Summary
I nematodi entomopatogeni vivono in simbiosi con i batteri e insieme infettano con successo gli insetti minando il loro sistema immunitario innato. Per promuovere la ricerca sulle basi genetiche dell'infezione da nematodi, vengono descritti metodi per il mantenimento e la manipolazione genetica dei nematodi entomopatogeni.
Abstract
I nematodi entomopatogeni nei generi Heterorhabditis e Steinernema sono parassiti obbligati di insetti che vivono nel terreno. La caratteristica principale del loro ciclo vitale è l'associazione mutualistica con i batteri Photorhabdus e Xenorhabdus, rispettivamente. I parassiti nematodi sono in grado di localizzare ed entrare in ospiti di insetti adatti, sovvertire la risposta immunitaria degli insetti e moltiplicarsi in modo efficiente per produrre la prossima generazione che caccia attivamente nuove prede di insetti da infettare. A causa delle proprietà del loro ciclo vitale, i nematodi entomopatogeni sono popolari agenti di controllo biologico, che vengono utilizzati in combinazione con insetticidi per controllare i parassiti distruttivi degli insetti agricoli. Allo stesso tempo, questi nematodi parassiti rappresentano uno strumento di ricerca per analizzare la patogenicità dei nematodi e le risposte anti-nematodi dell'ospite. Questa ricerca è aiutata dal recente sviluppo di tecniche genetiche e approcci trascrittomici per comprendere il ruolo delle molecole secrete dai nematodi durante l'infezione. Qui, viene fornito un protocollo dettagliato sul mantenimento dei nematodi entomopatogeni e sull'utilizzo di una procedura di abbattimento genico. Queste metodologie promuovono ulteriormente la caratterizzazione funzionale dei fattori di infezione da nematodi entomopatogeni.
Introduction
La ricerca sui nematodi entomopatogeni (EPN) si è intensificata negli ultimi anni principalmente a causa dell'utilità di questi parassiti nelle strategie di gestione integrata dei parassiti e del loro coinvolgimento nella ricerca biomedica di base 1,2. Recenti studi hanno stabilito l'EPN come organismi modello in cui esaminare le componenti genetiche dei nematodi che vengono attivate durante le diverse fasi del processo di infezione. Queste informazioni forniscono indizi critici sulla natura e il numero di molecole secrete dai parassiti per alterare la fisiologia dell'ospite e destabilizzare la risposta immunitaria innata dell'insetto 3,4. Allo stesso tempo, questa conoscenza è comunemente integrata da nuovi dettagli sul tipo di vie di segnalazione immunitaria dell'ospite insetto e sulle funzioni che regolano per limitare l'ingresso e la diffusione dei patogeni 5,6. Comprendere questi processi è fondamentale per immaginare entrambi i lati dell'interazione dinamica tra EPN e i loro ospiti di insetti. Un migliore apprezzamento della relazione EPN-insetto ospite faciliterà senza dubbio studi simili con i nematodi parassiti dei mammiferi, che possono portare all'identificazione e alla caratterizzazione dei fattori di infezione che interferiscono con il sistema immunitario umano.
I nematodi EPN Heterorhabditis sp. e Steinernema sp. possono infettare una vasta gamma di insetti e la loro biologia è stata intensamente studiata in precedenza. I due parassiti nematodi differiscono nella loro modalità di riproduzione con Heterorhabditis autofecondata e Steinernema sottoposto a riproduzione anfimitica, anche se recentemente S. hermaphroditum ha dimostrato di riprodursi per autofecondazione di ermafroditi o attraverso la partenogenesi 7,8,9. Un'altra differenza tra Heterorhabditis e Steinernema nematodes è il loro mutualismo simbiotico con due generi distinti di batteri Gram-negativi, rispettivamente Photorhabdus e Xenorhabdus, che sono entrambi potenti patogeni degli insetti. Questi batteri si trovano nello stadio giovanile infettivo (IJ) a vita libera e non alimentare dell'EPN, che rileva gli ospiti sensibili, ottiene l'accesso all'emocoel degli insetti dove rilasciano i loro batteri associati che si replicano rapidamente e colonizzano i tessuti degli insetti. Sia l'EPN che i loro batteri producono fattori di virulenza che disarmano le difese degli insetti e compromettono l'omeostasi. Dopo la morte degli insetti, gli IJ nematodi si sviluppano per diventare EPN adulti e completare il loro ciclo di vita. Una nuova coorte di IJ formata in risposta alla privazione di cibo e al sovraffollamento all'interno del cadavere degli insetti emerge finalmente nel terreno per cacciare ospiti adatti 9,10,11,12.
Qui viene descritto un protocollo efficiente per mantenere, amplificare e manipolare geneticamente i nematodi EPN. In particolare, il protocollo delinea la replicazione di H. bacteriophora simbiotici e S. carpocapsae IJ, la generazione di IJ di nematodi axenici, la produzione di Ermafroditi H. bacteriophora per la microiniezione, la preparazione del dsRNA e la tecnica di microiniezione. Questi metodi sono essenziali per comprendere le basi molecolari della patogenicità dei nematodi e dell'immunità anti-nematodi dell'ospite.
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Protocol
1. Produzione di giovani infettivi di nematodi simbiotici
- Coprire una capsula di Petri (10 cm) con un pezzo di carta da filtro e aggiungere circa 10-15 larve di Galleria mellonella (Figura 1A).
- Utilizzando una pipetta, erogare 2 mL di acqua contenente circa 25-50 IJ per sospensione da 10 μL sui vermi della cera. Conservare la capsula di Petri in un armadietto a temperatura ambiente.
- A seconda dell'umidità della carta da filtro, aggiungere 1-2 ml di acqua ogni 2 giorni. I vermi di cera infetti da IJ normalmente muoiono entro 48 ore.
- Preparare le trappole d'acqua di White circa 10 giorni dopo che i vermi della cera sono stati infettati dagli IJ8 (Figura 1B, C). Trasferire con cura gli insetti morti sulla parte non imbevuta della carta da filtro. Utilizzare l'acqua del rubinetto per riempire la capsula di Petri inferiore e posizionare un tappo di un tubo da 15 ml come distanziatore per la ventilazione.
- Trasferire con cura i vermi di cera morbidi e fragili sollevandoli lentamente dalla carta da filtro utilizzando un paio di pinze di plastica. Utilizzare l'acqua del rubinetto invece dell'acqua demineralizzata o deionizzata. Questi ultimi causano l'aggregazione dei nematodi.
- Assicurarsi che il livello dell'acqua nella trappola dell'acqua raggiunga circa la metà dell'altezza della capsula di Petri. Aspettatevi che il livello dell'acqua cambi nel tempo a seconda delle condizioni di temperatura e umidità nella stanza.
- Quando l'acqua nella piccola capsula di Petri diventa torbida a causa della presenza di nematodi, utilizzare una pipetta per spostare la nuova generazione di IJ in un pallone di coltura cellulare T25 o T75.
- Aggiungere acqua di rubinetto fino a circa il 40% del volume fino a raggiungere la densità appropriata (Figura 1C). Evitare la congestione dei nematodi e conservare i palloni di coltura cellulare orizzontalmente.
- Aggiungere più acqua alla capsula di Petri inferiore e ripetere i passaggi 1.6 e 1.7 fino a quando gli IJ smettono di emergere dalle carcasse degli insetti in circa 3-5 giorni.
2. Produzione di giovani infettivi al nematode axenico
NOTA: I nematodi axenici sono usati perché dopo che il complesso nematode-batteri si dissocia all'interno dell'insetto, ogni partner mutualistico suscita una risposta immunitaria dell'ospite distinta5. Il ceppo mutante Ret16 di Photorhabdus temperata viene utilizzato perché questi batteri supportano la crescita di H. bacteriophora ma non riescono a colonizzare l'intestino dei nematodi13,14.
- Heterorhabditis bacteriophora giovani infettivi
- Usando una punta sterile della pipetta o una spatola, raschiare diversi fiocchi di una coltura congelata di P. temperata Ret16 su una piastra MacConkey e una striscia per singole colonie. Incubare la piastra per 2-3 giorni a 28 °C.
- Inoculare 10 mL di brodo LB con una colonia in un tubo da 50 mL e incubare la coltura durante la notte a 28 °C in un incubatore vibrante. Usa solo le colonie di fase primaria che sono rosse su MacConkey agar. Le colonie di fase secondaria saranno bianco sporco su MacConkey agar.
- Lavare 100 μL di coltura notturna con 900 μL di 1x PBS centrifugando in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL a 17.900 x g. Decantare il surnatante. Diluire la coltura 10x in 1x PBS. Lasciare il tubo sul ghiaccio.
- Immergere i vermi della cera in una soluzione di etanolo al 70%, asciugare gli insetti con un tovagliolo di carta e metterli in un tubo da 50 ml.
- Posizionare il tubo sul ghiaccio per 20 minuti per immobilizzare i vermi della cera.
- Utilizzare una carta da filtro per coprire la metà superiore e inferiore di una capsula di Petri (10 cm). Utilizzare il coperchio della capsula di Petri coperto con carta da filtro come supporto di base per l'iniezione. Inumidire la carta da filtro della capsula di Petri inferiore e trasferirla sul ghiaccio per aiutare i vermi di cera iniettati a recuperare.
- Pipettare 50 μL di batteri ghiacciati su un pezzo di parafilm e preparare la siringa ad ago da 22 G. Premere delicatamente lo stantuffo per rimuovere l'aria sulla punta dell'ago.
- Tenere un verme di cera vicino all'estremità posteriore sotto lo stereoscopio (Figura 2).
- Iniettare 50 μL della coltura batterica nel lato dorsale del torace, preferibilmente alla giunzione tra due segmenti. Per ridurre al minimo i danni interni, iniettare appena sotto la cuticola, il più parallelamente possibile al verme della cera. È naturale che una goccia di emolinfa sanguini quando il verme della cera viene perforato
- Trasferire gli insetti iniettati nella capsula di Petri di recupero.
- Ripetere i passaggi 2.1.7-2.1.9 fino a quando tutti gli insetti non vengono iniettati con i batteri. Per anestetizzare gli insetti, metterli sul ghiaccio per 5 minuti.
- Posizionare la capsula di Petri al buio (ad esempio, cassetto o armadio) e aggiungere acqua di rubinetto alla carta da filtro se appare asciutta. I vermi di cera soccomberanno 2 giorni dopo l'iniezione e appariranno rosso mattone dopo circa 3-4 giorni. Se gli insetti appaiono marroni, l'infezione batterica non ha avuto successo.
- A 7 giorni dall'infezione, trasferire gli insetti con il caratteristico colore rosso mattone su una capsula di Petri fresca rivestita di carta da filtro e continuare con "Produzione di giovani infettivi di nematodi simbiotici" dal passaggio 1. Se si utilizzano nematodi simbiotici, ripetere la procedura dal passaggio 2.1. utilizzando gli IJ di nuova produzione del primo turno.
- Sterilizzante superficiale H. bacteriophora IJs
- Raccogliere un numero sufficiente di H. bacteriophora simbiotici e IJ axenici candidati mediante centrifugazione per produrre un pellet da 100 μL in un tubo centrifugo da 1,5 mL.
- Aggiungere 500 μL di candeggina al 5% al pellet in ogni tubo microcentrifuga e invertire. Incubare per 10 min. Centrifuga a 17.900 x g per 1 min. Rimuovere il surnatante.
- Lavare il pellet con 1 mL di acqua sterile e ripetere la centrifugazione. Rimuovere il surnatante. Ripetere questo passaggio altre quattro volte.
- Verifica dell'axenicità
- Pipettare 400 μL di acqua sterile ai nematodi H. bacteriophora simbiotici e candidate-axenic lavate.
- Posizionare i nematodi sopra gli insetti nella capsula di Petri ed etichettare i trattamenti di conseguenza.
- Posizionare le piastre di Petri con gli insetti infetti al buio e controllare periodicamente se i vermi della cera diventano rossi.
NOTA: I vermi della cera infettati da nematodi simbiotici H. batteriophora diventeranno rossi entro 2 giorni dall'infezione. Lo scolorimento del waxworm è dovuto alla secrezione di vari composti prodotti dai batteri mutualistici Photorhabdus durante il processo di infezione. La mancanza di colore rosso nei vermi della cera infetti 4 giorni dopo l'infezione conferma che l'H. bacteriophora è axenico. Questo perché i batteri P. temperata Ret16 non sono presenti nell'intestino dei nematodi.
- Metodo alternativo per la verifica dell'axenicità
- Sterilizzare in superficie gli IJ simbiotici H. batteriofora e gli IJ H. batteriofora candidati-axenici come descritto al punto 2.1.14.
- Omogeneizzare circa 500 IJ in 500 μL di PBS sterile 1x in tubi di microfuga utilizzando pestelli sterili. Abbassare l'omogeneizzato, decantare il surnatante e distribuirlo sull'agar LB. Incubare le piastre a 28 °C per 24 ore.
- Contare le unità formanti colonie (CFU) per ogni piastra. I campioni di H. bacteriophora ascinico non formeranno colonie dei batteri simbiotici P. luminescens .
- Steinernema carpocapsae Giovani infettivi
- Preparazione di piastre lipidiche di agar (300 mL di soluzione produce circa 20 piastre divise)
- Pesare 2,4 g di brodo nutriente, 4,5 g di estratto di lievito e 1,5 g di agar e aggiungerli a 267 ml di acqua deionizzata. Autoclave la soluzione.
- Aggiungere 3 mL di 1 M MgCl2, 1,2 mL di olio di mais e 28,8 mL di sciroppo di mais al 7%.
- Preparare e aggiungere alla soluzione 300 μL di kanamicina da 30 mg/mL e 300 μL da 50 mg/mL di ampicillina (sterilizzata con filtro da 0,2 μm).
- Decantare il mix su una metà di una piastra di Petri divisa/ piastra divisa.
- Preparazione del prato batterico X. nematophila (ceppo ΔrpoS)
- Coltura X. nematophila (Xn) ΔrpoS direttamente da un stock batterico congelato in 2 mL di soluzione LB/kan/amp su uno shaker a 30 °C durante la notte.
- Inoculare 5 mL di terreno LB contenente 30 μg/mL di kanamicina e 50 μg/mL di ampicillina con 250 μL di coltura notturna e far crescere i batteri durante la notte su uno shaker.
NOTA: I batteri Xn non crescono bene se striati direttamente sul mezzo di agar lipidico di selezione da un brodo congelato. Se necessario, la fase Xn primaria e secondaria può essere confermata in primo luogo su terreni NBTA (agar nutriente integrato con 25 mg di bromotimolo blu l-1 e 40 mg di trifeniltetrazolio cloruro l-1) prima di iniziare una nuova coltura liquida. - Pipetta 100 μL della coltura sulle piastre lipidiche di agar e spalmabile su tutta la piastra con un anello inoculante sterile. Incubare le piastre per 24 ore a 30 °C.
- S. carpocapsae IJ sterilizzante in superficie
- Lasciare un pallone contenente IJ ad un angolo tale che gli IJ affondino in un angolo del pallone. Aspirare 1 mL degli IJ depositati in un tubo di microcentrifuga. Centrifuga a 17.900 x g per 10 s. Rimuovere il surnatante.
- Aggiungere 1 mL di soluzione di candeggina appena preparata all'1%. Invertire i tubi per mescolare accuratamente. Incubare per 1 minuto (l'incubazione prolungata di candeggina porterà alla morte di IJ). Girare di nuovo per 10 s. Rimuovere il surnatante.
- Per rimuovere i residui di candeggina, lavare i nematodi con 1 mL di acqua distillata sterile e centrifugare per 10 s. Rimuovere il surnatante. Ripeti il lavaggio altre quattro volte.
- Stimare la conta IJ per mL contando 10-20 μL degli IJ lavati sotto lo stereoscopio e regolare di conseguenza la concentrazione degli IJ.
- Allevamento di S. carpocapsae IJs
- Trasferire con una pipetta circa 1000 IJ sulle piastre lipidiche agar split (Figura 3, immagine a sinistra). Posizionare le piastre in un armadio o cassetto umidificato. Utilizzare asciugamani di carta umidi per aumentare l'umidità. Mantenere le piastre a temperatura ambiente (22-25 °C).
- Controlla gli asciugamani di carta a giorni alterni per assicurarti che rimangano umidi. Se necessario, aggiungere acqua a giorni alterni agli asciugamani di carta per mantenere l'umidità nell'armadio o nel cassetto. In alternativa, posizionare un bagno d'acqua sul fondo dell'armadio per aumentare l'umidità.
- Quando appaiono solo IJ, aggiungere acqua dall'altra parte della piastra e posizionare uno strato di carta da filtro al centro della piastra (trappola per l'acqua, Figura 3, immagine a destra). Raccogliere quest'acqua contenente i primi IJ rotondi in un pallone di coltura cellulare T75. Questi sono i nematodi Round I S. carpocapsae .
- Sterilizzare nuovamente in superficie con candeggina (punto 2.2.3) e ripetere il processo dal punto 2.2 utilizzando i nematodi S. carpocapsae del Round 1. Il risultato sarà round 2 S. carpocapsae nematodi.
- Controllare sotto uno stereoscopio ogni pochi giorni per monitorare lo sviluppo dei nematodi.
- Verifica dello stato axenico degli IJ di S. carpocapsae
- Sterilizzare in superficie gli IJ Round 1, Round 2 e simbiotici S. carpocapsae con candeggina come descritto al punto 2.2.3.
- Omogeneizzare circa 400-700 IJ in tubi di microfuga utilizzando pestelli di plastica sterili. Centrifugare l'omogeneizzato, decantare il surnatante e distribuire la soluzione su piastre di agar LB. Tenere le piastre di agar in un'incubatrice a 28 °C per 24 ore.
- Contare la formazione di CFU per ogni piastra. I campioni di nematodi astonici non produrranno alcuna crescita batterica.
- Verifica dello stato axenico degli IJ di S. carpocapsae mediante PCR
- Sterilizzare in superficie gli IJ Round 1, Round 2 e simbiotici S. carpocapsae con candeggina come descritto al punto 2.2.3.
- Estrarre il DNA dall'omogeneizzato. Una procedura di estrazione dettagliata è descritta al punto 4.1.2 di seguito.
- Condurre la PCR utilizzando i primer XptA2 con temperatura di ricottura 61 °C:
XptA · F: 5′-GCCTGGAAAGAGTGGACGAA-3′.
XptA · R: 5′-GTAAGACCAAGGGGCACTCC-3′.
NOTA: Questi primer amplificano il gene insetticida XptA2 di X. nematophila, producendo un amplicon di dimensioni 231 bp. Il programma di ciclismo era il seguente: 95 °C per 2 min, 34 cicli di 95 °C per 30 s, temperatura di ricottura di 61 °C per 1 min e 73 °C per 1 min seguita da 72 °C per 10 min. - Visualizza i frammenti amplificati per separazione in un gel di agarosio all'1,5%. I campioni axenici sterilizzati in superficie non formeranno alcuna fascia.
- Preparazione di piastre lipidiche di agar (300 mL di soluzione produce circa 20 piastre divise)
3. Allevamento di Ermafroditi di H. batteriofora per microiniezione
- Preparare piatti di Petri da 6 cm con NA+chol (1,5x Brodo nutriente, 1,5% di agar e 10 μg/mL di colesterolo).
- Preparare 3 mL di soluzione di PP3 (2% Protease Peptone #3, PP3) in un tubo di coltura da 10 mL.
- Utilizzare una punta sterile da 20 μL per raschiare la parte superiore del brodo di glicerolo P. luminescens (25% vol/vol glicerolo sterile) mantenuto a -80 °C e lasciarlo cadere nel tubo di coltura.
- Incubare il tubo durante la notte in uno shaker a temperatura controllata impostato a 28 °C, 200 giri/min.
- Il giorno seguente, la cultura sarà di colore rosso chiaro. Placcare 50 μL della coltura su una capsula di Petri NA+chol da 6 cm e distribuirla utilizzando uno spargitore batterico in modo circolare.
- Posizionare le piastre in un'incubatrice a 28 °C. Il prato P. luminescens sarà pronto in 24-36 h e apparirà di colore rosso chiaro.
- Inoculare la piastra con 50-100 IJ sterilizzati in superficie e mantenere la piastra a 28 °C.
- L'ermafrodito sano inizierà a comparire circa 48-54 ore dopo l'inoculazione. Sani, non affamati tardi L4 H. batteriofora ermafroditi sono necessari per l'iniezione.
4. Preparazione del dsRNA
- Design del primer
- Progettare primer per dsRNA per colpire ~ 500 regioni di esoni a coppia di basi del DNA di H. bacteriophora .
- I primer per le regioni di interesse possono essere determinati utilizzando Primer3 (https://primer3.ut.ee) o un programma simile, selezionando una lunghezza ottimale del prodotto di 500 coppie di basi, Tm di 60 °C e lunghezza del primer di 22 nucleotidi.
- Aggiungere un sito T7 (TAATACGACTCACTATAGGG) alle estremità 5′ di ciascun primer in avanti per consentire la trascrizione in vitro.
- Progettare primer per dsRNA per colpire ~ 500 regioni di esoni a coppia di basi del DNA di H. bacteriophora .
- Isolamento del DNA genomico
- Utilizzare DNA genomico isolato da pellet congelati di ~ 50.000 H. batteriofora IJ per la sintesi di dsRNA.
- Utilizzare un pellet IJ risospeso in 50 μL di tampone di lisi (50 mM KCl, 0,05% (p/v) gelatina, 10 mM Tris-HCl pH 8,2, 0,45% Tween 20, 60 μg/mL Proteinasi K, 2,5 mM MgCl2) posto a -80 °C per almeno 30 min.
- Omogeneizzare il pellet con un piccolo pestello a tubo.
- Riscaldare la soluzione a temperatura ambiente e incubare a 60 °C per 2 ore, vorticando ogni 15 min.
- Denaturare la Proteinasi K incubando il tessuto omogeneizzato per 15 min a 95 °C.
- Raffreddare il campione a 4 °C e centrifugare a 3.400 x g per 1 minuto.
- Utilizzare il surnatante risultante come modello per la successiva PCR.
- Impostare una reazione PCR da 50 μL utilizzando un mastermix commerciale con 200 ng di DNA modello, 0,2 μM di primer avanti e indietro e le condizioni di ciclo suggerite dal produttore.
- Analizzare la reazione PCR su un gel di agarosio all'1,2% per verificare che le reazioni abbiano prodotto singole bande della dimensione prevista.
- Sintesi del dsRNA
- Utilizzare un kit di trascrizione commerciale.
- Utilizzare una reazione PCR da 5 μL per la trascrizione in vitro. Seguire le istruzioni del produttore.
- Incubare la reazione per 16 ore a 37 °C.
- Pulire le reazioni di trascrizione in vitro con un kit commerciale utilizzando la precipitazione di acetato di ammonio/etanolo per concentrare il dsRNA.
- Sospendere il dsRNA pellettato in 10 μL di acqua priva di RNasi.
- Quantificare l'RNA utilizzando uno spettrofotometro.
- Valutare la qualità separando il dsRNA su un gel di agarosio all'1,2%
5. Microiniezione
NOTA: Un tampone per iniezione è un coperchio di vetro con uno strato di agarosio al 2% (p / v) al centro. Quando i vermi da iniettare vengono trasferiti a questi cuscinetti, lo strato di agarosio li immobilizzerà per la procedura. Normalmente, i cuscinetti extra sono tenuti vicino al microscopio per uso generale.
- Preparazione della piastra di iniezione
- Far bollire il 2% di agarosio in acqua aggiungendo 0,2 g di agarosio a 10 ml di acqua.
- Posizionare 1-4 gocce (~50 μL) al centro di una slitta di vetro sottile 50 mm x 70 mm.
- Usa un altro coverslip per appiattire la goccia.
- Lasciare asciugare il coverslip per 2-3 minuti prima di far scorrere il coverslip lateralmente.
- Contrassegnare con una 'R' il lato destro della coverslip rivolta verso l'alto.
- Lasciare asciugare le diapositive a temperatura ambiente per 1 giorno prima di utilizzarle.
- Preparazione degli aghi per iniezione
- Utilizzare capillari di vetro da 1,0 mm contenenti un filamento fine interno. Ciò consente un riempimento efficiente dell'ago.
NOTA: è possibile utilizzare qualsiasi estrattore di aghi commerciale (ad esempio, Narishige PB-7). - Accendere l'estrattore dell'ago.
- Assicurarsi che il riscaldatore sia impostato su max e che il solenoide sia impostato su 8,40 per garantire la nitidezza dell'ago richiesta e la lunghezza corretta.
- Inserire il tubo capillare nella cresta della manopola superiore attraverso il filamento e stringere la manopola superiore. La parte superiore del tubo capillare sarà a livello con la parte superiore dell'estrattore dell'ago e il filamento riscaldante sarà al centro del capillare.
- Spostare l'unità inferiore verso l'alto e quindi stringere la manopola inferiore. Assicurarsi che il capillare sia posizionato in modo sicuro.
- Chiudere il coperchio dell'estrattore dell'ago e premere start. La luce verde si accenderà. Dopo alcuni minuti il capillare verrà riscaldato e smontato per separarsi in due metà.
NOTA: I due aghi separati non sono della stessa lunghezza, ma possono essere entrambi utilizzati per le iniezioni. Sono preferiti punti dell'ago più lunghi. - Disporre gli aghi in posizione verticale con i loro punti verso il basso usando un pezzo di argilla modellante. In alternativa, conservare gli aghi in una capsula di Petri tenuta in posizione da due strisce di argilla modellante.
- Utilizzare capillari di vetro da 1,0 mm contenenti un filamento fine interno. Ciò consente un riempimento efficiente dell'ago.
- Caricamento dell'ago
NOTA: La soluzione di acido nucleico deve essere centrifugata per almeno 10 minuti a 20.784 x g per pellettizzare le impurità che possono essere presenti nella sospensione. La centrifugazione delle impurità impedisce loro di bloccare il flusso dell'ago per iniezione.- Utilizzare uno dei due metodi per caricare gli acidi nucleici negli aghi.
- Metodo 1
- Utilizzare una pipetta per trasferire circa 0,5 μL del campione di DNA centrifugato all'estremità non aspirata dell'ago per iniezione. Questo apparirà come una piccola goccia di liquido seduto sopra il tubo capillare.
- Attendere da 5 a 7 minuti per consentire al campione liquido di occupare l'estremità dell'ago. Il prodotto finale sarà un ago pieno senza bolle d'aria presenti.
- Utilizzare un microscopio di dissezione per confermare la presenza di soluzione nella punta dell'ago prima dell'iniezione.
- Metodo 2
- Utilizzare punte di caricamento per il microiniettore.
- Utilizzando questa punta di carico, pipettare 5 μL della soluzione di acido nucleico.
- Mentre l'ago tirato si trova sull'estrattore dell'ago, allentare la manopola superiore, spostare leggermente l'ago tirato verso l'alto e restringere la manopola.
- Inserire con attenzione la punta del caricatore nel tubo capillare ed estenderlo sul fondo dell'ago per iniezione.
- Pipettare la soluzione di acido nucleico nell'ago per iniezione.
- Rimuovere il caricatore dall'ago tirato e tenerlo separato per ulteriori carichi, se necessario. Assicurarsi di cambiare i caricatori quando si carica una miscela di acidi nucleici diversa.
- Preparazione del microscopio a iniezione
NOTA: un microscopio invertito con illuminazione diffusa dalla base del microscopio viene utilizzato per la preparazione del verme, la microiniezione e il recupero. Viene descritto l'uso di un microscopio invertito ad alta risoluzione con obiettivi 10x e 40x. Il microscopio è dotato di un manipolatore di aghi che trattiene l'ago e lo porta in posizione per l'iniezione. L'olio per microiniezione viene utilizzato per impedire la rapida disidratazione del verme mentre si trova sullo strato di agarosio della piastra di iniezione. L'olio consigliato da utilizzare è Halocarbon Oil 700.- Accendi la lampada e calibra la luminosità con il pannello di controllo.
- Controllare il numero sul prisma Wollaston del condensatore; corrisponderà all'obiettivo utilizzato (40x).
- Verificare che la torretta DIC, contrassegnata da "DIC", sia nella posizione giusta.
- Assicurarsi che la manopola dell'obiettivo sia impostata su zero (0).
- Girare l'anello Ph a destra fino alla fine.
- Regolare il polarizzatore in modo che la freccia sia in posizione orizzontale.
- Metti un pezzo di carta sul palco per osservare il punto focale (luce).
- Chiudere il diaframma del campo al punto che c'è un punto sulla carta.
- Usa il quadrante a sinistra per spostare il condensatore su e giù fino al punto in cui si vede un punto luce molto nitido sulla carta del pezzo.
- Aprire lentamente il diaframma di campo fino al punto in cui è visibile un piccolo cerchio di luce.
- Togliere il pezzo di carta.
- Assicurati che il punto luce sia al centro dell'obiettivo. Altrimenti, allineare il punto luce con il centro dell'obiettivo regolando le viti d'argento sulla parte superiore del condensatore.
- Aprire completamente il diaframma di campo.
- Verificare che l'analizzatore ICT/P sia inserito.
- Montaggio dell'ago per iniezione sul microscopio
- Accendere il flusso di azoto gassoso all'ago di microiniezione. La pressione del gas sull'ago sarà di circa 20 psi.
- Controllare che le manopole del micromanipolatore (la parte del microscopio che muove l'ago) siano posizionate al centro, il che consente la più ampia gamma di movimento quando l'ago è montato.
- Svitare il gruppo che contiene l'asta metallica per rimuoverlo dal supporto dell'ago.
- Inserire il nuovo ago nella parte superiore del microscopio; quindi installare la guarnizione in gomma per mantenere l'ago in posizione.
- Fissare la parte inferiore del supporto dell'ago adattandola all'assemblaggio.
- Mettere l'ago nella scanalatura del micromanipolatore e avvitarlo correttamente per mantenerlo stabile. Assicurarsi che la vite sia a circa 1 pollice dall'estremità del micromanipolatore.
- Posizionare la punta dell'ago al centro del campo visivo con un angolo di circa 45° rispetto alla piastra del palco, utilizzando le manopole e i comandi grossolani del micromanipolatore. È fondamentale lasciare la punta dell'ago abbastanza in alto in modo che non si rompa per caso.
- Rompere gli aghi
- Posizionare l'ago nel micromanipolatore dove la punta dell'ago si rompe normalmente per consentire alla soluzione di acido nucleico di fluire attraverso di essa.
- Rompere un capillare e posizionarlo sopra un vetrino che trasporta una goccia di olio per microiniezione.
- Posizionare il vetrino sul microscopio e mettere a fuoco.
- Portare la punta dell'ago allo stesso livello del lato del capillare usando i controlli fini del microscopio (Figura 4).
- Accendere brevemente il flusso di azoto utilizzando l'attuatore del piede per confermare che la punta dell'ago non sia rotta. Un rapido on-off sarà sufficiente.
- Muovi delicatamente l'ago in modo che tocchi a malapena il lato del capillare.
- Toccare leggermente il lato del microscopio per rompere la punta dell'ago.
- Rimuovere l'ago dal capillare e attivare il flusso di azoto per verificare che l'ago sia rotto correttamente.
- L'ago creerà una piccola goccia di iniezione circa cinque volte più grande della punta dell'ago (Figura 4). Se la goccia di iniezione è di dimensioni più piccole, rompere ulteriormente la punta. Se la goccia di iniezione è di dimensioni maggiori, provare a utilizzare un ago fresco.
6. Microiniezione
- Pipettare una goccia di olio per microiniezione su un tampone per iniezione.
- Immergere un plettro sterilizzato a fiamma nella goccia di olio per microiniezione e raccogliere un giovane H. batteriofora nematode adulto dal piatto.
- Scegli i nematodi da parti della piastra che non sono vicine al prato batterico per impedire il trasferimento di un numero elevato di cellule batteriche al tampone di iniezione. Inoltre, raccogli un nematode con gonadi ben formate.
- Spostare i nematodi sul tampone di iniezione e posizionarli verticalmente in modo che le gonadi siano rivolte verso l'ago. Assicurarsi che la vulva punti nella stessa direzione dell'ago per iniezione e che i due bracci gonadi distali siano nella direzione opposta e contro la parete del corpo del nematode.
NOTA: Come Pristionchus pacificus, la gonade di H. bacteriophora migra dorsalmente dalla posizione vulvare ventrale e poi migra di nuovo intorno alla posizione ventrale. - Controllare che la quantità di olio sia sufficiente per prevenire l'essiccazione dei nematodi senza permettere al nematode di vagare.
- Metti a fuoco il nematode con l'obiettivo 10x tenendo l'ago ben al di sopra del vetrino. Nell'olio, le gonadi dei nematodi sono viste come due regioni chiare vicine all'anteriore e posteriore del verme. Assicurarsi che le gonadi siano a fuoco e non le altre parti del worm.
- Disporre il nematode con un angolo da 15° a 45° rispetto all'ago per iniezione, che darà più spazio all'ago all'interno della gonade. Inoltre, questo approccio impedisce all'ago di passare attraverso l'intero corpo del nematode quando l'ago viene introdotto all'interno della gonade.
- Posizionare l'ago per iniezione e il nematode allo stesso livello abbassando gradualmente l'ago fino a quando non viene messo a fuoco (Figura 5). Assicurarsi che quando l'ago viene abbassato, rimanga vicino al nematode e non sopra il verme.
- Usa l'obiettivo 40x per concentrarti sul braccio gonad sinciziale del nematode.
- Spostare l'ago su e giù usando il regolatore fine fino a quando la punta è a fuoco insieme al braccio gondico sinciziale del nematode.
- Spostare lentamente il nematode verso l'ago usando lo stadio di scorrimento. Quindi spingere delicatamente la gonade in posizione con l'ago contro la parete del corpo del nematode, che si tradurrà in un'efficiente penetrazione dell'ago all'interno del corpo del nematode.
- Calpestare brevemente l'attuatore del piede per avviare il flusso della soluzione di acido nucleico. Un rapido on-off è sufficiente. Se l'ago è all'interno della gonade, la gonade si riempirà con la soluzione e si gonfierà.
- Una volta che l'ago è assicurato nella posizione corretta, riempire la gonade con la soluzione di acido nucleico fino a quando le braccia della gonade non sono riempite. È importante evitare l'espulsione del liquido dal verme attraverso il foro in cui l'ago lo ha perforato.
- Usando lo stadio scorrevole, spostare con attenzione il verme lontano dall'ago.
- Sollevare l'ago e girarlo in senso antiorario.
- Posizionare una goccia di 1 buffer PBS sopra il worm per farlo galleggiare.
- Utilizzare il raccoglitore sterilizzato a fiamma per sollevare il verme e metterlo in un'altra goccia di M9 su una piastra con semi di P. luminescens fresco per liberare il verme dall'olio in eccesso.
- Rimuovere il nematode dall'M9 e posizionarlo sul lato opposto del prato batterico.
- Utilizzare la stessa piastra per trasferire diversi nematodi iniettati.
- In 2-3 giorni, valutare i nematodi di prima generazione (F1) per il fenotipo transgenico. Separare i nematodi transgenici F1 su singole piastre per determinare quali vermi genereranno linee transgeniche stabili.
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Representative Results
Per valutare lo stato dei nematodi H. bacteriophora che hanno attraversato l'axenizzazione, è stata determinata la presenza o l'assenza di colonie batteriche di P. luminescens negli IJ. Per fare questo, è stato raccolto un pellet di circa 500 IJ che erano stati precedentemente sterilizzati in superficie e omogeneizzati in PBS. Il trattamento di controllo positivo consisteva in un pellet di circa 500 IJ provenienti dalla coltura di nematodi contenenti batteri simbiotici P. luminescens . I pellet di nematodi axenizzati e di controllo positivo sono stati omogeneizzati in 1x PBS. Gli omogeneizzati sono stati pipettati sull'agar e diffusi per facilitare la crescita delle singole colonie. Le piastre di agar sono state incubate a 28 °C per 24 ore. Il giorno successivo, è stata osservata la presenza di colonie di P. luminescens (CFU). Come previsto, H. bacteriophora dalla coltura stock trasportava cellule simbiotiche di P. luminsecens ; tuttavia, i nematodi privi dei loro batteri P. luminecens associati erano astonici e conservati separatamente per future sperimentazioni (Figura 6).
Il knockdown dell'espressione genica nol-5 è stato usato come esempio per mostrare l'efficacia dell'RNAi utilizzando il processo di microiniezione. La microiniezione è stata eseguita nella generazione parentale e l'effetto è stato osservato nella progenie F1. L'abbattimento di nol-5 mediante microiniezione di RNAi ha comportato l'assenza di linea germinale nella gonade del 60% della progenie (Figura 7).
Figura 1: Generazione di giovani infettivi (stadio di vita libero di nematodi entomopatogeni). (a) Infezione di larve di insetti Galleria mellonella (conservate nella capsula di Petri) con giovani infettivi di nematodi (conservati in pallone di coltura tissutale). b) Piegatura di un pezzo di carta da filtro per la preparazione di una trappola per l'acqua. c) La disposizione di una trappola d'acqua di nematodi entomopatogeni con larve di insetti morti della Galleria mellonella contenenti giovani infettivi (12 giorni dopo l'infezione da nematodi). La nuova generazione di giovani infettivi lascerà gli insetti morti e si sposterà verso l'acqua, che viene poi immagazzinata in un pallone per la coltura dei tessuti. Le immagini sono realizzate utilizzando il software grafico BioRender (https://biorender.com). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Iniezione di larve di insetti Galleria mellonella con il ceppo batterico Photorhabdus temperata Ret16. I vermi di cera sono tenuti in una capsula di Petri e vengono immobilizzati attraverso il trattamento a freddo (cioè, vengono posti sul ghiaccio per alcuni minuti). La parte posteriore del corpo dell'insetto viene premuta con un paio di pinze per creare una superficie gonfia adatta all'iniezione. L'angolo di iniezione è poco profondo per evitare di ferire i tessuti interni degli insetti, il che porterebbe alla morte degli insetti a causa di una manipolazione negligente. Le immagini sono realizzate utilizzando il software grafico BioRender (https://biorender.com). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Generazione di nematodi entomopatogeni axenici di Steinernema carpocapsae . Una metà di una capsula di Petri divisa contiene un prato di batteri Xenorhabdus nematophila ΔrpoS su agar lipidico e giovani infettivi di nematodi S. carpocapsae . Questo metodo in vitro induce i giovani infettivi a diventare nematodi adulti, che in seguito produrranno uova che si schiuderanno per dare origine alla nuova generazione dei parassiti. Quando un gran numero di giovani infettivi di S. carpocapsae di nuova generazione appaiono in questa parte della capsula di Petri divisa, l'acqua viene aggiunta all'altra metà del piatto insieme a un pezzo di carta da filtro per facilitare la migrazione dei nematodi. Le immagini sono realizzate utilizzando il software grafico BioRender (https://biorender.com) Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Rottura della punta dell'ago. La punta dell'ago è solitamente chiusa. Il corretto flusso della soluzione di acido nucleico viene controllato prima di eseguire l'iniezione vera e propria. Su una diapositiva di vetro, posizionare una goccia di olio alocarbonio. Posizionare un tubo capillare, utilizzato per fare l'ago, verticalmente come mostrato nella figura. Portare il capillare a fuoco a 40x e portare delicatamente l'ago verso il basso in piano con il capillare. Toccare delicatamente la punta dell'ago sul capillare. Questo crea un'apertura per il flusso regolare del dsRNA. Se non esce alcun fluido, eseguire un rapido flusso di azoto on-off utilizzando l'attuatore a pedale. La pressione dell'azoto e il contatto della punta dell'ago con il capillare romperanno l'ago. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Sito di iniezione. La gonade di H. bacteriophora migra dorsalmente dalla posizione vulvare ventrale e poi migra di nuovo intorno alla posizione ventrale. Le braccia migratorie si incrociano vicino alla vulva e si estendono oltre la vulva su entrambi i lati. Intorno alle 48 h, le braccia estese della gonade di un giovane adulto, cresciute da IJ, sono visibili vicino alla vulva. La microiniezione viene eseguita in questa posizione. Barra della scala: 0,1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Validazione dell'axenizzazione dell'eterohabdite batteriofora . Il successo della procedura di axenizzazione è stato stimato confermando l'assenza di cellule batteriche Photorhabdus luminescens nei giovani affettivi da H. bacteriophora trattati. Per questo, un pellet di circa 500 vermi sterilizzati in superficie dalla coltura di stock (simbiotici) o vermi che avevano subito il processo di axenizzazione (axenic) sono stati omogeneizzati. Quindi, l'omogeneizzato è stato distribuito su piastre di agar e dopo un'incubazione di 24 ore, è stata monitorata la comparsa di colonie batteriche (unità formanti colonie, CFU). La mancanza di colonie batteriche sulle piastre suggerisce che i nematodi H. bacteriophora sono privi dei loro batteri simbiotici P. luminescens . Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Knockdown mediato da RNAi del gene nol-5 . L'abbattimento mediato dall'RNAi del gene H. bacteriophora nol-5 si traduce in un fenotipo senza linea germinale. La progenie di un tipo selvatico, non iniettato H. batteriofora nematode (a) contiene uova nelle sue gonadi. La progenie di un tipo selvatico, nol-5 RNAi iniettato H. batteriofora nematode (b) non contiene uova nelle sue gonadi vuote a causa dell'abbattimento dell'RNA nol-5 . Barra della scala: 0,1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Comprendere le basi molecolari dell'infezione da nematodi entomopatogeni e dell'immunità anti-nematodi degli insetti richiede la separazione dei parassiti dai batteri mutualisticamente associati 13,15,16. I nematodi entomopatogeni H. bacteriophora e S. carpocapsae convivono con i batteri Gram-negativi P. luminescens e X. nematophila, rispettivamente17. Entrambe le specie batteriche hanno dimostrato in precedenza di codificare fattori che conferiscono patogenicità prendendo di mira i tessuti degli insetti e contrastando il sistema immunitario innato durante l'infezione18,19. Ciò ostacola gli sforzi per identificare le strategie che i nematodi si sono evoluti per interagire con l'ospite dell'insetto. Pertanto, l'identificazione e la caratterizzazione funzionale attraverso l'abbattimento genico dei componenti nematodi che partecipano anche al processo di infezione possono essere facilitati dalla generazione di vermi astonici. Qui vengono presentati protocolli efficienti per la produzione di nematodi entomopatogeni axenici e l'esecuzione del silenziamento genico RNAi in H. bacteriophora.
Un passo fondamentale in entrambi i protocolli per generare con successo nematodi axenici è la sterilizzazione superficiale di H. bacteriophora e S. carpocapsae IJs14,20. Questa parte del metodo prevede il trattamento dei vermi con soluzione di candeggina ed è considerata cruciale per il successo del processo di axenizzazione perché rimuove i batteri P. luminescens e X. nematophila dalla cuticola del nematode. Questa è una procedura importante per garantire che vengano eliminati solo i batteri mutualistici sulla superficie dei vermi e non quelli all'interno dei parassiti. Il completamento di questa fase richiede attenzione perché il trattamento prolungato con candeggina avrà un impatto sulla sopravvivenza dei nematodi.
Una somiglianza dell'attuale protocollo di axenizzazione per i nematodi di S. carpocapsae con un metodo precedentemente stabilito è l'uso dei batteri mutanti X. nematophila ΔrpoS che non sono in grado di colonizzare i vermi21. Una differenza tra l'attuale metodologia e un protocollo precedentemente riportato, che ha introdotto uova di nematodi sterilizzate in superficie sul nutriente agar22, è l'aggiunta di antibiotici nei terreni di coltura per inibire la contaminazione microbica che probabilmente influenzerebbe la crescita e l'idoneità dei nematodi.
L'RNAi mediante microiniezione è un metodo semplice e affidabile per fornire l'RNA agli ovociti. L'esplosione di liquido all'interno della gonade fornisce una conferma visiva del rilascio della soluzione di acido nucleico durante il processo di iniezione. È stato dimostrato che l'RNAi per microiniezione è significativamente migliore dell'RNAi per ammollo. Ciò è probabilmente dovuto alla capacità della soluzione RNAi di raggiungere gli ovociti che si trovano in diversi stadi di differenziazione all'interno della gonade.
Durante l'ottimizzazione del processo, si consiglia di testare diverse concentrazioni di soluzione di RNA per ottenere risultati migliori. Sono state testate varie concentrazioni di RNA che vanno da 50 ng/μL a 10 μg/μL. Si è scoperto che una concentrazione di 6 μg / μL ha funzionato meglio di altre concentrazioni. Per aumentare la resa dell'RNA durante la fase di trascrizione in vitro , il protocollo è stato modificato da un periodo di incubazione di 4 ore a 16 ore. Ciò ha comportato un sostanziale aumento della resa finale di RNA. Uno dei fattori chiave per il successo della microiniezione è la quantità di tempo che un nematode trascorre sulla piastra di iniezione. Meno tempo si traduce in un nematode sano sopravvissuto e una progenie sana con una maggiore possibilità di osservare il fenotipo previsto.
L'attuale protocollo per la coltivazione e la manipolazione genetica dei nematodi entomopatogeni è un contributo significativo per studi futuri nei campi della nematologia, dell'immunologia e delle interazioni ospite-parassita. La combinazione di approcci che consentono la manipolazione di nematodi entomopatogeni porterà alla scoperta dei fattori genetici che definiscono l'interazione tra le molecole effettrici dei nematodi e i componenti di segnalazione immunitaria dell'ospite che codificano fattori con proprietà anti-nematodi. Determinerà inoltre quali componenti molecolari chiave dei nematodi determinano la relazione simbiotica con i batteri correlati. Rispondere a queste domande è importante per migliorare le pratiche agricole e sviluppare nuovi mezzi per il controllo dei nematodi parassiti umani.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.
Acknowledgments
Ringraziamo i membri del Dipartimento di Scienze Biologiche della George Washington University per la lettura critica del manoscritto. Tutte le figure grafiche sono state realizzate utilizzando BioRender. Ricerca in I. E., J. H. e D. O'H. i laboratori sono stati supportati dalla George Washington University e dal Columbian College of Arts and Sciences facilitando fondi e fondi di ricerca interdisciplinari.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | VWR | 97062-244 | |
| Ambion Megascript T7 Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1333 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | 611770250 | |
| Cell culture flask T25 | Fisher Scientific | 156367 | |
| Cell culture flask T75 | Fisher Scientific | 156499 | |
| ChoiceTaq Mastermix | Denville Scientific | C775Y42 | |
| Corn oil | VWR | 470200-112 | |
| Corn syrup | MP Biomedicals/VWR | IC10141301 | |
| Culture tube 10 mL | Fisher Scientific | 14-959-14 | |
| Eppendorf Femtotips Microloader Tips | Eppendorf | E5242956003 | |
| Ethanol | Millipore-Sigma | E7023 | |
| Falcon tube 50 mL | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Femtojet Microinjector | Eppendorf | 5252000021 | |
| Filter paper | VWR | 28320-100 | |
| Galleria mellonella waxorms | Petco | - | |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | 12-553-464 | 50 x 24 mm |
| Halocarbon Oil 700 | Sigma | H8898 | |
| Inoculating loop | VWR | 12000-806 | |
| Kanamycin | VWR | 97062-956 | |
| Kwik-Fil Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-3 | 1.0 mm |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | LB agar miller powder 500 g |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | LB broth miller powder 500 g |
| Leica DM IRB Inverted Research Microscope | Microscope Central | - | |
| MacConkey medium | Millipore-Sigma | M7408-250G | |
| MEGAclear Transcription Clean-Up Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1908 | |
| Microcentrifuge tube | VWR | 76332-064 | 1.5 ml |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| Needle syringe | VWR | BD305155 | 22G |
| Nutrient broth | Millipore-Sigma | 70122-100G | |
| Parafilm | VWR | 52858-076 | |
| Partitioned Petri dish | VWR | 490005-212 | |
| PBS | VWR | 97062-732 | Buffer PBS tablets biotech grade 200 tab |
| PCR primers | Azenta | - | |
| Pestle | Millipore-Sigma | BAF199230001 | Bel-Art Disposable Pestle |
| Petri dish 6 cm | VWR | 25384-092 | 60 x 15 mm |
| Petri dish 10 mm | VWR | 10799-192 | 35 x 10 mm |
| Proteose Peptone #3 | Thermo Fisher Scientific | 211693 | |
| Yeast extract | Millipore-Sigma | Y1625 |
References
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