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Bioengineering

ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स का रासायनिक ट्राइफॉस्फोराइलेशन

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63877
Automatic Translation
1, 1
1The Salk Institute

Summary

ओलिगोन्यूक्लियोटाइड 5'-ट्राइफॉस्फेट आवश्यक जैविक मार्गों में सर्वव्यापी घटक हैं और जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों में बढ़ते उपयोग को देखा है। यहां, हम मानक स्वचालित संश्लेषण तकनीकों द्वारा तैयार ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड 5'-ट्राइफॉस्फेट के नियमित संश्लेषण और शुद्धिकरण के लिए तकनीकों का वर्णन करते हैं।

Abstract

5'-ट्राइफॉस्फेट एक आवश्यक न्यूक्लिक एसिड संशोधन है जो पूरे जीवन में पाया जाता है और जैव प्रौद्योगिकी और सिंथेटिक जीव विज्ञान में ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के कार्यात्मक संशोधन के रूप में तेजी से उपयोग किया जाता है। ओलिगोन्यूक्लियोटाइड 5'-ट्राइफॉस्फेट ऐतिहासिक रूप से एंजाइमी तरीकों से इन विट्रो में तैयार किए गए हैं। हालांकि, ये विधियां प्राकृतिक आरएनए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स तक सीमित हैं, मजबूत अनुक्रम प्राथमिकताएं हैं, और विषम उत्पादों का उत्पादन करती हैं। रासायनिक ट्राइफॉस्फोराइलेशन के नए तरीके फॉस्फोरामाइड रसायन विज्ञान द्वारा स्वचालित ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड संश्लेषण की कम लागत और अब उपलब्ध न्यूक्लियोटाइड संशोधनों की विविध श्रृंखला दोनों के पूरक हैं। इस प्रकार, मनमाने ढंग से अनुक्रम और लंबाई के ओलिगोन्यूक्लियोटाइड ट्राइफॉस्फेट का संश्लेषण, और वैकल्पिक रूप से विभिन्न गैर-प्राकृतिक संशोधनों से युक्त, अब सुलभ है।

यह पेपर सैलिसिल फॉस्फोरोक्लोरिडाइट और पाइरोफॉस्फेट का उपयोग करके ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के रासायनिक ट्राइफॉस्फोराइलेशन के लिए उपयुक्त तरीकों और तकनीकों को प्रस्तुत करता है। यह विधि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मकों का उपयोग करती है, मानक ठोस-चरण संश्लेषण विधियों द्वारा तैयार किए गए अधिकांश ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के साथ संगत है, और डिप्रोटेक्शन और शुद्धिकरण से पहले ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड संश्लेषण के बाद 2 घंटे में पूरा किया जा सकता है। उत्प्रेरक आरएनए एंजाइमों के लिए सब्सट्रेट के रूप में रासायनिक रूप से ट्राइफॉस्फोराइलेटेड ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के दो उपयोगों का प्रदर्शन किया जाता है, जिसमें गैर-जैविक एल-आरएनए ट्राइफॉस्फेट से हैमरहेड राइबोजाइम के दर्पण-छवि संस्करण का संश्लेषण शामिल है।

Introduction

आरएनए का 5'-ट्राइफॉस्फोराइलेटेड रूप जीव विज्ञान में सर्वव्यापी है क्योंकि यह जीवन के सभी डोमेन में आरएनए प्रतिलेखन और कई आरएनए वायरस के जीवन चक्र के दौरान आरएनए प्रतिकृति द्वारा उत्पन्न होता है। ये ट्राइफॉस्फेट यूकेरियोट्स में 7-मिथाइलगुआनिलेट-कैप्ड एमआरएनए के गठन के लिए सब्सट्रेट के रूप में काम करते हैं और इसलिए, प्रोटीन अभिव्यक्ति1 में एक आवश्यक भूमिका निभाते हैं। इसके विपरीत, ट्राइफॉस्फेट को बैक्टीरिया और वायरस में बनाए रखा जाता है; इस प्रकार, आरएनए 5'-ट्राइफॉस्फेट को यूकेरियोट्स 2,3,4,5,6,7 में जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया नियामकों द्वारा मान्यता प्राप्त है। जीव विज्ञान के बाहर, आरएनए लिगेज राइबोजाइम का एक मेजबान इन विट्रो8 में 5'-ट्राइफॉस्फेट का उपयोग करने के लिए विकसित किया गया है और नैदानिक परख 9,10,11,12,13,14,15 में उपयोग के लिए संशोधित किया गया है। इस तरह के एक राइबोजाइम का उपयोग एल-आरएनए के टेम्पलेट-निर्भर संश्लेषण के लिए किया जा सकता है, प्राकृतिक डी-आरएनए के गैर-जैविक "दर्पण-छवि" एनेंटिओमर, छोटे एल-आरएनए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड 5'-ट्राइफॉस्फेट 16,17,18 से। इन प्रणालियों की जांच के लिए अलग-अलग अनुक्रम और रीढ़ की हड्डी की संरचना के ट्राइफॉस्फोराइलेटेड ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स की नियमित तैयारी आवश्यक है।

प्रयोगशाला में आरएनए 5'-ट्राइफॉस्फेट तैयार करने के लिए सबसे आम और सुलभ विधि इन विट्रो प्रतिलेखन द्वारा है। हालांकि, इस विधि द्वारा उत्पादित आरएनए आरएनए पोलीमरेज़ एंजाइम के प्रमोटर और सब्सट्रेट आवश्यकताओं द्वारा अनुक्रम और आकार में प्रतिबंधित है। टी 7 आरएनए पोलीमरेज़ और विशेष डेरिवेटिव इस उद्देश्य के लिए उपयोग किए जाने वाले सबसे आम पोलीमरेज़ हैं 19,20,21,22। इन एंजाइमों के साथ तैयार इन विट्रो ट्रांसक्रिप्टेड आरएनए को 5'-टर्मिनल प्यूरीन के साथ शुरू किया जाना चाहिए और पहले 10 न्यूक्लियोटाइड23,24 में प्यूरीन के प्रति दृढ़ता से पक्षपाती है। इसके अलावा, आधार- या रीढ़ की हड्डी-संशोधित न्यूक्लियोटाइड्स का एंजाइमेटिक समावेश प्राकृतिक पोलीमरेज़ के साथ सबसे अच्छा अक्षम और अधिक बार असंभव है, जो प्राकृतिक डी-आरएनए के अलावा किसी भी चीज़ से बना ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड 5'-ट्राइफॉस्फेट का उत्पादन करने के अवसर को सीमित करता है। एक अन्य सीमित कारक यह है कि इन विट्रो प्रतिलेखन द्वारा उत्पन्न आरएनए में पर्याप्त 5 '- और 3' - विषमता हो सकती है और 20 एनटी 23,24,25,26,27 से कम होने पर बेहद विषम उत्पादों के रूप में उत्पादित किया जाता है।

इसके विपरीत, ठोस चरण फॉस्फोरामिडाइट संश्लेषण 28,29,30,31,32,33,34,35 द्वारा तैयार ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के रासायनिक ट्राइफॉस्फोराइलेशन का उपयोग किसी भी अनुक्रम के ओलिगोन्यूक्लियोटाइड 5'-ट्राइफॉस्फेट्स 3-50 एनटी लंबे, तैयार करने के लिए किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, फॉस्फोरामिडाइट संश्लेषण के लिए सुलभ न्यूक्लिक एसिड संशोधनों की एक विशाल सरणी को 5'-ट्राइफॉस्फोराइलेशन 14,15,16,17,18,29,36 से पहले ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स में जोड़ा जा सकता है। इनमें से कई विधियां फॉस्फिटाइलेशन अभिकर्मक सैलिसिल फॉस्फोरोक्लोरिडाइट का उपयोग करती हैं, जिसे लुडविग और एकस्टीन द्वारा मोनोन्यूक्लियोसाइड्स37 के समाधान-चरण ट्राइफॉस्फोराइलेशन के लिए विकसित किया गया था। इस अभिकर्मक के साथ ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स का ट्राइफॉस्फोराइलेशन ठोस चरण पर ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड 5'-हाइड्रॉक्सिल के फॉस्फिटाइलेशन द्वारा प्राप्त किया जाता है, पाइरोफॉस्फेट और ऑक्सीकरण के साथ प्रतिक्रिया द्वारा ट्राइफॉस्फेट में रूपांतरण, ठोस समर्थन, असुरक्षा और शुद्धिकरण (चित्रा 1) 28 से ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड की दरार के लिए मानक प्रक्रियाओं के बाद।

Figure 1
चित्रा 1: सिंथेटिक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के ट्राइफॉस्फोराइलेशन के लिए योजना। पहले चरण में, ओलिगोन्यूक्लियोटाइड 5-हाइड्रॉक्सिल को साल्पसीएल के साथ फॉस्फिटाइलेट किया जाता है। अगले चरण में, चक्रीय मेटाफॉस्फाइट बनाने के लिए 5-सैलिसिल फॉस्फाइट को टीबीएपी के साथ प्रतिक्रिया दी जाती है, फिर तीसरे चरण में डीएनए / आरएनए सिंथेसाइज़र ऑक्सीकरण समाधान (0.1 एम आयोडीन / पाइरिडीन / एच2ओ / टीएचएफ) में चक्रीय 5-ट्राइमेटाफॉस्फेट उत्पन्न करने के लिए ऑक्सीकरण किया जाता है, जो एक ही समाधान28 में रैखिक 5-ट्राइफॉस्फेट उत्पन्न करने के लिए तेजी से हाइड्रोलाइज्ड होता है। 37. अमोनिया में ठोस सीपीजी समर्थन और ओलिगोन्यूक्लियोटाइड के असुरक्षा से बाद में क्षारीय दराररैखिक रूप में किसी भी अवशिष्ट चक्रीय ट्राइमेटाफॉस्फेट को हाइड्रोलाइज करेगी। संक्षिप्त नाम: साल्पक्ल = सैलिसिल फॉस्फोरोक्लोरिडाइट; टीबीएपी = ट्रिब्यूटिलामोनियम पाइरोफॉस्फेट; टीएचएफ = टेट्राहाइड्रोफ्यूरन; सीपीजी = नियंत्रित ताकना ग्लास; एमईएनएच2 = मिथाइलमाइन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

यद्यपि इस पद्धति का उपयोग करके प्रारंभिक प्रकाशित रिपोर्ट अक्सर खराब पैदावार और अवांछित साइड उत्पादों 28,37,38 से पीड़ित होती हैं, निर्जल स्थितियों का सावधानीपूर्वक रखरखाव नियमित रूप से उच्च पैदावार प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। यह अभिकर्मकों की सावधानीपूर्वक तैयारी और मानक प्लास्टिक घटकों से इकट्ठे एक साधारण प्रतिक्रिया उपकरण के उपयोग से प्राप्त किया जा सकता है। यहां, हम ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के रासायनिक ट्राइफॉस्फोराइलेशन के लिए उपयुक्त चरणों का प्रदर्शन करते हैं, जिसमें अभिकर्मकों की तैयारी, प्रतिक्रिया कक्ष की असेंबली, ट्राइफॉस्फोराइलेशन प्रतिक्रिया और ट्राइफॉस्फोराइलेटेड ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के बाद के डिप्रोटेक्शन और शुद्धिकरण शामिल हैं। प्राकृतिक डी-आरएनए और अजैविक एल-आरएनए रीढ़ की हड्डियों के साथ बड़े न्यूक्लिक एसिड उत्पादों के संश्लेषण के लिए लिगेज राइबोजाइम के लिए सब्सट्रेट के रूप में 5'-ट्राइफॉस्फोराइलेटेड ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स का प्रतिनिधि उपयोग भी शामिल है।

Protocol

1. एक ठोस समर्थन पर 5'-हाइड्रॉक्सिल ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स का स्वचालित ठोस-चरण संश्लेषण

  1. लक्ष्य ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड संरचना और उपकरण निर्देशों के अनुसार अभिकर्मकों और फॉस्फोरामिडाइट्स के साथ स्वचालित डीएनए / आरएनए सिंथेसाइज़र तैयार करें।
  2. सिंथेसाइज़र पर ठोस समर्थन युक्त एक संश्लेषण स्तंभ लोड करें और सिंथेसाइज़र इंस्ट्रूमेंट प्रोटोकॉल के अनुसार ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स को संश्लेषित करें।
    नोट: ट्राइफॉस्फोराइलेशन प्रक्रिया को 1 μmol पैमाने पर तैयार ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के लिए अनुकूलित किया गया है।
  3. पिछले चरण में ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड संश्लेषण के हिस्से के रूप में ठोस समर्थित ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड 5'-हाइड्रॉक्सिल का उत्पादन करने के लिए 5'-डाइमेथोक्सिट्रिटाइल सुरक्षा समूह को हटा दें, या सिंथेसाइज़र इंस्ट्रूमेंट प्रोटोकॉल के अनुसार टर्मिनल डिट्रिटिलेशन चरण करके।
  4. सिंथेसाइज़र से ठोस समर्थन पर 5'-हाइड्रॉक्सिल ओलिगोन्यूक्लियोटाइड युक्त कॉलम को हटा दें, अवशिष्ट विलायक को हटाने के लिए 10 मिनट के लिए एक घर वैक्यूम के नीचे सूखा, और ट्राइफॉस्फोराइलेशन (धारा 3 और 4) के लिए आगे बढ़ें एक बार ट्राइफॉस्फोराइलेशन के लिए सामग्री तैयार हो जाती है (धारा 2)।
    नोट: यदि तुरंत उपयोग नहीं किया जाता है, तो सूखे स्तंभ को -20 डिग्री सेल्सियस पर डेसिकेंट के साथ एक सीलबंद प्लास्टिक कंटेनर में एक सामान्य वातावरण के तहत संग्रहीत किया जा सकता है। इस स्तर पर आगे सुखाने की आवश्यकता नहीं है क्योंकि खंड 3 में ट्राइफॉस्फोराइलेशन से पहले स्तंभ को अच्छी तरह से सुखाया जाता है।

2. ट्राइफॉस्फोराइलेशन के लिए सामग्री तैयार करना

  1. कम से कम दो लाइनों के साथ एक गैस मैनिफोल्ड के लिए समायोज्य दबाव के साथ एक शुष्क आर्गन स्रोत संलग्न करें और एक बबलर से कनेक्ट करें। सुनिश्चित करें कि प्रतिक्रिया तंत्र से कनेक्शन की सुविधा के लिए लाइनें 1 एमएल प्लास्टिक सिरिंज में समाप्त होती हैं।
  2. ट्राइफॉस्फोराइलेशन के दौरान उपयोग किए जाने वाले उपकरणों को इकट्ठा करें, जिसमें 1 एमएल प्लास्टिक सिरिंज, तीन-तरफ़ा पॉलीप्रोपाइलीन स्टॉपकॉक, नॉनकोरिंग सुई, 1.5 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब और एक छोटा धातु स्पैटुला शामिल है। उपयोग करने से कम से कम 1 दिन पहले कमरे के तापमान पर डेसिकेंट के साथ उन्हें एक सीलबंद कंटेनर या डिसिकेटर में स्टोर करें।
  3. निर्जल 1,4-डाइऑक्सेन, 3: 1 डाइऑक्सेन: मात्रा से पाइरिडीन, एन, एन-डाइमिथाइलफॉर्मामाइड (डीएमएफ), और एसिटोनिट्राइल (एसीएन) सूखे 30 एमएल कांच की बोतलों में सुखाने वाले जाल (सील झिल्ली पैकेट में 4 ए आणविक छलनी) में से प्रत्येक को 30 मिलीलीटर तैयार करें। रबर सेप्टा के साथ सील करें, और डेसिकेंट के साथ एक डेसिकेटर में स्टोर करें।
  4. ठोस 2-क्लोरो-4 एच -1,3,2-बेंज़ोडिओक्साफॉस्फोरिन -4-वन (सैलिसिल फॉस्फोरोक्लोरिडाइट, एसएएलपीसीएल) को 4 डिग्री सेल्सियस पर डेसिकेंट के साथ एक सील बंद जार के अंदर अपने मूल कंटेनर में स्टोर करें। हमेशा उपयोग के बीच आर्गन के साथ कंटेनर फ्लश करें।
  5. ट्राइफॉस्फोराइलेशन प्रतिक्रिया से कम से कम 5 दिन पहले एक ट्रिब्यूटिलामोनियम पाइरोफॉस्फेट (टीबीएपी) समाधान तैयार करें:
    1. सूखे 30-एमएल कांच की बोतल में 1-5 ग्राम ठोस टीबीएपी का वजन करें और डीएमएफ के 1 एमएल और टीबीएपी के प्रति ग्राम 0.5 एमएल ट्रिब्यूटिलामाइन में घुल जाएं।
    2. तीन सुखाने जाल जोड़ें, आर्गन के नीचे एक रबर सेप्टम के साथ बोतल सील करें, और 30 मिनट के लिए आर्गन के साथ बुलबुला डेगास करें।
    3. आणविक छलनी सभी ट्रेस पानी को अवशोषित करने की अनुमति देने के लिए 5 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर डेसिकेंट के साथ एक सील बंद जार के अंदर स्टोर करें। जार को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और 6 महीने के बाद ताजा तैयार करें।

3. ट्राइफॉस्फोराइलेशन तंत्र को इकट्ठा करना और उपयोग करना

  1. -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण से पुनर्प्राप्त करने पर संश्लेषण स्तंभ को कमरे के तापमान पर गर्म करने की अनुमति दें।
  2. चित्रा 2 में दिखाए गए प्रतिक्रिया कक्ष को इकट्ठा करें:
    1. एंटीचैम्बर तैयार करें: एक सूखी 1 एमएल सिरिंज से सवार को हटा दें, कैंची या रेजर ब्लेड का उपयोग करके सिरिंज के शीर्ष को काट लें, और सिरिंज को संश्लेषण कॉलम में संलग्न करें। सिरिंज के शीर्ष पर तीन-तरफा स्टॉपकॉक संलग्न करें और स्टॉपकॉक के साइड इनलेट को बबलर के साथ सूखे आर्गन स्रोत में संलग्न करें, ताकि स्टॉपकॉक का शीर्ष इनलेट अभिकर्मक इंजेक्शन पोर्ट हो।
    2. क्लैंप के साथ एक स्टैंड के लिए इस उपकरण को सुरक्षित करें और मोम सीलिंग फिल्म के साथ सभी अपस्ट्रीम जोड़ों को सील करें। स्टॉपकॉक को समायोजित करें ताकि इंजेक्शन पोर्ट बंद हो जाए, और उपकरण आर्गन स्रोत के लिए खुला हो। बबलर बंद करें, और कम दबाव (<10 साई) पर आर्गन को 5 मिनट के लिए प्रतिक्रिया कक्ष के माध्यम से स्ट्रीम करने की अनुमति दें।
      नोट: एकाधिक प्रतिक्रिया कक्षों को ट्राइफॉस्फोराइलेट 2-4 ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के समानांतर सेट किया जा सकता है। हालांकि, कई गुना से एक पंक्ति अभिकर्मक बोतलों को आर्गन की आपूर्ति के लिए आरक्षित किया जाना चाहिए।
    3. बबलर को फिर से खोलें और संश्लेषण स्तंभ के नीचे एक सिरिंज संलग्न करें, जो अपशिष्ट सिरिंज होगा। अपशिष्ट सिरिंज का उपयोग करके बार-बार कॉलम के माध्यम से आर्गन खींचें; फिर, सवार के साथ सिरिंज को पूरी तरह से धक्का दिया।
      नोट: अभिकर्मकों लोड होने तक, स्टॉपकॉक को सेट किया जाना चाहिए ताकि इंजेक्शन पोर्ट बंद हो जाए और तंत्र आर्गन स्रोत के लिए खुला हो, जैसा कि चित्रा 2 ए में दिखाया गया है। इसी तरह, अपशिष्ट सिरिंज संलग्न किया जाना चाहिए और संश्लेषण स्तंभ के संयुक्त को मोम सीलिंग फिल्म के साथ सील कर दिया जाना चाहिए जब तक कि अभिकर्मकों को सक्रिय रूप से हटा न दिया जाए।
  3. अभिकर्मक या विलायक जोड़ने के लिए:
    1. सूखे आर्गन स्रोत के लिए एक सुई संलग्न करें और इसे अभिकर्मक या विलायक बोतल सेप्टम में डालें, ध्यान रखें कि बोतल सामग्री में सुई विसर्जित न हो।
    2. एक सुई के साथ एक सूखी सिरिंज इकट्ठा करें और इसे बोतल सामग्री में विसर्जित किए बिना अभिकर्मक या विलायक बोतल सेप्टम में डालें। आर्गन के साथ सिरिंज भरें, सेप्टम से सुई वापस लें, और आर्गन को निष्कासित करें। आर्गन के साथ सिरिंज भरें और फिर से निष्कासित करें; फिर, आर्गन दबाव के तहत विलायक या अभिकर्मक की आवश्यक मात्रा के साथ सिरिंज भरें।
    3. उपकरण पर स्टॉपकॉक समायोजित करें ताकि आर्गन स्रोत बंद हो जाए, और इंजेक्शन पोर्ट खुला हो (चित्रा 2 बी)। स्रोत की बोतल से भरी हुई सिरिंज और सुई को जल्दी से हटा दें, सुई के किनारे या टिप पर फंसे किसी भी विलायक को मिटा दें, और सुई को इंजेक्शन पोर्ट में डालें। अभिकर्मक को तंत्र के एंटीचैम्बर में निष्कासित करें, सुई को हटा दें, और इंजेक्शन पोर्ट को बंद करें, तंत्र को आर्गन स्रोत में फिर से खोलें।
    4. अपशिष्ट सिरिंज का उपयोग करके संश्लेषण स्तंभ के माध्यम से धीरे-धीरे एंटीचेम्बर से तरल खींचें ताकि सभी तरल अब अपशिष्ट सिरिंज में आयोजित किए जाएं। अब, धीरे-धीरे समाधान को संश्लेषण कॉलम में वापस धक्का दें, यह सुनिश्चित करते हुए कि कॉलम में कोई गैस बुलबुले नहीं हैं। मिश्रण या आंदोलन करने के लिए, धीरे-धीरे अपशिष्ट सिरिंज के साथ स्तंभ पर समाधान को ऊपर और नीचे खींचें।
      नोट: हमेशा प्रतिक्रिया कक्ष के माध्यम से धीरे-धीरे और धीरे-धीरे तरल ले जाएं ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि कोई सील टूट नहीं गई है, जो हवा को उपकरण में प्रवेश करने की अनुमति देती है।
  4. स्तंभ से अभिकर्मक या विलायक को हटाने के लिए:
    1. धीरे-धीरे समाधान को अपशिष्ट सिरिंज में खींचें। समाधान का बड़ा हिस्सा अपशिष्ट सिरिंज में पारित होने के बाद, कॉलम से शेष विलायक को फ्लश करने के लिए आर्गन खींचें।
    2. अपशिष्ट सिरिंज संयुक्त के चारों ओर मोम सीलिंग फिल्म निकालें, फिर सिरिंज को हटा दें और अपशिष्ट समाधान को त्याग दें। अपशिष्ट सिरिंज को एक नए, सूखे सिरिंज के साथ बदलें, और मोम सीलिंग फिल्म के साथ संयुक्त को रीसील करें।

Figure 2
चित्रा 2: ट्राइफॉस्फोराइलेशन उपकरण। मिश्रण या प्रतिक्रियाओं के दौरान, डिवाइस (ए) आर्गन स्रोत (i) के लिए खुला होता है और तीन-तरफ़ा स्टॉपकॉक (ii) को समायोजित करके हवा के लिए बंद हो जाता है। अभिकर्मकों को अपशिष्ट सिरिंज (वी) के माध्यम से एंटीचेम्बर (iii) से संश्लेषण स्तंभ (iv) में खींचा जाता है। अभिकर्मकों को अपशिष्ट सिरिंज (वी) में सभी तरल खींचकर और इसे त्यागकर हटा दिया जाता है। अभिकर्मकों (बी) को लोड करते समय, तीन-तरफ़ा स्टॉपकॉक (ii) वायुमंडल के लिए खुला होता है, और अभिकर्मक को सिरिंज और सुई (vi) के माध्यम से एंटीचेम्बर (iii) में लोड किया जाता है। (सी) अभिकर्मक मिश्रण और प्रतिक्रिया के लिए (ए) के रूप में सेट इकट्ठे उपकरण की एक तस्वीर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

4. सिंथेटिक 5'-हाइड्रॉक्सिल ओलिगोन्यूक्लियोटाइड के ऑन-कॉलम ट्राइफॉस्फोराइलेशन

  1. -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण से एसएएलपीसीएल और टीबीएपी समाधान निकालें और उपयोग करने से पहले उन्हें कमरे के तापमान पर गर्म करने की अनुमति दें।
  2. 3.3.1-3.3.3 चरणों के अनुसार, एंटीचेम्बर में पाइरिडीन / डाइऑक्सेन के 200 μL जोड़ें। हालांकि, चरण 4.4 तक संश्लेषण स्तंभ पर विलायक लोड न करें।
  3. एक सूखी 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में 6-12 मिलीग्राम एसएएलपीसीएल वजन करने के लिए एक सूखी धातु स्पैटुला का उपयोग करें, और माइक्रोसेंट्रिफेज ट्यूब के भीतर विलायक को धीरे-धीरे ऊपर और नीचे सिरिंज करके डाइऑक्सेन के 100 μL में भंग करें।
  4. भंग एसएएलपीसीएल को एंटीचैम्बर में जोड़ें और चरण 3.3 के बाद इसे संश्लेषण कॉलम पर लोड करें। इसे 15 मिनट के लिए प्रतिक्रिया दें, हर 5 मिनट में समाधान को उत्तेजित करें। चरण 3.4 के अनुसार सालपीसीएल समाधान निकालें और त्यागें।
    नोट: एसएएलपीसीएल को बड़ी अधिकता में जोड़ा जाता है और प्रतिक्रिया कक्ष में तैयारी और लोडिंग के दौरान अवशोषित किसी भी पानी को साफ कर देगा। हालांकि, चरण 4.5 और 4.6 के दौरान किसी भी नमी की शुरूआत अंतिम ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड 5'-ट्राइफॉस्फेट उपज से समझौता करेगी।
  5. एंटीचैम्बर में टीबीएपी समाधान के 250 μL जोड़ें और चरण 3.3 के बाद इसे संश्लेषण कॉलम पर लोड करें। इसे 20 मिनट के लिए प्रतिक्रिया दें, हर 5 मिनट में आंदोलन करें। चरण 3.4 के अनुसार टीबीएपी समाधान निकालें और त्यागें।
  6. डीएमएफ के 0.5 एमएल के साथ कॉलम को धोएं, फिर एसीएन के 0.5 एमएल, चरण 3.3 और 3.4 के अनुसार प्रत्येक जोड़ के बाद विलायक को हटा दें।
  7. ऑक्सीडाइज़र समाधान के 250 μL (टेट्राहाइड्रोफ्यूरान (टीएचएफ) / पाइरिडीन / पानी में 0.1 एम आयोडीन, 88: 10: 2) एंटेचैम्बर में जोड़ें और चरण 3.3 के बाद संश्लेषण कॉलम पर लोड करें। इसे 30 मिनट के लिए प्रतिक्रिया दें, हर 10 मिनट में आंदोलन करें। चरण 3.4 के अनुसार ऑक्सीडाइज़र समाधान निकालें और त्यागें।
  8. एसीएन के 0.5 एमएल के साथ कॉलम धो लें और चरण 3.3 और 3.4 के अनुसार हटा दें।
  9. प्रतिक्रिया तंत्र को अलग करें। एसीएन के 5 एमएल के साथ संश्लेषण स्तंभ धो लें और कॉलम को सुखाएं।

5. ठोस समर्थन, असुरक्षा और शुद्धिकरण से दरार

  1. संश्लेषण स्तंभ से सूखे ठोस समर्थन राल को निकालें और इसे सिलिकॉन ओ-रिंग के साथ 1.5 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन स्क्रू-कैप सील करने योग्य ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  2. 28% -30% जलीय अमोनिया और 40% जलीय मिथाइलमाइन (एएमए) के 1: 1 मिश्रण के 1 एमएल में राल को निलंबित करें और ट्यूब को कसकर सील करें। कोमल उलटा39 द्वारा आंतरायिक मिश्रण के साथ 10 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। 40 एनटी से अधिक समय तक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के लिए 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर हल्के उपचार का उपयोग करें।
    सावधानी: एएमए समाधान का हीटिंग ट्यूब को उच्च दबाव में डाल देगा। यदि ट्यूब को कसकर सील नहीं किया गया है या अमोनिया-संगत (सिलिकॉन) ओ-रिंग का उपयोग नहीं किया जाता है, तो ट्यूब गैस या रिसाव विलायक को वेंट कर सकती है, संभावित रूप से सुरक्षा या अंतिम उत्पाद उपज से समझौता कर सकती है। परिवेश के तापमान से ऊपर होने पर ट्यूब को कभी न खोलें, क्योंकि गर्म एएमए समाधान हिंसक रूप से गैस विकसित कर सकता है।
  3. बर्फ पर ट्यूब को ठंडा करें और संक्षेप में इसे अपकेंद्रित्र करें (10 एस के लिए 6,000-12,000 × ग्राम )। राल से सतह पर तैरनेवाला निकालें, एक 0.2 μm फिल्टर के साथ सुसज्जित एक सिरिंज के माध्यम से फ़िल्टर, और एक नए, बाँझ पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब में स्थानांतरित करें। अमोनिया-न्यूट्रलाइजिंग रासायनिक जाल के साथ लगे वैक्यूम अपकेंद्रित्र का उपयोग करके सूखापन के समाधान को वाष्पित करें।
    नोट: यदि सिंथेटिक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड में 2'-सिलिल सुरक्षा समूहों के साथ कोई आरएनए न्यूक्लियोटाइड नहीं होता है, तो चरण 5.8 पर जाएं।
  4. टीएचएफ में 1 एम टेट्राब्यूटाइलमोनियम फ्लोराइड (टीबीएएफ) के 1 एमएल में सूखी सामग्री को भंग करके सिलिल की रक्षा करने वाले समूहों को हटा दें, 55 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें, यदि आवश्यक हो तो ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड को पूरी तरह से भंग करने के लिए मिलाते हुए, और 16-24 घंटे40,41 के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
  5. 1 एम ट्रिस बफर, पीएच 7.5 के 1 एमएल के साथ टीबीएएफ समाधान को बुझाएं, और वैक्यूम अपकेंद्रित्र का उपयोग करके टीएचएफ को हटा दें।
  6. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए, डिस्पोजेबल आकार बहिष्करण कॉलम का उपयोग करके टीबीएएफ लवण निकालें। 15 एनटी से कम ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के लिए, अंशों में एल्यूएट एकत्र करके उत्पाद के क्षालन की पुष्टि करें, और यूवी-विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर 260 एनएम पर अवशोषण द्वारा मुख्य उत्पाद अंशों की पहचान करें।
  7. 15 एनटी से कम होने पर लियोफिलाइजेशन या वैक्यूम अपकेंद्रित्र द्वारा असुरक्षित आरएनए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड को केंद्रित करें, या 15 एनटी से अधिक इथेनॉल वर्षा द्वारा।
  8. ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड आकार, जेल प्लेट और स्टैंड के लिए उपयुक्त प्रोटोकॉल के अनुसार, 19: 1 मोनो: बिस एक्रिलामाइड स्टॉक का उपयोग करके एक प्रारंभिक पैमाने 10% -20% पॉलीक्रिलामाइड / जेल प्लेट को जलाशयों में 1x टीबीई के साथ खड़े होने के साथ इकट्ठा करें और कम से कम 30 मिनट के लिए 35 डब्ल्यू (या जेल प्लेट प्रारूप के लिए उपयुक्त) पर पूर्व-रन करें।
  9. यूरिया जेल लोडिंग बफर (8 एम यूरिया, 10% सुक्रोज, 50 एमएम ट्रिस, पीएच 8, ब्रोमोफेनॉल और जाइलीन साइनोल रनिंग रंगों के साथ 1 एमएम ईडीटीए) में ठोस ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड को भंग करें और 80 डिग्री सेल्सियस तक गर्मी। पॉलीक्रिलामाइड जेल पर लोड करें और 25-35 डब्ल्यू (या जेल प्लेट प्रारूप और ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड आकार के लिए उपयुक्त) पर 1-2 घंटे के लिए चलाएं।
    नोट: ब्रोमोफेनोल ब्लू या जाइलीन साइनोल को 15 एनटी से कम ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के लिए जेल लोडिंग बफर से बाहर रखा जाना चाहिए यदि या तो उत्पाद के साथ सह-माइग्रेट होता है, क्योंकि इथेनॉल वर्षा के बिना एल्यूटेड ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड से इन रंगों को हटाना मुश्किल है।
  10. जब जेल वैद्युतकणसंचलन पूरा हो जाता है, तो जेल स्टैंड से जेल प्लेट को हटा दें, जेल प्लेट को अलग करें, और जेल को पॉलीविनाइलक्लोराइड फिल्म में लपेटें। 254 एनएम यूवी प्रकाश के साथ बैक-शैडोइंग द्वारा उत्पाद बैंड की पहचान करें, और रेजर ब्लेड का उपयोग करके प्रमुख उत्पाद बैंड को उत्पादित करें।
  11. क्रश द्वारा एक्साइज्ड जेल से ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड निकालें और विधि42 को भिगोएं।
    1. प्लास्टिक सिरिंज के माध्यम से या यांत्रिक रूप से इसे बाहर निकालकर एक्साइज्ड जेल को क्रश करें।
    2. 15 एनटी से अधिक लंबे ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के लिए:
      1. आंदोलन या मिलाते हुए कम से कम 12 घंटे के लिए क्रश और सोख बफर (300 एमएम एनएसीएल; 10 एमएम ट्रिस, पीएच 8; 1 एमएम ईडीटीए) के 3 एक्स वॉल्यूम में एल्यूट।
      2. एक 0.2 μm फिल्टर के साथ फिट एक सिरिंज के माध्यम से समाधान पारित करके ठोस जेल टुकड़े निकालें और इथेनॉल वर्षा द्वारा ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड ध्यान केंद्रित करें।
    3. 15 एनटी से कम ओलिगोन्यूक्लियोटाइड के लिए:
      1. आंदोलन या मिलाते हुए कम से कम 12 घंटे के लिए न्यूक्लियस मुक्त पानी के 3x संस्करणों में एल्यूट करें।
      2. एक 0.2 μm फिल्टर के साथ फिट एक सिरिंज के माध्यम से समाधान पारित करके ठोस जेल टुकड़े निकालें और लियोफिलाइजेशन द्वारा ध्यान केंद्रित करें।
      3. चरण 5.6 के रूप में डिस्पोजेबल आकार बहिष्करण कॉलम का उपयोग करके अवशिष्ट लवण और विलेय निकालें। लियोफिलाइजेशन द्वारा ध्यान केंद्रित करें।
  12. टीई बफर (10 एमएम ट्रिस, पीएच 8; 1 एमएम ईडीटीए) में या इसी तरह के ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड स्टोरेज बफर में -20 डिग्री सेल्सियस पर शुद्ध ट्राइफॉस्फोराइलेटेड ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स स्टोर करें।
    1. यूवी-विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके 260 एनएम पर अवशोषण को मापकर ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड की एकाग्रता निर्धारित करें।
      नोट: ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड का अनुमानित विलुप्त होने गुणांक इसके 5'-फॉस्फोराइलेशन राज्य से प्रभावित नहीं होना चाहिए, और ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड विलुप्त होने गुणांक कैलकुलेटर का उपयोग करके इसके अनुक्रम से गणना की जा सकती है।
    2. मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा ट्राइफॉस्फोराइलेशन की जाँच करें। 5'-हाइड्रॉक्सिल ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड के सापेक्ष +239.94 दा के अपेक्षित द्रव्यमान की तलाश करें।
      आयनीकरण या इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएएलडीआई-एमएस या ईएसआई-एमएस, क्रमशः) न्यूक्लिक एसिड के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल का उपयोग करते समय ओलिगोन्यूक्लियोटाइड के ट्राइफॉस्फोराइलेशन राज्य की पहचान करने के लिए उपयुक्त हैं। ईएसआई-एमएस अधिक सुसंगत परिणाम प्रदान करता है, हालांकि, आयन विखंडन की कम दरों के कारण; सामग्री की तालिका में एक प्रतिनिधि वाणिज्यिक सेवा प्रदान की जाती है।

6. राइबोजाइम आत्म-प्रतिकृति के लिए सब्सट्रेट के रूप में ट्राइफॉस्फोराइलेटेड ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स

सावधानी: 32पी एक रेडियोधर्मी आइसोटोप है और निम्नलिखित चरणों को एक प्रयोगशाला में रेडियोधर्मी सामग्री के साथ काम करने के लिए मानक सुरक्षा प्रोटोकॉल का उपयोग करके और प्रासंगिक पर्यावरणीय स्वास्थ्य और सुरक्षा विभागों द्वारा रेडियोधर्मी सामग्री के उपयोग के लिए प्रमाणित शोधकर्ता द्वारा किया जाना चाहिए। एक विकल्प के रूप में, स्व-प्रतिकृति राइबोजाइम सब्सट्रेट ए को 5'-फ्लोरोसिन लेबल14 के साथ कृत्रिम रूप से तैयार किया जा सकता है और चरण 7.9 के रूप में फ्लोरोसेंटली इमेज किया जा सकता है।

  1. स्व-प्रतिलिपिकार राइबोजाइम ई और 5'-32पी-लेबल आरएनए सब्सट्रेट ए14 के मिश्रण के रूप में समाधान ए को क्रमशः 0.30 μM और 30 μM की सांद्रता के लिए तैयार करें। 75 एमएम ईपीपीएस बफर, पीएच 8.5 और 37.5 एमजीसीएल2 में क्रमशः इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन 14 या रासायनिक ट्राइफॉस्फोराइलेशन द्वारा तैयार15 μM ट्राइफॉस्फोराइलेटेड आरएनए सब्सट्रेट बी के साथ समाधान बी-ट्रांसक्रिप्टेड और बी-सिंथेटिक तैयार करें। दोनों समाधानों को 42 डिग्री सेल्सियस पर लाएं।
    नोट: सभी आरएनए घटक सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध हैं।
  2. स्व-प्रतिकृति शुरू करने के लिए, तेजी से समाधान ए के 5 μL को 10 μL समाधान बी-ट्रांसक्रिप्टेड या बी-सिंथेटिक के साथ 0.1 μM E, 10 μM A, 10 μM B, 25 mM MgCl 2, और 50 mMEPPS बफर, पीएच 8.5 की अंतिम एकाग्रता में मिलाएं। 42 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया मिश्रण सेते हैं।
  3. नियमित अंतराल पर, 0.5 μL विभाज्य लें और फॉर्मामाइड जेल लोडिंग बफर (95% फॉर्मामाइड; 10 एमएम ईडीटीए, पीएच 8) के 9.5 μL में बुझें।
  4. जेल प्लेट और स्टैंड के लिए उपयुक्त प्रोटोकॉल के अनुसार, एक विश्लेषणात्मक पॉलीक्रिलामाइड / 8 एम यूरिया / 1 एक्स टीबीई जेल तैयार करें। एक जेल स्टैंड में कास्ट जेल और प्लेट को इकट्ठा करें, जलाशयों को 1x टीबीई के साथ भरें, और 30 मिनट के लिए 40 डब्ल्यू (या विभिन्न जेल प्लेटों और स्टैंड के लिए उपयुक्त) पर प्रीरन करें।
  5. 80 डिग्री सेल्सियस के लिए बुझाने प्रतिक्रिया नमूने गर्मी, प्रत्येक कुएं में नमूना के 5 μL लोड, और लगभग 40 मिनट के लिए 40 डब्ल्यू पर जेल चलाने (या विभिन्न जेल प्लेटों और खड़ा है के लिए उपयुक्त के रूप में)।
  6. जेल स्टैंड से जेल प्लेट निकालें, अलग करें, और पॉलीविनाइलक्लोराइड फिल्म में जेल लपेटें। एक फॉस्फोर स्क्रीन के साथ जेल को कवर करें और 1 घंटे के लिए उजागर करें (या 32पी सीपीएम के लिए उपयुक्त); फॉस्फोरसेंट जेल स्कैनर का उपयोग करके स्क्रीन को स्कैन करें।
  7. जेल छवि मात्रा का ठहराव सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रतिक्रिया उपज की मात्रा निर्धारित करें।
    1. विश्लेषण टूलबॉक्स का उपयोग करके जेल छवि खोलें, विश्लेषण | चुनें आकृति परिभाषा, आयत आकृति | क्षेत्रों का चयन करें, और प्रत्येक बार और दोनों प्रतिक्रियाओं के लिए बिना प्रतिक्रिया वाले ए और उत्पाद ई के अनुरूप बैंड के चारों ओर समान आकार के आयत खींचें।
    2. विश्लेषण | चुनें पृष्ठभूमि घटाव, आयत आकार | क्षेत्रों का चयन करें, और जेल छवि के एक खाली हिस्से में एक ही आकार का एक आयत खींचें। छवि आयत करने के लिए सभी आयतों के लिए पृष्ठभूमि घटाव विधि परिवर्तित करें।
    3. विंडो | 2 क्षेत्र विंडो चुनें, फिर | संपादित करें किसी स्प्रेडशीट फ़ाइल में परिमाणित बैंड पिक्सेल वॉल्यूम निर्यात करने के लिए Excel को निर्यात करें।
  8. उत्पाद ई बनाम समय की एकाग्रता प्लॉट करें, और सांख्यिकीय डेटा-फिटिंग सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके लॉजिस्टिक ग्रोथ इक्यू (1) में डेटा फिट करें:
    [ई] = Equation 1 (1)
    जहां ए प्रतिक्रिया अधिकतम सीमा है, बी सिग्मोइडिसिटी की डिग्री है, और सी घातीय वृद्धि दर है।
    1. निर्यात स्प्रेडशीट में, उत्पाद ई वॉल्यूम को सब्सट्रेट ए और उत्पाद ई वॉल्यूम के योग से विभाजित करें ताकि प्रत्येक बार और दोनों प्रतिक्रियाओं के लिए उत्पाद की आंशिक उपज निर्धारित की जा सके। समय के एक समारोह के रूप में उत्पाद ई की उपज निर्धारित करने के लिए सब्सट्रेट ए (10 μM) की प्रारंभिक एकाग्रता से गुणा करें।
    2. सांख्यिकीय डेटा-फिटिंग सॉफ़्टवेयर में, फ़ाइल | चुनें नई | नई प्रोजेक्ट फ़ाइल, नई तालिका और ग्राफ़ के अंतर्गत XY का चयन करें, और बनाएँक्लिक करें। आसन्न कॉलम में दोनों प्रतिक्रियाओं के लिए प्रतिक्रिया समय और उत्पाद ई पैदावार दर्ज करें, और लेबल कॉलम तदनुसार (जैसे, "समय", "ट्रांसक्रिप्टेड बी", "सिंथेटिक बी")।
    3. | सम्मिलित करें चुनें नया विश्लेषण, एक्सवाई विश्लेषण का चयन करें | नॉनलाइनियर प्रतिगमन (वक्र फिट) फिर ठीक क्लिक करें। | विकास घटता चुनें लॉजिस्टिक विकास और ठीक क्लिक करें; किसी भी अन्य पैरामीटर को समायोजित न करें। परिणाम के तहत फिट मापदंडों और आत्मविश्वास अंतराल और रेखांकन के तहत डेटा बिंदुओं और फिट घटता की साजिश का निरीक्षण करें।

7. एल-आरएनए की क्रॉस-चिरल कॉपी

  1. 20 μM डी-आरएनए 27.3 टी क्रॉस-चिरल पोलीमरेज़, 2 μM 5'-फ्लोरोसिन-लेबल एल-आरएनए प्राइमर, 4 μM बायोटिनिलेटेड एल-आरएनए हैमरहेड टेम्पलेट, और एल-आरएनए पीपीपीसीयूजी, पीपीपीएजीजी, और पीपीपीसीजीसी के 20 μM वाले आरएनए समाधान के 10 μL को 50 एमएम ट्रिस के 10 μL में तैयार करें एक पीसीआर थर्मोसाइक्लर में 1 मिनट के लिए 90 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करके और 0.2 डिग्री सेल्सियस / एस पर 23 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करके आरएनए को एनील करें। पोलीमरेज़, प्राइमर और टेम्पलेट के बारे में विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।
  2. 17 डिग्री सेल्सियस पर आरएनए समाधान सेते हैं और 2x प्रारंभ बफर (400 एमएमएमजीसीएल 2, 500 एमएम एनएसीएल, और 50 एमएम ट्रिस, पीएच 8.3) के 10 μL जोड़कर प्रतिक्रिया शुरू करते हैं। सुनिश्चित करें कि प्रतिक्रिया के सभी घटकों की अंतिम सांद्रता 10 μM पोलीमरेज़, 1 μM प्राइमर, 2 μM टेम्पलेट, 10 μM प्रत्येक ट्रिन्यूक्लियोटाइड 5'-ट्राइफॉस्फेट, 200 एमएम एमजीसीएल2, 250 एमएम एनएसीएल, और 50 एमएम ट्रिस, पीएच 8.3 हैं।
  3. जैसे ही प्रतिक्रिया आगे बढ़ती है, 10 μL विभाज्य लें और 0.5 एम ईडीटीए, पीएच 8 के 5 μL के साथ बुझें।
  4. प्रत्येक बुझाए गए प्रतिक्रिया नमूने के लिए, 0.05% तटस्थ डिटर्जेंट के साथ टीई बफर में 1 एम एनएसीएल के 10 μL में निलंबित स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित चुंबकीय मोती (20 पीएमओएल बायोटिन-ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड बाध्यकारी क्षमता) के 0.1 मिलीग्राम जोड़ें बायोटिनिलेटेड टेम्पलेट के माध्यम से ट्रिमर-विस्तारित प्राइमरों को पकड़ने के लिए और झटकों के साथ कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
  5. एक मनका-कैप्चर चुंबक पर मोती कैप्चर करें, तरल निकालें और त्यागें, और 50 μL धोने के समाधान (0.05% तटस्थ डिटर्जेंट के साथ टीई में 250 एमएम एनएसीएल) जोड़ें। मोतियों को मिलाएं, उन्हें फिर से कैप्चर करें, और धोने के समाधान को हटा दें। इसे एक बार फिर दोहराएं।
  6. मोतियों से विस्तारित प्राइमरों को हटाने के लिए, 50 μL क्षालन समाधान (0.05% तटस्थ डिटर्जेंट के साथ 25 एमएम एनएओएच) जोड़ें, और मोतियों को मिलाएं। मोतियों को पुनः प्राप्त करें, क्षालन समाधान को हटा दें, 100 एमएम ट्रिस (पीएच 7.5) के साथ बुझें, और इथेनॉल के साथ अवक्षेपित करें।
  7. जेल प्लेट और स्टैंड के लिए उपयुक्त प्रोटोकॉल के अनुसार, एक विश्लेषणात्मक पॉलीक्रिलामाइड /8 एम यूरिया / 1 एक्स टीबीई जेल तैयार करें। एक जेल स्टैंड में कास्ट जेल और प्लेट को इकट्ठा करें, जलाशयों को 1x टीबीई के साथ भरें, और 30 मिनट के लिए 40 डब्ल्यू (या विभिन्न जेल प्लेटों और स्टैंड के लिए उपयुक्त) पर प्रीरन करें।
  8. फॉर्मामाइड जेल लोडिंग बफर के 10 μL में अवक्षेपित आरएनए को भंग करें, और फॉर्मामाइड जेल लोडिंग बफर में 0.5 μM पर अनियंत्रित अंत-लेबल प्राइमर तैयार करें। 80 डिग्री सेल्सियस के लिए गर्मी के नमूने, प्रत्येक कुएं में नमूने के 5 μL लोड, और लगभग 40 मिनट के लिए 40 डब्ल्यू पर जेल चलाने के लिए (या विभिन्न जेल प्लेटों और खड़ा है के लिए उपयुक्त के रूप में)।
  9. स्टैंड से जेल प्लेट निकालें, और क्रॉस-चिरल एल-आरएनए एक्सटेंशन उत्पादों की कल्पना करने के लिए फ्लोरोसेंट /

Representative Results

ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स को फॉस्फोरामिडाइट्स और स्वचालित डीएनए / आरएनए सिंथेसाइज़र के लिए उपयुक्त मानक प्रोटोकॉल का उपयोग करके संश्लेषित किया जाना चाहिए, जिससे उत्पाद ओलिगोन्यूक्लियोटाइड मूल प्लास्टिक संश्लेषण स्तंभ में ठोस समर्थन से अशुद्ध हो जाता है, जिसमें 5-टर्मिनल डाइमेथोक्सीट्रिटिल समूह को मुक्त 5-हाइड्रॉक्सिल (धारा 1) उत्पन्न करने के लिए हटा दिया जाता है। इस प्रदर्शन में उपयोग किए जाने वाले सभी ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स को ठोस समर्थन के रूप में 1,000 ए नियंत्रित ताकना ग्लास (सीपीजी) राल का उपयोग करके तैयार किया गया था और 0.2 या 1 μmol पैमाने पर आयोजित किया गया था। सिंथेसाइज़र कॉलम, रेजिन, अभिकर्मकों और फॉस्फोरामाइडाइट्स के प्रतिनिधि उदाहरण सामग्री की तालिका में प्रदान किए गए हैं। बड़े पैमाने पर प्रतिक्रियाओं के लिए, बाद के चरणों में उपयोग किए जाने वाले वॉल्यूम और समय को समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है।

ट्राइफॉस्फोराइलेशन प्रतिक्रिया सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध मानक, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध घटकों का उपयोग करके कस्टम-निर्मित प्रतिक्रिया कक्ष (चित्रा 2, धारा 3) में ऑन-कॉलम आयोजित की जाती है और चित्रा 1 (धारा 4) 28 में सचित्र योजना का अनुसरण करती है। यह आवश्यक है कि ट्राइफॉस्फोराइलेशन के दौरान शर्तों को सख्ती से निर्जल रखा जाए, और सभी सॉल्वैंट्स और अभिकर्मकों को पहले से आणविक छलनी पर तैयार किया जाए और उपयोग से पहले पूरी तरह से सूखने की अनुमति दी जाए (धारा 2)। ट्राइफॉस्फोराइलेशन आमतौर पर होने में 2 घंटे लगते हैं, और बाद में, धोए गए और सूखे कॉलम को मानक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड डिप्रोटेक्शन और शुद्धिकरण प्रक्रियाओं (धारा 5) के अनुसार इलाज किया जा सकता है।

डिप्रोटेक्शन के बाद, ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड ट्राइफॉस्फेट को पॉलीएक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (पेज) को विकृत करके शुद्ध किया जाता है, जो यूवी बैक-शैडोइंग द्वारा एक प्रमुख उत्पाद बैंड दिखाता है जिसे जेल से एक्साइज और एल्यूट किया जा सकता है। 5'-ट्राइफॉस्फेट उत्पाद को छोटे ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के लिए प्रतिक्रिया पक्ष उत्पादों से आसानी से अलग किया जाता है, जैसा कि डीएनए ट्राइन्यूक्लियोटाइड 5-ट्राइफॉस्फेट, पीपीपीएएए और पीपीपीसीसी और एल-आरएनए ट्रिन्यूक्लियोटाइड 5-ट्राइफॉस्फेट पीपीपीजीएए के लिए दिखाया गया है। एएए और सीसीसी डीएनए ट्रिमर के लिए 5'-हाइड्रॉक्सिल और 5'-ट्राइफॉस्फेट उत्पादों दोनों को बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा उत्पादित और पहचाना गया था और तदनुसार चित्रा 3 ए में लेबल किया गया था। अतिरिक्त बैंड, जैसा कि एएए डीएनए ट्रिमर के लिए दिखाई देता है, आमतौर पर पुनर्प्राप्त करने और पहचानने के लिए पर्याप्त सामग्री नहीं होती है। हालांकि, इन बैंडों की उपस्थिति अशुद्ध प्रतिक्रिया उत्पादों (चित्रा 3 सी) में अतिरिक्त उत्पाद द्रव्यमान के साथ सहसंबंधित है, आमतौर पर 5'-डिफॉस्फेट, मोनोफॉस्फेट और एच-फॉस्फोनेट साइड उत्पादों का प्रतिनिधित्व करती है, जैसा कि नीचे चर्चा की गई है।

पेज शुद्धिकरण के बाद, बड़े ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स को क्रश और सोख विधि42 और बाद में इथेनॉल वर्षा का उपयोग करके एल्यूट किया जा सकता है। हालांकि, 15 एनटी से कम ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स को कुशलतापूर्वक इथेनॉल अवक्षेपित नहीं किया जा सकता है और इस प्रकार, जेल क्षालन (चरण 5.11.3) के लिए एक संशोधित प्रक्रिया की आवश्यकता होती है। सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध डिस्पोजेबल आकार बहिष्करण कॉलम को केवल 10 एनटी से अधिक लंबे ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के साथ उपयोग के लिए रेट किया गया है। हालांकि, हमने पाया है कि ट्रिमर के रूप में कम ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स को निर्माता के अनुशंसित प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्रभावी ढंग से डीसाल्ट किया जा सकता है। फिर भी, लघु ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स (चरण 5.6 और 5.11.3 के रूप में) को डीसाल्ट करते समय यह अनुशंसा की जाती है कि कॉलम एल्यूएट को अंशों में एकत्र किया जाए, और उत्पाद अंशों को यूवी-विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके 260 एनएम पर अवशोषण द्वारा पहचाना जाए। छोटे ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के लिए अनुकूलित एक आकार बहिष्करण स्तंभ वैकल्पिक विकल्प के रूप में सामग्री की तालिका में प्रदान किया गया है। शुद्धिकरण के बाद 1 μmol पैमाने पर ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड संश्लेषण से अंतिम उपज 50-300 एनएमओएल है।

ट्राइफॉस्फोराइलेशन की पुष्टि मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा की जा सकती है, जहां ट्राइफॉस्फोराइलेटेड उत्पाद का द्रव्यमान +239.94 डीए 5'-हाइड्रॉक्सिल ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड से अधिक होता है, हालांकि 5'-डि- और मोनोफॉस्फेट (+159.96 और +79.98 डीए, क्रमशः) के अनुरूप सामग्रियों की उपस्थिति अक्सर देखी जाती है। 5'-ओएच द्रव्यमान से द्रव्यमान +63.98 दा के साथ एक 5'-एच-फॉस्फोनेट साइड उत्पाद भी देखा जा सकता है, और इस उत्पाद के उच्च स्तर से संकेत मिलता है कि ट्राइफॉस्फोराइलेशन के दौरान स्थितियां पर्याप्त निर्जल नहीं थीं। शुद्धिकरण से पहले, असुरक्षित ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स आमतौर पर इन सभी उत्पादों (चित्रा 3 सी) को दिखाएगा, जबकि शुद्ध सामग्री 5'-डि- और मोनोफॉस्फेट (चित्रा 3 डी, ई) के साथ 5'-ट्राइफॉस्फेट उत्पाद के अनुरूप एक चोटी दिखाएगी।

अकेले मास स्पेक्ट्रोमेट्री आमतौर पर आयनीकरण के दौरान ट्राइफॉस्फेट के आयनीकरण और विखंडन की अंतर दरों के कारण 5'-ट्राइफॉस्फेट शुद्धता का कठोर माप नहीं देगा। अंतिम उत्पाद शुद्धता को मापने के लिए, रिवर्स-फेज तरल क्रोमैटोग्राफी और अग्रानुक्रम ईएसआई-एमएस (आरपी-एलसी / ईएसआई-एमएस) की सिफारिश की जाती है, खासकर लंबे समय तक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के लिए। ईएसआई-एमएस (चित्रा 4 ए, बी, क्रमशः) द्वारा डी-आरएनए 5-ट्राइफॉस्फेट पीपीपीएसीजीएजीजी और पीपीपीजीएजीएसीसीजीसीएसीएयूए का विश्लेषण विशिष्ट अंतिम उत्पाद शुद्धता दिखाता है, जिसमें 20% 5-डिफॉस्फेट होता है क्योंकि इन दोनों प्रजातियों को लंबे समय तक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड पर मौजूद होने पर अलग करना मुश्किल होता है।

सिंथेटिक 5'-ट्राइफॉस्फेट ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड आमतौर पर जैव रासायनिक अध्ययनों में एंजाइमेटिक रूप से तैयार सामग्री की तुलना में अच्छी तरह से या बेहतर कार्य करते हैं। धारा 6 में, एक उदाहरण के रूप में, 5'-ट्राइफॉस्फेट 14 एनटी आरएनए सब्सट्रेट या तो कृत्रिम रूप से या इन विट्रो प्रतिलेखन द्वारा तैयार किए गए आरएनए-उत्प्रेरित आत्म-प्रतिकृति प्रतिक्रिया14,15,43,44,45 में तुलना की गई थी। राइबोजाइम ई घातीय वृद्धि (चित्रा 5 ए) में सक्षम एक ऑटोकैटेलिटिक प्रतिक्रिया में ई की एक नई प्रति प्राप्त करने के लिए सब्सट्रेट ए और बी के जुड़ने को उत्प्रेरित करता है। ई और 32पी-लेबल ए घटक इन विट्रो प्रतिलेखन द्वारा तैयार किए गए थे, और ट्राइफॉस्फोराइलेटेड सब्सट्रेट बी को या तो कृत्रिम रूप से तैयार किया गया था, जैसा कि ऊपर वर्णित है, या इन विट्रो प्रतिलेखन14 द्वारा। स्व-प्रतिकृति प्रतिक्रिया प्रगति की निगरानी आवधिक नमूने लेकर की गई थी जो पेज को विकृत करके विश्लेषण किया गया था और फ्लोरोसेंट / परिणामी डेटा, एक रसद विकास समारोह के लिए फिट, पता चला है कि या तो ट्रांसक्रिप्टेड या सिंथेटिक बी सब्सट्रेट घातीय वृद्धि का समर्थन करता है, लेकिन सिंथेटिक बी उत्पाद (चित्रा 5 बी) की थोड़ी अधिक मात्रा देता है। यह परिणाम इन विट्रो प्रतिलेखन23,24 द्वारा तैयार आरएनए के 5'-अंत में रचनात्मक विषमता को प्रतिबिंबित कर सकता है।

रासायनिक ट्राइफॉस्फोराइलेशन ओलिगोन्यूक्लियोटाइड ट्राइफॉस्फेट के संश्लेषण को भी सक्षम बनाता है जिसे जैविक रूप से तैयार नहीं किया जा सकता है, या तो इन विट्रो या कोशिकाओं में। धारा 7 में, एल-आरएनए से बने गैर-जैविक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड ट्राइफॉस्फेट, प्राकृतिक डी-आरएनए के एनेंटिओमर, धारा 1-5 के रूप में तैयार किए गए, डी-आरएनए "क्रॉस-चिरल" पोलीमरेज़ राइबोजाइम 27.3 टी (चित्रा 6 ए) के लिए सब्सट्रेट के रूप में उपयोग किए गए थे, जो छोटे एल-आरएनए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड से लंबे एल-आरएनए उत्पाद के टेम्पलेट-निर्देशित पोलीमराइजेशन को उत्प्रेरित करता है। एक उदाहरण के रूप में, राइबोजाइम हथौड़ाहेड स्व-दरार आकृति (चित्रा 6 बी) 18 के एल-आरएनए संस्करण को संश्लेषित कर सकता है। शुद्ध एल-आरएनए ट्राइन्यूक्लियोटाइड ट्राइफॉस्फेट को फ्लोरोसिन-लेबल एल-आरएनए प्राइमर और एल-आरएनए टेम्पलेट (चित्रा 6 सी) के साथ जोड़ा गया था और क्रॉस-चिरल लिगेज के साथ प्रतिक्रिया की गई थी। प्रतिक्रिया के दौरान नमूनों का विश्लेषण पेज द्वारा किया गया था और टेम्पलेट (चित्रा 6 डी) द्वारा एन्कोडेड हैमरहेड राइबोजाइम के एल-आरएनए संस्करण के संश्लेषण को प्रदर्शित करने के लिए फ्लोरोसेंट /

Figure 3
चित्र 3: ट्राइन्यूक्लियोटाइड 5-ट्राइफॉस्फेट की शुद्धि। (ए) डीएनए ट्राइन्यूक्लियोटाइड्स त्रि-डीऑक्सीडेनोसिन (एएए, नीला) और त्रि-डीऑक्सीसाइटिडाइन (सीसीसी, लाल) के ट्राइफॉस्फोराइलेशन के पृष्ठ विश्लेषण (यूवी-बैक-शैडोइंग द्वारा कल्पना की गई), जानबूझकर मामूली साइड-उत्पादों की कल्पना करने के लिए अतिभारित। 5-ट्राइफॉस्फेट उत्पाद (पीपीपी) और 5-हाइड्रॉक्सिल (ओएच) दोनों शुरुआती सामग्री को मालदी-एमएस द्वारा एक्साइज और पहचाना गया था। (बी) एल-आरएनए ट्राइन्यूक्लियोटाइड जीएए के ट्राइफॉस्फोराइलेशन का प्रारंभिक पृष्ठ, प्रमुख उत्पाद बैंड के साथ उत्पादित और ईएसआई-एमएस द्वारा 5-ट्राइफॉस्फेट (पीपीपी) के रूप में पहचाना जाता है। (सी) डीप्रोटेक्शन के बाद कच्चे प्रतिक्रिया उत्पादों के मालदी-एमएस और (डी) (ए) से शुद्ध उत्पाद। 5-ट्राइफॉस्फेट (पीपीपी; पीपीपीएएए ने 1,119 दा की उम्मीद की, 1,118 डीए मनाया; पीपीपीसीसी ने 1,047 दा की उम्मीद की, 1,046 मनाया); 5-डिफॉस्फेट (पीपी), 5-मोनोफॉस्फेट (पी), 5-हाइड्रॉक्सिल (ओएच), और 5-एच-फॉस्फोनेट (एचपी) को लेबल किया गया है। (ई) (बी) से पृथक 5-ट्राइफॉस्फेट उत्पाद के प्रत्यक्ष इंजेक्शन ईएसआई-एमएस से विघटित द्रव्यमान स्पेक्ट्रम, पहचाने गए चोटियों के साथ लेबल किया गया (अपेक्षित 1,181.6 दा, 1,181.0 दा मनाया गया)। 5-डिफॉस्फेट (पीपी) उत्पाद भी देखे जाते हैं, जैसा कि ट्राई- और डाई-फॉस्फेट उत्पादों (+22 दा) दोनों के लिए सोडियम आयन चोटियों हैं। सामान्य संदूषक चोटियों को तारांकन चिह्न के साथ लेबल किया जाता है। तुलना में आसानी के लिए, द्रव्यमान स्पेक्ट्रा को प्रत्येक स्पेक्ट्रम में मापा गया उच्चतम तीव्रता के लिए सामान्यीकृत किया गया था और उस मूल्य के सापेक्ष प्रतिशत के रूप में रिपोर्ट किया गया था। संक्षिप्त नाम: पृष्ठ = पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन; मालदी-एमएस = मैट्रिक्स-असिस्टेड लेजर डिसॉर्प्शन / ईएसआई-एमएस = इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण मास स्पेक्ट्रोमेट्री। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4: 6 एनटी और 14 एनटी डी-आरएनए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड ट्राइफॉस्फेट के विश्लेषणात्मक आरपी-एलसी( ए) 5-पीपीपीएसीजीएजीजी -3 और (बी) 5-पीपीपीजीएसीसीजीसीएसीयूए -3। अग्रानुक्रम ईएसआई-एमएस ने दोनों (~ 70%) के प्रमुख शिखर की पहचान 5-ट्राइफॉस्फेट (पीपीपी) के रूप में की, जिसमें 5-डिफॉस्फेट (पीपी) की कम मात्रा थी। संक्षिप्त नाम: आरपी-एलसी = रिवर्स-चरण तरल क्रोमैटोग्राफी; एनटी = न्यूक्लियोटाइड; ईएसआई-एमएस = इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण मास स्पेक्ट्रोमेट्री। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: रासायनिक संश्लेषण या इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन द्वारा तैयार ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड 5-ट्राइफॉस्फेट सब्सट्रेट की तुलना( ए) स्व-प्रतिकृति राइबोजाइम ई लिगेट्स आरएनए ए और 5'-ट्राइफॉस्फोराइलेटेड आरएनए बी (बी) 10 μM A और 10 μM B का उपयोग करके स्व-प्रतिकृति प्रतिक्रियाओं की तुलना, या तो सिंथेटिक (खुले हलकों) या इन विट्रो ट्रांसक्रिप्टेड (भरे हुए) (बी) डेटा लॉजिस्टिक विकास समीकरण के लिए फिट थे: [ई] = ए / (1 + बी ई-सीटी), जहां ए अंतिम उपज है, बी सिग्मोइडिसिटी की डिग्री है, और सी घातीय वृद्धि दर है। दो प्रतिक्रियाओं के लिए विकास दर समान थी, 1.14 एच -1 पर, जबकि सिंथेटिक बी के साथ प्रतिक्रियाओं के लिए अंतिम सीमा 10% अधिक थी।

Figure 6
चित्रा 6: एक राइबोजाइम के साथ क्रॉस-चिरल एल-आरएनए पोलीमराइजेशन (ए) डी-आरएनए 27.3 टी पोलीमरेज़ राइबोजाइम, जो एल-आरएनए के टेम्पलेट-निर्भर बंधाव को उत्प्रेरित करता है। (बी) 27.3 टी द्वारा संश्लेषित एल-आरएनए उत्पाद एक हैमरहेड एंडोन्यूक्लाइज आकृति का हिस्सा बनता है। (सी) एल-आरएनए पोलीमराइजेशन एक बायोटिनिलेटेड एल-आरएनए टेम्पलेट (भूरा), एक अंत-लेबल एल-आरएनए प्राइमर (मैजेंटा), और चार एल-आरएनए ट्राइन्यूक्लियोटाइड ट्राइफॉस्फेट (सियान) का उपयोग करके 27.3 टी द्वारा उत्प्रेरित, सिंथेटिक रूप से तैयार किया गया। (डी) 4 घंटे और 24 घंटे पर (बी) के विस्तार उत्पादों का पृष्ठ विश्लेषण, पूर्ण लंबाई वाले उत्पाद (ब्लैक डॉट) तक प्रत्येक ट्राइन्यूक्लियोटाइड निगमन दिखा रहा है। अनियंत्रित एल-आरएनए प्राइमर को संदर्भ मार्कर के रूप में शामिल किया गया है। संक्षिप्त नाम: पृष्ठ = पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन; एम = संदर्भ मार्कर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

यहां वर्णित ट्राइफॉस्फोराइलेशन प्रक्रिया मानक फॉस्फोरामाइड रसायन विज्ञान का उपयोग करके ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड संश्लेषण के साथ व्यापक रूप से संगत है। न्यूक्लियोसाइड फॉस्फोरामिडाइट्स में एएमए39 में तेजी से डीप्रोटेक्शन के साथ संगत बेस-लेबिल प्रोटेक्टिंग ग्रुप होने चाहिए, जिसमें फॉस्फाइट पर मानक β-साइनोएथिल, और आइसोब्यूटिल, डाइमिथाइलफॉर्मामिडिल, एसिटाइल, फेनोक्सीएसिटाइल, या न्यूक्लियोबेस के एक्सोसाइक्लिक अमाइन पर 4-आइसोप्रोपाइलफेनोक्सीएसिटाइल समूह शामिल हैं। राइबोज 2'-हाइड्रॉक्सिल समूहों को सिलिल सुरक्षा समूहों द्वारा संरक्षित किया जाना चाहिए, या तो टी-ब्यूटाइलडिमिथाइलसिलिल (टीबीडीएमएस) या त्रि-आइसो-प्रोपिलसिलिलोक्सीमिथाइल (टीओएम) 40,41। बेस-लेबिल पिवालॉयलॉक्सीमिथाइल (पीआईवीओएम) समूह को रासायनिक ट्राइफॉस्फोराइलेशन30 के साथ संगत होने की भी सूचना दी गई है।

सिंथेटिक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स 28,29,30,31,32,33,34,35 के रासायनिक ट्राइफॉस्फोराइलेशन के लिए कई तरीकों का वर्णन किया गया है। हमने लुडविग-एकस्टीन अभिकर्मक37 का उपयोग करके ट्राइफॉस्फोराइलेशन को सबसे सुलभ में से एक पाया है, जिसमें अभिकर्मकों के कोई विशेष संश्लेषण की आवश्यकता नहीं है और कोई विशेष उपकरण नहीं है। इस विधि द्वारा तैयार ओलिगोन्यूक्लियोटाइड 5'-ट्राइफॉस्फेट का उपयोग नियमित रूप से आरएनए लिगेज राइबोजाइम के लिए सब्सट्रेट के रूप में किया जाता है, जिसमें टेम्पलेट-निर्भर संश्लेषण और इस "दर्पण-छवि" न्यूक्लिक एसिड14,16,17,18 की प्रतिकृति प्राप्त करने के लिए एंजाइमेटिक रूप से दुर्गम एल-आरएनए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड ट्राइफॉस्फेट का उपयोग शामिल है . विधि छोटे 5'-ट्राइफॉस्फोराइलेटेड स्टेम-लूप आरएनए की तैयारी के लिए भी उपयुक्त है जो कशेरुक 6,7 में जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के शक्तिशाली सक्रियकर्ता हैं।

लुडविग-एकस्टीन अभिकर्मक, सैलिसिल फॉस्फोरोक्लोरिडाइट37, पानी के लिए अत्यधिक प्रतिक्रियाशील है, और ओलिगोन्यूक्लियोटाइड कॉलम पर लोड होने से पहले अभिकर्मक को भंग करते समय पेश किए गए किसी भी पानी को प्रभावी ढंग से साफ करता है। इस बिंदु के बाद, हालांकि, 5'-फॉस्फिटाइलेटेड ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड अधिमानतः पाइरोफॉस्फेट पर सिस्टम में पेश किए गए किसी भी पानी के साथ प्रतिक्रिया करेगा, जो वर्कअप28,37,38 के बाद 5'-एच-फॉस्फोनेट साइड उत्पाद का निर्माण करेगा। ट्राइफॉस्फोराइलेशन अभिकर्मकों और ट्राइफॉस्फोराइलेशन प्रतिक्रिया कक्ष की सावधानीपूर्वक तैयारी यह सुनिश्चित करती है कि यह पक्ष उत्पाद नहीं बनता है। विलायक सुखाने के लिए, टाइप 4 ए आणविक छलनी को अधिकांश ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड संश्लेषण अभिकर्मक कंपनियों द्वारा विभिन्न ब्रांड नामों के तहत अधिकांश कार्बनिक सॉल्वैंट्स के साथ संगत टेफ्लॉन बैग में प्रीपैकेज बेचा जाता है। अतिरिक्त सावधानियां, जैसे निर्जल वातावरण के तहत एक दस्ताने बॉक्स में ट्राइफॉस्फोराइलेशन करना, आमतौर पर आवश्यक नहीं है।

टीबीएपी के साथ 5'-फॉस्फिटाइलेटेड ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड की प्रतिक्रिया एक चक्रीय 5'-ट्राइमेटाफॉस्फाइट मध्यवर्ती बनाती है, जिसे तब ओलिगोन्यूक्लियोटाइड संश्लेषण ऑक्सीडाइज़र समाधान (पानी / यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि वाणिज्यिक ऑक्सीडाइज़र समाधान आयोडीन की अलग-अलग मात्रा का उपयोग करते हैं, और ट्राइफॉस्फेट के पूर्ण ऑक्सीकरण को सुनिश्चित करने के लिए उच्च 0.1 एम आयोडीन एकाग्रता का उपयोग करना आवश्यक है। चक्रीय उत्पाद को एक ही समाधान37 में अंतिम रैखिक 5'-ट्राइफॉस्फेट में हाइड्रोलाइज्ड किया जाता है, और वैकल्पिक, निर्जल ऑक्सीडाइज़र समाधान का उपयोग किया जाना चाहिए यदि पानी के अलावा अन्य न्यूक्लियोफाइल के साथ रैखिककरण वांछित है (अनुप्रयोगों के लिए नीचे देखें)33। हालांकि, किसी भी अवशिष्ट चक्रीय ट्राइमेटाफॉस्फेट को ओलिगोन्यूक्लियोटाइड के बाद के क्षारीय डिप्रोटेक्शन के दौरान रैखिक किया जाएगा। चक्रीय 5'-ट्राइमेटाफॉस्फेट का हाइड्रोलिसिस शाखित ट्राइफॉस्फेट37,46 के बजाय केवल रैखिक पैदावार देता है।

ओलिगोन्यूक्लियोटाइड डिप्रोटेक्शन को आमतौर पर 5'-ट्राइफॉस्फोराइलेशन को समायोजित करने के लिए संशोधित करने की आवश्यकता नहीं होती है, लेकिन कुछ सावधानियां बरती जानी चाहिए। ट्राइफॉस्फेट क्षारीय स्थितियों के संक्षिप्त संपर्क के लिए अपेक्षाकृत स्थिर है, लेकिन देखभाल की जानी चाहिए कि ट्राइफॉस्फेट को आवश्यकता से अधिक समय तक एएमए में उजागर न करें। 65 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट से अधिक के लिए अमोनिया या एएमए में अधिक लंबे समय तक उपचार की आवश्यकता वाले समूहों की रक्षा से बचा जाना चाहिए। अधिक कोमल उपचार, जैसे कमरे के तापमान पर अमोनिया में 2 घंटे स्वीकार्य हैं जब अन्य फॉस्फोरामिडाइट सुरक्षा समूहों के साथ संगत होते हैं। सिलिल-संरक्षित सिंथेटिक आरएनए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के लिए एक सामान्य, तेज़ डिप्रोटेक्शन विधि ट्राइथाइलमाइन ट्राइहाइड्रोफ्लोराइड और उच्च तापमान47 का उपयोग करती है; हालांकि, आरएनए 5'-ट्राइफॉस्फेट तैयार करते समय इससे बचा जाना चाहिए क्योंकि लंबे समय तक अम्लीय स्थितियां ट्राइफॉस्फेट हाइड्रोलिसिस31,32 में तेजी लाने के लिए पाई जाती हैं।

प्रारंभिक पृष्ठ 5'-ट्राइफॉस्फोराइलेटेड ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स (चित्रा 3 और चित्रा 4) के पोस्टडिप्रोटेक्शन शुद्धिकरण के लिए सबसे सरल और सबसे विश्वसनीय तरीका साबित हुआ है। हालांकि, प्रारंभिक रिवर्स-चरण एचपीएलसी का उपयोग ट्राइफॉस्फोराइलेटेड उत्पादों को शुद्ध करने के लिए भी किया जा सकता है। मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा ट्राइफॉस्फोराइलेशन को सत्यापित करते समय 5'-डिफॉस्फेट और, कुछ हद तक, 5'-मोनोफॉस्फेट उत्पादों की उपस्थिति नियमित रूप से देखी जाती है। हमने रासायनिक संश्लेषण या प्रतिलेखन द्वारा तैयार अत्यधिक शुद्ध सामग्री से मास स्पेक्ट्रोमेट्री के दौरान 5'-ट्राइफॉस्फेट विखंडन देखा है, खासकर अगर उपकरण ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के विश्लेषण के लिए अनुकूलित नहीं है। फिर भी, आरपी-एलसी विश्लेषण अक्सर 5'-डिफॉस्फेट साइड उत्पाद का 10% -20% दिखाता है जो लंबे समय तक 5'-ट्राइफॉस्फोराइलेटेड ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स (चित्रा 4) में मौजूद है। ट्रिब्यूटाइलमोनियम पाइरोफॉस्फेट की वाणिज्यिक तैयारी 20% मोनोफॉस्फेट से दूषित हो सकती है, जो ट्राइफॉस्फोराइलेशन30,31 के दौरान साइड उत्पाद के रूप में 5'-डिफॉस्फेट का उत्पादन करेगी। घर में इस अभिकर्मक की सावधानीपूर्वक तैयारी से बहुत अधिक शुद्ध टीबीएपी स्टॉक31 प्राप्त हो सकते हैं। हालांकि, हमने पाया है कि टीबीएपी के वाणिज्यिक स्रोतों का उपयोग करके ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स ट्राइफॉस्फोराइलेटेड अभी भी इन विट्रो प्रतिलेखन द्वारा तैयार सामग्री की तुलना में एंजाइमी प्रतिक्रियाओं (चित्रा 5 बी) में सब्सट्रेट के रूप में उपयोग किए जाने पर तुलनीय या अधिक प्रतिक्रियाशीलता दिखाते हैं।

लुडविग-एकस्टीन अभिकर्मक के साथ ओलिगोन्यूक्लियोटाइड ट्राइफॉस्फोराइलेशन का एक उल्लेखनीय और उपयोग चक्रीय ट्राइमेटाफॉस्फाइट मध्यवर्ती33 का लाभ उठाता है। यदि बाद के ऑक्सीकरण चरण को हेक्सेन में 1 एम टी-ब्यूटाइल पेरोक्साइड के साथ आयोजित किया जाता है, जिसका उपयोग अक्सर निर्जल स्थितियों के तहत ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड ऑक्सीकरण के लिए किया जाता है, तो फॉस्फाइट का ऑक्सीकरण रिंग ओपनिंग हाइड्रोलिसिस के बिना होता है, जिससे चक्रीय ट्राइमेटाफॉस्फेट उत्पन्न होता है। इस मध्यवर्ती को तब प्राथमिक अमाइन या अल्कोहल न्यूक्लियोफाइल के साथ प्रतिक्रिया की जा सकती है ताकि γ-फॉस्फेट में संशोधनों के साथ 5'-ट्राइफॉस्फेट प्राप्त किया जा सके। इन संशोधनों में फॉस्फोरामिडेट बॉन्ड द्वारा जुड़े लिपोफिलिक टैग के अलावा शामिल है, जो आरपी-एलसी द्वारा तेजी से ट्राइफॉस्फेट-विशिष्ट शुद्धिकरण की सुविधा प्रदान करता है, इसके बाद ट्राइफॉस्फेट33 से टैग का अम्लीय हाइड्रोलिसिस होता है। γ-फॉस्फेट स्थिति में फ्लोरोसेंट संशोधनों को राइबोजाइम-उत्प्रेरित बंधाव प्रतिक्रियाओं15,33 के लिए वास्तविक समय फ्लोरोसेंट संवाददाताओं के रूप में उपयोग के लिए भी पेश किया जा सकता है।

Disclosures

लेखकों ने घोषणा की है कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं हैं।

Acknowledgments

लेखक ग्रेग स्प्रिंगस्टीन, नताशा पॉल, चार्ल्स ओलिया, जूनियर, जोनाथन स्ज़ेपांस्की और कैटरीना झुंग के आभारी हैं, जो रासायनिक ट्राइफॉस्फोराइलेशन प्रतिक्रियाओं के लिए सर्वोत्तम प्रथाओं पर उपयोगी चर्चा के लिए और उपयोगी टिप्पणियों के लिए गेराल्ड जॉयस के लिए। इस काम को राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन से अनुदान एमसीबी 2114588 द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm polyethersulfone syringe filter MilliporeSigma SLMP025SS Syringe filter for removing crushed polyacrylamide gel particles (Section 5)
0.22 µm PTFE syringe filter MilliporeSigma SLLG013SL Syringe filter for removing CPG resin (Section 5)
1 mL plastic syringes ThermoFisher Scientific 14-823-434 (BD 309659) Components of triphosphorylation apparatus (sections 2–4)
1,4-Dioxane, anhydrous MilliporeSigma 296309 Triphosphorylation solvent (sections 2–4)
2-Chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one, Salicyl Phosphorochloridite (SalPCl) MilliporeSigma 324124 Triphosphorylation reagent (sections 2–4)
30 mL glass bottles MilliporeSigma 23232 Bottles for preparing triphosphorylation solvents and TBAP solution (section 2)
3-way Stopcock, polycarbonate/polypropylene Bio-Rad Laboratories 7328103 Component of triphosphorylation apparatus (sections 2–4)
40% acrylamide/bis-acrylamide solution, 19:1 Bio-Rad Laboratories 1610144 For PAGE (sections 5–7)
Acetonitrile, anhydrous, 100 mL Glen Research 40-4050-50 Triphosphorylation solvent (sections 2–4)
Ammonia-neutralizing Trap ThermoFisher Scientific ANT100 and ANS121 For use with Speedvac DNA130 (section 5)
Ammonium persulfate (APS) Bio-Rad Laboratories 1610700 For PAGE, catalyst for acrylamide polymerization (sections 5–7)
Aqueous ammonia, 28% MilliporeSigma 338818 For preparing AMA deprotection reagent (section 5)
Aqueous methylamine, 40% TCI America TCI-M0137 For preparing AMA deprotection reagent (section 5)
Automated DNA/RNA oligonucleotide synthesizer PerSeptive Biosystems Expedite 8909 DNA/RNA Synthesizer any column-based synthesizer is acceptable (section 1)
Bead-capture magnet ThermoFisher Scientific 12320D For streptavidin bead capture (section 7)
Bromophenol blue Bio-Rad Laboratories 1610404 For PAGE urea loading buffer (section 5)
Deep vacuum oil pump ThermoFisher Scientific VLP200-115 For use with lyophilizer (section 5)
Drierite dessicant, 10-20 mesh MilliporeSigma 737828 Desiccant for storing triphosphorylation chemicals and equipment (sections 1–2)
D-RNA 27.3t cross-chiral polymerase prepared in house18 5′-GGUGGUGGAC GUGAUCAUUA CGGAUCACUA ACUCGUCAGU GCAUUGAGAA GGAGAAUAAA AUGCACAUAG GUCGAAAGAC CUUAUACAAG AACUGUAUCA CCGGAGGGCG AGCACCACC-3′ For cross-chiral ribozyme reactions (section 7)
D-RNA CPG solid supports, 1,000Å, prepackaged 1 µmole synthesis columns Glen Research 20-3404-41E, 20-3415-41E, 20-3424-41E, 20-3430-41E representative, for D-RNA oligonucleotide synthesis (section 1)
D-RNA TOM-protected phosphoramidites ChemGenes ANP-3201, 3202, 3203, 3205 representative, for D-RNA oligonucleotide synthesis (section 1)
Empty Expedite Synthesis Columns, 1µm Glen Research 20-0021-01 Synthesis columns for use with Expedite DNA/RNA synthesizer (section 1)
EPPS, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(3-propanesulfonic acid), solid MilliporeSigma E1894 Ribozyme reaction buffer component (section 6)
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), solid MilliporeSigma EDS Divalent metal ion chelator for use in various buffers (sections 5–7)
Filters for Expedite synthesis columns Glen Research 20-0021-0F Expedite-style synthesis column filters, for use with empty synthesis columns (section 1)
Fluorescent/phosphorescent gel scanner Cytiva Amersham Typhoon RGB, 29187193 For visualizing analytical PAGE (sections 6–7)
Formamide, deionized VWR Life Science 97062 For PAGE formamide gel loading buffer (sections 6–7)
Gel image quantitation software Cytiva ImageQuant TL For quantifying scanned gel images (section 6)
Glass desiccator MilliporeSigma CLS3121150 Triphosphorylation solvent storage (section 2)
L-RNA CPG solid supports, 1,000Å, bulk ChemGenes N-4691-10, N-4692-10, N-4693-10, N-4694-10 L-RNA oligonucleotide synthesis (section 1)
L-RNA hammerhead template prepared in house18 5′-GCGCCUCAUC AGUCGAGCC-3′ For cross-chiral ribozyme reactions (section 7)
L-RNA primer prepared in house18 5′-fluorescein-GGCUCGA-3′ For cross-chiral ribozyme reactions (section 7)
L-RNA TOM-protected phosphoramidites ChemGenes OP ANP-5201, 5202, 5203, 5205 L-RNA oligonucleotide synthesis (section 1)
Lyophilizer/Freeze Dryer VirTis Benchtop K For concentrating oligonucleotides (section 5)
Magnesium Chloride Hexahydrate, solid MilliporeSigma M2670 For ribozyme reactions (sections 6–7)
N,N-Dimethylformamide, anhydrous MilliporeSigma 227056 Triphosphorylation solvent (section 2)
NAP-25 Desalting column (Sephadex G-25 resin) ThermoFisher Scientific 45000150 Disposable gravity-flow size exclusion chromatography columns containing Sephadex G-25 resin (section 5)
Non-coring stainless steel needle, 20 G ThermoFisher Scientific 14-815-410 Needles for piercing rubber septa (sections 2–4)
Oligonucleotide extinction coefficient calculator Integrated DNA Technologies OligoAnalyzer Tool Nearest-Neighbor Model Short Oligonucleotide 260nm extinction coefficient calculator (section 5)
Oxidizer solution, 0.1 M Iodine in THF/pyridine/water ChemGenes RN-1456 Triphosphorylation reagent (section 4)
PAGE plates Timberrock/CBS NGP-250-BO and NO For PAGE (sections 5–7)
PAGE power supply Bio-Rad Laboratories PowerPac HV 1645056 For PAGE (sections 5–7)
PAGE spacers and combs (analytical) Timberrock/CBS VGS-0725 and VGC-0714 For PAGE (sections 6–7)
PAGE spacers and combs (preparative) Timberrock/CBS VGS-3025R and VGC-3001 For PAGE (section 5)
PAGE stand Timberrock/CBS ASG-250 For PAGE (sections 5–7)
Parafilm M ThermoFisher Scientific 13-374-12 (Bemis PM999) Wax sealing film for triphosphorylation apparatus (sections 2–4)
PCR thermocycler Bio-Rad Laboratories C1000 Touch Thermalcycler For cross-chiral ribozyme reactions (section 7)
PD 10 Desalting column (Sephadex G-10 resin) MilliporeSigma GE17-0010-01 Disposable gravity-flow size exclusion chromatography columns containing Sephadex G-10 resin, for oligonucleotides < 15 nt (section 5)
Phosphor screens Cytiva 28956480 For visualizing 32P-labeled RNA (section 6)
Phosphoramidite synthesis reagents Glen Research 30-3142-52, 40-4050-53, 40-4012-52, 40-4122-52, 40-4132-52, 40-4060-62 representative, for standard RNA/DNA synthesis (section 1)
Polypropylene screw-cap sealable tube MilliporeSigma BR780752 1.5 mL microcentrifuge tubes with screw-cap and silicone O-ring, for safe AMA deprotection (section 5)
Pyridine, anhydrous MilliporeSigma 270970 Triphosphorylation solvent (section 2)
Reverse-phase liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometry (RP-LC/ESI-MS) Novatia n/a Commercial service for LC/MS specializing in oligonucleotides (section 5)
Rubber Septa (ID x OD 7.9 mm x 14 mm), white MilliporeSigma Z564702 Septa for preparing triphosphorylation solvents and TBAP (section 2)
Self-replicator ribozyme E prepared in house14 5′-GGAAGUUGUG CUCGAUUGUU ACGUAAGUAA CAGUUUGAAU GGUUGAAGUA UGAGACCGCA ACUUA-3′ For self-replicator ribozyme reactions (section 6)
Self-replicator substrate A prepared in house14 5′-32P-GGAAGUUGUG CUCGAUUGUU ACGUAAGUAA CAGUUUGAAU GGUUGAAGUA U-3′-OH For self-replicator ribozyme reactions (section 6)
Self-replicator substrate B, transcribed prepared in house14 5′-pppGAGACCGCAA CUUA-3′ For self-replicator ribozyme reactions (section 6)
Small Drying Traps, 4 Å molecular sieves ChemGenes DMT-1975 Drying traps for DNA/RNA synthesizer phosphoramidites and triphosphorylation reagents (sections 1–2)
Sodium Chloride (NaCl), solid MilliporeSigma S7653 Salt for use in various buffers (sections 5–7)
Sodium Hydroxide (NaOH), solid MilliporeSigma S8045 Salt for use in various buffers (sections 5–7)
Statistical data-fitting software GraphPad Prism For fitting data from analytical PAGE to kinetic models (section 6)
Streptavidin-coated magnetic beads ThermoFisher Scientific 65002 For capturing biotin-labeled RNA in cross-chiral ribozyme reactions (section 7)
Sucrose MilliporeSigma 84097 For PAGE urea loading buffer (section 5)
TBE running buffer, 10x ThermoFisher Scientific AAJ62788K3 For PAGE (sections 5–7)
Tetrabutylammonium Fluoride, 1.0 M solution in Tetrahydrofuran Aldrich 216143 For removing 2′-silyl protecting groups (section 5)
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-Rad Laboratories 1610801 For polymerizing acrylamide for PAGE (sections 5–7)
Tributylamine MilliporeSigma 90781 Triphosphorylation reagent (section 2)
Tributylammonium pyrophosphate (TBAP) MilliporeSigma P8533 Triphosphorylation reagent (section 2)
Tris base MilliporeSigma T6666 Buffering agent for use in various buffers (sections 5–7)
TWEEN20 polysorbate detergent MilliporeSigma P7949 Neutral detergent for use with magnetic beads (Section 7)
Urea MilliporeSigma U5378 For PAGE and gel loading buffer (sections 5–7)
UV-Vis spectrophotometer ThermoFisher Scientific NanoDrop 2000, ND2000 For measuring oligonucleotide concentrations (section 5)
Vacuum centrifuge ThermoFisher Scientific Savant Speedvac DNA130-115 Vacuum Concentrator For removing AMA and THF (section 5)
Xylene cyanol Bio-Rad Laboratories 1610423 For PAGE urea loading buffer (section 5)

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 184
ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स का रासायनिक ट्राइफॉस्फोराइलेशन
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Bare, G. A. L., Horning, D. P.… More

Bare, G. A. L., Horning, D. P. Chemical Triphosphorylation of Oligonucleotides. J. Vis. Exp. (184), e63877, doi:10.3791/63877 (2022).

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