Summary
Bu protokolde kardiyopulmoner bypass yapılmadan sol göğüs duvarında küçük bir kesiden yeni domuz ven baypas greftleme yapıldı. İntimal kalınlaşma gösteren postoperatif patoloji çalışması yapıldı.
Abstract
Venöz greft hastalığı (VGH) koroner arter baypas greft (KABG) yetmezliğinin önde gelen nedenidir. Hastalık mekanizmalarının araştırılması ve terapötik stratejilerin geliştirilmesi için CABG-VGD'nin büyük hayvan modellerine ihtiyaç vardır.
Ameliyatı gerçekleştirmek için, üçüncü interkostal boşluktan kalp odasına giriyoruz ve iç meme damarını dikkatlice diseke ediyoruz ve normal saline batırıyoruz. Sağ ana koroner arter daha sonra iskemi için tedavi edilir. Hedef damar kesilir, bir şant tıkacı yerleştirilir ve greft veninin distal ucu anastomoz edilir. Asendan aort kısmen bloke edilir ve greft veninin proksimal ucu perforasyondan sonra anastomoz edilir. Greft veni açıklık açısından kontrol edilir ve proksimal sağ koroner arter bağlanır.
CABG cerrahisi, vasküler greft olarak kullanılmak üzere sol iç meme damarını toplamak için minipiglerde yapılır. Serum biyokimyasal testleri, hayvanların ameliyat sonrası fizyolojik durumlarını değerlendirmek için kullanılır. Ultrason muayenesi greft damarının proksimal, orta ve distal ucunun engelsiz olduğunu gösterir. Cerrahi modelde KABG cerrahisi sonrası histolojik inceleme ile greftte çalkantılı kan akımı, greftte intimal hiperplazi ile ilişkili venöz greft darlığı gözlenir. Buradaki çalışma, tekrarlanabilir KABG kaynaklı VGD modelinin oluşturulması için ayrıntılı cerrahi prosedürler sunmaktadır.
Introduction
Koroner kalp hastalığı mortalitesi son yıllarda önemli ölçüde azalmış olsa da, Amerika Birleşik Devletleri'ndeki orta yaşlı yetişkinlerin yarısı her yıl iskemik kalple ilgili semptomlar geliştirir ve yaşlı yetişkinlerin üçte biri koroner kalp hastalığından ölür1. Koroner arter baypas greftleme (KABG) miyokard iskemisini iyileştirmek için etkili bir cerrahi yöntemdir ve daha da önemlisi, çok damarlı koroner arter hastalığının tedavisinde yeri doldurulamaz bir cerrahi modalitedir2. Bununla birlikte, zamanla, vasküler greftler inflamasyon, intimal hiperplazi ve ilerleyici ateroskleroz geliştirir ve bu da ven greft yetmezliğine veya ven greft hastalığına (VGD) yol açtığı bilinmektedir3. CABG'den sonraki hastalarda, restenoz meydana gelirse, bazı durumlarda sadece hastalıklı kan damarı değiştirilebilir2. Yaşlı hastalar ve eklenen komorbiditeler, koroner arter baypas greftlemenin yeniden yapılmasını oldukça zorlaştırmaktadır. Aşılanmış kan damarları ile ilişkili patolojik problemlerin geciktirilmesi veya kontrol altına alınması çözülmesi gereken acil bir sorundur. Hastalık mekanizmalarının araştırılması ve terapötik stratejilerin geliştirilmesi için CABG-VGD'nin büyük hayvan modellerine ihtiyaç vardır. Araştırmacılar, fareler4, sıçanlar5, tavşanlar6 ve domuzlar7 gibi küçük ve büyük hayvanlarda hayvan VGD modellerini başarıyla kurdular. Küçük hayvanlarla karşılaştırıldığında, domuz gibi büyük hayvanlar anatomik yapılara ve insanlara benzer fizyolojik özelliklere sahiptir ve daha uzun ömürlüdür 8,9. Bu nedenle, büyük hayvanlar venöz greft hastalığındaki uzun vadeli patolojik değişiklikleri araştırmak ve ilaçların veya cihazların klinik öncesi testleri için daha uygundur. Biz ve işbirliği yaptığımız ekibimiz, domuz kalp yetmezliği modeli oluşturmak için cerrahi teknikleri başarıyla uyguladık ve bu model10'daki kardiyak patolojik değişiklikleri tanımladık.
CABG cerrahisi klinik uygulamada standartlaştırılmıştır, ancak VGD hayvan modellerinin kurulmasına uygulandığında, türler arasındaki farklar, hayvan ekipman ve tesislerinin edinilmesi, hayvan cerrahi operasyonları ve hayvan besleme ve hemşireliği araştırmacılar için büyük zorluklardır. Klinik uygulamada olduğu gibi, VGD hayvan modellerini oluşturmak için kullanılan CABG cerrahisi yaklaşımları arasında orta hat sternotomi11 ve sol lateral torakotomi12 bulunmaktadır. Orta hat sternotomi daha sık kullanılır13,14. Bununla birlikte, bu yaklaşımın hem insanlar hem de hayvanlar için yüksek riskleri vardır. Thankam ve ark. tarafından bildirilen çalışmada, modelleme için kullanılan altı domuzdan ikisi ameliyat sırasında öldü15. Yüksek model mortalitesi çalışma maliyetlerini arttırır ve sonuçların doğruluğunu etkiler. Bir çalışma daha önce sol göğüs duvarı insizyonunun domuzlarda CABG'ye bağlı VGD'yi oluşturmak için mümkün olduğunu göstermiştir11. Burada, bu çalışma, minidomuzlarda KABG kaynaklı bir VGD modeli için tekrarlanabilir bir cerrahi oluşturmak için adım adım bir protokolü tanımlamayı ve bu modelin fenotipini değerlendirmeyi amaçlamaktadır. Deneysel protokol, kalp cerrahisi ve anestezi ekipleri tarafından ortaklaşa tasarlanmıştır. Sol üçüncü interkostal boşluk için cerrahi yaklaşım, ameliyat öncesi laboratuvarda bulunan diğer minipiglerin kadavralarına göre belirlendi ve anestezi yöntemi merkez16'da kullanılan yönteme göre uygulandı. Hayvan modellerini değerlendirmek için kan biyokimyasal testleri, ultrasonik muayene ve histoloji incelemesi yapıldı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı ile ilgili prosedürler, Guangdong Laboratuvar Hayvanları İzleme Enstitüsü Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Tüm deneyler Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na (8. Baskı, 2011, Ulusal Araştırma Konseyi, ABD) uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Cerrahi prosedür Şekil 1'de gösterilmiştir.
1. Hayvanların ameliyat öncesi hazırlanması
- 30-35 kg ağırlığındaki 10 adet 3 aylık erkek minidomuzu rastgele sahte gruba (n = 5) ve VGD grubuna (n = 5) bölün.
- Vücut kitle indeksini (VKİ) kullanarak domuzların ameliyat öncesi ve sonrası sağlık koşullarını değerlendirir. VKİ'yi aşağıdaki gibi hesaplayın:
BMI = vücut ağırlığı (kg)/(vücut uzunluğu [cm] × vücut uzunluğu [cm])
NOT: Vücut uzunluğu, domuzun burnundan kuyruğun tabanına kadar ölçülür. - Anestezi sonrası aspirasyonu önlemek için ameliyattan önce hayvanları 12 saat boyunca hızlandırın. Bir anestezi makinesi, gaz, anestezik ilaçlar, anestezi boru hattı, özel bir laringoskop ve cerrahi aletler, bir kaburga tutucu, dikişler, tiroid retraktörü, cerrahi forseps vb. dahil olmak üzere anestezi cihazları ve cerrahi aletler hazırlayın. Ameliyatta kullanılacak tüm aletleri sterilize edin.
2. Hayvanların ameliyata hazırlanması
- Hayvanları tartın ve anestezik dozu hesaplayın. 2 mg / kg 1: 1 Tiletamin ve Zolazepam, 0.2 mg / kg diazepam ve 0.02 mg / kg atropin17'den oluşan anestezik karışımı kas içinden uygulayın. İntraoperatif ağrı kesici 30 için fentanil (50 mg / kg) kullanın.
- Uygun bir anestezik düzlemin elde edildiğinden emin olun ve kulak erişimini sağlamak için marjinal kulak damarına yerleşik bir venöz kateter (20G) yerleştirin. Domuzu ameliyat masasına aktarın ve sırtüstü pozisyona getirin. Uzuvları bandajlarla hareketsiz hale getirin ve kafayı steril bir örtü ile yükseltin.
NOT: Anestezi durumu, göz küresinin santral fiksasyonu, miyoz, pupilla refleksi kaybı ve ağrı refleksi kaybı ile izlendi. Kalp atış hızı ve kan basıncı taban çizgisinden daha düşük bir seviyede tutuldu. Cerrah, felç altındaki HR, BP ve diğer parametreleri izlemeli ve HR başlangıçtan% 20 > artarsa anestezik dozu arttırmalıdır. - Epiglottis ve glottis'i veteriner laringoskop kullanarak ortaya çıkarın. 7.0-7.5Fr tüp ile trakea entübasyonu yapın ve anestezi solunum devresine bağlayın.
NOT: Vantilatör, gelgit hacmi 280 mL, inspiratuar/ekspiratuar oranı 1:2, solunum hızı 20 kez/dak ve pozitif ekspiratuar basınç (5 cm H2O) ile sürekli pozitif basınçlı ventilasyon için kullanılır. - Cerrahi işlemler sırasında kasları gevşetmek için intravenöz olarak vekuronyum bromür (0.1 mg / kg) enjekte edin ve anesteziyi 16-20 bpm solunum hızında ve 10 mL / kg'lık bir gelgit hacminde tutmak için% 2 izofluran kullanın.
NOT: Vekuronyum, felçli hayvanlarda yeterli anestezi derinliğini sağlamak için verilir, çünkü özellikle indüksiyon ilacı ve izofluran dozu önerilenin alt ucundadır. - Anestezi altındayken kuruluğu önlemek için domuzun gözlerinde veteriner merhem kullanın. Domuzun vücut ısısını 38 ° C ± 5 ° C'de tutmak için elektrikli battaniyeler kullanın.
- Kalp atış hızını, kan oksijen seviyelerini ve vücut ısısını izlemek için bir elektrokardiyogram kullanın.
3. Cerrahi işlemler
- Sol göğüs duvarını tıraş edin ve cerrahi bölgeyi sol mandibuler açıya, göbek kordonuna, arka aksiller hatta sola ve aksiller öne doğru aseptik olarak hazırlamak için% 0.7 iyot ve% 75 alkolden oluşan üç alternatif tur uygulayın. Ameliyat alanının etrafına steril bir cerrahi örtü yerleştirin.
- Üçüncü sol interkostal boşluğa elektrikli bıçakla 7-10 cm'lik enine bir kesi yapın ve deri altı dokuları katman katman ayırın (Şekil 2A). Üçüncü kaburganın 5-6 cm'lik bir segmentini kemik makasla çıkarın ve üçüncü kaburga-sternal eklemi açığa çıkardıktan sonra iç meme damarını bir retraktör ile açığa çıkarın (Şekil 2B).
- İç meme damarını, sternumun sol tarafındaki sol iç meme arteri ile birlikte bulun. Vasküler forseps ile iç meme damarının künt bir diseksiyonunu gerçekleştirin.
- Sol iç meme damarının dallarının elektrikli bıçakla elektrokoagülasyonu ile hemostaz yapın. Hemostaz eksikse, hemostaz için pamuk ipliği ligasyonu kullanın. Hasat sırasında damarın iki ucunu bağlayın ve işaretleyin (Şekil 2C).
- 2 mL heparin sodyum çözeltisi ve 98 mL normal salin ekleyerek heparin normal salin hazırlayın. Damarı çıkardıktan sonra, ön işlem için damar içine heparin normal salin enjekte edin (Şekil 2D). Ardından, damarı normal salin içine koyun ve yedekleme için saklayın.
- Yukarıda tarif edildiği gibi benzer bir kesi yapın ve sahte gruptaki iç meme damarını çıkarın. Perikard'ı açın, ardından sahte gruptaki göğüs duvarını kapatın. Koroner arter baypas grefti olmadan patolojik kontrol için sahte grubun iç meme damarını kullanın.
- Sağ koroner arter gövdesini ortaya çıkarmak için perikard üzerinde elektrikli bıçakla ~ 7 cm'lik bir kesi yapın. Perikardın askıya alınması ve ipsilateral taraftaki cilde 1-0 cerrahi dikişlerle dikilmesi (Şekil 2E). Sağ koroner arter gövdesini çevre dokulardan ayırın (Şekil 2E).
- Aortun yakınındaki izole sağ koroner arterin proksimal ucunun altındaki blokaj bandını bir tel kanca ile atlayın ve bloke bandını sıkılaştırarak ve gevşeterek miyokardın üç döngü 2 dakikalık iskemi ve 5 dakikalık reperfüzyonla tedavi edilmesi (Şekil 2F). İskemi/reperfüzyon ön koşullandırması sırasında elektrokardiyogram monitörü ile kalbin elektriksel aktivitesini izleyin (Şekil 2G).
NOT: Sağ koroner arter tıkandığında, elektrokardiyogram artmış kalp atış hızı ve ST segmenti yükselmesi gösterir. - Doğru koroner kan akışını engellemek için bandı sıkın. Kan damarlarını kaplayan epikardı kesin. Koroner arter duvarını açığa çıkarın ve cerrahi bir bıçağın ucu ile kan damarlarının ön duvarının merkezine karşı uzunlamasına kesin.
- Lümeni kestikten sonra, kesiyi makasla büyütün ve koroner bir şant yerleştirin. Şantın bir ucunu bir bobin ile yırtıktan distal koroner artere sokun. Koroner arterlerdeki kanı içi boş koroner şanta sokarak açık bir ameliyat alanı sağlayın (Şekil 2H).
- 7-0 polipropilen sütür ile iç meme damarı ile sağ koroner gövde arasında uçtan uca sürekli bir dikiş yapın (Şekil 2I). Yükselen aortun ortasında, yükselen aortun sol anterolateral duvarını yarı oklüzyon kelepçesi ile tıkayın.
- Adventitinin kesildiği aort duvarında küçük bir kesi yapmak için cerrahi bir bıçak kullanın, zımbanın baş ucundaki sürgülü şaftın baş ucunu bu kesiden aort boşluğuna yerleştirin, sürgülü şaftı dışa doğru daraltın ve üstündeki dairesel bıçak arteriyel duvarın bir parçasını keser. Zımba ile kesilen doku bloğu yaklaşık 3 mm çapındadır (Şekil 2J).
- Şantı çıkarın. 6-0 polipropilen sütür ile iç meme damarı ile aort duvarı arasında uçtan uca sürekli bir dikiş yapın (Şekil 2K). Yarı oklüzyon kelepçesini açın.
- Ultrason kullanarak sağ koroner arter gövdesinin anastomoz bölgesine proksimal bypass akışını kaydedin. Elektrokardiyogramı kullanarak kalbin elektriksel aktivitesini izleyin (Şekil 2L).
- Kan ve sıvıların boşalmasına izin vermek için göğüs boşluğuna geçici bir drenaj tüpü (Fr: 16) yerleştirin. Perikard insizyonunu 1-0 pamuklu bir iplik kullanarak dikin ve her bir tabakaya penisilin (yaklaşık 0.5 g) tozu yerleştirirken göğüs tabakasını katman katman kapatın (içeriden dışarıya: Plevra tabakası, kas tabakası, deri altı doku tabakası, cilt tabakası). Cilt insizyonunu 1-0 pamuklu bir iplik kullanarak diktikten sonra drenaj tüpünü çıkarın.
4. Ameliyat sonrası bakım
- Hayvanlar kendiliğinden nefes almaya döndükten sonra endotrakeal tüpü çıkarın. Anestezi uzmanı, hayvanın yaşamsal değerlerini (örneğin, solunum hızı, kalp atış hızı, oksijen doygunluğu, vb.) değerlendirmeli ve hayvanlar uyandıktan ve kendiliğinden aktiviteye döndükten sonra EKG'yi çıkarmalıdır. Hayvanları beslenme odasına geri gönderin ve sahte hayvanları üreme odasındaki başka bir kaleme yerleştirin. Hayvanları elektrikli bir battaniyeyle sıcak tutun. Ameliyattan sonra her saat başı hayvanları gözlemleyin (en az 4 kez).
- Ameliyattan sonraki gün hayvanı besleyin. Postoperatif trombozu önlemek ve yara ağrısını azaltmak için hayvan yemine 7 gün boyunca günde 2 kat aspirin (200 mg) ekleyin.
NOT: Aspirasyonu önlemek için ameliyat günü hayvanları beslemekten kaçının. - Postoperatif enfeksiyonu önlemek için hayvana günde 1x penisilin intramüsküler enjeksiyonu uygulayın (kg başına 14.000 ünite).
5. Ultrasonik muayene
- CABG ameliyatından sonra, yüksek frekanslı lineer dizi probunu sarmak için steril bir ultrasonik prob manşonu kullanın. Probu venöz greftin yüzeyine yerleştirin.
- Greftin ana hatlarını iki boyutlu ultrason modunda görüntüleyin, ardından greftteki kan akışını tespit etmek için renkli Doppler moduna geçin.
6. Venöz greft doku toplama
- Biyokimyasal test için kulak damarının venöz devresinden 10 mL kan örneği toplayın. (Tablo 1). Kan örneğini 5 dakika boyunca 1.000 x g'de santrifüj yapın ve otomatik bir biyokimyasal analizör ile biyokimyasal testler yapın.
- Hayvanı daha önce tarif edildiği gibi anestezi yapın. Anestezi derinliğinin doğrulanması üzerine, kulak marjinal veninden veya ön ayak damarından% 10 potasyum klorür 0.5mL / kg vücut ağırlığı enjekte edin. Daha sonra, ameliyattan 30 gün sonra damar greftini toplamak için elektrikli bıçakla 10 cm'lik bir medyan sternal kesi yapın. Vücut pozisyonunu adım 2.2'deki gibi sabitleyin ve sterilizasyon ve bir örtünün yerleştirilmesinden sonra, sternumu bölmek için medyan sternum insizyonu yapın. Ayırma sırasında, ana kan damarlarından ve kalpten kaçının ve aşılanmış kan damarlarını katman katman ayırın.
- Kalbe bağlanan büyük kan damarlarını hızla kesin, kalbi ve yükselen aortu buz yongaları üzerine yerleştirin ve greft vasküler köprüsünü, bağlı aortu ve sağ koroner arteri çıkarın. Tüm numuneleri 4 °C'de normal salinle durulayın.
- Yaklaşık 3-4 cm büyüklüğündeki tüm greft damarını alın, 4-5 eşit parçaya bölün ve kriyoprezervasyon tüplerine aktarın. Donmak için tüpleri hızlı bir şekilde sıvı azot içine koyun ve depolama için -80 °C ultra düşük sıcaklıktaki dondurucuya geçin.
- Analiz için, grefti buz soğuk% 0.9 salin ile durulayın ve% 4 paraformaldehit çözeltisine sabitleyin. Doku bloğu boyutunun 1:10'luk fiksatif çözeltiye oranını koruyun ve dokuyu 12 saatten fazla sabitleyin.
- Bölümleri 3 dakika boyunca 50 mL sulu hematoksilin çözeltisinde sabitleyin. Her biri 10 s için 50 mL% 0.5 hidroklorik asit etanol ve 50 mL% 0.2 amonyak suyu ile yıkayarak bölümleri ayırın.
- Akan su ile 1 saat durulayın ve ardından 3 dakika bekleterek damıtılmış suda temizleyin. Her biri 10 dakika boyunca% 70 ve% 90 etanol içinde kurutun. 2-3 dakika boyunca 50 mL% 0.5 alkol eozin boyama çözeltisine yerleştirin.
- Lekeli bölümleri 10 dakika boyunca saf etanol ile kurutun ve ardından numuneleri şeffaf hale getirmek için 10 dakika boyunca saf ksilenin içine batırın. Şeffaf bölümleri nötr yapıştırıcı ile damlatın ve bir kapak kayması ile örtün. Patolojik bölümleri 40x büyütmede bir ışık mikroskobu altında gözlemleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
VKİ ve serum biyokimyasal indeksleri
Sahte ve VGD grupları arasındaki VKİ anlamlı olarak farklı değildi (sahte vs VGD, 22.05 kg/cm2 ± 0.46 kg/cm2 ve 21.14 kg/cm2 ± 0.39 kg/cm2, p = 0.46). Serum biyokimyasal sonuçları Tablo 1'de listelenmiştir. Aspartat aminotransferaz (AST, sahte vs VGD, 25.25 IU / L ± 1.88 IU / L vs 31.5 IU / L ± 2.58 IU / L), serum bilirubin (sahte vs VGD, 2.5 μmol / L ± 0.47 μmol / L vs 4.5 μmol / L ± 0.14 μmol / L), toplam bilirubin (sahte vs VGD, 0.025 μmol / L ± 0.14 μmol / L vs 0.92 μmol / L ± 0.33 μmol / L) dahil olmak üzere dört biyokimyasal indekste istatistiksel olarak anlamlı değişiklikler bulundu. ve kreatinin (sahte vs VGD, 92.75 μmol / L ± 4.15 μmol / L vs 141.75 μmol / L ± 12.65 μmol / L).
Ultrasonik muayene
Sahte (n = 5) ve VGD gruplarındaki (n = 5) tüm hayvanlar hayatta kaldı. CABG'nin cerrahi prosedürleri Şekil 1'de gösterilmiştir. Ortalama ameliyat süresi 105 dakika ± 25 dakika (dağılım: 90-160 dk), ortalama intraoperatif kanama hacmi 85 mL ± 35 mL (dağılım: 50-200 mL) idi. Çalışma süresinin etkisi esas olarak operatörün yeterliliğinin insandan domuza geçişidir ve özel bir önemi yoktur. İnsizyon anastomozundan trakeal ekstübasyona kadar geçen ortalama süre 17 dakika ± 5 dakika (aralık: 15-30 dakika) idi. Ultrason muayenesi, greftlenmiş damarın kan akışının normal koroner artere kıyasla kısmi yetersizliği olduğunu ve genel kan akımı yönünün genellikle normal olduğunu gösterdi (Şekil 3). Postoperatif dönemde pnömotoraks, tamponad, enfeksiyon veya diğer ciddi komplikasyonlar gözlenmedi. Sham ve VGD grupları arasında ameliyat sonrası 1 ay boyunca ağırlık veya VKİ açısından anlamlı fark saptanmadı.
Greft damarının proksimal ucuna (Şekil 3A,B), damar boşluğuna (Şekil 3C,D) ve distal ucuna (Şekil 3E,F) ultrasonik muayene yapıldı. Retrograd akım greft damarının proksimal ve distal uçlarında gözlendi; ancak kan ekstravazasyonu gözlenmedi.
Damarlardaki patolojik değişiklikler
Her venöz greft uzunluklarına göre eşit olarak üç segmente ayrıldı ve değerlendirme için her segmentten bir bölüm seçildi ve koroner arter darlığı için modifiye Proudilit sınıflandırmasına göre sınıflandırıldı18. Üç bölümden alınan ortalama değerler, oklüzyon derecesinin sonuçları olarak kabul edilmiştir. Spesifik sınıflandırma aşağıdaki gibiydi: derece I = 0 puan, restenoz olmadan normal; derece II = 1 puan, hafif darlık <% 30; derece III = 2 puan,% 30 ila% 50 arasında darlık; derece IV = 3 puan,% 50 ila% 90 arasında ciddi darlık; derece V = 4 puan, alt toplam oklüzyon >% 90; ve derece VI = 5 puan, toplam tıkanıklık, venöz greftlere kan akışı olmadan. Koroner arter darlığı için modifiye Proudilit sınıflaması nicel sonuçları değerlendirmek için benimsenmiştir. Sahte grup için sonuç 0.00 ± 0.00 idi, bu da vasküler tıkanıklık olmadığını gösterirken, CABG grubu için sonuç 3.12 ± 1.22 idi. Bu nedenle iki grup arasındaki fark anlamlıydı (p < 0.05, Tablo 2).
Mikroskop altında, sahte grupta, tunika intima, tunika media ve venöz greftin venöz duvarı normal görünüyordu. VGD grubunda, venöz greftlerin tunika intima ve tunika ortamı, KABG cerrahisinden 30 gün sonra anlamlı olarak kalınlaştı. Tunika intima, tunika medyasından belirsiz bir şekilde ayrıldı. Tunika ortamının elastik tabakası kayboldu (Şekil 4). Venöz greftin lümeni hiperplastik dokularla doluydu (Şekil 4). Damar çapında, anlamlı bir değişiklik gözlenmedi.
Şekil 1: Prosedürün ana hatları. (A-C) Operasyon öncesi: Minipigleri tartın, defibrilatör ve ventilatörün performansını kontrol edin ve ventilasyon tüpünü bağlayın. (D-F) Anestezi: Minipiglere intramüsküler anestezi enjeksiyonu uygulayın, minipigi ameliyat masasına sabitleyin, trakeal entübasyon için hava yolunu tamamen açığa çıkarın, ventilatörü bağlayın ve anesteziyi sürdürmek için inhalasyon anestezisi kullanın. (G-I) Operasyon sırasında: Minipiglerde kardiyak fonksiyonun ameliyat öncesi ultrason değerlendirmesini yapın ve sol göğüs duvarı insizyonundan koroner arter baypas greftlemesini tamamlayın. (J-L) Ameliyat sonrası: Yaraları anastomoz edin ve ameliyat sonrası bakım ve minidomuzların beslenmesine dikkat edin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Cerrahi işlem. (A) Göğüs duvarını kesmek, (B) iç meme damarını izole etmek, (C) iç meme damarını çıkarmak, (D) heparin ön koşullandırması yapmak, (E) perikardın askıya alınması, (F) miyokard iskemisi reperfüzyonu yapmak, (G) EKG değişikliklerini izlemek, (H) koroner kan akışını bloke etmek, (I) greft damarının proksimal ucunu anastomoz etmek, (J ) distal koroner anastomoz bölgesi, (K) koroner arterlere distal anastomozlar, (L) tam koroner arter baypas greftleme. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Ultrasonik muayene. Koroner arter baypas greftinin tamamlanmasından sonra, greftlenmiş damarın kan akış açıklığı ultrason ile değerlendirilir. (A,C,E) Normal koroner kan akımı görüntüleri. Sürekli kan akımı sinyalleri, aşılanan damarların (B) proksimal, (D) orta ve (F) distal uçlarında görülür. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Histolojik analiz . (A) Normal internal meme veni patolojik kesitinde açık vasküler hiyerarşi saptandı ve lümen darlığı saptanmadı. (B,C) Koroner arter transplantasyonundan 30 gün sonra iç meme damarının patolojisi, damarın intimasının değişen derecelerde kalınlaştığını ve lümenin açıkça daraldığını gösterdi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Gösterge | Şam Grubu (n=5) | Greft Grubu (n=5) |
| ALT (IU/L) | 46 ±5,11 | 47.75±7.88 |
| AST (IU/L) | 25,25 ±1,88 | 31,5±2,58* |
| Toplam Protein (IU/L) | 63,12 ±,138 | 60.17±1.91 |
| Albümin (IU/L) | 32,25 ±0,77 | 23.77±5.61 |
| Globulin (g/L) | 30.87 ±.136 | 36.4±6.03 |
| Serum Bilirubin (μmol/L) | 2,5 ±0,47 | 4,5±0,14* |
| Toplam Bilirubin (μmol/L) | 0.025 ±0.14 | 0,92±0,33* |
| Alkali Fosfataz (IU/L) | 103 ±19,3 | 104±16.04 |
| Glukozamin (mmol/L) | 4.44 ±0.36 | 5.96±0.42 |
| Üre Azotu (mmol/L) | 2,46 ±0,17 | 2.89±0.65 |
| Serum Kreatinin μmol/L | 92,75 ±4,15 | 141,75±12,65* |
| Toplam Kolesterol (mmol/L) | 2.37 ±0.12 | 2.16±0.06 |
| Trigliserit (mmol/L) | 0.48 ±0.10 | 0.25±0.05 |
| Yüksek Yoğunluklu Lipoprotein mmol / L | 1.05 ±0.07 | 1.03±0.07 |
| Çok Düşük Yoğunluklu Lipoprotein (mmol / L) | 1.43 ±0.06 | 1.29±0.04 |
| Laktat Dehidrogenaz (mmol/L) | 384,75 ±26,8 | 478,25±49,58* |
Tablo 1. Serum biyokimyasal göstergeleri. Analiz için istatistiksel analiz yazılımı kullanıldı. Veriler ortalama ± standart hata (n=5) olarak ifade edildi. Ölçüm verilerinin karşılaştırılması Öğrencinin t-testi ile analiz edilmiştir. 0.05'ten küçük bir p değeri istatistiksel anlamlılığı gösterdi. *p < 0.05, CABG vs. sham.
| Proudilit sınıflandırması | ||||||
| S. Numune numarası | CABG ameliyatından hemen sonra skor | CABG ameliyatından 30 gün sonra skor | ||||
| 1 | 0, 0, 0 | 2, 2, 2 | ||||
| 2 | 0, 0, 0 | 1, 2, 2 | ||||
| 3 | 0, 0, 0 | 2, 3, 2 | ||||
| 4 | 0, 0, 0 | 3, 2, 2 | ||||
| 5 | 0, 0, 0 | 2, 1, 2 | ||||
Tablo 2. Greft tıkanıklık derecelerinin ameliyattan hemen sonra ve ameliyat sonrası 30 gün içinde istatistiksel sonuçları. Modifiye Proudilit sınıflandırma ölçeği vasküler oklüzyon derecesi için kullanıldı: derece I = 0 puan, restenoz olmadan normal; derece II = 1 puan, hafif darlık <% 30; derece III = 2 puan,% 30 ila% 50 arasında darlık; derece IV = 3 puan,% 50 ila% 90 arasında ciddi darlık; derece V = 4 puan, alt toplam oklüzyon >% 90; ve derece VI = 5 puan, toplam tıkanıklık, venöz greftlere kan akışı olmadan. Veriler, uzunluklarına göre eşit olarak üç bölüme ayrılmış beş venöz greftten elde edilen sonuçları içerir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada, KABG kaynaklı VGD modeli geliştirilirken hayvan seçimi, alet hazırlama, cerrahi prosedürler ve postoperatif değerlendirme protokolü ayrıntılı olarak açıklanmıştır. KABG cerrahisi öncesi ve sonrası venöz greftin ultrasonik muayenesini ve ameliyattan 30 gün sonra greftin histolojik incelemesini yaptık. CABG ameliyatından önce iç meme damarındaki kan akımı normalken, iç meme damarının greftinde retrograd akım gözlendi. Sahte operasyon grubu ile karşılaştırıldığında, operasyon grubundaki hayvanların karaciğer ve böbrek fonksiyonları bir dereceye kadar hasar görmüştür. Koroner greft hastalığı göz önüne alındığında, miyokard kontraktilitesinin zayıflaması periferik dokuların yetersiz perfüzyonuna neden olmuştur. Venöz greftte CABG cerrahisinden 30 gün sonra intimal hiperplazi ve vasküler remodellenme görüldü (Şekil 4). Kan damarlarının etrafındaki fibrotik değişiklikler yara iyileşmesi ile ilişkilidir, fibroblast proliferasyonu 1. günden 3. güne kadar yara iyileşmesinin erken dönemlerinde meydana gelir 19. gün, aktif tip I kollajen ve fibronektin üretimi 4. günden 6. güne ve sitoplazmik α-SM aktin fibril agregasyonu 7. günden14. güne kadar gerçekleşir. Stres lifleri, yara kasılması20 ile çakışan miyofibroblastların oluşumunu ima eder. Perivasküler fibrozisin cerrahi sonuçları etkileyip etkilemediği belirsizdir.
Burada, damar grefti hastalığı modelini oluşturmak için minipigleri seçtik. Sıçanlar gibi küçük hayvanlar VGD21'in patolojik mekanizmalarını incelemek için kullanılmış olsa da, domuzlar boyut, anatomi ve fizyoloji bakımından insanlara benzerdir ve bu nedenle insan kalp hastalığının patogenezini incelemek veya cihaz gelişimi için bir araç olarak daha uygundur22. İç meme damarları da sıklıkla klinik olarak greft olarak seçilir. İki bağımsız gruptan yapılan klinik çalışmalar, internal meme ven greftlerinin yüksek ven grefti lezyonu insidansı özelliğine sahip olduğunu ve çalışmamızda da aynı patolojik değişikliklerin gözlendiğini bulmuştur (Şekil 4)23,24. Klinik pratikte olduğu gibi, hayvan cerrahisinde de uygun cerrahi yaklaşımın seçilmesi ameliyatın başarısı için kritik öneme sahiptir; Burada Hocum'un sol torakotomi11'ine atıfta bulunduk. Sol torakotominin ameliyat alanını net bir şekilde ortaya çıkarabildiğini, insizyonun etrafındaki anatominin tanımlanmasının kolay olduğunu ve kanama miktarının düşük olduğunu bulduk. Ek olarak, medyan torakotomi ile karşılaştırıldığında, lateral torakotomi sternumun kesilmesini gerektirmez, bu nedenle cerrahi stres azaltılabilir.
Anestezi, cerrahi bir modelin başarısı için çok önemlidir. Bu çalışmada protokol Kotani ve ark.'dan anestezi indüksiyonu olarak ketamin ve diazepam kombinasyonu ve idame anestezisi olarak izofluran inhalasyonu ile modifiye edilmiştir25. Ek olarak, bir araştırma grubu intravenöz ilaçların idame anestezisi için de uygun olduğunu göstermiştir26. Domuzlarda endotrakeal entübasyon bir hayvan cerrahi ekibi için zor olabilir. İnsan hava yolu ile karşılaştırıldığında, domuzların trakea anatomisi, glottis'in maruz kalmasını zorlaştırır27. Burada, glottis'i daha iyi ortaya çıkarmak için, domuzun glottis'ini ortaya çıkarmaya yardımcı olmak için domuzun üst çenesine bastırdık (Şekil 1D). Öte yandan, direkt laringoskopi veya fiber optik bronkoskopi kullanımı endotrakeal entübasyonda glottis görselleştirilmesine yardımcı olacaktır28.
Venöz greft hastalığının patolojik durumu esas olarak üç aşamaya ayrılır: 1) akut evre (1 ay içinde) tromboz; 2) subakut evre (1-12 ay) intimal hiperplazi; 3) greft darlığı ve tıkanıklık nedeni olan aterosklerozun geç evre (12 aydan fazla) oluşumu29. VGD'nin akut fazındaki değişikliklerin çoğu operasyonel faktörlerle ilgilidir ve geç evrede oluşan ateroskleroz geri dönüşümsüzdür. Subakut endometriyal kalınlaşmanın incelenmesi VGH'nin patogenezi, tedavisi ve önlenmesi açısından çok önemlidir. Seçilen greft damarlarının büyük safen venin dikey damarlarından farklı olması da kritik öneme sahiptir. İç meme damarı genellikle daha az hidrostatik basınç taşır ve transplantasyondan sonra patolojik değişiklikler büyük safen venden daha hızlıdır. Modelimizde greftli damarın lümenini tıkayan tipik intimal hiperplazi ameliyattan 30 gün sonra yapılan histolojik incelemede görülmüş ve diğer klinik çalışmalarda da aynı patolojik değişiklikler gözlenmiştir23,24. Minidomuzlarda iç meme damarının seçilmesinin modelleme sonuçları fenotipte kararlıdır, modelleme süresi kısadır ve VGD'nin patolojik değişikliklerinin azalma derecesi yüksektir, bu da takip araştırmalarının gelişmesine elverişlidir.
Modelin ayrıca bazı sınırlamaları vardır. Büyük hayvan modelleme sürecindeki bazı ince operasyonlar, hayvan yaşamsal belirtilerinin intraoperatif izlenmesi ve postoperatif resüsitasyon, profesyonel cerrahların ve anestezistlerin eğitime rehberlik etmesini ve hayvanların kazara ölümlerini büyük ölçüde azaltmasını gerektiren belirli pratik deneyimler gerektirir. Büyük hayvan cerrahisi, daha küçük enstitüler için daha ağır bir yük olabilecek belirli deney alanları, profesyonel personel ve yeterli finansal destek gerektirir.
Sonuç olarak, profesyonellerin rehberliğinde, iyi donanımlı laboratuvarlar, VGD'nin tedavisi için büyük önem taşıyan bu minipig VGD modelini kurarak VGD'nin patolojik değişikliklerini daha fazla inceleyebilirler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Yazarlar, teknik destek, hayvan bakımı ve numune toplama için Guangdong Laboratuvar Hayvanları İzleme Enstitüsü'ne teşekkür eder. Ayrıca ultrasonik muayenede teknik destek için Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd.'ye teşekkür ederler. Bu çalışma Guangdong Bilim ve Teknoloji Programı, Çin ve Jinan Üniversitesi Merkez Üniversiteleri Temel Bilimsel Araştırma İşletme Giderleri Projesi (2017A020215076, 2008A08003 ve 21621409) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aortic Punch | Medtronic Inc. , America | 3.0mm, 3.5mm, 4.0mm | Used for proximal coronary bridge anastomosis |
| Automatic biochemical analyzer | IDEXX Laboratories, Inc. America | Catalyst One | |
| Cardiac coronary artery bypass grafting instrument kit | LANDANGER, France | ||
| Cardiogram monitor | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co, Ltd | MEC-1000 | |
| Coronary Shunt | AXIUS | OF-1500, OF-2500, OF-3000 | The product temporarily blocks the coronary artery during arteriotomy to reduce the amount of bleeding in the surgical field and provide blood flow to the distal end during anastomosis. The Axius shunt plug is not an implant and should be removed prior to completion of the anastomosis. |
| Defibrillator | MEDIANA | Mediana D500 | |
| Diazepam | Nanguo pharmaceutical Co. LTD, Guangdong, China | H37023039 | Narcotic inducer |
| Disposable manual electric knife | Covidien, America | E2516H | |
| Electric negative pressure suction machine | Shanghai Baojia Medical Instrument Co, Ltd | YX932D | |
| Esmolol | Guangzhou Wanzheng Pharmaceutical Co. LTD | H20055990 | Emergency drugs |
| Ice machine | Local suppliers, Guangzhou, China | ||
| Lidocaine | Chengdu First Pharmaceutical Co. LTD | H51021662 | Emergency drugs |
| Luxtec headlight system | Luxtec, America | AX-1375-BIF | Used for lighting fine parts during operation |
| Medical operation magnifier (glasses) | Germany Lista co, LTD | SuperVu Galilean 3.5× | Used for fine site operation during operation |
| Multi-function high-frequency electrotome | Shanghai Hutong Electronics Co, Ltd | GD350-B | |
| Nitrogen canister | Local suppliers, Guangzhou, China | ||
| Nonabsorbable surgical suture (polypropylene suture) | Johnson & Johnson, America | 6-0, 7-0 | Used to suture blood vessels. |
| Nonabsorbable suture (cotton thread) | Covidien, America | 1-0 | Used for skin and muscle tissue tugging |
| Open heart surgery instrument kit | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., LTD | ||
| Propofol injection | Xi 'an Libang Pharmaceutical Co. LTD | H19990282 | Anesthetic sedative |
| Refrigerator | Local suppliers, Guangzhou, China | ||
| Respiratory anesthesia machine for animal | Shenzhen Reward Life Technology Co, Ltd, China | R620-S1 | |
| Semi-occlusion clamp | Xinhua Surgical Instrument Co., Ltd. | ZL1701RB | Temporarily cut off the aortic flow |
| vecuronium bromide | Richter, Hungary | JX20090127 | Muscle relaxant |
| Veterinary ultrasound system | Royal Philips, Netherlands | CX50 | |
| Zoletil | Virbac, France | Zoletil 50 | Animal narcotic |
References
- Lloyd-Jones, D., et al. Executive summary: Heart disease and stroke statistics--2010 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 121 (7), 948-954 (2010).
- Taggart, D. P. Contemporary coronary artery bypass grafting. Frontiers of Medicine. 8, 395-398 (2014).
- Wolny, R., Mintz, G. S., Pregowski, J., Witkowski, A. Mechanisms, prevention and treatment of saphenous vein graft disease. The American Journal of Cardiology. 154, 41-47 (2021).
- Schachner, T., Laufer, G., Bonatti, J. In vivo (animal) models of vein graft disease. European Journal of Cardio-thoracic Surgery: Official Journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 30 (3), 451-463 (2006).
- Suggs, W. D., et al. Antisense oligonucleotides to c-fos and c-jun inhibit intimal thickening in a rat vein graft model. Surgery. 126 (2), 443-449 (1999).
- Jiang, Z., et al. A novel vein graft model: Adaptation to differential flow environments. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 286 (1), H240-H245 (2004).
- O'Brien, J. E., et al. Early injury to the media after saphenous vein grafting. The Annals of Thoracic Surgery. 65 (5), 1273-1278 (1998).
- Zou, Y., et al. Mouse model of venous bypass graft arteriosclerosis. The American Journal of Pathology. 153 (4), 1301-1310 (1998).
- Klyachkin, M. L., et al. Postoperative reduction of high serum cholesterol concentrations and experimental vein bypass grafts. Effect on the development of intimal hyperplasia and abnormal vasomotor function. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 108 (3), 556-566 (1994).
- Tan, W., et al. A porcine model of heart failure with preserved ejection fraction induced by chronic pressure overload characterized by cardiac fibrosis and remodeling. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 677727 (2021).
- Hocum Stone,, L, L., et al. Magnetic resonance imaging assessment of cardiac function in a swine model of hibernating myocardium 3 months following bypass surgery. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 153 (3), 582-590 (2017).
- Gedik, N., et al. Proteomics/phosphoproteomics of left ventricular biopsies from patients with surgical coronary revascularization and pigs with coronary occlusion/reperfusion: Remote ischemic preconditioning. Scientific Reports. 7 (1), 7629 (2017).
- Tsirikos Karapanos,, N,, et al. The impact of competitive flow on distal coronary flow and on graft flow during coronary artery bypass surgery. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 12 (6), 993-997 (2011).
- Meng, X., et al. Competitive flow arising from varying degrees of coronary artery stenosis affects the blood flow and the production of nitric oxide and endothelin in the internal mammary artery graft. European Journal of Cardio-thoracic Surgery: Official Journal of the. 43 (5), 1022-1027 (2013).
- Thankam, F. G., et al. Association of hypoxia and mitochondrial damage associated molecular patterns in the pathogenesis of vein graft failure: A pilot study. Translational Research: The Journal of Laboratory and Clinical. , 38-52 (2021).
- Li, X., et al. A surgical model of heart failure with preserved ejection fraction in Tibetan minipigs. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 180 (180), 63526 (2022).
- Rueda, A. lcalá, I,, et al. A live porcine model for surgical training in tracheostomy, neck dissection, and total laryngectomy. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology: Official Journal of the European Federation of Oto-Rhino-Laryngological Societies (EUFOS): Affiliated with the German Society for Oto-Rhino-Laryngology - Head and Neck Surgery. 278 (8), 3081-3090 (2021).
- Proudfit, W. L.
- Clark, R. A. Regulation of fibroplasia in cutaneous wound repair. TheAmerican Journal of the Medical Sciences. 306 (1), 42-48 (1993).
- Darby, I., Skalli, O., Gabbiani, G. Alpha-smooth muscle actin is transiently expressed by myofibroblasts during experimental wound healing. Laboratory Investigation. 63 (1), 21-29 (1990).
- Sterpetti, A. V., et al. Formation of myointimal hyperplasia and cytokine production in experimental vein grafts. Surgery. 123 (4), 461-469 (1998).
- Shannon, A. H., et al. Porcine model of infrarenal abdominal aortic aneurysm. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 153 (153), (2019).
- Langille, B. L., O'Donnell, F. Reductions in arterial diameter produced by chronic decreases in blood flow are endothelium-dependent. Science. 231 (4736), 405-407 (1986).
- Zwolak, R. M., Adams, M. C., Clowes, A. W. Kinetics of vein graft hyperplasia: Association with tangential stress. Journal of Vascular Surgery. 5 (1), 126-136 (1987).
- Kotani, K., et al. A subacute hypoxic model using a pig. Surgery Today. 35 (11), 951-954 (2005).
- Liu, D., et al. Comparison of ketamine-pentobarbital anesthesia and fentanyl-pentobarbital anesthesia for open-heart surgery in minipigs. Lab Animal. 38 (7), 234-240 (2009).
- Geovanini, G. R., Pinna, F. R., Prado, F. A., Tamaki, W. T., Marques, E. Standardization of anesthesia in swine for experimental cardiovascular surgeries. Revista Brasileira de Anestesiologia. 58 (4), 363-370 (2008).
- Alhomary, M., Ramadan, E., Curran, E., Walsh, S. R. Videolaryngoscopy vs. fibreoptic bronchoscopy for awake tracheal intubation: A systematic review and meta-analysis. Anaesthesia. 73 (9), 1151-1161 (2018).
- Parang, P., Arora, R. Coronary vein graft disease: Pathogenesis and prevention. Canadian Journal of Cardiology. 25 (2), e57-e62 (2009).
- Egan, T. D., et al. Fentanyl pharmacokinetics in hemorrhagic shock: a porcine model. Anesthesiology. 91 (1), 156-166 (1999).
