Summary
Denne protokol etablerer en peritonealdialyse (PD) musemodel af chlorhexidingluconat (CG)-induceret peritoneal fibrose. Den nuværende model er enkel og nem at bruge sammenlignet med andre PD dyremodeller.
Abstract
Peritoneal fibrose er en vigtig komplikation af peritonealdialyse (PD). For at undersøge og løse dette problem kræves en passende dyremodel af PD. Denne protokol etablerer en chlorhexidingluconat (CG) induceret peritoneal fibrose-model, der efterligner tilstanden hos en patient med PD. Peritoneal fibrose blev induceret ved intraperitoneal injektion af 0,1% CG i 15% ethanol i 3 uger (administreret hver anden dag), i alt ni gange i mandlige C57BL/6-mus. Peritoneale funktionelle tests blev derefter udført på dag 22. Efter at musene blev ofret, blev parietal peritoneum i abdominalvæggen og leverens viscerale peritoneum høstet. De var tykkere og mere fibrotiske, når de blev analyseret mikroskopisk efter Massons trikrome farvning. Ultrafiltreringshastigheden faldt, og glukosemassetransport indikerede en CG-induceret stigning i peritonealpermeabilitet. Den således etablerede PD-model kan have anvendelser til forbedring af PD-teknologi, dialyseeffektivitet og forlængelse af patientens overlevelse.
Introduction
Peritonealdialyse (PD) er en type nyreerstatningsterapi. PD har dog problemer, der ikke kan løses. For eksempel kan langvarig PD-behandling forårsage peritoneal skade, hvilket i sidste ende fører til ultrafiltreringssvigt og tilbagetrækning af behandling 1,2,3,4,5,6. Peritoneal fibrose er en af de mest alvorlige komplikationer 7,8. Peritoneal fibrose er karakteriseret ved aflejring og akkumulering af ekstracellulær matrix inden for interstitium og neo-angiogenese og vaskulopati i peritoneum 9,10.
Hovedårsagerne til disse peritoneale ændringer er tilbagevendende peritonitis og ikke-biokompatibilitet af dialysatet, som er hyperosmotisk, høj glukose, lav pH og glukosenedbrydningsproduktakkumulering11,12. Derfor kan egnede dyreforsøgsmodeller hjælpe forskere med bedre at studere bughindens fysiologiske og patologiske ændringer under PD-terapi. Derfor er etablering af en dyre-PD-model vigtig for at forbedre PD-teknologi og dialyseeffektivitet og forlænge patientens overlevelse. Denne undersøgelse havde til formål at generere en PD-musemodel ved intraperitoneal (i.p.) injektion af chlorhexidingluconat (CG), som beskrevet tidligere13,14. Denne PD-musemodel er enkel, nem at bruge og gennemførlig sammenlignet med andre PD-dyremodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle museforsøg blev godkendt af Laboratory Animal Center på E-DA Hospital / I-Shou University og blev håndteret i henhold til "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" (NRC, USA 2011). C57BL/6-hanmus, 7-8 uger gamle, blev anvendt til nærværende undersøgelse.
1. Kemisk forberedelse
- Forbered det kemiske irritationsmiddel ved at fortynde 0,1% chlorhexidingluconat (CG, se materialetabel) i 15% ethanol.
2. Behandling af dyr
- Tildel tre mus som kontrolgruppe. Udfør intraperitoneal injektion (i.p.) af 1 ml / kg 0,9% normalt saltvand (NS) hver anden dag i 3 uger, i alt ni gange.
- Tildel tre mus til peritoneal fibrosegruppen. Inducer peritoneal fibrose ved hjælp af chlorhexidingluconat (CG) ved administration af i.p. injektioner af 0,1% CG i 15% ethanol (trin 1.1) i en dosis på 12,5 μL / g legemsvægt. Udfør dette hver anden dag i 3 uger, i alt ni gange.
3. Peritonealfunktionstest (modificeret peritoneal ligevægtstest)
- Forbered en dialyseopløsning indeholdende 4,25% glucose. Træk 0,5 ml dialyseprøve med en sprøjte, og kontroller derefter glukosekoncentrationen i dialysatprøven.
BEMÆRK: Glucosekoncentrationen bestemmes efter hexokinase/G6PD-metoden. Dialysatprøver blev tilgået til L-type Glu 2-assay og undersøgt med en biokemisk analysator (se materialetabel). Dette er den indledende dialysatglukosekoncentration. - Bedøvelse af musene ved intramuskulær injektion af Zoletil og Xylazin (fremstillet i et forhold på 1:2 volumenprocent, se materialetabel) i en dosis på 20 μL/20 gw. Brug desuden dyrlægesalve på øjnene for at forhindre tørhed under anæstesi.
- Udfør i.p. instillation af dialyseopløsningen (2 ml/20 g legemsvægt).
- Efter 30 minutter skal du vurdere og verificere dybden af anæstesi med manglende tåklemmerefleks. Udfør derefter et lodret snit i midterlinjen af maven (under xiphoid-processen), åbn derefter musenes mave og opsaml den intraperitoneale væske med en sprøjte (defineret som "volumen 1"). Mål derefter vægten af en ren og tør bomuld og læg bomulden i musenes bughule for at absorbere den resterende intraperitonealvæske. Til sidst måles bomuldsvægten igen.
BEMÆRK: Vægtforøgelsen af bomuld er lig med vægten af den resterende intraperitonealvæske. Derefter konverteres til det opnåede volumen (vægtfylde: 1 g /cm3; defineret som "volumen 2"). Det endelige dialysevolumen er volumen 1 plus volumen 2. - Brug 0,5 ml dialyseprøve (slutdialysat) til at måle glukosekoncentrationen. Dette er den endelige dialysatglukosekoncentration.
- Beregn netto ultrafiltrering ved hjælp af formlen15:
- Beregn peritonealpermeabiliteten ved hjælp af følgende formel15:
4. Vævsforberedelse af abdominalvæggen, muskel og lever og histologisk analyse
- Ofre musene via hjertepunktur (flebotomi)3,16.
- Skær abdominalvæggen (1 cm x 1 cm) og total hepatektomi. Fastgør musenes abdominalvæg og levervæv natten over i 10% neutral bufret formalin.
- Forbered 3 μm tykke paraffinsektioner af bugvæggen, musklen og leveren, og udfør histologisk analyse efter tidligere offentliggjort rapport17.
- Evaluer parietal peritoneum i abdominalvæggen og visceralt peritoneum i musenes leveroverflader ved hjælp af morfometri18.
- Udfør statistiske analyser ved hjælp af statistik- og grafsoftware (se materialetabel). Udtryk alle data som middel ± SD og analyser for statistisk signifikans ved hjælp af en t-test19. Definer værdier med P < 0,05 som signifikante resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I figur 1A, B var parietal peritoneum i abdominalvæggen markant tykkere og mere fibrotisk under Massons trikrome farvning17, hvilket indikerer, at peritoneal fibrose i den CG-eksponerede gruppe er mere alvorlig end i kontrolsaltvandsgruppen (NS). I figur 2A,B var det viscerale peritoneum på leveroverfladerne også markant tykkere og mere fibrotisk, hvilket beviser, at peritoneal fibrose i den CG-eksponerede gruppe er mere alvorlig end i kontrolsaltvandsgruppen (NS). I figur 3A faldt ultrafiltreringshastigheden i CG-gruppen, og glukosemassetransport indikerede, at peritonealpermeabiliteten steg i den CG-inducerede gruppe (figur 3B).
Figur 1: Fibrose af parietal peritoneum i abdominalvæggen i peritonealdialyse (PD) musemodel. (A) For gruppen udsat for CG er peritoneal fibrose mere alvorlig end i kontrolgruppen (NS) under Massons trikrome farvning. B) kvantificerede data for (A) repræsenteret som gennemsnittet ± standardafvigelsen, n ≥ 3 P < 0,01. For (A) er skalabjælke = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Fibrose af det viscerale peritoneum af leveroverflader i peritonealdialyse (PD) musemodel . (A) For gruppen udsat for CG er peritoneal fibrose mere alvorlig end i kontrolgruppen (NS) under Massons trikromfarvning. B) kvantificerede data for (A) repræsenteret som gennemsnittet ± standardafvigelsen, n ≥ 3 P < 0,005. For (A) er skalabjælke = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Forringelse af peritonealfunktionen i PD-musemodellen. (A) I den chlorhexidingluconateksponerede gruppe (CG) var ultrafiltreringshastigheden signifikant lavere end i kontrolsaltvandsgruppen (NS). (B) Glukosemassetransporten indikerede også, at CG-inducerede en stigning i peritonealpermeabilitet. Data angives som gennemsnittet ± standardafvigelsen, n ≥ 3; P < 0,005. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne undersøgelse præsenteres en mus PD-model ved i.p. injektion af CG, og resultaterne viste peritoneal fibrose og funktionel forringelse i denne model, som efterlignede PD-patientens tilstand.
Der er flere kritiske trin i protokollen. For det første, for at udføre en i.p. injektion af CG eller NS, skal musens abdominalvægshud afhentes ved hjælp af tang for at forhindre punkteringsinduceret intraperitoneal organskade. For det andet skal det område, der er beskadiget af ip-injektioner, undgås, når bugvæggens bughindeum indsamles til histologiske analyser.
Blandt de mange eksperimentelle dyremodeller af peritoneal fibrose er den mest almindelige CG-modellen på grund af dens brugervenlighed og tilpasningsevne. Suga et al.20 var de første til at rapportere en CG-induceret peritoneal fibrose rottemodel i 1995. i.p. injektioner af 0,1% CG og 15% ethanol opløst i 2 ml saltvand blev anvendt dagligt i 26 dage. IshiI et al.21 brugte C57BL/6 mus og administrerede 0,3 ml 0,1% CG med 15% ethanol opløst i saltvand i.p. injektion i i alt 56 dage, hvor en eksperimentel skleroserende indkapsling af peritonitis blev induceret i mus. Nishino et al.22 brugte Wistar-rotter, der modtog ip-injektioner på 0,1% CG dagligt i 15% ethanol opløst i 2 ml saltvand i 28 dage. Mishima et al.23 brugte en lignende metode til at inducere peritoneal fibrose hos Sprague-Dawley (SD) rotter i samme år. Kushiyama et al.24 brugte SD-rotter og administrerede 0,1% CG i 15% ethanol opløst i saltvand (1,5 ml / 100 g legemsvægt) i.p. injektioner tre gange om ugen i 21 dage. Nishino et al.25 brugte mus dagligt og administrerede en injektion af 0,1% CG i 15% ethanol intraperitonealt, opløst i 0,2 ml saltvand i 7 dage og 15 dage. Lua et al.26 anvendte tamoxifen emulgeret i sesamolie ved 12,5 mg / ml, opløst i ethanol og i.p. injiceret i mus ved 100 mg / g legemsvægt i løbet af et 3-dages interval. Efter 2 uger blev 0,1% CG i 15% ethanol/fosfatbufret saltvand (1,5 ml/100 g) injiceret til musene hver anden dag i i alt 10 doser. Yoh et al.14 brugte SD-rotter og administrerede 1,5 ml / 100 g legemsvægt på 0,1% CG i 15 % ethanol opløst i saltvand i.p. injektioner tre gange om ugen i 21 dage. Yoh et al. brugte 10 uger gamle mus og administrerede 0,1% CG (0,01 ml / g legemsvægt) i 15% ethanol i.p. injektioner tre gange om ugen i alt 21 dage. Samme år brugte lo et al.13 også en lignende metode.
Den nuværende model har visse begrænsninger. For det første blev CG i denne dyremodel anvendt som et kemisk stimulerende middel til at fremkalde funktionel forringelse på grund af peritoneal fibrose i stedet for dialysat. CG er et kemisk irritationsmiddel, og dets gentagne administration kan føre til degeneration af mesothelceller og inflammatoriske reaktioner og dermed forårsage overdreven fibrose. Der blev observeret inflammation og neovaskularisering, og disse fund svarede til dem, der blev observeret hos patienter med PD. Selvom CG-injektioner resulterer i signifikant peritonealfortykkelse, viste en tidligere undersøgelse, at fibrinaflejringen var relativt svagere27. For det andet havde de mus, der blev brugt i denne undersøgelse, ikke nyresygdom; Derfor kunne virkningen af uræmiske toksiner på bughinden ikke vurderes. For det tredje evaluerede vi ikke inflammation, angiogenese og ekstracellulær matrixaflejring i bughinden. Men ifølge en tidligere undersøgelse13 har den samme dyremodel allerede vist, at antallet af både F4/80-positive celler og CD31-positive kar steg efter CG-eksponering. Det skal derfor bemærkes, at resultaterne opnået i denne dyremodel ikke fuldt ud kan repræsentere tilstanden af PD hos peritonealdialysepatienter. Hos patienter med PD er mekanismen for peritoneal skade kompleks og kan følge forskellige mønstre.
På trods af alle disse begrænsninger er den nuværende model enkel, nem at bruge og gennemførlig sammenlignet med andre dyremodeller af PD, ifølge de tidligere undersøgelser 3,13,14,16,18,25. Denne metode repræsenterer en PD-relateret peritoneal fibrosemodel, der kan anvendes til PD-feltforskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker oprigtigt Shin-Han Tseng for den kritiske diskussion og delvise udførelse af undersøgelsen. Denne undersøgelse blev støttet af EDAHP110003 og NCKUEDA110002 fra Research Foundation of E-DA Hospital og National Cheng Kung University, Taiwan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Normal Saline | Y F CHEMICAL CORP., New Taipei City, Taiwan | - | |
| 10% neutral buffered formalin | Taiwan Burnett International Co., Ltd., Taipei City, Taiwan | 00002A | |
| Automatic biochemical analyzer | Hitachi Ltd., Tokyo, Japan | Labospect Series 008 | for determining glucose concentration |
| Chlorhexidine digluconate solution, 20% in H2O | Sigma-Aldrich, MO, USA | C9394 | diluted to 0.1% with 15% ethanol for injection |
| Ethanol | Avantor Performance Materials, LLC, PA, USA | BAKR8006-05 | diluted to 15% with normal saline for working concentration |
| Glucose (Dianeal) | Baxter International, Inc., IL, USA | FNB9896 | Commercial dialysis solution (4.25%) |
| GraphPad Prism 8.0 | GraphPad Software, Inc., CA, US | ||
| L-type Glu 2 assay | FUJIFILM Wako, Japan | 461-32403 | |
| Xylazine 20 | Juily Pharmaceutical Co., Ltd., New Taipei City, Taiwan | - | |
| Zoletil 50 | Virbac Laboratories, Carros, France | - |
References
- Han, S. H., et al. Improving outcome of CAPD: twenty-five years' experience in a single Korean center. Peritoneal Dialysis International. 27 (4), 432-440 (2007).
- Kawaguchi, Y., Hasegawa, T., Nakayama, M., Kubo, H., Shigematu, T. Issues affecting the longevity of the continuous peritoneal dialysis therapy. Kidney International Supplements. 62, 105-107 (1997).
- Lee, Y. C., et al. Vitamin D can ameliorate chlorhexidine gluconate-induced peritoneal fibrosis and functional deterioration through the inhibition of epithelial-to-mesenchymal transition of mesothelial cells. BioMed Research International. 2015, 595030 (2015).
- Nakamoto, H., Kawaguchi, Y., Suzuki, H. Is technique survival on peritoneal dialysis better in Japan. Peritoneal Dialysis International. 26 (2), 136-143 (2006).
- Schaefer, F., Klaus, G., Muller-Wiefel, D. E., Mehls, O. Current practice of peritoneal dialysis in children: results of a longitudinal survey. Mid European Pediatric Peritoneal Dialysis Study Group (MEPPS). Peritoneal Dialysis International. 19, Suppl 2 445-449 (1999).
- Woodrow, G., Turney, J. H., Brownjohn, A. M. Technique failure in peritoneal dialysis and its impact on patient survival. Peritoneal Dialysis International. 17 (4), 360-364 (1997).
- Schmidt, D. W., Flessner, M. F. Pathogenesis and treatment of encapsulating peritoneal sclerosis: basic and translational research. Peritoneal Dialysis International. 28, Suppl 5 10-15 (2008).
- Augustine, T., Brown, P. W., Davies, S. D., Summers, A. M., Wilkie, M. E. Encapsulating peritoneal sclerosis: clinical significance and implications. Nephron Clinical Practice. 111 (2), 149-154 (2009).
- Di Paolo, N., Nicolai, G. A., Garosi, G. The peritoneum: from histological studies to mesothelial transplant through animal experimentation. Peritoneal Dialysis International. 28, Suppl 5 5-9 (2008).
- Fusshoeller, A. Histomorphological and functional changes of the peritoneal membrane during long-term peritoneal dialysis. Pediatric Nephrology. 23 (1), 19-25 (2008).
- Goffin, E. Peritoneal membrane structural and functional changes during peritoneal dialysis. Seminars in Dialysis. 21 (3), 258-265 (2008).
- Ito, T., Yorioka, N. Peritoneal damage by peritoneal dialysis solutions. Clinical and Experimental Nephrology. 12 (4), 243-249 (2008).
- Io, K., et al. SAHA suppresses peritoneal fibrosis in mice. Peritoneal Dialysis International. 35 (3), 246-258 (2015).
- Yoh, K., Ojima, M., Takahashi, S. Th2-biased GATA-3 transgenic mice developed severe experimental peritoneal fibrosis compared with Th1-biased T-bet and Th17-biased RORgammat transgenic mice. Experimental Animals. 64 (4), 353-362 (2015).
- Karl, Z. J. T., et al.
- Lee, Y. C., et al. The clinical implication of vitamin D nanomedicine for peritoneal dialysis-related peritoneal damage. International Journal of Nanomedicine. 14, 9665-9675 (2019).
- Goldner, J. A. Modification of the masson trichrome technique for routine laboratory purposes. The American Journal of Pathology. 14 (2), 237-243 (1938).
- Cheng, F. Y., et al. Novel application of magnetite nanoparticle-mediated vitamin D3 delivery for peritoneal dialysis-related peritoneal damage. International Journal of Nanomedicine. 16, 2137-2146 (2021).
- Ross, A., Willson, V. L. Basic and Advanced Statistical Tests: Writing Results Sections and Creating Tables and Figures. , SensePublishers. 13-16 (2017).
- Suga, H., et al. Preventive effect of pirfenidone against experimental sclerosing peritonitis in rats. Experimental and Toxicologic Pathology. 47 (4), 287-291 (1995).
- Ishii, Y., et al. An experimental sclerosing encapsulating peritonitis model in mice. Nephrology Dialysis Transplantation. 16 (6), 1262-1266 (2001).
- Nishino, T., et al. Antisense oligonucleotides against collagen-binding stress protein HSP47 suppress peritoneal fibrosis in rats. Kidney International. 64 (3), 887-896 (2003).
- Mishima, Y., et al. Enhanced expression of heat shock protein 47 in rat model of peritoneal fibrosis. Peritoneal Dialysis International. 23 (1), 14-22 (2003).
- Kushiyama, T., et al. Effects of liposome-encapsulated clodronate on chlorhexidine gluconate-induced peritoneal fibrosis in rats. Nephrology Dialysis Transplantation. 26 (10), 3143-3154 (2011).
- Nishino, T., et al. Involvement of lymphocyte infiltration in the progression of mouse peritoneal fibrosis model. Renal Failure. 34 (6), 760-766 (2012).
- Lua, I., Li, Y., Pappoe, L. S., Asahina, K. Myofibroblastic conversion and regeneration of mesothelial cells in peritoneal and liver fibrosis. The American Journal of Pathology. 185 (12), 3258-3273 (2015).
- Kitamura, M., et al. Epigallocatechin gallate suppresses peritoneal fibrosis in mice. Chemico-Biological Interactions. 195 (1), 95-104 (2012).
