Summary
I detta protokoll utfördes ny bypass-transplantation av grisvener genom ett litet snitt i vänster bröstvägg utan kardiopulmonell bypass. En postoperativ patologistudie gjordes, som visade intim förtjockning.
Abstract
Venös transplantatsjukdom (VGD) är den främsta orsaken till koronar bypass-transplantat (CABG) misslyckande. Stora djurmodeller av CABG-VGD behövs för undersökning av sjukdomsmekanismer och utveckling av terapeutiska strategier.
För att utföra operationen går vi in i hjärtkammaren genom det tredje interkostala utrymmet och dissekerar försiktigt den inre bröstvenen och fördjupar den i normal saltlösning. Den högra huvudsakliga kransartären behandlas sedan för ischemi. Målkärlet skärs, en shuntplugg placeras och den distala änden av transplantatvenen anastomoseras. Den stigande aortan är delvis blockerad och den proximala änden av transplantatvenen anastomoseras efter perforering. Transplantatvenen kontrolleras för patency, och den proximala högra kransartären ligeras.
CABG-kirurgi utförs i minigrisar för att skörda den vänstra inre bröstvenen för dess användning som ett vaskulärt transplantat. Serumbiokemiska tester används för att utvärdera djurens fysiologiska status efter operationen. Ultraljudsundersökning visar att den proximala, mellersta och distala änden av transplantatkärlet är obehindrad. I den kirurgiska modellen observeras turbulent blodflöde i transplantatet vid histologisk undersökning efter CABG-operationen, och venös transplantatstenstes associerad med intim hyperplasi observeras i transplantatet. Studien här ger detaljerade kirurgiska ingrepp för etablering av en repeterbar CABG-inducerad VGD-modell.
Introduction
Även om dödligheten i kranskärlssjukdomar har minskat avsevärt de senaste åren, utvecklar hälften av medelålders vuxna i USA ischemiska hjärtrelaterade symtom varje år och en tredjedel av äldre vuxna dör av kranskärlssjukdom1. Koronar bypass-transplantation (CABG) är en effektiv kirurgisk modalitet för att förbättra myokardischemi, och ännu viktigare, det är en oersättlig kirurgisk modalitet för behandling av flerkärlig kranskärlssjukdom2. Med tiden utvecklar dock vaskulära transplantat inflammation, intim hyperplasi och progressiv ateroskleros, vilket är känt för att leda till ventransplantatfel eller ventransplantatsjukdom (VGD)3. Hos patienter efter CABG, om restenos uppstår, kan endast det sjuka blodkärlet ersättas i vissa fall2. Äldre patienter och tillsatta comorbiditeter gör omarbetning av koronar bypass-transplantation ganska utmanande. Att fördröja eller kontrollera de patologiska problemen i samband med ympade blodkärl är ett brådskande problem som ska lösas. Stora djurmodeller av CABG-VGD behövs för undersökning av sjukdomsmekanismer och utveckling av terapeutiska strategier. Forskare har framgångsrikt etablerat VGD-modeller för djur i små och stora djur som möss4, råttor5, kaniner6 och grisar7. Jämfört med små djur har stora djur som grisar anatomiska strukturer och fysiologiska egenskaper som liknar människor och har längre livslängd 8,9. Således är stora djur mer lämpade för att utforska långsiktiga patologiska förändringar i venös transplantatsjukdom och för preklinisk testning av läkemedel eller anordningar. Vi och vårt samarbetsteam har framgångsrikt tillämpat kirurgiska tekniker för att etablera en svin hjärtsviktsmodell och beskrivit de hjärtpatologiska förändringarna i denna modell10.
CABG-kirurgi har standardiserats i klinisk praxis, men när den tillämpas på upprättandet av VGD-djurmodeller är skillnaderna mellan arter, förvärv av djurutrustning och anläggningar, djurkirurgiska operationer och djurfoder och omvårdnad stora utmaningar för forskare. Liksom i klinisk praxis inkluderar metoderna för CABG-kirurgi som används för att etablera VGD-djurmodeller mittlinjesternotomi11 och vänster lateral thorakotomi12. Midline sternotomi används oftare13,14. Detta tillvägagångssätt har dock höga risker för både människor och djur. I studien som rapporterades av Thankam et al. dog två av de sex grisarna som användes för modellering under operation15. Hög modelldödlighet ökar studiekostnaderna och påverkar resultatens noggrannhet. En studie visade tidigare att ett snitt i vänster bröstvägg var möjligt för att etablera CABG-inducerad VGD hos grisar11. Här syftar denna studie till att beskriva ett steg-för-steg-protokoll för att etablera en reproducerbar kirurgi för en CABG-inducerad VGD-modell i minigrisar och att utvärdera fenotypen för denna modell. Det experimentella protokollet utformades gemensamt av hjärtkirurgi- och anestesiteamen. Det kirurgiska tillvägagångssättet för det vänstra tredje interkostala utrymmet bestämdes enligt kadaverna från andra minigrisar i laboratoriet före operationen, och anestesimetoden utfördes enligt metoden som användes vid centrum16. Blodbiokemiska tester, ultraljudsundersökning och histologiundersökning genomfördes för att utvärdera djurmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Förfarandena för vård och användning av försöksdjur godkändes av den institutionella djurvårds- och användningskommittén vid Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute. Alla experiment utfördes i enlighet med Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (8th Ed., 2011, National Research Council, USA). Det kirurgiska ingreppet visas i figur 1.
1. Preoperativ beredning av djur
- Dela slumpmässigt 10 3 månader gamla manliga minigrisar som väger 30-35 kg i bluffgruppen (n = 5) och VGD-gruppen (n = 5).
- Utvärdera de preoperativa och postoperativa hälsotillstånden hos grisarna med hjälp av kroppsmassindex (BMI). Beräkna BMI enligt följande:
BMI = kroppsvikt (kg)/(kroppslängd [cm] × kroppslängd [cm])
OBS: Kroppslängden mäts från grisens nos till svansbasen. - Fasta djuren i 12 timmar före operationen för att undvika aspiration efter anestesi. Förbered anestesiapparater och kirurgiska instrument, inklusive en anestesimaskin, gas, bedövningsmedel, en anestesirörledning, ett speciellt laryngoskop och kirurgiska instrument, en revbenshållare, suturer, en sköldkörtelupprullare, kirurgiska pincett etc. Sterilisera alla instrument som ska användas vid operationen.
2. Förbereda djuren för operation
- Väg djuren och beräkna bedövningsdosen. Administrera intramuskulärt anestesiblandningen bestående av 2 mg/kg 1:1 tiletamin och zolazepam, 0,2 mg/kg diazepam och 0,02 mg/kg atropin17. Använd fentanyl (50 mg/kg) för intraoperativ smärtlindring30.
- Se till att ett korrekt bedövningsplan uppnås och sätt in en kvarliggande venkateter (20G) i den marginella öronvenen för att upprätta öronåtkomst. Överför grisen till operationsbordet och placera den i ryggläge. Immobilisera lemmarna med bandage och höj huvudet med ett sterilt draperi.
OBS: Anestesitillståndet övervakades genom central fixering av ögongloben, mios, förlust av pupillreflex och förlust av smärtreflex. Hjärtfrekvensen och blodtrycket bibehölls på en lägre nivå än baslinjen. Kirurgen bör övervaka HR, BP och andra parametrar under förlamning och öka anestesidosen om HR ökar > 20% över baslinjen. - Exponera struplocket och glottis med hjälp av ett veterinärlaryngoskop. Utför trakeal intubation med ett 7,0-7,5Fr-rör och anslut det till anestesi-andningskretsen.
OBS: Ventilatorn används för kontinuerlig övertrycksventilation med tidalvolym 280 ml, inandnings-/utandningsförhållande 1:2, andningsfrekvens 20 gånger/min och positivt slututandningstryck (5 cmH2O). - Injicera intravenöst vekuroniumbromid (0,1 mg/kg) för att slappna av musklerna under de kirurgiska ingreppen och använd 2% isofluran för att upprätthålla anestesi vid en andningsfrekvens på 16-20 slag per minut och en tidalvolym på 10 ml/kg.
OBS: Vekuronium ges för att säkerställa tillräckligt djup av anestesi hos förlamade djur, särskilt eftersom dosen av induktionsläkemedel och isofluran ligger i den nedre delen av rekommenderat. - Använd veterinärsalva på grisens ögon för att förhindra torrhet under anestesi. Använd elektriska filtar för att hålla grisens kroppstemperatur vid 38 °C ± 5 °C.
- Använd ett elektrokardiogram för att övervaka hjärtfrekvens, syrehalten i blodet och kroppstemperaturen.
3. Kirurgiska ingrepp
- Raka vänster bröstvägg och applicera tre alternerande omgångar av 0,7% jod och 75% alkohol för att aseptiskt förbereda operationsområdet upp till vänster mandibulär vinkel, ner till navelsträngen, vänster till den bakre axillära linjen och höger till axillärfronten. Placera ett sterilt kirurgiskt draperi runt operationsområdet.
- Gör ett 7-10 cm tvärgående snitt med en elektrisk kniv i det tredje vänstra interkostala utrymmet och separera det subkutana vävnadsskiktet för lager (figur 2A). Ta bort ett segment på 5–6 cm av det tredje revbenet med en bensax och exponera den inre bröstvenen med ett upprullningsdon efter att ha exponerat den tredje revbensleden (figur 2B).
- Lokalisera den inre bröstvenen tillsammans med den vänstra inre bröstartären på vänster sida av bröstbenet. Utför en trubbig dissektion av den inre bröstvenen med vaskulära pincett.
- Utför hemostas genom elektrokoagulering av grenarna i den vänstra inre bröstvenen med en elektrisk kniv. Om hemostas är ofullständig, använd bomullstrådligering för hemostas. Ligate och markera venens två ändar medan den skördas (figur 2C).
- Bered heparin normal saltlösning genom att tillsätta 2 ml heparinnatriumlösning och 98 ml normal saltlösning. Efter avlägsnande av venen, injicera heparin normal saltlösning i venen för förbehandling (figur 2D). Lägg sedan venen i normal saltlösning och behåll den för säkerhetskopiering.
- Gör ett liknande snitt som beskrivits ovan och ta bort den inre bröstvenen i bluffgruppen. Öppna perikardiet och stäng sedan bröstväggen i bluffgruppen. Använd den inre bröstvenen i skamgruppen för patologisk kontroll utan koronar bypass-transplantation.
- Gör ett snitt på ~ 7 cm med en elektrisk kniv på hjärtsäcken för att exponera den högra kransartärstammen. Suspendera perikardiet och sy på huden på ipsilaterala sidan med 1-0 kirurgiska suturer (figur 2E). Separera den högra kranskärlsstammen från de omgivande vävnaderna (figur 2E).
- Bypass blockeringsbandet under den proximala änden av den isolerade högra kransartären nära aortan med en trådkrok och behandla myokardiet med tre cykler om 2 min ischemi och 5 min reperfusion genom att dra åt och slappna av blockeringsbandet (figur 2F). Övervaka hjärtats elektriska aktivitet med elektrokardiogrammonitorn under förkonditioneringen av ischemi / reperfusion (figur 2G).
OBS: När den högra kransartären är blockerad visar elektrokardiogrammet en ökad hjärtfrekvens och ST-segmenthöjning. - Dra åt bandet för att blockera det högra koronara blodflödet. Skär epikardiet som täcker blodkärlen. Exponera kranskärlsväggen och skär i längdriktningen med spetsen av ett kirurgiskt blad mot mitten av blodkärlens främre vägg.
- Efter att ha klippt lumen, förstora snittet med sax och placera en koronar shunt. Sätt in ena änden av shunten med en spole i den distala kransartären genom tåran. Shunt blodet i kransartärerna i den ihåliga koronar shunten för att säkerställa ett tydligt operativt fält (figur 2H).
- Utför en kontinuerlig sutur från sida till sida mellan den inre bröstvenen och den högra koronarstammen med 7-0 polypropensuturen (figur 2I). I mitten av den stigande aortan, ockludera den vänstra anterolaterala väggen i den stigande aortan med en halvocklusionsklämma.
- Använd ett kirurgiskt blad för att göra ett litet snitt i aortaväggen där adventitia har skurits, sätt in glidaxelns huvudände vid stansens huvudände i aortahålan genom detta snitt, dra ihop glidaxeln utåt och den cirkulära kniven ovanför den skär av en bit av artärväggen. Vävnadsblocket som skärs ut av stansen är cirka 3 mm i diameter (figur 2J).
- Dra ut shunten. Utför en kontinuerlig sutur från sida till sida mellan den inre bröstvenen och aortaväggen med 6-0 polypropensuturen (figur 2K). Öppna halvocklusionsklämman.
- Spela in bypassflödet av den högra kransartärstammen proximalt till anastomosstället med ultraljud. Övervaka hjärtats elektriska aktivitet med hjälp av elektrokardiogrammet (figur 2L).
- Bo ett tillfälligt dräneringsrör (Fr: 16) i brösthålan så att blod och vätskor kan rinna ut. Sy perikardiumsnittet med en 1-0 bomullstråd och stäng bröstskiktet för lager (från insidan till utsidan: Pleura-skiktet, muskelskiktet, subkutant vävnadsskikt, hudskikt) medan du placerar penicillinpulver (ca 0,5 g) på varje lager. Ta bort dräneringsröret efter att ha sytt hudsnittet med en 1-0 bomullstråd.
4. Vård efter operationen
- Ta bort endotrakealröret efter att djuren återgått till spontan andning. Narkosläkaren bör bedöma djurets vitalitet (t.ex. andningsfrekvens, hjärtfrekvens, syremättnad etc.) och ta bort EKG efter att djuren vaknat och återgått till spontan aktivitet. Skicka tillbaka djuren till utfodringsrummet och placera skendjuren i en annan hage i avelsrummet. Håll djuren varma med en elektrisk filt. Observera djuren varje timme efter operationen (minst 4 gånger).
- Foder djuret dagen efter operationen. Tillsätt aspirin (200 mg) 2x dagligen i 7 dagar till djurfodret för att förhindra postoperativ trombos och minska sårsmärta.
OBS: Undvik att mata djur på operationsdagen för att förhindra aspiration. - Administrera djuret med en intramuskulär injektion av penicillin 1x dagligen i 7 dagar i följd för att förhindra postoperativ infektion (14 000 enheter per kg).
5. Ultraljudsundersökning
- Efter CABG-kirurgi, använd en steril ultraljudssondhylsa för att linda in den högfrekventa linjära arraysonden. Placera sonden på ytan av det venösa transplantatet.
- Visa konturen av transplantatet i det tvådimensionella ultraljudsläget och växla sedan till färgdopplerläget för att detektera blodflödet i transplantatet.
6. Insamling av venös transplantatvävnad
- Samla 10 ml blodprov från den venösa kretsen i öronvenen för biokemisk testning. (Tabell 1). Centrifugera blodprovet vid 1 000 x g i 5 minuter och utför biokemiska tester med en automatisk biokemisk analysator.
- Bedöva djuret som beskrivits tidigare. Vid bekräftelse av anestesidjup, injicera 10% kaliumklorid 0,5 ml / kg kroppsvikt från öronmarginalvenen eller frambenvenen. Gör sedan ett 10 cm median sternalt snitt med en elektrisk kniv för att skörda ventransplantatet 30 dagar efter operationen. Fixa kroppspositionen som i steg 2.2., och efter sterilisering och placering av ett draperi, gör ett median bröstbenssnitt för att dela bröstbenet. Under separationen, undvik de viktigaste blodkärlen och hjärtat och separera de ympade blodkärlen lager för lager.
- Skär snabbt av de stora blodkärlen som ansluter till hjärtat, placera hjärtat och stigande aorta på ischips och ta bort transplantatkärlsbryggan, den anslutna aortan och den högra kranskärlen. Skölj alla prover med normal saltlösning vid 4 °C.
- Ta hela transplantatkärlet på cirka 3-4 cm i storlek, dela det i 4-5 lika delar och överför till kryokonserveringsrör. Lägg snabbt rören i flytande kväve för att frysa och flytta till en frys med ultralåg temperatur på -80 °C för förvaring.
- För analys, skölj transplantatet med iskall 0,9% saltlösning och fixera det i 4% paraformaldehydlösning. Håll ett förhållande mellan vävnadsblockstorlek och fixativ lösning på 1:10 och fixera vävnaden i mer än 12 timmar.
- Färga sektionerna i 50 ml vattenlösning av hematoxylin i 3 minuter. Separera sektionerna genom att tvätta med 50 ml 0,5% saltsyraetanol och 50 ml 0,2% ammoniakvatten i 10 s vardera.
- Skölj med rinnande vatten i 1 timme och rengör sedan i destillerat vatten genom blötläggning i 3 min. Dehydrera i 70% och 90% etanol i 10 minuter vardera. Placera i 50 ml 0,5% alkoholfärgningslösning för eosin i 2-3 min.
- Dehydrera de färgade sektionerna med ren etanol i 10 minuter och blötlägg sedan i ren xylen i 10 minuter för att göra proverna transparenta. Droppa de transparenta sektionerna med neutralt lim och täck med ett täckglas. Observera patologiska sektioner under ett ljusmikroskop vid 40x förstoring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
BMI och serum biokemiska index
BMI mellan sken- och VGD-grupperna skilde sig inte signifikant (sham vs. VGD, 22,05 kg/cm, 2 ± 0,46 kg/cm, 2 vs. 21,14 kg/cm,2 ± 0,39 kg/cm2, p =0,46). De biokemiska resultaten från serum anges i tabell 1. Statistiskt signifikanta förändringar mellan grupperna hittades i fyra biokemiska index, inklusive aspartataminotransferas (ASAT, bluff jämfört med VGD, 25,25 IE/L ± 1,88 IE/L jämfört med 31,5 IE/L ± 2,58 IE/L), serumbilirubin (sham jämfört med VGD, 2,5 μmol/L ± 0,47 μmol/L jämfört med 4,5 μmol/L ± 0,14 μmol/L), totalt bilirubin (sham jämfört med VGD, 0,025 μmol/L ± 0,14 μmol/L vs. 0,92 μmol/L ± 0,33 μmol/L), och kreatinin (bluff jämfört med VGD, 92,75 μmol/L ± 4,15 μmol/L vs. 141,75 μmol/L ± 12,65 μmol/L).
Ultraljudsundersökning
Alla djur i sham (n = 5) och VGD-grupperna (n = 5) överlevde. De kirurgiska ingreppen av CABG visas i figur 1. Den genomsnittliga operationstiden var 105 min ± 25 min (intervall: 90-160 min) och den genomsnittliga intraoperativa blödningsvolymen var 85 ml ± 35 ml (intervall: 50-200 ml). Påverkan av driftstiden är främst övergången av operatörens skicklighet från människa till gris och har ingen speciell betydelse. Den genomsnittliga varaktigheten från efter snittanastomos till trakeal extubation var 17 min ± 5 min (intervall: 15-30 min). Ultraljudsundersökning visade att blodtillförseln i det ympade kärlet hade partiell uppstötning jämfört med den normala kransartären, och den totala blodflödesriktningen var i allmänhet normal (figur 3). Pneumotorax, tamponad, infektion eller andra allvarliga komplikationer observerades inte postoperativt. Ingen signifikant skillnad hittades i vikt eller BMI mellan sken- och VGD-grupperna, 1 månad postoperativt.
Ultraljudsundersökning utfördes på den proximala änden (figur 3A, B), kärlhålan (figur 3C, D) och distala änden (figur 3E, F) av transplantatkärlet. Det retrograda flödet observerades vid de proximala och distala ändarna av transplantatkärlet; Ingen blodextravasering observerades emellertid.
Patologiska förändringar i venerna
Varje venöst transplantat delades jämnt in i tre segment efter längd, och en sektion valdes från varje segment för utvärdering och klassificerades enligt den modifierade Proudidit-klassificeringen för kranskärlsstenos18. Medelvärden från de tre avsnitten antogs som resultat för graden av ocklusion. Den specifika klassificeringen var följande: grad I = 0-poäng, normal utan restenos; grad II = 1-poäng, mild stenos <30%; grad III = 2 poäng, stenos mellan 30% och 50%; grad IV = 3 poäng, svår stenos mellan 50% och 90%; grad V = 4 poäng, subtotal ocklusion >90%; och grad VI = 5 poäng, total ocklusion, utan blodflöde till ventransplantatet. Den modifierade Proudilit-klassificeringen för kranskärlsstenos antogs för att bedöma de kvantifierade resultaten. Resultatet för skengruppen var 0,00 ± 0,00, vilket indikerar ingen vaskulär ocklusion, medan resultatet för CABG-gruppen var 3,12 ± 1,22. Därför var skillnaden signifikant mellan de två grupperna (p < 0,05, tabell 2).
Under mikroskopet, i skengruppen, verkade tunica intima, tunica media och venös vägg i venös transplantat normal. I VGD-gruppen förtjockades tunica intima och tunicamediet i venösa transplantat signifikant 30 dagar efter CABG-operationen. Tunica intima avgränsades tvetydigt från tunicamediet. Det elastiska skiktet i tunikamediet försvann (figur 4). Lumen i det venösa transplantatet fylldes med hyperplastiska vävnader (figur 4). Ingen signifikant förändring i kärlets diameter observerades.
Figur 1: Översikt över förfarandet. (A–C) Före operation: Väg minigrisarna, kontrollera hjärtstartarens och ventilatorns prestanda och anslut ventilationsröret. (D-F) Anestesi: Administrera en intramuskulär injektion av anestesi till minigrisarna, fixa minigrisen på operationsbordet, exponera luftvägarna helt för trakeal intubation, anslut ventilatorn och använd inhalationsanestesi för att upprätthålla anestesi. (G–I) Under operation: Utför en preoperativ ultraljudsbedömning av hjärtfunktionen hos minigrisarna och slutföra koronar bypass-transplantation genom ett snitt i vänster bröstvägg. (J–L) Efter operationen: Anastomos såren och var uppmärksam på den postoperativa vården och utfodringen av minigrisarna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Det kirurgiska ingreppet. (A) Klipp bröstväggen, (B) isolera den inre bröstvenen, (C) avlägsna den inre bröstvenen, (D) utföra heparinförkonditionering, (E) suspendera perikardiet, (F) utföra myokardischemireperfusion, (G) övervaka EKG-förändringarna, (H) blockera koronar blodflöde, (I) anastomos den proximala änden av transplantatkärlet, (J ) distal koronar anastomos plats, (K) anastomoser distala till kransartärer, (L) fullständig koronar bypass-transplantation. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Ultraljudsundersökning. Efter avslutad koronar bypass-transplantation bedöms blodflödespatencyen hos det ympade kärlet med ultraljud. (A, C, E) Normala koronar blodflödesbilder. Kontinuerliga blodflödessignaler ses vid (B) proximala, (D) mellersta och (F) distala ändar av de ympade kärlen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Histologisk analys . (A) Det normala patologiska avsnittet i den inre bröstvenen visade tydlig vaskulär hierarki och ingen lumenstenos. (B,C) Patologin hos den inre bröstvenen 30 dagar efter kranskärlstransplantation visade att kärlets intima förtjockades i varierande grad och lumen var uppenbarligen inskränkt. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Indikatorer | Sham Grupp (n=5) | Transplantatgrupp (n=5) |
| ALAT (IE/L) | 46 ±5.11 | 47.75±7.88 |
| ASAT (IE/L) | 25,25 ±1,88 | 31.5±2.58* |
| Totalt protein (IE/l) | 63,12 ±,138 | 60.17±1.91 |
| Albumin (IE/L) | 32,25 ±0,77 | 23.77±5.61 |
| Globulin (g/L) | 30,87 ±,136 | 36.4±6.03 |
| Bilirubin i serum (μmol/l) | 2.5 ±0.47 | 4.5±0.14* |
| Totalt bilirubin (μmol/l) | 0,025 ±0,14 | 0.92±0.33* |
| Alkaliskt fosfatas (IE/L) | 103 ±19,3 | 104±16.04 |
| Glukosamin (mmol / L) | 4,44 ±0,36 | 5.96±0.42 |
| Kväve som urea (mmol/L) | 2,46 ±0,17 | 2.89±0.65 |
| Serumkreatinin μmol/L | 92,75 ±4,15 | 141,75±12,65* |
| Totalt kolesterol (mmol / L) | 2,37 ±0,12 | 2.16±0.06 |
| Triglycerid (mmol/L) | 0,48 ±0,10 | 0.25±0.05 |
| Lipoprotein mmol / L med hög densitet | 1,05 ±0,07 | 1.03±0.07 |
| Mycket låg densitet lipoprotein (mmol / L) | 1.43 ±0.06 | 1.29±0.04 |
| Laktatdehydrogenas (mmol/L) | 384,75 ±26,8 | 478,25±49,58* |
Tabell 1. Serum biokemiska indikatorer. Statistisk analysprogramvara användes för analys. Data uttrycktes som medel- ± standardfel (n = 5). Jämförelser av mätdata analyserades med studentens t-test. Ett p-värde mindre än 0,05 indikerade statistisk signifikans. *p < 0,05, CABG vs. bluff.
| Proudilit klassificering | ||||||
| S. Nej av provet | Poäng omedelbart efter CABG-operation | Poäng 30 dagar efter CABG-operation | ||||
| 1 | 0, 0, 0 | 2, 2, 2 | ||||
| 2 | 0, 0, 0 | 1, 2, 2 | ||||
| 3 | 0, 0, 0 | 2, 3, 2 | ||||
| 4 | 0, 0, 0 | 3, 2, 2 | ||||
| 5 | 0, 0, 0 | 2, 1, 2 | ||||
Tabell 2. Statistiska resultat av transplantatocklusionsgraderna omedelbart efter operationen och 30 dagar postoperativt. Den modifierade Proudit-klassificeringsskalan användes för vaskulär ocklusionsgrad: grad I = 0-poäng, normal utan restenos; grad II = 1-poäng, mild stenos <30%; grad III = 2 poäng, stenos mellan 30% och 50%; grad IV = 3 poäng, svår stenos mellan 50% och 90%; grad V = 4 poäng, subtotal ocklusion >90%; och grad VI = 5 poäng, total ocklusion, utan blodflöde till ventransplantatet. Data inkluderar resultat från fem venösa transplantat jämnt fördelade i tre sektioner efter längd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna studie beskrev vi i detalj protokollet för djurval, instrumentberedning, kirurgiska ingrepp och postoperativ utvärdering vid utveckling av en CABG-inducerad VGD-modell. Vi utförde ultraljudsundersökning av ventransplantatet före och efter CABG-operationen och histologisk undersökning av transplantatet 30 dagar efter operationen. Blodflödet i den inre bröstvenen var normalt före CABG-operationen, medan retrograd flöde observerades i transplantatet i den inre bröstvenen. Jämfört med skenoperationsgruppen skadades lever- och njurfunktionen hos djuren i operationsgruppen i viss utsträckning. Med tanke på förekomsten av koronar transplantatsjukdom resulterade försvagningen av myokardiell kontraktilitet i otillräcklig perfusion av perifera vävnader. Det venösa transplantatet visade intim hyperplasi och vaskulär remodellering 30 dagar efter CABG-operationen (figur 4). Fibrotiska förändringar runt blodkärlen är förknippade med sårläkning, fibroblastproliferation sker tidigt i sårläkning på dag 1 till dag 3 19, produktionen av aktivt kollagen av typ I och fibronektin sker på dag 4 till dag 6 och cytoplasmatisk α-SM-aktinfibrillaggregering sker på dag 7 till dag 1419. Stressfibrer innebär bildandet av myofibroblaster, vilket sammanfaller med sårkontraktion20. Det är oklart om perivaskulär fibros påverkar kirurgiska resultat.
Här valde vi minigrisar för att etablera vengraftsjukdomsmodellen. Medan små djur som råttor har använts för att studera de patologiska mekanismerna för VGD21, har grisar liknande storlek, anatomi och fysiologi som människor och är därför mer lämpade för att studera patogenesen av mänsklig hjärtsjukdom eller som ett verktyg för enhetsutveckling22. Interna bröstvener väljs också ofta som transplantat kliniskt. Kliniska studier från två oberoende grupper fann att inre bröstventransplantat har egenskapen för hög förekomst av ventransplantatskador, och samma patologiska förändringar observerades i vår studie (figur 4) 23,24. Liksom i klinisk praxis är valet av ett lämpligt kirurgiskt tillvägagångssätt inom djurkirurgi avgörande för operationens framgång; här hänvisade vi till Hocums vänstra thorakotomi11. Vi fann att vänster thorakotomi tydligt kunde exponera operationsfältet, anatomin runt snittet var lätt att identifiera och blödningsmängden var låg. Dessutom, jämfört med median thorakotomi, kräver lateral thorakotomi inte sågning av bröstbenet, så kirurgisk stress kan minskas.
Anestesi är avgörande för framgången med en kirurgisk modell. I denna studie modifierades protokollet från Kotani et al., där kombinationen ketamin och diazepam användes som anestesinduktion och isofluraninhalation som underhållsanestesi25. Dessutom visade en forskargrupp att intravenösa läkemedel också var lämpliga för underhållsanestesi26. Endotrakeal intubation hos grisar kan vara svårt för ett djurkirurgiskt team. Jämfört med den mänskliga luftvägen gör trakealanatomin hos grisar exponering av glottis svår27. Här, för att bättre exponera glottis, pressade vi ner grisens överkäke för att hjälpa till att exponera grisens glottis (figur 1D). Å andra sidan kommer användningen av en direkt laryngoskopi eller en fiberoptisk bronkoskopi att hjälpa till att visualisera glottis vid endotrakeal intubation28.
Det patologiska tillståndet för venös transplantatsjukdom är huvudsakligen uppdelad i tre steg: 1) akut stadium (inom 1 månad) trombos; 2) subakut stadium (1-12 månader) intim hyperplasi; 3) sen stadium (mer än 12 månader) bildning av ateroskleros, vilket är en orsak till transplantatstensens och ocklusion29. De flesta förändringarna i den akuta fasen av VGD är relaterade till operativa faktorer, och aterosklerosen som bildas i det sena skedet är irreversibel. Studien av subakut endometrieförtjockning är mycket viktig för patogenesen, behandlingen och förebyggandet av VGD. Det är också viktigt att de valda transplantatkärlen skiljer sig från de vertikala kärlen i den stora saphenösa venen. Den inre bröstvenen bär vanligtvis mindre hydrostatiskt tryck, och de patologiska förändringarna är snabbare efter transplantation än för den stora saphenösa venen. I vår modell sågs typisk intim hyperplasi som täcker lumen i det ympade kärlet i den histologiska undersökningen 30 dagar efter operationen, och samma patologiska förändringar har observerats i andra kliniska studier23,24. Modelleringsresultaten för att välja den inre bröstvenen hos minigrisar är stabila i fenotyp, modelleringstiden är kort och graden av minskning av de patologiska förändringarna av VGD är hög, vilket bidrar till utvecklingen av uppföljningsforskning.
Modellen har också vissa begränsningar. Vissa fina operationer i stordjurmodelleringsprocessen, intraoperativ övervakning av djurvitala tecken och postoperativ återupplivning kräver alla viss praktisk erfarenhet, vilket kräver professionella kirurger och anestesiologer för att styra träningen och kraftigt minska djurens oavsiktliga dödlighet. Stordjurskirurgi kräver specifika experimentella platser, professionell bemanning och tillräckligt ekonomiskt stöd, vilket kan vara en tyngre börda för mindre institut.
Sammanfattningsvis kan välutrustade laboratorier under ledning av yrkesverksamma ytterligare studera de patologiska förändringarna av VGD genom att etablera denna minipig VGD-modell, vilket är av stor betydelse för behandlingen av VGD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute för tekniskt stöd, djurvård och provinsamling. De tackar också Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd, för teknisk support vid ultraljudsundersökningen. Detta arbete stöddes av Guangdong Science and Technology Program, Kina, och Jinan University Central Universities Basic Scientific Research Business Costs Project (2017A020215076, 2008A08003 och 21621409).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aortic Punch | Medtronic Inc. , America | 3.0mm, 3.5mm, 4.0mm | Used for proximal coronary bridge anastomosis |
| Automatic biochemical analyzer | IDEXX Laboratories, Inc. America | Catalyst One | |
| Cardiac coronary artery bypass grafting instrument kit | LANDANGER, France | ||
| Cardiogram monitor | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co, Ltd | MEC-1000 | |
| Coronary Shunt | AXIUS | OF-1500, OF-2500, OF-3000 | The product temporarily blocks the coronary artery during arteriotomy to reduce the amount of bleeding in the surgical field and provide blood flow to the distal end during anastomosis. The Axius shunt plug is not an implant and should be removed prior to completion of the anastomosis. |
| Defibrillator | MEDIANA | Mediana D500 | |
| Diazepam | Nanguo pharmaceutical Co. LTD, Guangdong, China | H37023039 | Narcotic inducer |
| Disposable manual electric knife | Covidien, America | E2516H | |
| Electric negative pressure suction machine | Shanghai Baojia Medical Instrument Co, Ltd | YX932D | |
| Esmolol | Guangzhou Wanzheng Pharmaceutical Co. LTD | H20055990 | Emergency drugs |
| Ice machine | Local suppliers, Guangzhou, China | ||
| Lidocaine | Chengdu First Pharmaceutical Co. LTD | H51021662 | Emergency drugs |
| Luxtec headlight system | Luxtec, America | AX-1375-BIF | Used for lighting fine parts during operation |
| Medical operation magnifier (glasses) | Germany Lista co, LTD | SuperVu Galilean 3.5× | Used for fine site operation during operation |
| Multi-function high-frequency electrotome | Shanghai Hutong Electronics Co, Ltd | GD350-B | |
| Nitrogen canister | Local suppliers, Guangzhou, China | ||
| Nonabsorbable surgical suture (polypropylene suture) | Johnson & Johnson, America | 6-0, 7-0 | Used to suture blood vessels. |
| Nonabsorbable suture (cotton thread) | Covidien, America | 1-0 | Used for skin and muscle tissue tugging |
| Open heart surgery instrument kit | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., LTD | ||
| Propofol injection | Xi 'an Libang Pharmaceutical Co. LTD | H19990282 | Anesthetic sedative |
| Refrigerator | Local suppliers, Guangzhou, China | ||
| Respiratory anesthesia machine for animal | Shenzhen Reward Life Technology Co, Ltd, China | R620-S1 | |
| Semi-occlusion clamp | Xinhua Surgical Instrument Co., Ltd. | ZL1701RB | Temporarily cut off the aortic flow |
| vecuronium bromide | Richter, Hungary | JX20090127 | Muscle relaxant |
| Veterinary ultrasound system | Royal Philips, Netherlands | CX50 | |
| Zoletil | Virbac, France | Zoletil 50 | Animal narcotic |
References
- Lloyd-Jones, D., et al. Executive summary: Heart disease and stroke statistics--2010 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 121 (7), 948-954 (2010).
- Taggart, D. P. Contemporary coronary artery bypass grafting. Frontiers of Medicine. 8, 395-398 (2014).
- Wolny, R., Mintz, G. S., Pregowski, J., Witkowski, A. Mechanisms, prevention and treatment of saphenous vein graft disease. The American Journal of Cardiology. 154, 41-47 (2021).
- Schachner, T., Laufer, G., Bonatti, J. In vivo (animal) models of vein graft disease. European Journal of Cardio-thoracic Surgery: Official Journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 30 (3), 451-463 (2006).
- Suggs, W. D., et al. Antisense oligonucleotides to c-fos and c-jun inhibit intimal thickening in a rat vein graft model. Surgery. 126 (2), 443-449 (1999).
- Jiang, Z., et al. A novel vein graft model: Adaptation to differential flow environments. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 286 (1), H240-H245 (2004).
- O'Brien, J. E., et al. Early injury to the media after saphenous vein grafting. The Annals of Thoracic Surgery. 65 (5), 1273-1278 (1998).
- Zou, Y., et al. Mouse model of venous bypass graft arteriosclerosis. The American Journal of Pathology. 153 (4), 1301-1310 (1998).
- Klyachkin, M. L., et al. Postoperative reduction of high serum cholesterol concentrations and experimental vein bypass grafts. Effect on the development of intimal hyperplasia and abnormal vasomotor function. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 108 (3), 556-566 (1994).
- Tan, W., et al. A porcine model of heart failure with preserved ejection fraction induced by chronic pressure overload characterized by cardiac fibrosis and remodeling. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 677727 (2021).
- Hocum Stone,, L, L., et al. Magnetic resonance imaging assessment of cardiac function in a swine model of hibernating myocardium 3 months following bypass surgery. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 153 (3), 582-590 (2017).
- Gedik, N., et al. Proteomics/phosphoproteomics of left ventricular biopsies from patients with surgical coronary revascularization and pigs with coronary occlusion/reperfusion: Remote ischemic preconditioning. Scientific Reports. 7 (1), 7629 (2017).
- Tsirikos Karapanos,, N,, et al. The impact of competitive flow on distal coronary flow and on graft flow during coronary artery bypass surgery. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 12 (6), 993-997 (2011).
- Meng, X., et al. Competitive flow arising from varying degrees of coronary artery stenosis affects the blood flow and the production of nitric oxide and endothelin in the internal mammary artery graft. European Journal of Cardio-thoracic Surgery: Official Journal of the. 43 (5), 1022-1027 (2013).
- Thankam, F. G., et al. Association of hypoxia and mitochondrial damage associated molecular patterns in the pathogenesis of vein graft failure: A pilot study. Translational Research: The Journal of Laboratory and Clinical. , 38-52 (2021).
- Li, X., et al. A surgical model of heart failure with preserved ejection fraction in Tibetan minipigs. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 180 (180), 63526 (2022).
- Rueda, A. lcalá, I,, et al. A live porcine model for surgical training in tracheostomy, neck dissection, and total laryngectomy. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology: Official Journal of the European Federation of Oto-Rhino-Laryngological Societies (EUFOS): Affiliated with the German Society for Oto-Rhino-Laryngology - Head and Neck Surgery. 278 (8), 3081-3090 (2021).
- Proudfit, W. L.
- Clark, R. A. Regulation of fibroplasia in cutaneous wound repair. TheAmerican Journal of the Medical Sciences. 306 (1), 42-48 (1993).
- Darby, I., Skalli, O., Gabbiani, G. Alpha-smooth muscle actin is transiently expressed by myofibroblasts during experimental wound healing. Laboratory Investigation. 63 (1), 21-29 (1990).
- Sterpetti, A. V., et al. Formation of myointimal hyperplasia and cytokine production in experimental vein grafts. Surgery. 123 (4), 461-469 (1998).
- Shannon, A. H., et al. Porcine model of infrarenal abdominal aortic aneurysm. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 153 (153), (2019).
- Langille, B. L., O'Donnell, F. Reductions in arterial diameter produced by chronic decreases in blood flow are endothelium-dependent. Science. 231 (4736), 405-407 (1986).
- Zwolak, R. M., Adams, M. C., Clowes, A. W. Kinetics of vein graft hyperplasia: Association with tangential stress. Journal of Vascular Surgery. 5 (1), 126-136 (1987).
- Kotani, K., et al. A subacute hypoxic model using a pig. Surgery Today. 35 (11), 951-954 (2005).
- Liu, D., et al. Comparison of ketamine-pentobarbital anesthesia and fentanyl-pentobarbital anesthesia for open-heart surgery in minipigs. Lab Animal. 38 (7), 234-240 (2009).
- Geovanini, G. R., Pinna, F. R., Prado, F. A., Tamaki, W. T., Marques, E. Standardization of anesthesia in swine for experimental cardiovascular surgeries. Revista Brasileira de Anestesiologia. 58 (4), 363-370 (2008).
- Alhomary, M., Ramadan, E., Curran, E., Walsh, S. R. Videolaryngoscopy vs. fibreoptic bronchoscopy for awake tracheal intubation: A systematic review and meta-analysis. Anaesthesia. 73 (9), 1151-1161 (2018).
- Parang, P., Arora, R. Coronary vein graft disease: Pathogenesis and prevention. Canadian Journal of Cardiology. 25 (2), e57-e62 (2009).
- Egan, T. D., et al. Fentanyl pharmacokinetics in hemorrhagic shock: a porcine model. Anesthesiology. 91 (1), 156-166 (1999).
