Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Dyrking og genetisk manipulering av entomopatogene nematoder

Published: March 31, 2022 doi: 10.3791/63885
Automatic Translation
1, 2, 1, 2, 1
1Department of Biological Sciences, The George Washington University, 2Department of Microbiology, Immunology, and Tropical Medicine, School of Medicine and Health Sciences, The George Washington University

Summary

Entomopatogene nematoder lever i symbiose med bakterier, og sammen infiserer de insekter ved å undergrave deres medfødte immunsystem. For å fremme forskning på det genetiske grunnlaget for nematodeinfeksjon, beskrives metoder for å opprettholde og genetisk manipulere entomopatogene nematoder.

Abstract

Entomopatogene nematoder i slektene Heterorhabditis og Steinernema er obligatoriske parasitter av insekter som lever i jorda. Hovedkarakteristikken for deres livssyklus er den mutualistiske tilknytningen til henholdsvis bakteriene Photorhabdus og Xenorhabdus. Nematodeparasittene er i stand til å lokalisere og gå inn i egnede insektverter, undergrave insektets immunrespons og formere seg effektivt for å produsere neste generasjon som aktivt vil jakte på nye insektbytter for å infisere. På grunn av egenskapene til livssyklusen er entomopatogene nematoder populære biologiske kontrollmidler, som brukes i kombinasjon med insektmidler for å kontrollere ødeleggende i landbruket. Samtidig representerer disse parasittiske nematoder et forskningsverktøy for å analysere nematode patogenisitet og vert anti-nematode responser. Denne forskningen er hjulpet av den nylige utviklingen av genetiske teknikker og transkriptomiske tilnærminger for å forstå rollen som nematodeutskilte molekyler under infeksjon. Her er det gitt en detaljert protokoll for å opprettholde entomopatogene nematoder og bruke en gen knockdown-prosedyre. Disse metodene fremmer videre funksjonell karakterisering av entomopatogene nematodeinfeksjonsfaktorer.

Introduction

Forskning på entomopatogene nematoder (EPN) har intensivert de siste årene hovedsakelig på grunn av nytten av disse parasittene i integrerte skadedyrshåndteringsstrategier og deres engasjement i grunnleggende biomedisinsk forskning 1,2. Nylige studier har etablert EPN som modellorganismer for å undersøke nematodegenetiske komponenter som aktiveres under de forskjellige stadiene av infeksjonsprosessen. Denne informasjonen gir kritiske ledetråder om naturen og antall molekyler som skilles ut av parasittene for å endre vertsfysiologi og destabilisere insektets medfødte immunrespons 3,4. Samtidig blir denne kunnskapen ofte supplert med nye detaljer om typen insektvertens immunsignaleringsveier og funksjonene de regulerer for å begrense inntreden og spredning av patogenene 5,6. Å forstå disse prosessene er avgjørende for å se for seg begge sider av det dynamiske samspillet mellom EPN og deres insektverter. Bedre forståelse av EPN-insekt vert forholdet vil utvilsomt lette lignende studier med pattedyr parasittiske nematoder, noe som kan føre til identifisering og karakterisering av infeksjonsfaktorer som forstyrrer det menneskelige immunsystemet.

EPN-nematodene Heterorhabditis sp. og Steinernema sp. kan infisere et bredt spekter av insekter, og deres biologi har blitt grundig studert tidligere. De to nematodeparasittene er forskjellige i reproduksjonsmodus med heterorhabditt som selvgjødslet og Steinernema gjennomgår amphimictisk reproduksjon, selv om S. hermafroditt nylig ble vist å reprodusere ved selvbefruktning av hermafroditter eller gjennom parthenogenese 7,8,9. En annen forskjell mellom Heterorhabditis og Steinernema nematoder er deres symbiotiske mutualisme med to forskjellige slekter av Gram-negative bakterier, henholdsvis Photorhabdus og Xenorhabdus, som begge er potente patogener av insekter. Disse bakteriene finnes i det frittlevende og ikke-fôrende infeksiøse juvenile (IJ) -stadiet av EPN, som oppdager følsomme verter, får tilgang til insekthemokolen der de frigjør deres tilknyttede bakterier som replikerer raskt og koloniserer insektvev. Både EPN og deres bakterier produserer virulensfaktorer som avvæpner insektforsvar og svekker homeostase. Etter insektdød utvikler nematode-IJs seg til å bli voksen EPN og fullføre livssyklusen. En ny kohort av IJs dannet som svar på matmangel og overbefolkning i insektkadaveren dukker endelig opp i jorden for å jakte påegnede verter 9,10,11,12.

Her beskrives en effektiv protokoll for å opprettholde, forsterke og genetisk manipulere EPN-nematoder. Spesielt skisserer protokollen replikasjonen av symbiotiske H. bacteriophora og S. carpocapsae IJs, genereringen av axenisk nematode IJs, produksjonen av H. bacteriophora hermafroditter for mikroinjeksjon, fremstilling av dsRNA og mikroinjeksjonsteknikken. Disse metodene er avgjørende for å forstå det molekylære grunnlaget for nematodepatogenitet og vertsanti nematodeimmunitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Produksjon av symbiotiske nematodeinfeksiøse ungdommer

  1. Dekk et petriskål (10 cm) med et stykke filterpapir og tilsett ca. 10-15 Galleria mellonella larver (figur 1A).
  2. Bruk en pipette til å dispensere 2 ml vann som inneholder ca. 25-50 IJ per 10 μL suspensjon på voksormene. Oppbevar petriskålen i et skap ved romtemperatur.
  3. Avhengig av fuktigheten til filterpapiret, tilsett 1-2 ml vann hver 2. Waxworms infisert med IJs normalt vil dø innen 48 timer.
  4. Forbered Whites vannlåser ca. 10 dager etter at voksormene er infisert med IJs8 (Figur 1B, C). Overfør forsiktig de døde insektene til den uberørte delen av filterpapiret. Bruk vann fra springen til å fylle den nederste petriskålen og plasser en hette på et rør på 15 ml som avstandsstykke for ventilasjon.
  5. Overfør de myke og skjøre voksormene forsiktig ved å løfte dem sakte fra filterpapiret ved hjelp av et par plasttang. Bruk vann fra springen i stedet for demineralisert eller avionisert vann. Sistnevnte forårsaker nematodeaggregering.
    1. Sørg for at vannstanden i vannlåsen når omtrent halvparten av høyden på petriskålen. Forvent at vannstanden vil endre seg over tid, avhengig av temperatur og fuktighetsforhold i rommet.
  6. Når vannet i den lille petriskålen blir overskyet på grunn av tilstedeværelsen av nematoder, bruk en pipette for å flytte den nye generasjonen IJs til en T25- eller T75-cellekulturkolbe.
  7. Tilsett vann fra springen opptil ca. 40 % av volumet til riktig tetthet er nådd (figur 1C). Unngå overbelastning av nematoder og lagre cellekulturflaskene horisontalt.
  8. Tilsett mer vann i den nederste petriskålen og gjenta trinn 1.6 og 1.7 til IJ slutter å komme ut av insektskroppene etter ca. 3-5 dager.

2. Produksjon av øksenisk nematode infeksiøse ungdommer

MERK: Axeniske nematoder brukes fordi etter at nematode-bakteriekomplekset dissosierer inne i insektet, fremkaller hver mutualistisk partner en distinkt vertsimmunrespons5. Den mutante stammen Ret16 av Photorhabdus temperata brukes fordi disse bakteriene støtter veksten av H. bacteriophora, men ikke klarer å kolonisere nematode gut13,14.

  1. Heterorhabditis bacteriophora smittsomme ungdommer
    1. Bruk en steril pipettespiss eller spatel, skrap flere flak av en frossen kultur av P. temperata Ret16 på en MacConkey-plate og strek for enkeltkolonier. Rug platen i 2-3 dager ved 28 °C.
    2. Inokuler 10 ml LB-buljong med en koloni i et 50 ml rør og inkuber kulturen over natten ved 28 ° C i en ristende inkubator. Bruk bare primærfasekoloniene som er røde på MacConkey-agar. Sekundærfasekoloniene vil være off-white på MacConkey-agar.
    3. Vask 100 μL overnattingskultur med 900 μL 1x PBS ved sentrifugering i et 1,5 ml mikrosentrifugerør ved 17 900 x g. Dekantere supernatanten. Fortynn kulturen 10x i 1x PBS. La røret ligge på is.
    4. Dyp voksormene i en 70% etanolløsning, tørk insektene med et papirhåndkle og legg dem i et 50 ml rør.
    5. Plasser røret på is i 20 minutter for å immobilisere voksormene.
    6. Bruk et filterpapir til å dekke de øverste og nederste halvdelene av en petriskål (10 cm). Bruk petriskållokket dekket med filterpapir som basestøtte for injeksjon. Fukt filterpapiret på den nederste petriskålen og overfør på is for å hjelpe de injiserte voksormene til å komme seg.
    7. Pipetter 50 μL iskalde bakterier på et stykke parafilm og klargjør 22 G nålesprøyten. Trykk forsiktig på stempelet for å fjerne luften på tuppen av nålen.
    8. Hold en voksorm nær bakre ende under stereoskopet (figur 2).
    9. Injiser 50 μL av bakteriekulturen i dorsalsiden av thoraxen, helst i krysset mellom to segmenter. For å minimere indre skader, injiser like under neglebåndet, så parallelt med voksormen som mulig. Det er naturlig at en dråpe hemolymfe blør ut når voksormen er gjennomboret
    10. Overfør de injiserte insekter til utvinning Petri parabolen.
    11. Gjenta trinn 2.1.7-2.1.9 til alle insekter er injisert med bakteriene. For å bedøve insektene, legg dem på is i 5 minutter.
    12. Plasser petriskålen i mørket (f.eks. skuff eller skap) og tilsett vann fra springen på filterpapiret hvis det virker tørt. Voksorm vil bukke under 2 dager etter injeksjon, og vises murstein rød etter ca 3-4 dager. Hvis insektene ser brune ut, har bakterieinfeksjonen vært mislykket.
    13. Ved 7 dager etter infeksjon, overfør insektene med den karakteristiske mursteinrøde fargen til en fersk filterpapirforet petriskål, og fortsett med "Produksjon av symbiotiske nematodeinfeksjonsyngel" fra trinn 1. Hvis du bruker symbiotiske nematoder, gjenta prosedyren fra trinn 2.1. ved hjelp av de nyproduserte ID-ene fra første runde.
    14. Overflatesteriliserende H. bacteriophora IJs
      1. Samle tilstrekkelig symbiotisk H. bacteriophora og kandidat axenic IJs ved sentrifugering for å lage en 100 μL pellet i et 1,5 ml sentrifugerør.
      2. Tilsett 500 μL 5% blekemiddel til pelleten i hvert mikrocentrifugerør og inverter. Rug i 10 min. Sentrifuge ved 17 900 x g i 1 min. Fjern supernatanten.
      3. Vask pelleten med 1 ml sterilt vann og gjenta sentrifugering. Fjern supernatanten. Gjenta dette trinnet fire ganger til.
    15. Verifisere akselerasjon
      1. Pipetter 400 μL sterilt vann til de vaskede symbiotiske og kandidatakseniske H. bakteriophora nematoder.
      2. Plasser nematodene over insektene i petriskålen og merk behandlingene deretter.
      3. Plasser petriskålene med de infiserte insektene i mørket og sjekk med jevne mellomrom om voksormene blir røde.
        MERK: Waxworms infisert med H. bacteriophora symbiotiske nematoder vil bli rød innen 2 dager etter infeksjon. Voksorm misfarging skyldes sekresjon av ulike forbindelser produsert av mutualistic Photorhabdus bakterier under infeksjonsprosessen. Mangel på rød farge i de infiserte voksormene 4 dager etter infeksjon bekrefter at H. bacteriophora er axenic. Dette skyldes at P. temperata Ret16-bakterier ikke er tilstede i nematodens tarm.
    16. Alternativ metode for verifisering av akselicitet
      1. Overflatesteriliser symbiotiske H. bacteriophora IJs og kandidat-axenic H. bacteriophora IJs som beskrevet i trinn 2.1.14.
      2. Homogeniser ca. 500 IJ i 500 μL steril 1x PBS i mikrofugerør ved bruk av sterile pestler. Spinn ned homogenatet, dekanter supernatanten og spre det på LB-agar. Inkuber platene ved 28 °C i 24 timer.
      3. Tell kolonidannende enheter (CFU) for hver plate. Prøver fra axenic H. bacteriophora vil ikke danne noen kolonier av de symbiotiske P. luminescens-bakteriene .
  2. Steinernema carpocapsae Smittsomme ungdommer
    1. Fremstilling av lipidagarplater (300 ml oppløsning gjør ca. 20 delte plater)
      1. Vei 2,4 g næringsbuljong, 4,5 g gjærekstrakt og 1,5 g agar og legg dem til 267 ml avionisert vann. Autoklav løsningen.
      2. Tilsett 3 ml 1 M MgCl2, 1,2 ml maisolje og 28,8 ml 7% mais sirup.
      3. Klargjør og tilsett oppløsningen 300 μL 30 mg / ml kanamycin og 300 μL 50 mg / ml ampicillin (sterilisert med 0,2 μm filter).
      4. Dekanter blandingen på den ene halvdelen av en delt petriskål/delt tallerken.
    2. Fremstilling av X. nematophila (stamme ΔrpoS) bakteriell plen
      1. Kultur X. nematophila (Xn) ΔrpoS direkte fra en frossen bakteriell stockin 2 ml LB/kan/amp løsning på en shaker ved 30 °C over natten.
      2. Inokuler 5 ml LB-medium inneholdende 30 μg / ml kanamycin og 50 μg / ml ampicillin med 250 μL av nattkulturen og dyrk bakteriene over natten på en shaker.
        MERK: Xn-bakterier vokser ikke godt når de strekkes direkte på utvalg lipid agar media fra en frossen bestand. Om nødvendig kan primær og sekundær fase Xn først bekreftes på NBTA-medier (næringsagar supplert med 25 mg bromothymol blå l−1 og 40 mg trifenyltetrazoliumklorid l−1) før oppstart av en ny flytende kultur.
      3. Pipette 100 μL av kulturen på lipidagarplatene og spred på hele platen med en steril inokuleringssløyfe. Inkuber platene i 24 timer ved 30 °C.
    3. Overflatesteriliserende S. carpocapsae IJs
      1. La en kolbe inneholde IJs i en vinkel slik at IJs synker til et hjørne av kolben. Aspirer 1 ml av de faste IJ-ene i et mikrocentrifugerør. Sentrifuge ved 17 900 x g i 10 s. Fjern supernatanten.
      2. Tilsett 1 ml 1% nylaget blekemiddelløsning. Inverter rør for å blande grundig. Inkubere i 1 min (langvarig blekemiddelinkubasjon vil føre til IJ-død). Spinn igjen i 10 s. Fjern supernatant.
      3. For å fjerne blekemiddelrester, vask nematodene med 1 ml sterilt destillert vann og sentrifuge i 10 s. Fjern supernatant. Gjenta vasken fire ganger til.
      4. Estimer IJ-tellingen per ml ved å telle 10-20 μL av de vaskede IJ-ene under stereoskopet og juster konsentrasjonen av IJs tilsvarende.
    4. Oppdrett S. carpocapsae IJs
      1. Overfør med en pipette rundt 1000 IJs på lipid agar split plater (figur 3, venstre bilde). Plasser platene i et fuktet skap eller skuff. Bruk fuktige papirhåndklær for å øke fuktigheten. Oppbevar platene i romtemperatur (22-25 °C).
      2. Sjekk papirhåndklærne annenhver dag for å sikre at de holder seg fuktige. Tilsett om nødvendig vann annenhver dag i papirhåndklærne for å opprettholde fuktigheten i skapet eller skuffen. Alternativt kan du plassere et vannbad til bunnen av skapet for å øke luftfuktigheten.
      3. Når IJ bare vises, tilsett vann på den andre siden av platen, og legg et lag med filterpapir over midten av platen (vannlås, figur 3, høyre bilde). Samle dette vannet som inneholder de første runde IJ-ene i en T75-cellekulturkolbe. Dette er Round I S. carpocapsae nematoder.
      4. Overflatesteriliser med blekemiddel (trinn 2.2.3) igjen og gjenta prosessen fra trinn 2.2 ved hjelp av rund 1 S. carpocapsae nematoder. Resultatet blir runde 2 S. carpocapsae nematoder.
      5. Sjekk under et stereoskop med noen dagers mellomrom for å spore utviklingen av nematoder.
    5. Verifisere den akseniske tilstanden til S. carpocapsae IJs
      1. Overflatesteriliser runde 1, runde 2 og symbiotiske S. carpocapsae IJs med blekemiddel som beskrevet i trinn 2.2.3.
      2. Homogeniser ca. 400-700 IJ i mikrofugerør ved bruk av sterile plastpestler. Sentrifuger homogenatet, dekanter supernatanten og spre løsningen på LB-agarplater. Oppbevar agarplatene i et inkubatorsett ved 28 °C i 24 timer.
      3. Tell dannelsen av CFU for hver plate. Prøver fra økseniske nematoder vil ikke gi noen bakterievekst.
    6. Verifisere den akseniske tilstanden til S. carpocapsae IJs ved PCR
      1. Overflatesteriliser runde 1, runde 2 og symbiotiske S. carpocapsae IJs med blekemiddel som beskrevet i trinn 2.2.3.
      2. Ekstraher DNA fra homogenatet. En detaljert ekstraksjonsprosedyre er beskrevet i avsnitt 4.1.2 nedenfor.
      3. Utfør PCR ved hjelp av XptA2-primere med glødetemperatur 61 °C:
        XptA F: 5′-GCCTGGAAAGAGTGGACGAA-3'.
        XptA R: 5'-GTAAGACCAAGGGGCACTCC-3'.
        MERK: Disse primerne forsterker det insekticide genet XptA2 av X. nematophila, og produserer en amplikon på 231 bp. Sykkelprogrammet var som følger: 95 °C i 2 min, 34 sykluser på 95 °C i 30 s, glødetemperatur på 61 °C i 1 min og 73 °C i 1 min etterfulgt av 72 °C i 10 minutter.
      4. Visualiser de forsterkede fragmentene ved separasjon i en 1, 5% agarosegel. Axenic overflatesteriliserte prøver vil ikke danne noen bånd.

3. Heve H. bacteriophora hermafroditter for mikroinjeksjon

  1. Tilbered 6 cm petriskålplater med NA+chol (1,5x næringsbuljong, 1,5 % agar og 10 μg/ml kolesterol).
  2. Klargjør 3 ml PP3-oppløsning (2 % Protease Peptone #3, PP3) i en 10 ml dyrkningstube.
  3. Bruk en steril 20 μL spiss for å skrape toppen av P. luminescens glyserol lager (25% vol / vol steril glyserol) holdt ved -80 ° C og slipp den i kulturrøret.
  4. Inkuber røret over natten i en temperaturkontrollert shaker satt til 28 °C, 200 rpm.
  5. Dagen etter vil kulturen være lys rød i fargen. Tallerken 50 μL av kulturen på en 6 cm NA + chol petriskål og spre den ved hjelp av en bakteriespreder på en sirkulær måte.
  6. Plasser platene i en 28 °C inkubator. P. luminescens plenen vil være klar i 24-36 timer og vil vises lys rød i fargen.
  7. Inokuler platen med 50-100 overflatesteriliserte IJs og hold platen ved 28 °C.
  8. Sunn L4 hermafroditt vil begynne å vises ca 48-54 timer etter inokulasjon. Sunn, ikke-sultet sen L4 H. bacteriophora hermafroditter kreves for injeksjon.

4. Fremstilling av dsRNA

  1. Primer design
    1. Design primere for dsRNA for å målrette ~ 500 basepar eksonregioner av H. bacteriophora DNA.
      1. Primere for regioner av interesse kan bestemmes ved hjelp av Primer3 (https://primer3.ut.ee) eller et lignende program, velge for en optimal produktlengde på 500 basepar, Tm på 60 ° C og primerlengde på 22 nukleotider.
      2. Legg til et T7-nettsted (TAATACGACTCACTATAGGG) til 5'-endene av hver fremre primer for å tillate in vitro-transkripsjon.
  2. Genomisk DNA-isolasjon
    1. Bruk genomisk DNA isolert fra frosne pellets på ~ 50.000 H. bacteriophora IJs for dsRNA-syntese.
    2. Bruk en IJ-pellet resuspendert i 50 μL lysisbuffer (50 mM KCl, 0,05 % (w/v) gelatin, 10 mM Tris-HCl pH 8,2, 0,45 % Tween 20, 60 μg/ml Proteinase K, 2,5 mM MgCl2) plassert ved −80 °C i minst 30 minutter.
    3. Homogeniser pelleten med en liten rørpestle.
    4. Varm oppløsningen til romtemperatur og rug ved 60 °C i 2 timer, og virvle hvert 15. minutt.
    5. Denaturer proteinase K ved å inkubere det homogeniserte vevet i 15 minutter ved 95 °C.
    6. Avkjøl prøven til 4 °C og sentrifuger ved 3 400 x g i 1 min.
    7. Bruk den resulterende supernatanten som en mal for påfølgende PCR.
    8. Sett opp en 50 μL PCR-reaksjon ved hjelp av en kommersiell mastermix med 200 ng mal-DNA, 0,2 μM fremover og revers primer, og produsentens foreslåtte sykkelforhold.
    9. Analyser PCR-reaksjonen på en 1,2% agarosegel for å verifisere at reaksjonene produserte enkeltbånd av den forutsagte størrelsen.
  3. dsRNA-syntese
    1. Bruk et kommersielt transkripsjonssett.
    2. Bruk en 5 μL PCR-reaksjon for in vitro transkripsjon. Følg produsentens instruksjoner.
    3. Inkuber reaksjonen i 16 timer ved 37 °C.
    4. Rengjør transkripsjonsreaksjonene in vitro med et kommersielt sett ved bruk av ammoniumacetat/etanolutfelling for å konsentrere dsRNA.
    5. Suspender det pelleterte dsRNA i 10 μL RNase-fritt vann.
    6. Kvantifiser RNA ved hjelp av et spektrofotometer.
    7. Vurder kvaliteten ved å skille dsRNA på en 1,2% agarosegel

5. Mikroinjeksjon

MERK: En injeksjonspute er en glassdekslerlipp med et lag på 2% (w / v) agarose på midten. Når ormene som skal injiseres overføres til disse putene, vil agaroselaget immobilisere dem for prosedyren. Normalt holdes ekstra pads nær mikroskopet for generell bruk.

  1. Klargjøre injeksjonsputen
    1. Kok 2% agarose i vann ved å tilsette 0,2 g agarose til 10 ml vann.
    2. Plasser 1-4 dråper (~ 50 μL) på midten av en 50 mm x 70 mm tynn glassdeksler.
    3. Bruk en annen deksler for å flate ut dråpen.
    4. La dekslene tørke i 2-3 min før du skyver dekslene av sidelengs.
    5. Merk med en 'R' på høyre side av den oppovervendte dekslippen.
    6. La lysbildene tørke ved romtemperatur i 1 dag før du bruker dem.
  2. Tilberedning av injeksjonskanyler
    1. Bruk 1,0 mm glasskapillærer som inneholder et internt fint filament. Dette muliggjør effektiv fylling av nålen.
      MERK: Enhver kommersiell nåletrekker (f.eks. Narishige PB-7) kan brukes.
    2. Slå på kanyletrekkeren.
    3. Forsikre deg om at varmeren er satt til maks og solenoiden er satt til 8,40 for å sikre nødvendig nåleskarphet og riktig lengde.
    4. Sett kapillærrøret inn i den øverste knottryggen gjennom filamentet og stram toppknappen. Toppen av kapillærrøret vil være på nivå med toppen av nåltrekkeren, og varmefilamentet vil være midt i kapillæren.
    5. Flytt bunnenheten til toppen, og stram deretter den nederste knappen. Forsikre deg om at kapillæren er forsvarlig plassert.
    6. Lukk beskyttelseshetten på kanyletrekkeren og trykk på start. Det grønne lyset slås på. Etter noen minutter blir kapillæren oppvarmet og trukket fra hverandre for å skille seg i to halvdeler.
      MERK: De to separerte kanylene er ikke like lange, men de kan begge brukes til injeksjonene. Lengre nålepunkter foretrekkes.
    7. Ordne nålene i vertikal stilling med punktene nedover ved hjelp av et stykke modelleringsleire. Alternativt kan du oppbevare nålene i en petriskål som holdes på plass av to strimler av modelleringsleire.
  3. Lasting av kanylen
    MERK: Nukleinsyreoppløsningen må sentrifugeres i minst 10 minutter ved 20 784 x g til pellets urenheter som kan være tilstede i suspensjonen. Sentrifugering av urenheter hindrer dem i å blokkere strømmen av injeksjonsnålen.
    1. Bruk en av de to metodene for å laste nukleinsyrer i nålene.
    2. Metode 1
      1. Bruk en pipette til å overføre ca. 0,5 μL av den sentrifugerte DNA-prøven til den upulerte enden av injeksjonsnålen. Dette vil vises som en liten dråpe væske som sitter på toppen av kapillærrøret.
      2. Stå på i 5 til 7 minutter for å la væskeprøven oppta enden av nålen. Det endelige produktet vil være en fylt nål uten luftbobler til stede.
      3. Bruk et disseksjonsmikroskop for å bekrefte tilstedeværelsen av oppløsning i nålespissen før injeksjon.
    3. Metode 2
      1. Bruk lastetips for mikroinjektoren.
      2. Ved hjelp av denne belastningsspissen pipetterer du 5 μL av nukleinsyreoppløsningen.
      3. Mens den trukket nålen er på nåltrekkeren, løsner du den øverste knappen, beveger den øvre trukket nålen litt oppover og strammer knappen igjen.
      4. Stikk tuppen av lasteren forsiktig inn i kapillærrøret og strekk den til bunnen av injeksjonsnålen.
      5. Pipetter nukleinsyreoppløsningen inn i injeksjonsnålen.
      6. Fjern lasteren fra den trukket nålen og hold den atskilt for videre lasting, om nødvendig. Sørg for å bytte ut lastere når du legger inn en annen nukleinsyreblanding.
  4. Klargjøre injeksjonsmikroskopet
    MERK: Et omvendt mikroskop med diffus belysning fra mikroskopbasen brukes til ormforberedelse, mikroinjeksjon og gjenoppretting. Bruken av et høyoppløselig invertert mikroskop med 10x og 40x mål er beskrevet. Mikroskopet er utstyrt med en nålmanipulator som holder nålen og bringer den på plass for injeksjonen. Mikroinjeksjonsolje brukes til å forhindre ormen fra rask dehydrering mens den er på agaroselaget av injeksjonsputen. Den foreslåtte oljen å bruke er Halocarbon Oil 700.
    1. Slå på lampen og kalibrer lysstyrken med kontrollpanelet.
    2. Sjekk nummeret på kondensatoren Wollaston prisme; det vil tilsvare det brukte målet (40x).
    3. Bekreft at DIC-tårnet, merket med "DIC", er i riktig posisjon.
    4. Forsikre deg om at knappen på målet er satt til null (0).
    5. Vri Ph-ringen til høyre til slutten.
    6. Juster polarisatoren på en slik måte at pilen er i horisontal posisjon.
    7. Legg et stykke papir på scenen for å observere fokuspunktet (lyset).
    8. Lukk feltmembranen til det punktet at det er en flekk på papiret.
    9. Bruk skiven til venstre for å flytte kondensatoren opp og ned til det punktet at et veldig skarpt lyspunkt på stykket papir er sett.
    10. Åpne feltmembranen sakte opp til det punktet at en liten sirkel av lys er synlig.
    11. Ta papiret bort.
    12. Forsikre deg om at lyspunktet er i sentrum av målet. Ellers kan du stille opp lyspunktet med midten av målet ved å justere sølvskruene på toppen av kondensatoren.
    13. Åpne feltmembranen helt.
    14. Sjekk at analysatoren IKT/P er trykket inn.
  5. Montering av injeksjonsnålen på mikroskopet
    1. Slå på nitrogengassstrømmen til mikroinjeksjonsnålen. Gasstrykket til nålen vil være ca. 20 psi.
    2. Kontroller at mikromanipulatorknappene (den delen av mikroskopet som beveger nålen) er plassert i midten, noe som gir det bredeste bevegelsesområdet når nålen er montert.
    3. Skru av forsamlingen som holder metallstangen for å fjerne den fra nåleholderen.
    4. Sett den nye nålen inn i den øverste delen av mikroskopet; Monter deretter gummipakningen for å holde nålen på plass.
    5. Fest den nederste delen av kanyleholderen ved å feste den til forsamlingen.
    6. Sett nålen inn i sporet på mikromanipulatoren og skru den ordentlig for å holde den stødig. Forsikre deg om at skruen er omtrent 1 tommer fra enden av mikromanipulatoren.
    7. Plasser spissen av nålen midt i synsfeltet i omtrent 45° vinkel i forhold til sceneplaten, ved hjelp av knottene og grove kontroller fra mikromanipulatoren. Det er viktig å la nålespissen være høy nok til at den ikke går i stykker ved et uhell.
  6. Bryte nålene
    1. Plasser nålen i mikromanipulatoren der spissen av nålen normalt vil bryte for å la nukleinsyreoppløsningen strømme gjennom den.
    2. Bryt en kapillær og legg den på toppen av et glassglass som bærer en dråpe mikroinjeksjonsolje.
    3. Plasser lysbildet på mikroskopet og fokuser.
    4. Før spissen av nålen til samme nivå som kapillærens side ved hjelp av mikroskopets fine kontroller (figur 4).
    5. Slå på nitrogenstrømmen kort ved hjelp av fotaktuatoren for å bekrefte at nålespissen ikke er ødelagt. En rask on-off vil være tilstrekkelig.
    6. Beveg nålen forsiktig slik at den knapt berører kapillærens side.
    7. Knips lett på siden av mikroskopet for å knekke nålespissen.
    8. Fjern nålen fra kapillæren og slå på nitrogenstrømmen for å kontrollere at nålen er ordentlig ødelagt.
    9. Nålen vil skape et lite injeksjonsfall som er omtrent fem ganger større enn nålespissen (figur 4). Hvis injeksjonsdråpen er av mindre størrelse, bryt spissen ytterligere. Hvis injeksjonsdråpen er av større størrelse, prøv å bruke en ny nål.

6. Mikroinjeksjon

  1. Pipetter en dråpe mikroinjeksjonsolje på en injeksjonspute.
  2. Dypp en flammesterilisert hakke i mikroinjeksjonsoljedråpen og samle en ung H. bacteriophora voksen nematode fra platen.
  3. Velg nematoder fra deler av platen som ikke er nær bakterieplenen for å forhindre overføring av et høyt antall bakterieceller til injeksjonsputen. Høst også en nematode med velformede gonader.
  4. Flytt nematodene til injeksjonsputen og plasser dem vertikalt slik at gonadene vender mot nålen. Pass på at vulva peker i samme retning som injeksjonsnålen, og de to distale gonadarmene er i motsatt retning og opp mot nematodens kroppsvegg.
    MERK: I likhet med Pristionchus pacificus migrerer gonaden til H. bacteriophora dorsalt fra den ventrale vulvalposisjonen og migrerer deretter tilbake til ventralposisjonen.
  5. Kontroller at mengden olje er tilstrekkelig til å forhindre uttørking av nematoder uten å la nematoden vandre rundt.
  6. Bring nematoden i fokus med 10x målet ved å holde nålen godt over lysbildet. I olje blir nematodegonnadene sett på som to klare regioner nær ormens fremre og bakre. Sørg for at gonadene er i fokus og ikke de andre delene av ormen.
  7. Ordne nematoden i en vinkel på 15° til 45° mot injeksjonsnålen, noe som vil gi mer plass til nålen inne i gonaden. Denne tilnærmingen forhindrer også nålen i å passere gjennom hele nematodelegemet når nålen blir introdusert inne i gonaden.
  8. Plasser injeksjonsnålen og nematoden til samme nivå ved gradvis å senke kanylen til den kommer i fokus (figur 5). Forsikre deg om at når nålen senkes, forblir den ved siden av nematoden og ikke over ormen.
  9. Bruk 40x-målet til å fokusere på den syncytiale gonadarmen til nematoden.
  10. Beveg nålen opp og ned med finjusteringen til spissen er i fokus sammen med nematodens syncytielle gonadarm.
  11. Beveg nematoden sakte mot nålen ved hjelp av glidetrinnet. Skyv deretter gonaden forsiktig til posisjon med nålen mot nematodens kroppsvegg, noe som vil resultere i effektiv nålinntrengning inne i nematodelegemet.
  12. Tråkk kort på fotaktuatoren for å starte strømmen av nukleinsyreoppløsningen. En rask on-off er tilstrekkelig. Hvis nålen er inne i gonaden, vil gonaden fylles med løsningen og svulme.
  13. Når nålen er sikret i riktig posisjon, fyll gonaden med nukleinsyreoppløsningen til armene på gonaden er fylt. Det er viktig å unngå utvisning av væske fra ormen gjennom hullet der nålen punkterte den.
  14. Bruk glidetrinnet til å flytte ormen forsiktig bort fra nålen.
  15. Løft nålen og vri den mot klokken.
  16. Plasser en dråpe på 1x PBS-buffer på toppen av ormen for å få den til å flyte.
  17. Bruk den flammesteriliserte hakken til å løfte ormen og legg den i en annen dråpe M9 på en fersk P. luminescens frøet plate for å kvitte ormen med overflødig olje.
  18. Fjern nematoden fra M9 og plasser den på den andre siden av bakterieplenen.
  19. Bruk samme plate til å overføre flere injiserte nematoder.
  20. På 2-3 dager, evaluer første generasjon (F1) nematoder for den transgene fenotypen. Skill de transgene F1-nematodene på individuelle plater for å bestemme hvilke ormer som vil generere stabile transgene linjer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å vurdere statusen til H. bacteriophora nematoder som har gått gjennom axenization, ble tilstedeværelsen eller fraværet av P. luminescens bakteriekolonier i IJs bestemt. For å gjøre dette ble en pellet på ca. 500 IJs som tidligere hadde blitt overflatesterilisert og homogenisert i PBS samlet. Den positive kontrollbehandlingen besto av en pellet på ca. 500 IJ fra nematodekulturen som inneholdt symbiotiske P. luminescensbakterier . Pellets av axeniserte og positive kontroll nematoder ble homogenisert i 1x PBS. Homogenatene ble pipettert på agar og spredt for å lette veksten av individuelle kolonier. Agarplatene ble ruget ved 28 °C i 24 timer. Neste dag ble forekomsten av P. luminescens kolonier (CFU) observert. Som forventet bar H. bacteriophora fra lagerkulturen symbiotiske P. luminsecens-celler ; Nematoder uten tilhørende P. luminecens-bakterier var imidlertid økseniske og lagret separat for fremtidig eksperimentering (figur 6).

Knockdown av nol-5 genuttrykk ble brukt som et eksempel for å vise effekten av RNAi ved hjelp av mikroinjeksjonsprosessen. Mikroinjeksjon ble utført i foreldregenerasjonen, og effekten ble observert i F1-avkom. Knockdown av nol-5 ved bruk av RNAi mikroinjeksjon resulterte i fravær av germline i gonaden på 60% av avkom (figur 7).

Figure 1
Figur 1: Generering av infeksiøse ungdyr (fritt levestadium av entomopatogene nematoder). (a) Infeksjon av Galleria mellonella insektlarver (holdt i petriskål) med nematodeinfeksiøse ungdyr (holdt i vevskulturkolbe). (b) Bretting av et stykke filterpapir for fremstilling av en vannlås. (c) Arrangement av en vannfelle av entomopatogene nematoder med døde Galleria mellonella insektlarver som inneholder infeksiøse ungdyr (12 dager etter nematodeinfeksjon). Den nye generasjonen av smittsomme ungdommer vil forlate de døde insektene og flytte til vannet, som deretter lagres i en vevskulturkolbe. Bildene er laget ved hjelp av BioRender grafisk programvare (https://biorender.com). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Injeksjon av Galleria mellonella insektlarver med bakteriestammen Photorhabdus temperata Ret16. Voksorm holdes i en petriskål, og de immobiliseres gjennom kald behandling (dvs. de legges på is i noen minutter). Den bakre delen av insektslegemet presses med et par tang for å skape en hovent overflate som er egnet for injeksjon. Injeksjonsvinkelen er grunne for å forhindre skade på indre insektvev, noe som vil føre til insektdød på grunn av uforsiktig håndtering. Bildene er laget ved hjelp av BioRender grafisk programvare (https://biorender.com). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Generering av økseniske Steinernema carpocapsae entomopatogene nematoder. Den ene halvdelen av en delt petriskål inneholder en plen av Xenorhabdus nematophila ΔrpoS-bakterier på lipidagar og smittsomme ungdommer av S. carpocapsae nematoder. Denne in vitro-metoden induserer de infeksiøse ungfuglene til å bli voksne nematoder, som senere vil produsere egg som vil klekkes for å gi opphav til den nye generasjonen av parasittene. Når et stort antall nylig genererte S. carpocapsae-smittsomme ungdommer vises i denne delen av den delte petriskålen, tilsettes vann til den andre halvdelen av parabolen sammen med et stykke filterpapir for å lette migrasjonen av nematodene. Bildene er laget med BioRender grafisk programvare (https://biorender.com) Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Brudd på kanylespissen. Spissen av nålen er vanligvis lukket. Den riktige strømmen av nukleinsyreoppløsningen kontrolleres før selve injeksjonen utføres. Plasser en dråpe halokarbonolje på et glassglass. Plasser et kapillærrør som brukes til å lage nålen, vertikalt som vist på figuren. Bring kapillæren til å fokusere på 40x og forsiktig bringe nålen ned i plan med kapillæren. Berør kanylespissen forsiktig mot kapillæren. Dette skaper en åpning for jevn flyt av dsRNA. Hvis det ikke kommer ut væske, kan du utføre en rask nitrogenstrøm ved hjelp av fotaktuatoren. Trykket fra nitrogenet og kontakt av nålespissen med kapillæren vil bryte nålen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Injeksjonssted. Gonaden til H. bacteriophora migrerer dorsalt fra den ventrale vulvalposisjonen og migrerer deretter tilbake til ventral posisjon. De migrerende armene krysser hverandre nær vulva og strekker seg utover vulva på hver side. På rundt 48 timer er de forlengende armene til gonaden til en ung voksen, vokst fra IJ, synlige nær vulvaen. Mikroinjeksjon utføres i denne stillingen. Skalalinje: 0,1 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Validering av Heterorhabditis bacteriophora axenization. Suksessen til økseniseringsprosedyren ble estimert ved å bekrefte fraværet av Photorhabdus luminescens bakterieceller i behandlede H. bacteriophora infeksiøse ungdommer. For dette ble en pellet på ca. 500 overflatesteriliserte ormer fra stamkulturen (symbiotisk) eller ormer som hadde gjennomgått axeniseringsprosessen (axenic) homogenisert. Deretter ble homogenatet spredt på agarplater og etter en 24 timers inkubasjon ble utseendet til bakteriekolonier (kolonidannende enheter, CFU) overvåket. Mangel på bakteriekolonier på platene antyder at H. bacteriophora nematoder er fri for deres P. luminescens symbiotiske bakterier. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: RNAi-mediert knockdown av nol-5-genet . RNAi mediert knockdown av H. bacteriophora nol-5 genet resulterer i en fenotype uten germline. Avkom av en vill type, ikke-injisert H. bacteriophora nematode (a) inneholder egg i sine gonader. Avkommet av en vill type, nol-5 RNAi injisert H. bacteriophora nematode (b) inneholder ingen egg i sine tomme gonader på grunn av knockdown av nol-5 RNA. Skalalinje: 0,1 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Å forstå det molekylære grunnlaget for entomopatogen nematodeinfeksjon og insektanti nematodeimmunitet krever separasjon av parasittene fra de mutualistisk assosierte bakteriene 13,15,16. De entomopatogene nematodene H. bacteriophora og S. carpocapsae lever sammen med de gramnegative bakteriene P. luminescens og X. nematophila, henholdsvis17. Begge bakterieartene har tidligere vist seg å kode faktorer som gir sykdomsfremkallende egenskaper ved å rette seg mot insektvev og motvirke det medfødte immunsystemet under infeksjon18,19. Dette hindrer arbeidet med å identifisere strategiene som nematoder har utviklet for å samhandle med insektverten. Derfor kan identifikasjon og funksjonell karakterisering gjennom gen knockdown av nematodekomponentene som også deltar i infeksjonsprosessen, forenkles ved generering av axeniske ormer. Her presenteres effektive protokoller for produksjon av økseniske entomopatogene nematoder og utførelse av RNAi-geninaktivering i H. bakteriophora.

Et kritisk skritt i begge protokollene for vellykket generering av axeniske nematoder er overflatesterilisering av H. bacteriophora og S. carpocapsae IJs14,20. Denne delen av metoden innebærer behandling av ormene med blekemiddelløsning og anses som avgjørende for suksessen til akseniseringsprosessen fordi den fjerner P. luminescens og X. nematophila bakterier fra nematode kutikula. Dette er en viktig prosedyre for å sikre at bare de mutualistiske bakteriene på overflaten av ormene blir ryddet og ikke de som er inne i parasittene. Fullføring av dette trinnet krever oppmerksomhet fordi utvidet blekemiddelbehandling vil påvirke nematodeoverlevelse.

En likhet med den nåværende akseniseringsprotokollen for S. carpocapsae nematoder med en tidligere etablert metode er bruken av X. nematophila ΔrpoS mutante bakterier som ikke er i stand til å kolonisere ormene21. En forskjell mellom dagens metodikk og en tidligere rapportert protokoll, som introduserte overflatesteriliserte nematodeegg på næringsagar22, er tilsetning av antibiotika i kulturmediet for å hemme mikrobiell forurensning som sannsynligvis vil påvirke nematodevekst og kondisjon.

RNAi ved mikroinjeksjon er en enkel og pålitelig metode for å levere RNA til oocyttene. Væskeutbruddet inne i gonaden gir visuell bekreftelse på frigjøringen av nukleinsyreoppløsningen under injeksjonsprosessen. Det ble vist at RNAi ved mikroinjeksjon er betydelig bedre enn RNAi ved soaking. Dette skyldes sannsynligvis RNAi-løsningens evne til å nå oocytter som er i forskjellige stadier av differensiering inne i gonaden.

Mens du optimaliserer prosessen, anbefales det å teste forskjellige konsentrasjoner av RNA-løsning for bedre resultater. Ulike konsentrasjoner av RNA fra 50 ng / μL til 10 μg / μL ble testet. Det ble funnet at en konsentrasjon på 6 μg / μL fungerte bedre enn andre konsentrasjoner. For å øke RNA-utbyttet under in vitro-transkripsjonstrinnet ble protokollen modifisert fra en 4 timers inkubasjonsperiode til 16 timer. Dette resulterte i en betydelig økning i det endelige utbyttet av RNA. En av nøkkelfaktorene for vellykket mikroinjeksjon er hvor lang tid en nematode bruker på injeksjonsputen. Mindre tid resulterer i en sunn overlevende nematode og sunt avkom med økt sjanse for å observere den tiltenkte fenotypen.

Den nåværende protokollen for dyrking og genetisk manipulering av entomopatogene nematoder er et betydelig bidrag til fremtidige studier innen nematologi, immunologi og vertsparasittinteraksjoner. Kombinere tilnærminger som tillater manipulering av entomopatogene nematoder, vil føre til oppdagelsen av de genetiske faktorene som definerer samspillet mellom nematodeeffektormolekyler og vertsimmunsignalkomponenter som koder for faktorer med anti-nematodeegenskaper. Det vil videre bestemme hvilke viktige nematodemolekylære komponenter som bestemmer det symbiotiske forholdet til de relaterte bakteriene. Å svare på disse spørsmålene er viktig for å forbedre landbrukspraksis og utvikle nye midler for kontroll av menneskelige parasittiske nematoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Vi takker medlemmer av Institutt for biologiske vitenskap ved George Washington University for kritisk lesing av manuskriptet. Alle grafiske figurer ble laget ved hjelp av BioRender. Forskning i I. E., J. H. og D. O'H. laboratorier har blitt støttet av George Washington University og Columbian College of Arts and Sciences tilrettelegge midler og tverrfaglige forskningsmidler.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose VWR 97062-244
Ambion Megascript T7 Kit Thermo Fisher Scientific AM1333
Ampicillin Fisher Scientific 611770250
Cell culture flask T25 Fisher Scientific 156367
Cell culture flask T75 Fisher Scientific 156499
ChoiceTaq Mastermix Denville Scientific C775Y42
Corn oil VWR 470200-112
Corn syrup MP Biomedicals/VWR IC10141301
Culture tube 10 mL Fisher Scientific 14-959-14
Eppendorf Femtotips Microloader Tips Eppendorf E5242956003
Ethanol Millipore-Sigma E7023
Falcon tube 50 mL Fisher Scientific 14-432-22
Femtojet Microinjector Eppendorf 5252000021
Filter paper VWR 28320-100
Galleria mellonella waxorms Petco -
Glass coverslip Fisher Scientific 12-553-464 50 x 24 mm
Halocarbon Oil 700 Sigma H8898
Inoculating loop VWR 12000-806
Kanamycin VWR 97062-956
Kwik-Fil Borosilicate Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100F-3 1.0 mm
LB Agar Fisher Scientific BP1425-500 LB agar miller powder 500 g
LB Broth Fisher Scientific BP1426-500 LB broth miller powder 500 g
Leica DM IRB Inverted Research Microscope Microscope Central -
MacConkey medium Millipore-Sigma M7408-250G
MEGAclear Transcription Clean-Up Kit Thermo Fisher Scientific AM1908
Microcentrifuge tube VWR 76332-064 1.5 ml
NanoDrop 2000 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-2000
Needle syringe VWR BD305155 22G
Nutrient broth Millipore-Sigma 70122-100G
Parafilm VWR 52858-076
Partitioned Petri dish VWR 490005-212
PBS VWR 97062-732 Buffer PBS tablets biotech grade 200 tab
PCR primers Azenta -
Pestle Millipore-Sigma BAF199230001 Bel-Art Disposable Pestle
Petri dish 6 cm VWR 25384-092 60 x 15 mm
Petri dish 10 mm VWR 10799-192 35 x 10 mm
Proteose Peptone #3 Thermo Fisher Scientific 211693
Yeast extract Millipore-Sigma Y1625

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lacey, L. A., et al. Insect pathogens as biological control agents: Back to the future. Journal of Invertebrate Pathology. 132, 1-41 (2015).
  2. Ozakman, Y., Eleftherianos, I. Nematode infection and antinematode immunity in Drosophila. Trends in Parasitology. 37 (11), 1002-1013 (2021).
  3. Kenney, E., Hawdon, J. M., O'Halloran, D. M., Eleftherianos, I. Secreted virulence factors from Heterorhabditis bacteriophora highlight its utility as a model parasite among Clade V nematodes. International Journal of Parasitology. 51 (5), 321-325 (2021).
  4. Bobardt, S. D., Dillman, A. R., Nair, M. G. The two faces of nematode infection: Virulence and immunomodulatory molecules from nematode parasites of mammals, insects and plants. Frontiers in Microbiology. 11, 2983 (2020).
  5. Castillo, J. C., Reynolds, S. E., Eleftherianos, I. Insect immune responses to nematode parasites. Trends in Parasitology. 27 (12), 537-547 (2011).
  6. Eleftherianos, I., Heryanto, C. Transcriptomic insights into the insect immune response to nematode infection. Genes. 12 (2), 202 (2021).
  7. Ciche, T. The biology and genome of Heterorhabditis bacteriophora. WormBook. , 1-9 (2007).
  8. Stock, S. P. Partners in crime: symbiont-assisted resource acquisition in Steinernema entomopathogenic nematodes. Current Opinion in Insect Science. 32, 22-27 (2019).
  9. Cao, M., Schwartz, H. T., Tan, C. -H., Sternberg, P. W. The entomopathogenic nematode Steinernema hermaphroditum is a self-fertilizing hermaphrodite and a genetically tractable system for the study of parasitic and mutualistic symbiosis. Genetics. 220 (1), (2021).
  10. Goodrich-Blair, H., Clarke, D. J. Mutualism and pathogenesis in Xenorhabdus and Photorhabdus: two roads to the same destination. Molecular Microbiology. 64 (2), 260-268 (2007).
  11. Abd-Elgawad, M. M. M. Photorhabdus spp.: An overview of the beneficial aspects of mutualistic bacteria of insecticidal nematodes. Plants. 10 (8), 1660 (2021).
  12. Dreyer, J., Malan, A. P., Dicks, L. M. T. Bacteria of the genus Xenorhabdus, a novel source of bioactive compounds. Frontiers in Microbiology. 9, 3177 (2018).
  13. Hallem, E. A., Rengarajan, M., Ciche, T. A., Sternberg, P. W. Nematodes, bacteria, and flies: a tripartite model for nematode parasitism. Current Biology. 17 (10), 898-904 (2007).
  14. Castillo, J. C., Shokal, U., Eleftherianos, I. A novel method for infecting Drosophila adult flies with insect pathogenic nematodes. Virulence. 3 (3), 339-347 (2012).
  15. Castillo, J. C., Shokal, U., Eleftherianos, I. Immune gene transcription in Drosophila adult flies infected by entomopathogenic nematodes and their mutualistic bacteria. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 179-185 (2013).
  16. Eleftherianos, I., Joyce, S., Ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Reynolds, S. E. Probing the tri-trophic interaction between insects, nematodes and Photorhabdus. Parasitology. 137 (11), 1695-1706 (2010).
  17. Nielsen-LeRoux, C., Gaudriault, S., Ramarao, N., Lerelcus, D., Givaudan, A. How the insect pathogen bacteria Bacillus thuringiensis and Xenorhabdus/Photorhabdus occupy their hosts. Current Opinion in Microbiology. 15 (3), 220-231 (2012).
  18. Waterfield, N. R., Ciche, T., Clarke, D. Photorhabdus and a host of hosts. Annual Review of Microbiology. 63, 557-574 (2009).
  19. Ozakman, Y., Eleftherianos, I. Immune interactions between Drosophila and the pathogen Xenorhabdus. Microbiological Research. 240, 126568 (2020).
  20. Yadav, S., Shokal, U., Forst, S., Eleftherianos, I. An improved method for generating axenic entomopathogenic nematodes. BMC Research Notes. 8 (1), 1-6 (2015).
  21. Mitani, D. K., Kaya, H. K., Goodrich-Blair, H. Comparative study of the entomopathogenic nematode, Steinernema carpocapsae, reared on mutant and wild-type Xenorhabdus nematophila. Biological Control. 29 (3), 382-391 (2004).
  22. McMullen, J. G., Stock, S. P. In vivo and in vitro rearing of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae). Journal of Visualized Experiments. (91), e52096 (2014).

Tags

Immunologi og infeksjon utgave 181 entomopatogene nematoder heterorhabditt Steinernema parasittisme vertsparasittinteraksjoner
Dyrking og genetisk manipulering av entomopatogene nematoder
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Heryanto, C., Ratnappan, R.,… More

Heryanto, C., Ratnappan, R., O'Halloran, D. M., Hawdon, J. M., Eleftherianos, I. Culturing and Genetically Manipulating Entomopathogenic Nematodes. J. Vis. Exp. (181), e63885, doi:10.3791/63885 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter