबीएस के साथ एक पॉलीस्टाइल पेट्री डिश और इसके ढक्कन को भरें और दो ठीक संदंश, वन्नस वसंत कैंची, एक ब्लेड धारक और एक टूटने योग्य रेजरब्लेड आसान रखें। विच्छेदन चरण के आधार पर ~ 2-4 मिमी की काटने की सतह प्राप्त करने के लिए रेजरब्लेड से टुकड़ों को तोड़ें। एक पंक्ति में बढ़ते माध्यम की तीन बूंदें रखकर एक माइक्रोस्कोप स्लाइड तैयार करें।
    नोट: रेजर ब्लेड की काटने की सतह जल्दी से पहनती है। कोक्लीआ के लगभग हर दूसरे टुकड़े को विच्छेदन और बढ़ते के बाद ब्लेड का आदान-प्रदान किया जाना चाहिए।
  2. यदि चरण 3.1 में पहले से ही नहीं किया गया है, तो पहले स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत मोडिओलस के साथ कोक्लीआ को आधे में काट लें। इसके लिए, एक ब्लेड धारक में कोक्लीआ की कुंडलित लंबाई से अधिक समय तक रेजरब्लेड का एक टुकड़ा रखें। पेट्री डिश में कोक्लीआ रखें और रेजरब्लेड के टुकड़े के साथ अतिरिक्त ऊतक को काट लें। ठीक संदंश के साथ जगह में कोक्लीआ पकड़ो और मोडिओलस के साथ आधे में कटौती।
  3. एक आधे से शुरू करें, लेकिन पेट्री डिश में दूसरे आधे हिस्से को भी छोड़ दें। ध्यान से संदंश के साथ कॉक्लियर आधा तय करें जैसे कि काटने का किनारा ऊपर की ओर सामना कर रहा है। शीर्ष को कवर करते हुए, हेलिकोट्रेमा के ऊपर कोक्लीआ की हड्डी को काटने के लिए ठीक वसंत कैंची का उपयोग करें।
  4. कोक्लियर टुकड़ों के पृथक्करण को शुरू करने के लिए, मोडिओलस और श्रवण तंत्रिका के माध्यम से कैंची के साथ काटकर मध्य मोड़ को अलग करें, ऊपर (स्कैला वेस्टिबुली) और नीचे (स्कैला टिम्पनी)।
  5. कोक्लियर वाहिनी के भीतर स्ट्रिया संवहनी को कवर करने वाली कोक्लियर हड्डी के माध्यम से काटें। कोर्टी के अंग के ऊपर और स्ट्रिया संवहनी के साथ कोक्लियर हड्डी के दोनों किनारों पर दो कटौती करें और अंततः कोक्लियर टुकड़ों को अलग करने के लिए रेजरब्लेड का उपयोग करें।
    नोट: स्ट्रिया संवहनी आसानी से एक अंधेरे पट्टी के रूप में दिखाई देता है। स्ट्रिया संवहनी के साथ काटने से कोर्टी का अंग बरकरार रहता है।
  6. वैकल्पिक: स्ट्रिया संवहनी को इकट्ठा करने के लिए, दोनों को अलग करने के लिए कॉर्टी के अंग और स्ट्रिया संवहनी के बीच सावधानीपूर्वक कटौती करें। सर्पिल लिगामेंट (कोक्लीआ की बाहरी सतह को कवर करने वाली हड्डी से जुड़ी हड्डी से जुड़ी) से जुड़े स्ट्रिया संवहनी को छोड़ दें और संदंश का उपयोग करके डिकैल्सीफाइड हड्डी को हटा दें। बढ़ते माध्यम की एक बूंद में माइक्रोस्कोप स्लाइड पर स्ट्रिया पक्ष के साथ टुकड़ा रखें।
    नोट: यदि एकत्रित टुकड़ा बहुत दृढ़ता से घुमावदार है, तो स्लाइड पर बढ़ते के लिए पर्याप्त फ्लैट होने के लिए इसे छोटे टुकड़ों में विभाजित करना आवश्यक हो सकता है।
  7. पॉलीस्टाइल पेट्री डिश के पीबीएस से भरे ढक्कन में कॉक्लियर टुकड़ों को स्थानांतरित करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि कोक्लियर पूरे माउंट स्लाइड पर जितना संभव हो उतना सपाट झूठ बोलते हैं। अतिरिक्त ऊतक निकालें, जैसे कि अबनेयुरल पक्ष पर सर्पिल स्नायुबंधन के कुछ हिस्सों और तंत्रिका पक्ष पर सर्पिल लिम्बस के कुछ हिस्सों। ध्यान से सुपर ठीक संदंश के साथ टेक्टोरियल झिल्ली को हटा दें।
  8. बढ़ते माध्यम की एक बूंद में स्लाइड पर कॉक्लियर टुकड़े रखें। इमेजिंग के लिए ऑप्टिकल पथ में आईएचसी को अस्पष्ट करने से बचने के लिए स्लाइड पर सामना करने वाले कॉर्टी के अंग के साथ कोक्लियर पूरे माउंट रखें। आईएचसी के करीब निकटता में सर्पिल लिम्बस के आक्रमण की तलाश करें, जो ऊपर की ओर सामना करने के लिए पक्ष की पहचान करने के लिए धनु विमान में कॉक्लियर टुकड़े को स्थानांतरित करके दिखाई देता है।
    नोट: आगे की प्रक्रिया के दौरान अपने व्यक्तिगत टुकड़ों से पूर्ण कोक्लीआ को डिजिटल रूप से पुनर्निर्माण करने के लिए, टुकड़ों के स्केच और नोट स्थलों के स्केच को दस्तावेज करने की दृढ़ता से अनुशंसा की जाती है। इसके अलावा, टुकड़ों को आदर्श रूप से स्लाइड पर सही क्रम में व्यवस्थित किया जाना चाहिए।
  9. पूरे कोक्लीआ माइक्रोस्कोप स्लाइड पर स्थानांतरित होने तक चरण 4.3 से 4.8 दोहराएं। यदि आवश्यक हो, तो अधिक बढ़ते माध्यम जोड़ें, स्लाइड को कवरस्लिप करें, और किनारों के चारों ओर चित्रित काले नाखून पॉलिश के साथ कवरस्लिप को सील करें। इसे कमरे के तापमान पर अंधेरे में सूखने दें और फिर स्लाइड को 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में स्टोर करें।
    नोट: यहां तक कि अगर संवेदी उपकला के कुछ हिस्सों को गलती से खो दिया जाता है, तो भी सही लंबाई अनुमान के लिए कोक्लियर टुकड़े के बचे हुए हिस्से को माउंट करना महत्वपूर्ण है।

5. कॉक्लियर लंबाई माप

  1. एक एपीआई-फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप सिस्टम और संबंधित सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके इसके टुकड़ों की ब्राइटफील्ड छवियों से कोक्लीआ की लंबाई को मापें। प्रत्येक कॉक्लियर टुकड़े से कम-आवर्धन छवियों (4x लेंस) को सहेजें और प्रत्येक छवि में आईएचसी की पंक्ति के साथ एक रेखा खींचने के लिए माइक्रोस्कोप सॉफ़्टवेयर के लासो माप उपकरण का उपयोग करें। सभी टुकड़ों की लंबाई जोड़कर कुल लंबाई की गणना करें।
    नोट: जब संवेदी उपकला के कुछ हिस्सों को एक कोक्लियर टुकड़े के भीतर गायब कर रहे हैं, तो लाइन को प्रक्षेपित करें।
  2. एक व्यक्तिगत कोक्लीआ में विश्लेषण किए जाने वाले कोक्लियर स्थानों को परिभाषित करने के लिए, मुलर25 द्वारा दिए गए समीकरण का उपयोग करके शीर्ष से उनकी संबंधित दूरी की गणना करें। उदाहरण के लिए, इन स्थानों को कॉक्लियर टुकड़ों के प्रिंटआउट पर चिह्नित करें।

6. एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ छवि अधिग्रहण

  1. एक तेल विसर्जन 40x उद्देश्य (संख्यात्मक एपर्चर 1.3) और उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए उपयुक्त तेल के साथ एक कन्फोकल माइक्रोस्कोप का प्रयोग करें।
    नोट: यदि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप में एक उलटा प्रकाश पथ है, तो स्लाइड को उल्टा तैनात किया जाना चाहिए। इस मामले में, नमूना को सिंक करने के लिए लगभग 30 मिनट दें और अंतिम स्कैन शुरू करने से पहले कवरस्लिप पर स्थिर रूप से आराम करें। वैकल्पिक रूप से, एक बढ़ते माध्यम का उपयोग करें जो विच्छेदन की अवधि के दौरान तरल पदार्थ है लेकिन बाद में जम जाता है और साथ ही प्रतिदीप्ति को संरक्षित करता है।
  2. उपयुक्त लेजर को सक्रिय करें: α = 488 एनएम और λ = 522 एनएम की तरंग दैर्ध्य के साथ दो ऑप्टिकली पंप अर्धचालक लेजर, और α = 638 एनएम की तरंग दैर्ध्य के साथ एक डायोड लेजर इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाता है। प्रतिदीप्ति टैग की उत्सर्जन सीमा चुनें (एएफ 488: 499-542 एनएम, एएफ 568: 582-621 एनएम, एएफ 647: 666-776 एनएम)। एक हाइब्रिड डिटेक्टर जारी फोटॉनों की गिनती करता है के रूप में, उत्सर्जन वक्र से कम से कम 10 एनएम दूर लेजर लाइन जगह है।
    नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए एकल-लेबल वाले ऊतक के साथ प्रारंभिक जांच करना महत्वपूर्ण है कि चुने हुए डिटेक्टर बैंडविड्थ रंग चैनलों को साफ-सुथरा रूप से अलग करते हैं (यानी, चैनल क्रॉसस्टॉक का नेतृत्व नहीं करते हैं)। रेडियो तरंगें हाइब्रिड डिटेक्टर के साथ हस्तक्षेप करती हैं, जिसके परिणामस्वरूप अधिकतम फोटॉन गिनती होती है, और इस प्रकार स्टैक में आर्टिफैक्टुअल धारियों का कारण बनता है। इसलिए माइक्रोस्कोप के पास मोबाइल फोन का इस्तेमाल करने से बचें।
  3. ऊतक पर ज़ूम इन करें जब तक कि छवि 10 आईएचसी तक न फैले। नाइक्विस्ट नमूनाकरण के अनुसार छवि का रिज़ॉल्यूशन चुनें, जो आमतौर पर ~ 40-60 एनएम / जेड-दिशा में चरण आकार को 0.3 μm और इमेजिंग गति को 400-700 हर्ट्ज पर सेट करें।
    नोट: ये दोनों सेटिंग्स (चरण आकार और इमेजिंग गति) इष्टतम इमेजिंग मापदंडों का उपयोग करने और स्कैनिंग समय बचाने के बीच समझौता कर रहे हैं।
  4. इमेजिंग समय को छोटा करने के लिए द्विदिश नमूनाकरण करें। 488 एनएम और 638 एनएम चैनल 3एक्स के लिए फ्रेम जमा करें और 522 एनएम चैनल 6 एक्स के लिए; इसके अतिरिक्त, प्रत्येक चैनल के लिए लाइनों 3x औसत। जेड-आयाम में स्टैक की शुरुआत और अंत चुनें।
  5. सिग्नल-टू-शोर अनुपात में कमी से बचने के लिए हाइब्रिड डिटेक्टर (गिनती मोड) का उपयोग करते समय लाभ को 100 पर सेट करें। लेजर पावर सेट करें ताकि ब्याज के क्षेत्र में कोई पिक्सेल संतृप्त न हो, लेकिन संरचनाएं ज्यादातर पूर्ण 8 बिट रेंज को कवर करती हैं। 0.5% की कम लेजर शक्ति के साथ शुरू करें और इसे तब तक बढ़ाएं जब तक कि संरचनाएं दिखाई न दें।
    नोट: अच्छा धुंधला आम तौर पर 0.1% और 5% के बीच एक लेजर शक्ति की जरूरत है।
  6. सैद्धांतिक बिंदु-प्रसार फ़ंक्शन का उपयोग करके छोटे फ्लोरोसेंट संरचनाओं के चारों ओर धुंधले प्रभामंडल को हटाने के लिए छवि ढेर के पोस्ट हॉक प्रसंस्करण के लिए डिकॉन्वोल्यूशन सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें। एक प्रयोग के भीतर प्रत्येक स्टैक के लिए समान सेटिंग्स का उपयोग करें। विघटित छवियों को .tif या .ics के रूप में सहेजें।
    नोट: मायोविया-लेबल (आईएचसी) को विघटन से लाभ नहीं होता है और समय बचाने के लिए छोड़ा जा सकता है। सॉफ़्टवेयर छवि फ़ाइलों के मेटा डेटा का उपयोग करता है; हालाँकि, प्रकाश पथ, एम्बेडिंग माध्यम या विसर्जन माध्यम जैसे कई मापदंडों को निर्दिष्ट करने की आवश्यकता है।

7. अन्तर्ग्रथन मात्रा का ठहराव

  1. अतिरिक्त बायोवोक्सेल-प्लगइन के साथ स्वतंत्र रूप से सुलभ सॉफ़्टवेयर इमेजजे में डिकोनवॉल्व्ड स्टैक की एक प्रति खोलें, जो उनकी वेबसाइट पर भी उपलब्ध है।
  2. चैनलों को विभाजित करके व्यक्तिगत चैनलों के रंगों को समायोजित करें (छवि | रंग | विभाजन चैनल) और विलय (छवि | रंग | मर्ज चैनल) उन्हें फिर से, विभिन्न रंगों को असाइन करना। छवि को आरजीबी-स्टैक में कनवर्ट करें (छवि | रंग | आरजीबी के लिए स्टैक) और चमक और कंट्रास्ट समायोजित करें (छवि | | समायोजित करें चमक/कंट्रास्ट | अधिकतम के बारे में ऑटो या स्लाइडर), यदि आवश्यक हो, ताकि पूर्व और पोस्टसिनेप्टिक संरचनाएं और आईएचसी लेबल पृष्ठभूमि से सुखद रूप से अलग हों।
  3. पांच आईएचसी चुनें और स्टैक के भीतर वांछित स्थान पर क्लिक करके उन्हें टेक्स्ट टूल (आईएचसी 1-आईएचसी 5) के साथ लेबल करें। आरओआई प्रबंधक खोलें (विश्लेषण | उपकरण | आरओआई प्रबंधक); एक संख्या के साथ बिंदुओं को लेबल करने के लिए टिकबॉक्स लेबल को सक्रिय करें। ब्याज के आईएचसी पर ज़ूम इन करें।
  4. मल्टीपॉइंट मोड में पॉइंट/मल्टीपॉइंट टूल का उपयोग करें (पॉइंट- या मल्टीपॉइंट मोड के बीच चयन करने के लिए टूल पर राइट-क्लिक करें)। जेड-आयाम के माध्यम से स्क्रॉल करते समय एक कार्यात्मक रिबन सिनैप्स (यानी, पोस्टसिनेप्टिक ग्लूटामेट पैच के करीब एक प्रीसिनेप्टिक रिबन) पर क्लिक करें।
    नोट: ओवरलैप की उनकी मात्रा और प्रत्येक चैनल के लिए चुने गए रंग के आधार पर, साझा पिक्सेल मिश्रित रंग में दिखाई देते हैं। आमतौर पर, व्यक्तिगत कार्यात्मक सिनैप्स के बीच का अंतर सरल होता है क्योंकि वे एक दूसरे से पर्याप्त रूप से दूर होते हैं।
  5. जब ब्याज की सभी संरचनाएं टिक जाती हैं, तो आरओआई प्रबंधक के ग्राफिकल यूजर इंटरफेस पर जोड़ें पर क्लिक करें। मनमाने नाम पर क्लिक करें और नाम बदलें चुनें।
    नोट: बिंदु-लेबल अभी भी स्टैक के सभी विमानों के माध्यम से रहते हैं जब सभी चेकबॉक्स दिखाएँ बिंदु उपकरण विकल्प मेनू ( बिंदु उपकरण आइकन पर डबल-क्लिक करें) में चुना जाता है, जो एक ही रिबन सिनैप्स को कई बार गिनने से बचने में मदद करता है।
  6. गिनती के लिए अगला आईएचसी चुनते समय, हाथ उपकरण के साथ अगले आईएचसी को पूरी तरह से प्रदर्शित करने के लिए छवि को समायोजित करके अनजाने में गिनती जोड़ने से बचें। पहले संग्रहीत डेटा में अधिक पंक्टा जोड़ने से बचने के लिए मल्टीपॉइंट टूल से पॉइंट टूल में बदलें। अगले आईएचसी के भीतर ब्याज की संरचना पर क्लिक करें और मल्टीपॉइंट टूल में वापस बदलें। ब्याज के सभी आईएचसी का मूल्यांकन किए जाने तक चरण 7.4 से 7.5 दोहराएं।
  7. डेटा सहेजने के लिए, आरओआई प्रबंधक में डेटासेट पर क्लिक करें और फिर माप पर। मापा डेटा बिंदुओं को सूचीबद्ध करते हुए, एक नई विंडो दिखाई देने की प्रतीक्षा करें। इस सूची को स्प्रेडशीट फ़ाइल के रूप में सहेजें (फ़ाइल | इस रूप में सहेजें)। आरओआई प्रबंधक में सभी दिखाएँ सक्रिय करके छवि सहेजें। स्टैक में पॉइंट-लेबल को स्थायी रूप से जोड़ने के लिए फ़्लैट पर क्लिक करें। छवि स्टैक को बंद करते समय, परिवर्तनों को सहेजने के लिए सहमत हों।

8. बाल कोशिका पर अन्तर्ग्रथन मात्रा और स्थिति का विश्लेषण

नोट: लेखकों ने मैटलैब के आधार पर एक कस्टम-प्रोग्राम की गई प्रक्रिया का उपयोग किया। चूंकि यह सार्वजनिक रूप से उपलब्ध नहीं है, इसलिए इसे केवल व्यापक शब्दों में यहां उल्लिखित किया गया है (यह भी देखें7). यदि इसका उपयोग करने में रुचि रखते हैं तो कृपया संबंधित लेखक से संपर्क करें। प्रक्रिया इनपुट के रूप में टीआईएफएफ प्रारूप में ट्रिपल-लेबल (आईएचसी, प्री- और पोस्टसिनेप्टिक) छवि स्टैक की अपेक्षा करती है, उपयोगकर्ता को ग्राफिकल इंटरफ़ेस के माध्यम से विश्लेषण के विभिन्न चरणों के माध्यम से मार्गदर्शन करती है, और स्प्रेडशीट प्रारूप में परिणामों का व्यापक आउटपुट प्रदान करती है।

  1. स्तंभ-मोडियोलर अक्ष और कोक्लियर एपिकल-बेसल अक्ष और आईएचसी के शीर्ष (क्यूटिकुलर प्लेट) से नीचे (सिनैप्टिकिक पोल) अक्ष पर व्यक्तिगत आईएचसी की सीमा द्वारा परिभाषित 3 डी-समन्वय प्रणाली के लिए सिनैप्टिक संरचनाओं की स्थिति को सामान्य करें।
    नोट: अन्तर्ग्रथनी तत्वों की मात्रा (पूर्व और पोस्टसिनेप्टिक दोनों, और कार्यात्मक सिनैप्स की संयुक्त मात्रा) μm3 में प्रदान की जाती है और संबंधित औसत मान3 के लिए सामान्यीकृत होती है।

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Representative Results

कोक्ली को या तो पूरे जानवर के फिक्सेटिव के साथ कार्डियोवैस्कुलर छिड़काव के बाद काटा गया था या जानवर को इच्छामृत्यु और विसर्जन-तय करने के बाद तेजी से विच्छेदित किया गया था। बाद की विधि के साथ, आईएचसी विच्छेदन के दौरान जगह में रहे, जबकि, असफल छिड़काव के मामलों में और इस प्रकार अपर्याप्त रूप से निश्चित ऊतक, संवेदी उपकला अक्सर नष्ट हो गई थी। ध्यान दें कि लेखकों को ऐसे मामलों का सामना करना पड़ा जहां ट्रांसकार्डियल छिड़काव के बाद कोक्ली का निर्धारण अपर्याप्त था जबकि मस्तिष्क का निर्धारण अभी भी पर्याप्त था। एक अवर छिड़काव से ऊतक को अभी भी कोक्लियर एपेक्स और बेस में छेद खोलकर और 2 दिनों के लिए 4% पीएफए में विसर्जन करके कोक्ली को पोस्टफिक्स करके बचाया जा सकता है।

पूरे कोक्लीआ की लंबाई निर्धारण मुलर25 के अनुसार विशिष्ट कोक्लियर पदों पर आईएचसी और उनके सिनैप्स का मूल्यांकन करने के लिए आयोजित किया गया था, जो अलग-अलग विशेषता आवृत्तियों (तालिका 1) के बराबर है। इसके लिए, वांछित कोक्लियर पदों की गणना कोक्लियर बेस से बेसिलर झिल्ली की लंबाई के प्रतिशत के रूप में की गई थी। युवा वयस्क गेरबिल्स से 13 कोक्लियर की औसत कोक्लियर लंबाई 11.3 मिमी (इंटरक्वार्टाइल रेंज: 11.02-11.52 मिमी) थी। वृद्ध गेरबिल्स से 24 कोक्लियर की औसत कोक्लियर लंबाई 11.5 मिमी (इंटरक्वार्टाइल रेंज: 11.24-11.73 मिमी) थी। युवा वयस्क और वृद्ध कोक्ली की लंबाई के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था (मान-व्हिटनी यू-टेस्ट: यू = -1.62, पी = 0.105); कुल मिलाकर औसत 11.48 मिमी था। कोई तर्क दे सकता है कि व्यक्तिगत कोक्ली की लंबाई में यह भिन्नता छोटी थी और निश्चित लंबाई की स्थिति (मिमी में) का उपयोग करना पर्याप्त है। हालांकि, स्थान-आवृत्ति फ़ंक्शन गैर-रैखिक है। इसलिए, औसत लंबाई से विचलन अपेक्षाकृत अधिक एपिकल कॉक्लियर स्थानों की तुलना में बेसल कॉक्लियर स्थानों के लिए एक बड़ी त्रुटि का कारण बनता है। उदाहरण के लिए, 1 किलोहर्ट्ज की आवृत्ति के बराबर कोक्लियर स्थान के लिए, औसत कोक्लियर लंबाई (यानी, 11.48 मिमी) के आधार पर गणना की जाती है, इसी आवृत्ति क्रमशः इस नमूने में सबसे कम (10.36 मिमी) और सबसे लंबे कोक्लीआ (12.28 मिमी) के लिए 1.16 किलोहर्ट्ज से 0.91 किलोहर्ट्ज तक होती है। बेसली स्थित आवृत्ति (जैसे, 32 किलोहर्ट्ज) के लिए, आवृत्ति रेंज क्रमशः सबसे कम और सबसे लंबे समय तक कोक्लीआ के लिए 51.62 किलोहर्ट्ज से 23.97 किलोहर्ट्ज थी। इसलिए, प्रत्येक कोक्लीआ पर अलग-अलग स्थानों की गणना करना उचित है, विशेष रूप से बेसल कोक्लियर स्थानों की जांच करते समय।

चित्रा 1 एक युवा वयस्क (10 महीने, चित्रा 1 ए) और एक वृद्ध गेरबिल (38 महीने, चित्रा 1 बी) से कोक्ली के अधिकतम तीव्रता जेड-आयाम अनुमानों को दर्शाता है, जो आदर्श इम्यूनोलेबल के उदाहरण हैं। युवा वयस्क गेरबिल के कोक्लीआ को दर्शाती छवि में, मायोविया-लेबल वाले आईएचसी, यहां नीले रंग में दिखाए गए हैं, काले रंग की पृष्ठभूमि के विपरीत हैं। इसलिए, व्यक्तिगत आईएचसी आसानी से पता लगाने योग्य हैं। प्री- और पोस्टसिनेप्टिक संरचनाएं क्रमशः हरे और लाल तत्वों के रूप में स्पष्ट रूप से दिखाई देती हैं। जब भी वे करीबी जुड़ाव में होते हैं तो उन्हें एक कार्यात्मक अन्तर्ग्रथन बनाने के लिए माना जाता है (चित्रा 1ए ', बी')। वृद्ध गेरबिल्स के कोक्ली में शायद ही कभी अप्रकाशित प्रीसिनेप्टिक संरचनाएं (अनाथ रिबन) स्पष्ट थीं। पुराने गेरबिल (चित्रा 1 बी) से कोक्लीआ को ऑटोफ्लोरेसेंस क्वेंचर के साथ इलाज किया गया था। आईएचसी लेबल कमजोर प्रतीत होता है, हालांकि इस नमूने में उपयोग की जाने वाली लेजर शक्ति युवा वयस्क गेरबिल से कोक्लीआ के लिए उपयोग की जाने वाली तुलना में तीन गुना अधिक थी। फिर भी, आईएचसी अभी भी पृष्ठभूमि से अलग हैं। प्री-और पोस्टसिनेप्टिक संरचनाएं स्पष्ट रूप से दिखाई देती हैं, और उन दोनों चैनलों के लिए उपयोग की जाने वाली लेजर शक्ति युवा वयस्क नमूने के लिए समान या उससे भी नीचे थी। वृद्ध जानवरों के ऊतक आमतौर पर काफी अधिक निरर्थक दिखने वाले फ्लोरोसेंट सिग्नल दिखाते हैं। इसलिए, युवा वयस्क और वृद्ध सामग्री के लिए प्रोटोकॉल में मुख्य अंतर एक ऑटोफ्लोरेसेंस क्वेंचर के साथ उपचार है। ध्यान दें कि यह प्रतिदीप्ति-टैग किए गए एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोस्टेनिंग के बाद किया गया था और सिद्धांत रूप में, इच्छित एंटीबॉडी लेबल को भी प्रभावित कर सकता है। हालांकि, उपचार प्रभावी ढंग से निरर्थक मूल के बाहरी प्रतिदीप्ति को कम कर दिया, जबकि ब्याज की संरचनाओं के विशिष्ट लेबल के पर्याप्त संकेत छोड़ने (चित्रा 2 बी के साथ चित्रा 1 बी की तुलना करें)। हालांकि, प्रारंभिक परिणामों ने संकेत दिया कि, स्ट्रिया संवहनी में, वृद्ध गेरबिल्स के नमूनों में बाहरी प्रतिदीप्ति प्रकट नहीं हुई थी।

सबऑप्टिमली संसाधित किए गए ढेर के उदाहरण चित्रा 2 में दिखाए गए हैं। चित्रा 2 ए एक पुराने गेरबिल (36 महीने) से एक ढेर के अधिकतम तीव्रता जेड-प्रक्षेपण को दर्शाता है, जहां आईएचसी, जो या तो अस्वाभाविक रूप से मुड़े हुए थे या अलग हो गए थे, उनकी संपूर्णता में स्कैन नहीं किए गए थे। नतीजतन, इस स्कैन में केवल आईएचसी के एपिकल और बेसल ध्रुव दिखाई देते हैं। इसे बाहर नहीं किया जा सकता है कि आईएचसी के लापता मध्य भाग में अधिक सिनैप्स स्थित थे और इसलिए, एक विश्वसनीय विश्लेषण संभव नहीं है। इस प्रकार, यह महत्वपूर्ण है कि सभी मूल्यांकन किए गए आईएचसी को कॉन्फोकल स्टैक में पूरी तरह से स्कैन किया जाए। चित्रा 2 बी एक वृद्ध गेरबिल (38 महीने) में नमूना एक ढेर की अधिकतम तीव्रता जेड प्रक्षेपण से पता चलता है। अस्पष्ट उत्पत्ति का प्रतिदीप्ति अधिक है क्योंकि इस मामले में ऑटोफ्लोरेसेंस क्वेंचर का उपयोग नहीं किया गया था। हालांकि, बाहरी प्रतिदीप्ति काफी हद तक ग्लूए 2-लेबल से जुड़े (लाल) चैनल तक ही सीमित थी, जो काफी विशिष्ट है। ऐसे मामलों में, कार्यात्मक सिनैप्स की गणना करना अभी भी संभव हो सकता है यदि रिबन का सीटीबीपी 2-लेबल अपेक्षाकृत साफ और विशिष्ट है। चित्रा 2 सी एक वृद्ध गेरबिल (42 महीने) से प्राप्त ढेर की अधिकतम तीव्रता जेड-प्रक्षेपण को दर्शाता है। यहां, सिनैप्स को व्यक्तिगत आईएचसी को आवंटित नहीं किया जा सकता है क्योंकि आईएचसी काफी हद तक विघटित हो गए थे; वास्तव में, यह सुनिश्चित करना मुश्किल है कि कितने आईएचसी का प्रतिनिधित्व किया जाता है। चित्रा 3 ए में दिखाए गए उदाहरण में, स्कैन के दौरान कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के करीब एक मोबाइल फोन का उपयोग किया गया था। धारियां नीले चैनल (आईएचसी लेबल) में दिखाई देती हैं। सौभाग्य से, इस मामले में, इसने सिनैप्टिक चैनलों को प्रभावित नहीं किया और आईएचसी के केवल ऊपरी हिस्से को प्रभावित किया, इस प्रकार, एक विश्लेषण अभी भी व्यवहार्य था।

चित्रा 3 एक युवा वयस्क गेरबिल से कोक्लीआ के एक ही टुकड़े से लिए गए ढेर के अधिकतम तीव्रता जेड-अनुमानों को प्रदर्शित करता है, इम्यूनोस्टेनिंग के बाद 3 महीने (चित्रा 3 ए, ए ') और 29.5 महीने (चित्रा 3 बी, बी ') का अधिग्रहण किया जाता है। तुलनीय रहने के लिए, छवियों को ठीक उसी स्थान से नहीं लिया गया था (जो पिछले स्कैन से विरंजन का सामना करना पड़ सकता था) लेकिन एक ही कॉक्लियर टुकड़े से। बाद के समय बिंदु पर किए गए स्कैन के लिए, लेजर शक्ति को ~ 2- से 3 गुना तक बढ़ाया जाना था। फिर भी, लेबल संरचनाएं अभी भी स्पष्ट हैं। सिग्नल-टू-शोर अनुपात में कमी आई थी, खासकर पोस्टसिनेप्टिक और आईएचसी संरचनाओं को प्रदर्शित करने वाले चैनलों में, जबकि प्रीसिनेप्टिक लेबल वाला चैनल कम प्रभावित हुआ था। आईएचसी प्रति कार्यात्मक सिनैप्स का परिमाणीकरण अभी भी संभव है।

आईएचसी पर अन्तर्ग्रथन मात्रा और स्थिति के विश्लेषण के लिए विशिष्ट परिणाम चित्रा 4 में सचित्र हैं, चित्रा 1 ए में दिखाए गए कॉन्फोकल स्टैक का उपयोग करके। व्यक्तिगत रूप से परिभाषित आईएचसी को ग्राफिक रूप से विभिन्न रंगों में ग्रिड पुनर्निर्माण के रूप में प्रदर्शित किया जाता है, प्रत्येक को आवंटित कार्यात्मक सिनैप्स (प्री- और पोस्टसिनेप्टिक लेबल के कोलोकलाइजेशन द्वारा परिभाषित) के साथ या बिना। इस प्रदर्शन को विभिन्न देखने के कोण (चित्रा 4 ए, बी) प्राप्त करने के लिए 3 डी में स्वतंत्र रूप से घुमाया जा सकता है। आईएचसी को ग्राफिकल डिस्प्ले (चित्रा 4 बी) के लिए भी सिंगल किया जा सकता है। डेटा रेखांकन की एक बड़ी विविधता, आईएचसी-केंद्रित समन्वय प्रणाली के भीतर अन्तर्ग्रथनी संस्करणों के वितरण के विभिन्न पहलुओं को दर्शाती है, का उत्पादन किया जाता है (चित्रा 4 सी-ई में उदाहरण)। प्रत्येक आईएचसी और प्रत्येक सिनैप्टिक तत्व के लिए कच्चा मात्रात्मक डेटा स्प्रेडशीट के रूप में भी उपलब्ध है, उदाहरण के लिए, आगे सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए कई कॉन्फोकल स्टैक में जोड़ा जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: सफलतापूर्वक संसाधित कोक्ली के उदाहरण। (ए) एक युवा वयस्क गेरबिल (10 महीने) से कॉन्फोकल स्टैक के अधिकतम तीव्रता वाले जेड-अनुमान, 1 किलोहर्ट्ज के अनुरूप एक कोक्लियर स्थान पर प्राप्त किए गए, और (बी) एक वृद्ध गेरबिल (38 महीने, पैनल बी), 500 हर्ट्ज के बराबर कोक्लियर स्थान पर प्राप्त किया गया। और पोस्टसिनेप्टिक ग्लूटामेट पैच को एंटी-ग्लूए 2 (लाल) के साथ लेबल किया गया था। वृद्ध गेरबिल के कोक्लीआ को इम्यूनोस्टेनिंग के बाद एक ऑटोफ्लोरेसेंस क्वेंचर के साथ इलाज किया गया था। स्पष्टता के लिए, आईएचसी की रूपरेखा धराशायी लाइनों द्वारा इंगित की जाती है। पैनल (ए') और (बी') पैनलों (ए) और (बी) से संबंधित कोक्ली में वर्गों द्वारा उल्लिखित क्षेत्रों का इज़ाफ़ा प्रदर्शित करते हैं। पीले तीर कार्यात्मक सिनैप्स को इंगित करते हैं। प्री- और पोस्टसिनेप्टिक संरचनाओं (लेकिन आईएचसी चैनल नहीं) को प्रदर्शित करने वाले चैनलों को डिकॉन्वोल्यूशन से गुजरना पड़ा। स्केल सलाखों = 10 μm (ए, बी), 1 μm (ए', बी')। संक्षिप्त नाम: आईएचसी = आंतरिक बाल कोशिका; मायोविया = मायोसिन वीआईआईए; सीटीबीपी 2 = सी-टर्मिनल बाध्यकारी प्रोटीन 2; ग्लूए 2 = आयनोट्रोपिक ग्लूटामेट रिसेप्टर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: उप-संसाधित कोक्ली के उदाहरण। कॉन्फोकल स्टैक के अधिकतम तीव्रता वाले जेड-अनुमान जिनके लिए प्रसंस्करण सबऑप्टिमल था, गेरबिल्स से जो (ए) 36 महीने और (बी, सी) 38 महीने पुराने थे और क्रमशः 16 किलोहर्ट्ज, 8 किलोहर्ट्ज और 32 किलोहर्ट्ज के अनुरूप कोक्लियर स्थानों से थे। गेरबिल्स जिनसे पैनल (ए) और (सी) में कोक्ली प्राप्त किए गए थे, ट्रांसकार्डियल रूप से सुगंधित थे, और पैनल (सी) से कोक्लीआ को 4% पीएफए में 3 दिनों के लिए अतिरिक्त रूप से पोस्टफिक्स किया गया था। (बी) से कोक्लीआ 2 दिनों के लिए 4% पीएफए में विसर्जन-तय किया गया था। (ए) और (सी) से कोक्ली का इलाज ऑटोफ्लोरेसेंस क्वेंचर के साथ किया गया था। आईएचसी को मायोविया (नीला) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दाग दिया गया था, प्रीसिनेप्टिक रिबन को एंटी-सीटीबीपी 2 (हरा) के साथ लेबल किया गया था, और पोस्टसिनेप्टिक ग्लूटामेट पैच को एंटी-ग्लूए 2 (लाल) के साथ लेबल किया गया था। सभी चैनलों को डीकॉन्वोल्व्व्ड कर दिया गया था। कंफोकल स्कैन के बाद चमक और कंट्रास्ट को और समायोजित किया गया। स्केल सलाखों = 10 μm. संक्षिप्त नाम: पीएफए = पैराफॉर्मलडिहाइड; आईएचसी = आंतरिक बाल कोशिका; मायोविया = मायोसिन वीआईआईए; सीटीबीपी 2 = सी-टर्मिनल बाध्यकारी प्रोटीन 2; ग्लूए 2 = आयनोट्रोपिक ग्लूटामेट रिसेप्टर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: लंबे समय तक भंडारण के बाद इम्यूनोलेबल की स्थिरता। एक युवा वयस्क गेरबिल (10 महीने) से कॉन्फोकल स्टैक के अधिकतम तीव्रता वाले जेड-अनुमान, 16 किलोहर्ट्ज कॉक्लियर स्थान पर लिया जाता है, (ए) धुंधला होने के 3 महीने बाद और (बी) धुंधला होने के 29.5 महीने बाद एक ही कॉक्लियर टुकड़े पर थोड़ा अधिक बेसल कॉक्लियर स्थान पर। कोक्लीआ को 2 दिनों के लिए 4% पीएफए में विसर्जन-तय किया गया था। स्पष्टता के लिए, (ए') और (बी') क्रमशः (ए) और (बी) में वर्गों द्वारा इंगित क्षेत्रों से केवल कुछ कार्यात्मक सिनैप्स पर ज़ूम इन करें। आईएचसी को मायोविया (नीला) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दाग दिया गया था, प्रीसिनेप्टिक रिबन को एंटी-सीटीबीपी 2 (हरा) के साथ लेबल किया गया था, और पोस्टसिनेप्टिक ग्लूटामेट पैच को एंटी-ग्लूए 2 (लाल) के साथ लेबल किया गया था। आईएचसी चैनलों के लिए लेजर शक्ति 1.3% और 3%, प्रीसिनेप्टिक चैनलों के लिए 0.4% और 1.1% और पोस्टसिनेप्टिक चैनलों के लिए क्रमशः (ए) और (बी) में 1.1% और 2% थी। ध्यान दें कि (ए) में, आईएचसी के ऊपरी हिस्से में नीली धारियां दिखाई देती हैं, जो कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के करीब मोबाइल फोन के उपयोग के परिणामस्वरूप होती हैं। स्केल सलाखों = 10 μm (ए, बी), 1 μm (ए', बी')। संक्षिप्त नाम: पीएफए = पैराफॉर्मलडिहाइड; आईएचसी = आंतरिक बाल कोशिका; मायोविया = मायोसिन वीआईआईए; सीटीबीपी 2 = सी-टर्मिनल बाध्यकारी प्रोटीन 2; ग्लूए 2 = आयनोट्रोपिक ग्लूटामेट रिसेप्टर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: सिनैप्स वॉल्यूम के परिमाणीकरण के प्रतिनिधि परिणाम (ए) दस आईएचसी मायोविया इम्यूनोलेबल के आधार पर अलग-अलग रंगीन ग्रिड पुनर्निर्माण के रूप में दिखाए गए हैं। उनके संबंधित कार्यात्मक सिनैप्स, कोलोकलाइज्ड सीटीबीपी 2- (हरा) और ग्लूए 2-लेबल वाले तत्वों (लाल) द्वारा परिभाषित, आईएचसी के साथ एक साथ प्रदर्शित किए जाते हैं, और स्पष्टता के लिए नीचे भी अलग से प्रदर्शित होते हैं। ध्यान दें कि देखने के कोण को आईएचसी की लंबी धुरी के लंबवत होने के लिए चुना गया था और इस प्रकार मूल कॉन्फोकल छवि (चित्रा 1 ए) से अलग है। (बी) आईएचसी में से एक को एकल किया गया और 90 ° घुमाया गया दिखाया गया। ब्लैक प्लेन को उपयोगकर्ता द्वारा मैन्युअल रूप से परिभाषित किया गया था और आईएचसी को अपने स्तंभ-मोडियोलर अक्ष के साथ विभाजित करता है। (सी) बबल प्लॉट इस कॉन्फोकल स्टैक में सभी कार्यात्मक सिनैप्स के स्थान को दर्शाता है, उनके संबंधित आईएचसी के सामान्यीकृत तीन अक्षों के सापेक्ष। प्रतीकों का आकार प्रीसिनेप्टिक तत्व की मात्रा के आनुपातिक है। ध्यान दें कि देखने के कोण को पैनल (बी) के समान चुना गया था। (डी) सिनैप्टिक तत्वों के सामान्यीकृत संस्करणों का बॉक्सप्लॉट, कार्यात्मक सिनैप्स के प्रीसिनेप्टिक (बाएं 2 बक्से) और पोस्टसिनेप्टिक (दाएं 2 बक्से) भागीदारों के लिए अलग-अलग और आगे उनके संबंधित आईएचसी (विभिन्न रंगों) के मोडिओलर या स्तंभ आधे हिस्से में उनकी स्थिति के अनुसार अलग हो जाता है। बक्से इंटरक्वार्टाइल पर्वतमाला का प्रतिनिधित्व करते हैं, जिसमें माध्यिकाएं लाइनों द्वारा इंगित की जाती हैं। धराशायी मूंछें इंटरक्वार्टाइल रेंज का 1.5 गुना इंगित करती हैं, और क्रॉस उससे परे बाहरी मूल्यों को इंगित करते हैं। (ई) कार्यात्मक सिनैप्स के पूर्व-बनाम पोस्टसिनेप्टिक भागीदारों के सामान्यीकृत संस्करणों का स्कैटरप्लॉट। विभिन्न प्रतीक अपने संबंधित आईएचसी के मोडियोलर या स्तंभ आधे हिस्से में स्थिति को इंगित करते हैं। संक्षिप्त नाम: आईएचसी = आंतरिक बाल कोशिका; मायोविया = मायोसिन वीआईआईए; सीटीबीपी 2 = सी-टर्मिनल बाध्यकारी प्रोटीन 2; ग्लूए 2 = आयनोट्रोपिक ग्लूटामेट रिसेप्टर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 1: शीर्ष से दूरी जो विभिन्न लंबाई के कोक्ली में विशिष्ट लक्ष्य आवृत्तियों के बराबर हैं। मुलर25 द्वारा दिए गए समीकरण के आधार पर समतुल्य सर्वोत्तम आवृत्तियों की गणना की गई थी। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित विधि के साथ, युवा वयस्क और वृद्ध गेरबिल्स से कोक्ली में आईएचसी और सिनैप्टिक संरचनाओं को इम्युनोलेबल करना संभव है, पूर्व और पोस्टसिनेप्टिक तत्वों के सह-स्थानीयकरण द्वारा अनुमानित कार्यात्मक सिनैप्स की पहचान करना, उन्हें व्यक्तिगत आईएचसी को आवंटित करना, और उनकी संख्या, मात्रा और स्थान को निर्धारित करना। इस दृष्टिकोण में उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी ने बाहरी बाल कोशिकाओं (ओएचसी; मायोविया) और उनके प्रीसिनेप्टिक रिबन को भी लेबल किया। इसके अलावा, आईएचसी और ओएचसी दोनों के इम्यूनोलेबलिंग के लिए एक व्यवहार्य विकल्प ओटोफेर्लिन के खिलाफ एक एंटीबॉडी है, जिसमें ओएचसी आईएचसी की तुलना में बहुत बेहोश दिखाई देते हैं।

छिड़काव दो अलग-अलग सेटअपों का उपयोग करके किया जा सकता है। 1) एक गुरुत्वाकर्षण-खिलाया ड्रिप-लाइन प्रणाली जिसमें एक वाणिज्यिक ड्रिप लाइन को खिलाने वाली एक बोतल को जानवर से लगभग 1.5 मीटर ऊपर चरखी पहिया पर निलंबित कर दिया जाता है। बोतल को कम करने के बाद तरल पदार्थ क्रमिक रूप से पेश किए जाते हैं, जो शीर्ष पर खुला होता है। 2) एक डिजिटल चर-गति पेरिस्टाल्टिक पंप का उपयोग करने वाली एक प्रणाली, जिसमें तरल पदार्थ लेने के लिए एक छोर पर एक पतली, लंबी ट्यूब खुली होती है और एक सुई जिसे दूसरे छोर पर आसानी से संलग्न किया जा सकता है। दोनों समान रूप से अच्छी तरह से काम करते हैं, और सूक्ष्म मतभेदों को यहां विस्तृत नहीं किया जाएगा। लेखक विशेष रूप से अनुशंसा करते हैं, हालांकि, एक छिद्रित मंच पर जानवर के साथ एक डाउन ड्राफ्ट-स्टाइल वर्कबेंच और नीचे खींचे गए धुएं के साथ। यह निकास समारोह से समझौता किए बिना सर्जिकल क्षेत्र तक अच्छी पहुंच को सक्षम बनाता है (एक खुले धूआं कैबिनेट में काम करने के विपरीत)।

ऊतक का उचित निर्धारण महत्वपूर्ण महत्व का है, क्योंकि अन्यथा संवेदी उपकला विच्छेदन के दौरान अलग और विघटित हो जाएगी। गेरबिल में, आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले फिक्सेटिव के लिए अधिक लंबे समय तक संपर्क आवश्यक है (उदाहरण के लिए, चूहों के लिए 17,27,13 या गिनी सूअर28)। गेरबिल्स के लिए पसंदीदा तरीका कम से कम 1.5 दिनों के लिए जानवर की मृत्यु और विसर्जन-निर्धारण के बाद कोक्लीआ का तेजी से निष्कर्षण है। यदि कार्डियोवैस्कुलर छिड़काव पसंद किया जाता है, तो यह महत्वपूर्ण है कि निर्धारण कुछ मिनटों के भीतर सेट हो जाए और अच्छी तरह से आगे बढ़े। चूंकि छिड़काव के दौरान अंततः निर्धारण की गुणवत्ता को रेट करना मुश्किल हो सकता है, इसलिए वर्णित के रूप में कोक्ली को नियमित रूप से पोस्टफिक्स करने की सिफारिश की जाती है।

धोने के चरणों का पालन करना महत्वपूर्ण है, जिससे अंतिम धोने का चरण (चरण 2.7) सबसे महत्वपूर्ण है। यदि पर्याप्त रूप से धोया नहीं जाता है, तो ऊतक चिपचिपा होता है और विच्छेदन उपकरणों का पालन करता है, जिससे विच्छेदन मुश्किल हो जाता है। निरर्थक प्रतिदीप्ति को कम करने के लिए वृद्ध गेरबिल्स से काटे गए कोक्ली में एक ऑटोफ्लोरेसेंस क्वेंचर का उपयोग करने की भी सिफारिश की जाती है। ऑटोफ्लोरेसेंस लिपोफ्यूसिन से उत्पन्न हो सकता है, जोवृद्ध जानवरों 29,30,31 से ऊतक में आम है, और मोटे तौर पर उत्साहित होने के साथ-साथ मोटे तौर पर उत्सर्जित होता है। यूवी -स्पेक्ट्रम (λ = 364 एनएम) में तरंग दैर्ध्य के साथ उत्साहित होने पर, लिपोफुसिन की एक व्यापक उत्सर्जन सीमा होती है (λ = 400-700 एनएम, अधिकतम ~ ω = 568 एनएम)32। मानव मायोकार्डियल ऊतक में, लिपोफुसिन λ = 555 एनएम की उत्तेजना और α = 605 एनएम33 के उत्सर्जन के साथ दिखाई देता है। इसी तरह, गेरबिल्स के आईएचसी में, लेखकों ने एएफ 568 एंटीबॉडी के लिए उपयोग किए जाने वाले चैनल में निरर्थक प्रतिदीप्ति में वृद्धि देखी, जो लिपोफुसिन कणिकाओं से ऑटोफ्लोरेसेंस का सुझाव देता है। जानवरों से ऊतक के साथ काम करते समय एक सामान्य सिफारिश इस प्रकार कम से कम महत्वपूर्ण इम्यूनोलेबल के लिए 550-600 एनएम के आसपास उत्तेजना बैंडविड्थ का उपयोग करना है।

कुल कोक्लियर लंबाई का माप और विशिष्ट कोक्लियर पदों की सही पहचान केवल तभी संभव है जब इसकी पूरी लंबाई संरक्षित हो। यदि संवेदी उपकला के कुछ हिस्सों को विच्छेदन में खो दिया जाता है, तो अभी भी शेष भाग या यहां तक कि केवल सर्पिल नाड़ीग्रन्थि टुकड़े को माउंट करने और विस्तृत नोट्स रखने की सिफारिश की जाती है। फिर आमतौर पर उचित सटीकता के साथ लापता अनुभाग का अनुमान लगाना संभव है। यदि कोक्लीआ के एपिकल भाग पूरी तरह से संरक्षित हैं, लेकिन बेसल अंत गायब है, तो एपिकल भाग पर विशिष्ट कोक्लियर स्थानों को उपयोग की गई गेरबिल आबादी के भीतर औसत कोक्लियर लंबाई के आधार पर पदों की गणना करके परिभाषित किया जा सकता है क्योंकि वास्तविक मूल्य से विचलन छोटा है।

सिनैप्स वॉल्यूम परिमाणीकरण की एक महत्वपूर्ण सीमा यह है कि परिणामस्वरूप पूर्ण वॉल्यूम विभिन्न कॉन्फोकल स्टैक में तुलनीय नहीं हैं। महत्वपूर्ण कदम जो अन्तर्ग्रथनी तत्वों के परिणामस्वरूप मात्रा निर्धारित करता है, प्रारंभिक पहचान के लिए तीव्रता सीमा का विकल्प है। हालांकि, इस तीव्रता सीमा का विकल्प वर्तमान प्रोटोकॉल और कई अन्य 3,27,34 में उपयोगकर्ता द्वारा व्यक्तिपरक रूप से किया जाता है। इसके अलावा, कॉन्फोकल छवि में इम्यूनोफ्लोरेसेंस की चमक कई कारकों पर निर्भर करती है, जो नमूनों में मानकीकृत करना बहुत मुश्किल है, जैसे कि ऊतक की मोटाई, ऑप्टिकल पथ के सापेक्ष ऊतक का अभिविन्यास, लेजर एक्सपोजर की अवधि, और सटीक कॉन्फोकल और डिकोन्वोल्यूशन सेटिंग्स। इन सभी चेतावनियों को बढ़ाया जाता है यदि दुर्लभ सामग्री को काफी समय तक अधिग्रहित किया जाता है, जैसा कि उम्र बढ़ने वाले गेरबिल के लिए विशिष्ट है। साथ में, इसका मतलब है कि पूल किए गए डेटा में पूर्वाग्रहों को बाहर करना बहुत मुश्किल है, और सबसे अच्छा मामला परिदृश्य उच्च विचरण वाला डेटासेट है। इस प्रकार व्यक्तिगत कॉन्फोकल स्टैक की संबंधित औसत मात्रा के लिए नियमित रूप से सिनैप्टिक वॉल्यूम को सामान्य करने की सिफारिश की जाती है, जैसा कि लिबरमैन एट अल द्वारा पेश किया गया है। स्पष्ट नकारात्मक पक्ष यह है कि सिनैप्टिक वॉल्यूम तब केवल किसी दिए गए छवि स्टैक के भीतर तुलनीय होते हैं, उदाहरण के लिए, आईएचसी पर विभिन्न स्थानों के बीच लेकिन विभिन्न कोक्लियर स्थानों या नमूना उम्र के बीच नहीं।

प्री- और पोस्टसिनेप्टिक संरचनाओं की दोहरी लेबलिंग और सह-स्थानीयकरण की आवश्यकता अकेले लेबल का उपयोग करने की तुलना में कार्यात्मक सिनैप्स की संख्या का अधिक विश्वसनीय अनुमान लगाने की अनुमति देती है। यदि केवल एक लेबल संभव है, तो दो कारणों से समान तरंग दैर्ध्य बारीकियों के साथ एएफ 488 या फ्लोरोसेंट टैग के साथ युग्मित प्रीसिनेप्टिक एंटी-सीटीबीपी 2 का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। सबसे पहले, अनाथ रिबन, अर्थात, सह-स्थानीयकृत पोस्टसिनेप्टिक लेबल के बिना सीटीबीपी 2-लेबल वाले तत्व, दुर्लभ17 प्रतीत होते हैं, और लेखकों ने वृद्ध गेरबिल्स के लिए इसकी पुष्टि की। इस प्रकार, पोस्टसिनेप्टिक पार्टनर के साथ सह-स्थानीयकरण को सत्यापित करने में सक्षम नहीं होने से शुरू की गई त्रुटि छोटी है। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि शोर-उजागर कानों की जांच करते समय यह एक अधिक महत्वपूर्ण मुद्दा बन जाता है (उदाहरण के लिए, 28)। दूसरा, अस्पष्ट उत्पत्ति के उच्च प्रतिदीप्ति संकेत वाले मामलों में, शोर आमतौर पर 568 एनएम के आसपास उत्तेजना तरंग दैर्ध्य का उपयोग करके चैनल को सबसे बड़ी हद तक प्रभावित करता है ( उदाहरण चित्रा 2 बी में, ग्लूए 2 लेबल का प्रतिनिधित्व करता है)। इस शोर का कम से कम हिस्सा, वृद्ध जानवरों के ऊतकों में, लिपोफुसिन ऑटोफ्लोरेसेंस हो सकता है। इस प्रकार, एक साफ, एकल एंटी-सीटीबीपी 2 लेबल के लिए मौका अधिकतम करने के लिए, इस तरंग दैर्ध्य चैनल से बचने की सलाह दी जाती है। अंत में, यह दिखाया गया था कि, उचित शांत और अंधेरे भंडारण की स्थिति के साथ, यहां उपयोग की जाने वाली इम्यूनोलेबलिंग लंबे समय तक स्थिर है, कम से कम 2.5 साल (चित्रा 3 बी) तक, जो मूल्यवान ऊतक के पुनर्मूल्यांकन को संभव बनाता है, जैसे कि वृद्ध गेरबिल से, संभव है।

आईएचसी अभिवाही सिनैप्स संख्या का परिमाणीकरण कई संदर्भों में परिधीय श्रवण प्रणाली की स्थिति का मूल्यांकन करने के लिए एक महत्वपूर्ण मीट्रिक बन गया है, उनमें से आयु से संबंधित सुनवाई हानि। अब प्रकाशित विभिन्न प्रोटोकॉल हैं (उदाहरण के लिए,गेरबिल्स 21, चूहों17,13, गिनीसूअरों 10,28, और मनुष्य35)। यहां उल्लिखित विधि, इसके विवरण में, युवा वयस्क और वृद्ध गेरबिल के लिए विशिष्ट है, लेकिन कुछ सामान्य सिफारिशें प्राप्त की गई हैं जो अन्य प्रजातियों में भी उपयोगी हो सकती हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

लेखक इमेजिंग सुविधाओं के उपयोग के लिए विधि और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी सर्विस यूनिट, कार्ल वॉन ओसिएट्ज़की यूनिवर्सिटी ऑफ ओल्डेनबर्ग स्थापित करने में मदद करने के लिए लिचुन झांग को स्वीकार करते हैं। इस शोध को जर्मनी की उत्कृष्टता रणनीति -ईएक्ससी 2177/1 के तहत डॉयचे फोर्शुंग्सगेमिनशाफ्ट (डीएफजी, जर्मन रिसर्च फाउंडेशन) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Albumin Fraction V biotin-free Carl Roth 0163.2
anti-CtBP2 (IgG1 monoclonal mouse) BD Biosciences, Eysins 612044
anti-GluA2 (IgG2a monoclonal mouse) Millipore MAB39
anti-mouse (IgG1)-AF 488 Molecular Probes Inc. A21121
anti-MyosinVIIa (IgG polyclonal rabbit) Proteus Biosciences 25e6790
Blade Holder & Breaker - Flat Jaws Fine Science Tools 10052-11
Bonn Artery Scissors - Ball Tip Fine Science Tools 14086-09
Coverslip thickness 1.5H, 24 x 60 mm Carl Roth LH26.1
Disposable Surgical Blade Henry Schein 0473
donkey anti-rabbit (IgG)-AF647 Life Technologies-Molecular Probes A-31573
Dumont #5 - Fine Forceps Fine Science Tools 11254-20
Dumont #5SF Forceps Fine Science Tools 11252-00
Ethanol, absolute 99.8% Fisher Scientific 12468750
Ethylenediaminetetraacetic acid Carl Roth 8040.2
Excel Microsoft Corporation
Feather Double Edge Blade PLANO 112-9
G19 Cannula Henry Schein 9003633
goat anti-mouse (IgG2a)-AF568 Invitrogen A-21134
Heparin Ratiopharm N68542.04
Huygens Essentials Scientific Volume Imaging
ImageJ Fiji
Immersol, Immersion oil 518F Carl Zeiss 10539438
Intrafix Primeline Classic, 150 cm (mit Datamatrix Code auf der Sterilverpackung) Braun 4062957E
ISM596D Ismatec peristaltic pump
KL 1600 LED Schott 150.600 light source for stereomicroscope
Leica Application suite X Leica Microsystem CMS GmbH
Leica TCS SP8 system Leica Microsystem CMS GmbH
Matlab The Mathworks Inc.
Mayo Scissors Tungston Carbide ToghCut Fine Science Tools 14512-17
Mini-100 Orbital-Genie Scientific Industries SI-M100 for use in cold environment
Narcoren (pentobarbital) Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH
Nikon Eclipse Ni-Ei Nikon
NIS Elements Nikon Europe B.V.
Paraformaldehyde Carl Roth 0335.3
Petri dish without vents Avantor VWR 390-1375
Phosphate-buffered saline:
Disodium phosphate AppliChem A1046
Monopotassium phosphate Carl Roth 3904.1
Potassium chloride Carl Roth 6781.1
Sodium chloride Sigma Aldrich 31434-M
Screw Cap Containers Sarstedt 75.562.300
Sodium azide Carl Roth K305.1
Student Adson Forceps Fine Science Tools 91106-12
Student Halsted-Mosquito Hemostat Fine Science Tools 91308-12
Superfrost Adhesion Microscope Slides Epredia J1800AMNZ
Triton  X Carl Roth 3051.2
TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher Biotium 23007
Vannas Spring Scissors, 3mm Fine Science Tools 15000-00
Vectashield Antifade Mounting Medium Vector Laboratories H-1000
Vibrax VXR basic IKA 0002819000
VX 7 Dish attachment for Vibrax VXR basic IKA 953300
Wild TYP 355110 (Stereomicroscope) Wild Heerbrugg not available anymore

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तंत्रिका विज्ञान अंक 182 मंगोलियाई गेरबिल रिबन सिनैप्स पोस्टसिनेप्टिक ग्लूटामेट पैच आंतरिक बाल सेल ऑटोफ्लोरेसेंस क्वेंचर सिनैप्स मात्रा का ठहराव
युवा वयस्क और वृद्ध गेरबिल कोक्ली में इम्यूनोलेबलिंग और गिनती रिबन सिनैप्स
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Steenken, F., Bovee, S., Köppl, … More

Steenken, F., Bovee, S., Köppl, C. Immunolabeling and Counting Ribbon Synapses in Young Adult and Aged Gerbil Cochleae. J. Vis. Exp. (182), e63874, doi:10.3791/63874 (2022).

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