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Medicine

क्लोरहेक्सिडाइन ग्लूकोनेट-प्रेरित पेरिटोनियल क्षति का एक चूहा मॉडल

Published: April 28, 2022 doi: 10.3791/63903
Automatic Translation
*1,2, *1,2, *1, *1, 1,2, 3,4, 1,2,5
1School of Medicine, College of Medicine, I-Shou University, 2Division of Nephrology, Department of Internal Medicine, E-DA Hospital, 3Department of Pediatrics, National Cheng Kung University Hospital, 4Institute of Clinical Medicine, College of Medicine, National Cheng Kung University, 5Division of Nephrology, Department of Internal Medicine, E-DA Dachang Hospital
* These authors contributed equally

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल क्लोरहेक्सिडाइन ग्लूकोनेट (सीजी) -प्रेरित पेरिटोनियल फाइब्रोसिस के पेरिटोनियल डायलिसिस (पीडी) माउस मॉडल को स्थापित करता है। वर्तमान मॉडल अन्य पीडी पशु मॉडल की तुलना में सरल और उपयोग करने में आसान है।

Abstract

पेरिटोनियल फाइब्रोसिस पेरिटोनियल डायलिसिस (पीडी) की एक महत्वपूर्ण जटिलता है। इस समस्या की जांच और समाधान करने के लिए, पीडी के एक उपयुक्त पशु मॉडल की आवश्यकता होती है। वर्तमान प्रोटोकॉल एक क्लोरहेक्सिडाइन ग्लूकोनेट (सीजी) प्रेरित पेरिटोनियल फाइब्रोसिस मॉडल स्थापित करता है जो पीडी के साथ एक रोगी की स्थिति की नकल करता है। पेरिटोनियल फाइब्रोसिस को 3 सप्ताह के लिए 15% इथेनॉल में सीजी के 0.1% के इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा प्रेरित किया गया था (हर दूसरे दिन प्रशासित), पुरुष सी 57बीएल /6 चूहों में कुल नौ बार। पेरिटोनियल कार्यात्मक परीक्षण तब 22 वें दिन किए गए थे। चूहों की बलि के बाद, पेट की दीवार के पार्श्विका पेरिटोनियम और यकृत के आंत के पेरिटोनियम की कटाई की गई। मैसन के ट्राइक्रोम धुंधला होने के बाद सूक्ष्म रूप से विश्लेषण किए जाने पर वे मोटे और अधिक फाइब्रोटिक थे। अल्ट्राफिल्ट्रेशन दर में कमी आई, और ग्लूकोज मास ट्रांसपोर्ट ने पेरिटोनियल पारगम्यता में सीजी-प्रेरित वृद्धि का संकेत दिया। इस प्रकार स्थापित पीडी मॉडल में पीडी तकनीक, डायलिसिस प्रभावकारिता में सुधार और रोगी के अस्तित्व को बढ़ाने में अनुप्रयोग हो सकते हैं।

Introduction

पेरिटोनियल डायलिसिस (पीडी) गुर्दे की प्रतिस्थापन चिकित्सा का एक प्रकार है। हालांकि, पीडी में ऐसी समस्याएं हैं जिन्हें हल नहीं किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, दीर्घकालिक पीडी उपचार पेरिटोनियल क्षति का कारण बन सकता है, अंततः अल्ट्राफिल्ट्रेशन विफलता और उपचारकी वापसी 1,2,3,4,5,6 का कारण बन सकता है। पेरिटोनियल फाइब्रोसिस सबसे गंभीर जटिलताओं में से एक है 7,8. पेरिटोनियल फाइब्रोसिस को इंटरस्टिटियम के भीतर बाह्य मैट्रिक्स के जमाव और संचय और पेरिटोनियम 9,10 के नव-एंजियोजेनेसिस और वास्कुलोपैथी की विशेषता है।

इन पेरिटोनियल परिवर्तनों के मुख्य कारण आवर्तक पेरिटोनिटिस और डायलीसेट की गैर-जैव-अनुकूलता हैं, जो हाइपरोस्मोटिक, उच्च ग्लूकोज, कम पीएच और ग्लूकोज क्षरण उत्पाद संचय11,12 हैं। इसलिए, उपयुक्त पशु प्रयोगात्मक मॉडल शोधकर्ताओं को पीडी थेरेपी के दौरान पेरिटोनियम के शारीरिक और रोग संबंधी परिवर्तनों का बेहतर अध्ययन करने में मदद कर सकते हैं। इसलिए, पीडी तकनीक और डायलिसिस प्रभावकारिता में सुधार और रोगी के अस्तित्व को बढ़ाने के लिए एक पशु पीडी मॉडल स्थापित करना महत्वपूर्ण है। इस अध्ययन का उद्देश्य क्लोरहेक्सिडाइन ग्लूकोनेट (सीजी) के इंट्रापरिटोनियल (आईपी) इंजेक्शन द्वारा पीडी माउस मॉडल उत्पन्न करना था, जैसा कि पहले13,14 वर्णित है। यह पीडी माउस मॉडल सरल है, उपयोग करने में आसान है, और अन्य पीडी पशु मॉडल की तुलना में संभव है।

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Protocol

सभी माउस प्रयोगों को ई-डीए अस्पताल / आई-शो विश्वविद्यालय के प्रयोगशाला पशु केंद्र द्वारा अनुमोदित किया गया था और "प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड" (एनआरसी, यूएसए 2011) के अनुसार संभाला गया था। वर्तमान अध्ययन के लिए 7-8 सप्ताह के नर सी 57बीएल / 6 चूहों का उपयोग किया गया था।

1. रासायनिक तैयारी

  1. 15% इथेनॉल में 0.1% क्लोरहेक्सिडाइन ग्लूकोनेट (सीजी, सामग्री की तालिका देखें) को पतला करके रासायनिक अड़चन तैयार करें।

2. पशु उपचार

  1. नियंत्रण समूह के रूप में तीन चूहों को असाइन करें। कुल नौ बार 3 सप्ताह के लिए हर दूसरे दिन 0.9% सामान्य खारा (एनएस) के 1 एमएल / किग्रा के इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन (आईपी) का प्रदर्शन करें।
  2. पेरिटोनियल फाइब्रोसिस समूह के लिए तीन चूहों को असाइन करें। क्लोरहेक्सिडाइन ग्लूकोनेट (सीजी) का उपयोग करके पेरिटोनियल फाइब्रोसिस को प्रेरित करें, जिसमें 12.5 μL / g शरीर के वजन की खुराक पर 15% इथेनॉल (चरण 1.1) में सीजी के 0.1% के इंजेक्शन लगाए जाते हैं। इसे 3 सप्ताह के लिए हर दूसरे दिन, कुल नौ बार करें।

3. पेरिटोनियल फ़ंक्शन परीक्षण (संशोधित पेरिटोनियल संतुलन परीक्षण)

  1. 4.25% ग्लूकोज युक्त डायलिसिस समाधान तैयार करें। सिरिंज के साथ डायलीसेट नमूना के 0.5 एमएल खींचें, और फिर डायलीसेट नमूने में ग्लूकोज एकाग्रता की जांच करें।
    नोट: ग्लूकोज एकाग्रता हेक्सोकाइनेज / जी 6 पीडी विधि के अनुसार निर्धारित की जाती है। डायलीसेट नमूने एल-टाइप ग्लू 2 परख के लिए एक्सेस किए गए थे और जैव रासायनिक विश्लेषक के साथ जांच की गई थी ( सामग्री की तालिका देखें)। यह प्रारंभिक डायलीसेट ग्लूकोज एकाग्रता है।
  2. ज़ोलेटिल और ज़ाइलज़िन के इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन द्वारा चूहों को एनेस्थेटाइज करें (मात्रा के अनुसार 1: 2 के अनुपात में तैयार, सामग्री की तालिका देखें) 20 μL / 20 gw की खुराक पर। इसके अतिरिक्त, संज्ञाहरण के तहत सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर पशु चिकित्सक मलहम का उपयोग करें।
  3. डायलिसिस समाधान (2 एमएल / 20 ग्राम बॉडीवेट) का निर्माण करें।
  4. 30 मिनट के बाद, पैर की अंगुली पिंच रिफ्लेक्स की कमी के साथ संज्ञाहरण की गहराई का आकलन और सत्यापन करें। फिर, पेट की मध्य रेखा (xiphoid प्रक्रिया के नीचे) में एक ऊर्ध्वाधर चीरा करें, फिर चूहों के पेट को खोलें और सिरिंज ("वॉल्यूम 1" के रूप में परिभाषित) के साथ इंट्रापरिटोनियल तरल पदार्थ एकत्र करें। फिर, एक साफ और सूखी कपास के वजन को मापें और अवशिष्ट इंट्रापरिटोनियल द्रव को अवशोषित करने के लिए कपास को चूहों के पेट की गुहा में डालें। अंत में, कपास के वजन को फिर से मापें।
    नोट: कपास का वजन बढ़ना अवशिष्ट इंट्रापरिटोनियल द्रव के वजन के बराबर है। फिर, प्राप्त आयतन में परिवर्तित करें (विशिष्ट गुरुत्वाकर्षण: 1 g/ cm3; "वॉल्यूम 2" के रूप में परिभाषित)। अंतिम डायलीसेट वॉल्यूम वॉल्यूम 1 प्लस वॉल्यूम 2 है।
  5. ग्लूकोज एकाग्रता को मापने के लिए डायलीसेट नमूना (अंतिम डायलीसेट) के 0.5 एमएल का उपयोग करें। यह अंतिम डायलीसेट ग्लूकोज एकाग्रता है।
  6. सूत्र15 का उपयोग करके नेट अल्ट्राफिल्ट्रेशन की गणना करें:
    Equation 1
  7. निम्न सूत्र15 का उपयोग करके पेरिटोनियल पारगम्यता की गणना करें:
    Equation 2

4. पेट की दीवार की मांसपेशियों और यकृत की ऊतक तैयारी और हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण

  1. कार्डियक पंचर (फ्लेबोटोमी) 3,16 के माध्यम से चूहों का बलिदान करें।
  2. पेट की दीवार (1 सेमी x 1 सेमी) और कुल हेपेटेक्टॉमी काटें। चूहों के पेट की दीवार और यकृत के ऊतकों को रात भर 10% तटस्थ बफर्ड फॉर्मेलिन में ठीक करें।
  3. पेट की दीवार की मांसपेशियों और यकृत के 3 μm मोटी पैराफिन अनुभाग तैयार करें, और पहले प्रकाशित रिपोर्ट17 के बाद हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण करें।
  4. मॉर्फोमेट्री18 का उपयोग करके चूहों की यकृत सतहों के पेट की दीवार और आंत के पेरिटोनियम के पार्श्विका पेरिटोनियम का मूल्यांकन करें।
  5. सांख्यिकी और ग्राफ़िंग सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके सांख्यिकीय विश्लेषण करें ( सामग्री की तालिका देखें)। एसडी ± सभी डेटा को व्यक्त करें और टी-टेस्ट19 का उपयोग करके सांख्यिकीय महत्व के लिए विश्लेषण करें। महत्वपूर्ण परिणामों के रूप में P < 0.05 के साथ मानों को परिभाषित करें।

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Representative Results

चित्रा 1 ए, बी में, पेट की दीवार का पार्श्विका पेरिटोनियम मैसन के ट्राइक्रोम स्टेनिंग17 के तहत स्पष्ट रूप से मोटा और अधिक फाइब्रोटिक था, यह दर्शाता है कि सीजी-उजागर समूह में, पेरिटोनियल फाइब्रोसिस नियंत्रण खारा समूह (एनएस) की तुलना में अधिक गंभीर है। चित्रा 2 ए, बी में, यकृत सतहों के आंत के पेरिटोनियम भी स्पष्ट रूप से मोटे और अधिक फाइब्रोटिक थे, इस प्रकार यह साबित होता है कि सीजी-उजागर समूह में, पेरिटोनियल फाइब्रोसिस नियंत्रण खारा समूह (एनएस) की तुलना में अधिक गंभीर है। चित्रा 3 ए में, सीजी समूह में अल्ट्राफिल्ट्रेशन दर में कमी आई, और ग्लूकोज मास ट्रांसपोर्ट ने संकेत दिया कि सीजी-प्रेरित समूह (चित्रा 3 बी) में पेरिटोनियल पारगम्यता में वृद्धि हुई है।

Figure 1
चित्रा 1: पेरिटोनियल डायलिसिस (पीडी) माउस मॉडल में पेट की दीवार के पार्श्विका पेरिटोनियम का फाइब्रोसिस। (ए) सीजी के संपर्क में आने वाले समूह के लिए, पेरिटोनियल फाइब्रोसिस मैसन के ट्राइक्रोम स्टेनिंग के तहत नियंत्रण समूह (एनएस) की तुलना में अधिक गंभीर है। (बी) (ए) के परिमाणित डेटा को मानक विचलन के औसत ± रूप में दर्शाया गया है, एन ≥ 3; पी < 0.01. (A) के लिए, स्केल पट्टी = 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: पेरिटोनियल डायलिसिस (पीडी) माउस मॉडल में यकृत सतहों के आंत के पेरिटोनियम का फाइब्रोसिस। (ए) सीजी के संपर्क में आने वाले समूह के लिए, मैसन के ट्राइक्रोम स्टेनिंग के तहत नियंत्रण समूह (एनएस) की तुलना में पेरिटोनियल फाइब्रोसिस अधिक गंभीर है। (बी) (ए) के परिमाणित डेटा को मानक विचलन के औसत ± रूप में दर्शाया गया है, एन ≥ 3; पी < 0.005. (A) के लिए, स्केल पट्टी = 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: पीडी माउस मॉडल में पेरिटोनियल फ़ंक्शन की गिरावट। (ए) क्लोरहेक्सिडाइन ग्लूकोनेट-उजागर समूह (सीजी) में, अल्ट्राफिल्ट्रेशन दर नियंत्रण खारा समूह (एनएस) की तुलना में काफी कम थी। (बी) ग्लूकोज मास ट्रांसपोर्ट ने यह भी संकेत दिया कि सीजी ने पेरिटोनियल पारगम्यता में वृद्धि को प्रेरित किया। डेटा को मानक विचलन के औसत ± रूप में दर्शाया जाता है, एन ≥ 3; पी < 0.005. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस अध्ययन में, सीजी के आईपी इंजेक्शन द्वारा एक माउस पीडी मॉडल प्रस्तुत किया गया है, और परिणामों ने इस मॉडल में पेरिटोनियल फाइब्रोसिस और कार्यात्मक गिरावट दिखाई, जिसने पीडी रोगी की स्थिति की नकल की।

प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम हैं। सबसे पहले, सीजी या एनएस के आईपी इंजेक्शन करने के लिए, माउस की पेट की दीवार की त्वचा को पंचर-प्रेरित इंट्रापरिटोनियल अंग क्षति को रोकने के लिए फोर्सप्स का उपयोग करके उठाया जाना चाहिए। दूसरा, हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए पेट की दीवार के पेरिटोनियम को इकट्ठा करते समय, आईपी इंजेक्शन से क्षतिग्रस्त क्षेत्र से बचा जाना चाहिए।

पेरिटोनियल फाइब्रोसिस के कई प्रयोगात्मक पशु मॉडल में से, उपयोग और अनुकूलनशीलता में आसानी के कारण सबसे आम सीजी मॉडल है। सुगा एट अल.20 1995 में सीजी-प्रेरित पेरिटोनियल फाइब्रोसिस चूहे मॉडल की रिपोर्ट करने वाले पहले व्यक्ति थे। 2 एमएल खारा में घुलने वाले 0.1% सीजी और 15% इथेनॉल के इंजेक्शन का उपयोग 26 दिनों के लिए दैनिक रूप से किया गया था। इशी एट अल.21 ने सी 57बीएल/6 चूहों का उपयोग किया और कुल 56 दिनों के लिए खारा आईपी इंजेक्शन में घुलने वाले 15% इथेनॉल के साथ 0.1% सीजी के 0.3 एमएल प्रशासित किया, जहां चूहों में एक प्रयोगात्मक स्क्लेरोसिंग एनकैप्सुलेटिंग पेरिटोनिटिस को प्रेरित किया गया था। निशिनो एट अल.22 ने विस्टार चूहों का उपयोग किया, जिन्हें 28 दिनों के लिए 2 एमएल खारा में घुलने वाले 15% इथेनॉल में प्रतिदिन 0.1% सीजी के आईपी इंजेक्शन प्राप्त हुए। मिशिमा एट अल .23 ने उसी वर्ष स्प्राग-डॉवले (एसडी) चूहों में पेरिटोनियल फाइब्रोसिस को प्रेरित करने के लिए एक समान विधि का उपयोग किया। कुशियामा एट अल.24 ने एसडी चूहों का इस्तेमाल किया और खारा (1.5 एमएल / 100 ग्राम शरीर के वजन) में घुले 15% इथेनॉल में 0.1% सीजी प्रशासित किया, यानी 21 दिनों के लिए सप्ताह में तीन बार इंजेक्शन। निशिनो एट अल .25 ने रोजाना चूहों का इस्तेमाल किया, 15% इथेनॉल इंट्रापेरिटोनियल में 0.1% सीजी का इंजेक्शन दिया, 7 दिनों और 15 दिनों के लिए 0.2 एमएल खारा में भंग कर दिया। लुआ एट अल.26 ने तिल के तेल में 12.5 मिलीग्राम / एमएल पर टैमॉक्सिफेन इमल्सीफाइड का उपयोग किया, इथेनॉल में घुल गया, और 3 दिन के अंतराल के दौरान 100 मिलीग्राम / जी शरीर के वजन पर चूहों में इंजेक्ट किया गया। 2 सप्ताह के बाद, 15% इथेनॉल / फॉस्फेट-बफर्ड खारा (1.5 एमएल / 100 ग्राम) में 0.1% सीजी को कुल 10 खुराक के लिए हर दूसरे दिन चूहों को इंजेक्ट किया गया था। योह एट अल.14 ने एसडी चूहों का इस्तेमाल किया और 21 दिनों के लिए सप्ताह में तीन बार खारा यानी इंजेक्शन में घुलने वाले 15% इथेनॉल में 0.1% सीजी के 1.5 एमएल / 100 ग्राम शरीर के वजन को प्रशासित किया। योह एट अल ने 10 सप्ताह के चूहों का इस्तेमाल किया और कुल 21 दिनों के लिए सप्ताह में तीन बार 15% इथेनॉल यानी इंजेक्शन में 0.1% सीजी (0.01 मिलीलीटर / जी शरीर का वजन) प्रशासित किया। उसी वर्ष, लो एट अल .13 ने भी इसी तरह की विधि का उपयोग किया।

वर्तमान मॉडल की कुछ सीमाएं हैं। सबसे पहले, इस पशु मॉडल में, सीजी का उपयोग डायलीसेट के बजाय पेरिटोनियल फाइब्रोसिस के कारण कार्यात्मक गिरावट को प्रेरित करने के लिए एक रासायनिक उत्तेजक के रूप में किया गया था। सीजी एक रासायनिक अड़चन है, और इसके बार-बार प्रशासन से मेसोथेलियल कोशिकाओं और भड़काऊ प्रतिक्रियाओं का अध: पतन हो सकता है, इस प्रकार अत्यधिक फाइब्रोसिस हो सकता है। सूजन और नियोवैस्कुलराइजेशन देखा गया था, और ये निष्कर्ष पीडी के रोगियों में देखे गए समान थे। हालांकि सीजी इंजेक्शन के परिणामस्वरूप महत्वपूर्ण पेरिटोनियल मोटा होता है, एक पिछले अध्ययन से पता चला है कि फाइब्रिन जमाव अपेक्षाकृतकमजोर था। दूसरा, वर्तमान अध्ययन में उपयोग किए गए चूहों में गुर्दे की बीमारी नहीं थी; नतीजतन, पेरिटोनियम पर यूरेमिक विषाक्त पदार्थों के प्रभाव का आकलन नहीं किया जा सका। तीसरा, हमने पेरिटोनियम में सूजन, एंजियोजेनेसिस और बाह्य मैट्रिक्स जमाव का मूल्यांकन नहीं किया। हालांकि, पिछले अध्ययन13 के अनुसार, एक ही पशु मॉडल ने पहले ही दिखाया है कि सीजी एक्सपोजर के बाद एफ 4/80-पॉजिटिव कोशिकाओं और सीडी 31-पॉजिटिव वाहिकाओं दोनों की संख्या में वृद्धि हुई है। इसलिए, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस पशु मॉडल में प्राप्त परिणाम पेरिटोनियल डायलिसिस रोगियों में पीडी की स्थिति का पूरी तरह से प्रतिनिधित्व नहीं कर सकते हैं। पीडी वाले रोगियों में, पेरिटोनियल क्षति का तंत्र जटिल है और विभिन्न पैटर्न का पालन कर सकता है।

इन सभी सीमाओं के बावजूद, वर्तमान मॉडल पीडी के अन्य पशु मॉडल की तुलना में सरल, उपयोग में आसान और संभव है, पिछलेअध्ययनों के अनुसार 3,13,14,16,18,25। यह विधि पीडी से संबंधित पेरिटोनियल फाइब्रोसिस मॉडल का प्रतिनिधित्व करती है जिसे पीडी क्षेत्र अनुसंधान पर लागू किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम ईमानदारी से महत्वपूर्ण चर्चा और अध्ययन के आंशिक निष्पादन के लिए शिन-हान त्सेंग को धन्यवाद देते हैं। इस अध्ययन को ई-डीए अस्पताल के रिसर्च फाउंडेशन और नेशनल चेंग कुंग विश्वविद्यालय, ताइवान से ईडीएएचपी 110003 और एनकेयूईडीए 110002 द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% Normal Saline Y F CHEMICAL CORP., New Taipei City, Taiwan -
10% neutral buffered formalin Taiwan Burnett International Co., Ltd., Taipei City, Taiwan 00002A
Automatic biochemical analyzer Hitachi Ltd., Tokyo, Japan Labospect Series 008 for determining glucose concentration
Chlorhexidine digluconate solution, 20% in H2O Sigma-Aldrich, MO, USA C9394 diluted to 0.1% with 15% ethanol for injection
Ethanol Avantor Performance Materials, LLC, PA, USA BAKR8006-05 diluted to 15% with normal saline for working concentration
Glucose (Dianeal) Baxter International, Inc., IL, USA FNB9896 Commercial dialysis solution (4.25%)
GraphPad Prism 8.0 GraphPad Software, Inc., CA, US
L-type Glu 2 assay FUJIFILM Wako, Japan 461-32403
Xylazine 20 Juily Pharmaceutical Co., Ltd., New Taipei City, Taiwan -
Zoletil 50 Virbac Laboratories, Carros, France -

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चिकित्सा अंक 182 क्लोरहेक्सिडाइन ग्लूकोनेट पेरिटोनियल डायलिसिस मॉडल पेरिटोनियल फाइब्रोसिस
क्लोरहेक्सिडाइन ग्लूकोनेट-प्रेरित पेरिटोनियल क्षति का एक चूहा मॉडल
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