Summary
本协议建立了葡萄糖酸氯己定（CG）诱导的腹膜纤维化的腹膜透析（PD）小鼠模型。与其他PD动物模型相比，目前的模型简单易用。
Abstract
腹膜纤维化是腹膜透析（PD）的重要并发症。为了调查和解决这个问题，需要适当的PD动物模型。本协议建立了葡萄糖酸氯己定（CG）诱导的腹膜纤维化模型，该模型模拟PD患者的状况。 腹膜内注射0.1%的CG在15%乙醇中3周（每隔一天给药），在雄性C57BL / 6小鼠中总共9次诱导腹膜纤维化。然后在第22天进行腹膜功能测试。处死小鼠后，收获腹壁壁腹膜和肝脏内脏腹膜。在Masson的三色染色后进行显微镜分析时，它们更厚，纤维化更多。超滤速率降低，葡萄糖质量转运表明CG诱导的腹膜通透性增加。这样建立的PD模型在改善PD技术、透析疗效和延长患者生存期方面具有应用价值。
Introduction
腹膜透析（PD）是一种肾脏替代疗法。但是，PD存在无法解决的问题。例如，长期PD治疗可引起腹膜损伤，最终导致超滤失败和治疗停止1，2，3，4，5，6。腹膜纤维化是最严重的并发症之一7，8。腹膜纤维化的特征是间质内细胞外基质的沉积和积累，以及腹膜9，10的新血管生成和血管病变。
这些腹膜变化的主要原因是复发性腹膜炎和透析液的非生物相容性，它们是高渗、高葡萄糖、低pH和葡萄糖降解产物积累11，12。因此，合适的动物实验模型可以帮助研究人员更好地研究PD治疗过程中腹膜的生理和病理变化。因此，建立动物PD模型对于提高PD技术和透析疗效，延长患者生存期具有重要意义。本研究旨在通过腹膜内（ip）注射葡萄糖酸氯己定（CG）来生成PD小鼠模型，如前所述13，14。与其他PD动物模型相比，该PD小鼠模型简单，易于使用且可行。
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Protocol
所有小鼠实验均由E-DA医院/义寿大学实验动物中心批准，并根据“实验动物护理和使用指南”（NRC，美国2011）进行处理。雄性C57BL / 6小鼠，7-8周龄，用于本研究。
1. 化学制剂
- 通过在15%乙醇中稀释0.1%葡萄糖酸氯己定（CG，见 材料表）来制备化学刺激物。
2. 动物治疗
- 指定三只小鼠作为对照组。每隔一天进行 1 mL/kg 0.9% 生理盐水 （NS） 的腹膜内注射 （ip），持续 3 周，共 9 次。
- 将三只小鼠分配到腹膜纤维化组。使用葡萄糖酸氯己定（CG）以12.5μL / g体重的剂量腹膜注射0.1%的CG在15%乙醇中（步骤1.1）诱导腹膜纤维化。每隔一天执行一次，持续 3 周，总共 9 次。
3. 腹膜功能检查（改良腹膜平衡试验）
- 制备含有4.25%葡萄糖的透析溶液。用注射器抽取0.5mL透析液样品，然后检查透析液样品中的葡萄糖浓度。
注意：葡萄糖浓度根据己糖激酶/ G6PD方法测定。透析液样品进行L型Glu 2测定，并用生化分析仪进行研究（见 材料表）。这是初始透析液葡萄糖浓度。 - 通过肌肉注射唑莱地尔和赛拉嗪（以1：2体积的比例制备，参见 材料表）以20μL / 20gw的剂量麻醉小鼠。此外，在眼睛上使用兽医软膏以防止麻醉下干燥。
- 进行腹膜滴注透析溶液（2mL / 20g体重）。
- 30分钟后，评估并验证缺乏脚趾夹反射的麻醉深度。然后，在腹部中线（剑突下方）进行垂直切口，然后打开小鼠的腹部并用注射器收集腹膜内液（定义为“体积1”）。然后，测量干净干燥的棉花的重量，并将棉花放入小鼠的腹腔中以吸收残留的腹腔内液。最后，再次测量棉花重量。
注意：棉花的体重增加等于残留腹腔内液的重量。然后，转换为获得的体积（比重：1 g/cm3;定义为“体积2”）。最终透析液体积为第 1 卷加第 2 卷。 - 使用 0.5 mL 透析液样品（最终透析液）测量葡萄糖浓度。这是最终的透析液葡萄糖浓度。
- 使用公式15 计算净超滤：
- 使用以下公式15计算腹膜通透性：
4.腹壁肌肉和肝脏的组织准备及组织学分析
- 通过心脏穿刺（静脉切开术） 处 死小鼠3，16。
- 切开腹壁（1 cm x 1 cm）和全肝切除术。将小鼠的腹壁和肝组织在10%中性缓冲福尔马林中固定过夜。
- 准备腹壁肌肉和肝脏的3μm厚的石蜡切片，并根据先前发表的报告17进行组织学分析。
- 使用形态测量法评估小鼠腹壁的顶腹膜和肝脏表面的内脏腹膜18。
- 使用统计和绘图软件进行统计分析（见 材料表）。将所有数据表示为平均值± SD，并使用t 检验 19 分析统计显著性。将 P < 0.05 的值定义为显著结果。
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Representative Results
在图1A，B中，在Masson三色染色17下，腹壁壁壁腹膜明显增厚且纤维化更多，表明在CG暴露组中，腹膜纤维化比对照盐水组（NS）更严重。在图2A，B中，肝脏表面的内脏腹膜也明显增厚且纤维化，从而证明在CG暴露组中，腹膜纤维化比对照盐水组（NS）更严重。在图3A中，CG组的超滤速率降低，葡萄糖质量转运表明CG诱导组的腹膜通透性增加（图3B）。
图1：腹膜透析（PD）小鼠模型中腹壁顶腹膜的纤维化。 （A）对于暴露于CG的组，在Masson三色染色下，腹膜纤维化比对照组（NS）更严重。（B） 量化数据 （A） 表示为平均值±标准差 n ≥ 3;P < 0.01。对于 （A），比例尺 = 100 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图2：腹膜透析（PD）小鼠模型中肝脏表面内脏腹膜的纤维化 。 （A）对于暴露于CG的组，在Masson三色染色下，腹膜纤维化比对照组（NS）更严重。（B） 量化数据 （A） 表示为平均值±标准差 n ≥ 3; P < 0.005。对于 （A），比例尺 = 100 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图3：PD小鼠模型中腹膜功能的恶化。 （A）在葡萄糖酸氯己定暴露组（CG）中，超滤率显着低于对照盐水组（NS）。（B）葡萄糖质量转运也表明CG诱导腹膜通透性增加。数据表示为平均值±标准差，n ≥ 3; P < 0.005。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
本研究通过腹腔注射CG提出了小鼠PD模型，结果显示该模型存在腹膜纤维化和功能恶化，模拟PD患者的病情。
协议中有几个关键步骤。首先，为了进行CG或NS的腹腔注射，必须使用镊子拾取小鼠的腹壁皮肤，以防止穿刺引起的腹膜内器官损伤。其次，在收集腹壁腹膜进行组织学分析时，必须避免腹腔注射损伤的区域。
在腹膜纤维化的几种实验动物模型中，最常见的是CG模型，因为它易于使用和适应性强。Suga等人20 于1995年首次报告了CG诱导的腹膜纤维化大鼠模型。每天使用溶解在2mL盐水中的0.1%CG和15%乙醇的腹膜注射液，持续26天。IshiI等人21 使用C57BL / 6小鼠，并施用0.3mL的0.1%CG和溶解在盐水腹膜注射液中的15%乙醇共56天，其中在小鼠中诱导实验性硬化包封腹膜炎。Nishino等人22使用Wistar大鼠，每天接受0.1%CG的腹膜注射在溶解在2mL盐水中的15%乙醇中28 天。Mishima等人23 在同一年使用类似的方法诱导Sprague-Dawley（SD）大鼠的腹膜纤维化。Kushiyama等人24 使用SD大鼠，并在溶解在盐水（1.5mL / 100g体重）中的15%乙醇中施用0.1%CG，每周注射三次，持续21天。Nishino等25每天使用小鼠，腹腔注射0.1%CG在15%乙醇中，溶解在0.2mL盐水中7天和15 天。Lua等人26 使用他莫昔芬以12.5mg / mL在芝麻油中乳化，溶解在乙醇中，并在3天的间隔内以100mg / g体重腹膜注射到小鼠中。2周后，每隔一天向小鼠注射0.1%CG中的15%乙醇/磷酸盐缓冲盐水（1.5mL / 100g），共10次剂量。Yoh等人14 使用SD大鼠，并在溶解在盐水中腹膜注射剂中施用1.5mL / 100g体重的0.1%CG，每周三次，持续21天。Yoh等人使用10周龄小鼠，并在15%乙醇腹膜内注射0.1%CG（0.01ml / g体重），每周三次，共21天。同年，lo等人13 也使用了类似的方法。
目前的模式有一些局限性。首先，在该动物模型中，CG被用作化学兴奋剂，以诱导由于腹膜纤维化而不是透析液引起的功能恶化。CG是一种化学刺激物，其反复给药可导致间皮细胞变性和炎症反应，从而引起过度纤维化。观察到炎症和新生血管形成，这些发现与PD患者观察到的相似。虽然CG注射导致腹膜增厚，但先前的一项研究表明纤维蛋白沉积相对较弱27。其次，本研究中使用的小鼠没有肾脏疾病;因此，无法评估尿毒症毒素对腹膜的影响。第三，我们没有评估腹膜中的炎症、血管生成和细胞外基质沉积。然而，根据之前的一项研究13，相同的动物模型已经表明，在CG暴露后，F4 / 80阳性细胞和CD31阳性血管的数量增加。因此，必须注意的是，在该动物模型中获得的结果不能完全代表腹膜透析患者PD的状况。在帕金森病患者中，腹膜损伤的机制很复杂，可能遵循不同的模式。
尽管存在所有这些限制，但根据先前的研究3，13，14，16，18，25，与PD的其他动物模型相比，本模型是简单，易于使用和可行的。该方法代表了一种PD相关的腹膜纤维化模型，可以应用于PD现场研究。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们衷心感谢Shin-Han Tseng对这项研究的批判性讨论和部分执行。本研究得到了台湾E-DA医院研究基金和国立成功大学的EDAHP110003和NCKUEDA110002的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Normal Saline | Y F CHEMICAL CORP., New Taipei City, Taiwan | - | |
| 10% neutral buffered formalin | Taiwan Burnett International Co., Ltd., Taipei City, Taiwan | 00002A | |
| Automatic biochemical analyzer | Hitachi Ltd., Tokyo, Japan | Labospect Series 008 | for determining glucose concentration |
| Chlorhexidine digluconate solution, 20% in H2O | Sigma-Aldrich, MO, USA | C9394 | diluted to 0.1% with 15% ethanol for injection |
| Ethanol | Avantor Performance Materials, LLC, PA, USA | BAKR8006-05 | diluted to 15% with normal saline for working concentration |
| Glucose (Dianeal) | Baxter International, Inc., IL, USA | FNB9896 | Commercial dialysis solution (4.25%) |
| GraphPad Prism 8.0 | GraphPad Software, Inc., CA, US | ||
| L-type Glu 2 assay | FUJIFILM Wako, Japan | 461-32403 | |
| Xylazine 20 | Juily Pharmaceutical Co., Ltd., New Taipei City, Taiwan | - | |
| Zoletil 50 | Virbac Laboratories, Carros, France | - |
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