Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Een muizenmodel van chloorhexidine gluconaat-geïnduceerde peritoneale schade

Published: April 28, 2022 doi: 10.3791/63903
Automatic Translation
*1,2, *1,2, *1, *1, 1,2, 3,4, 1,2,5
1School of Medicine, College of Medicine, I-Shou University, 2Division of Nephrology, Department of Internal Medicine, E-DA Hospital, 3Department of Pediatrics, National Cheng Kung University Hospital, 4Institute of Clinical Medicine, College of Medicine, National Cheng Kung University, 5Division of Nephrology, Department of Internal Medicine, E-DA Dachang Hospital
* These authors contributed equally

Summary

Het huidige protocol stelt een peritoneale dialyse (PD) muismodel vast van chloorhexidinegluconaat (CG) -geïnduceerde peritoneale fibrose. Het huidige model is eenvoudig en gemakkelijk te gebruiken in vergelijking met andere PD-diermodellen.

Abstract

Peritoneale fibrose is een belangrijke complicatie van peritoneale dialyse (PD). Om dit probleem te onderzoeken en aan te pakken, is een geschikt diermodel van PD vereist. Het huidige protocol stelt een chloorhexidinegluconaat (CG) geïnduceerd peritoneale fibrosemodel vast dat de toestand van een patiënt met PD nabootst. Peritoneale fibrose werd geïnduceerd door intraperitoneale injectie van 0,1% CG in 15% ethanol gedurende 3 weken (om de andere dag toegediend), voor een totaal van negen keer bij mannelijke C57BL / 6-muizen. Peritoneale functionele tests werden vervolgens uitgevoerd op dag 22. Nadat de muizen waren geofferd, werden het pariëtale peritoneum van de buikwand en het viscerale peritoneum van de lever geoogst. Ze waren dikker en fibrotischer wanneer ze microscopisch werden geanalyseerd na de trichrome kleuring van Masson. De ultrafiltratiesnelheid nam af en glucosemassatransport duidde op een CG-geïnduceerde toename van de peritoneale permeabiliteit. Het aldus vastgestelde PD-model kan toepassingen hebben bij het verbeteren van PD-technologie, dialyse-werkzaamheid en het verlengen van de overleving van de patiënt.

Introduction

Peritoneale dialyse (PD) is een vorm van niervervangende therapie. PD heeft echter problemen die niet kunnen worden opgelost. Langdurige PD-behandeling kan bijvoorbeeld peritoneale schade veroorzaken, wat uiteindelijk leidt tot ultrafiltratiefalen en stopzetting van de behandeling 1,2,3,4,5,6. Peritoneale fibrose is een van de ernstigste complicaties 7,8. Peritoneale fibrose wordt gekenmerkt door de afzetting en accumulatie van extracellulaire matrix binnen het interstitium, en neo-angiogenese en vasculopathie van het peritoneum 9,10.

De belangrijkste oorzaken van deze peritoneale veranderingen zijn terugkerende peritonitis en niet-biocompatibiliteit van het dialysaat, die hyperosmotisch, hoge glucose, lage pH en accumulatie van glucoseafbraakproducten zijn11,12. Daarom kunnen geschikte dierexperimentele modellen onderzoekers helpen de fysiologische en pathologische veranderingen van het peritoneum tijdens PD-therapie beter te bestuderen. Daarom is het opzetten van een PD-model voor dieren belangrijk voor het verbeteren van PD-technologie en dialyse-effectiviteit en het verlengen van de overleving van de patiënt. Deze studie was gericht op het genereren van een PD-muismodel door intraperitoneale (i.p.) injectie van chloorhexidinegluconaat (CG), zoals eerder beschreven13,14. Dit PD-muismodel is eenvoudig, gemakkelijk te gebruiken en haalbaar in vergelijking met andere PD-diermodellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle muisexperimenten werden goedgekeurd door het Laboratory Animal Center van het E-DA Hospital / I-Shou University en werden behandeld volgens de "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" (NRC, USA 2011). Mannelijke C57BL/6 muizen, 7-8 weken oud, werden gebruikt voor de huidige studie.

1. Chemische bereiding

  1. Bereid de chemische irriterende stof door 0,1% chloorhexidinegluconaat (CG, zie materiaaltabel) te verdunnen in 15% ethanol.

2. Behandeling van dieren

  1. Wijs drie muizen toe als controlegroep. Voer intraperitoneale injectie (i.p.) uit van 1 ml / kg 0,9% normale zoutoplossing (NS) om de andere dag gedurende 3 weken, voor een totaal van negen keer.
  2. Wijs drie muizen toe aan de peritoneale fibrosegroep. Induceer peritoneale fibrose met chloorhexidinegluconaat (CG) door ip-injecties van 0,1% CG in 15% ethanol (stap 1.1) toe te dienen in een dosis van 12,5 μL/g lichaamsgewicht. Voer dit om de andere dag uit gedurende 3 weken, voor een totaal van negen keer.

3. Peritoneale functietests (gemodificeerde peritoneale evenwichtstest)

  1. Bereid een dialyseoplossing met 4,25% glucose. Trek 0,5 ml dialysaatmonster met een spuit en controleer vervolgens de glucoseconcentratie in het dialysaatmonster.
    OPMERKING: De glucoseconcentratie wordt bepaald volgens de hexokinase/G6PD-methode. Dialysaatmonsters werden benaderd voor L-type Glu 2-assay en onderzocht met een biochemische analysator (zie Tabel met materialen). Dit is de initiële glucoseconcentratie van dialysaten.
  2. Verdoof de muizen door intramusculaire injectie van Zoletil en Xylazine (bereid in een volumeverhouding van 1:2, zie tabel met materialen) in een dosis van 20 μL/20 gw. Gebruik bovendien veterinaire zalf op de ogen om uitdroging onder anesthesie te voorkomen.
  3. Voer i.p. instillatie van de dialyseoplossing uit (2 ml/20 g lichaamsgewicht).
  4. Beoordeel en verifieer na 30 minuten de diepte van de anesthesie met gebrek aan teenknijpreflex. Voer vervolgens een verticale incisie uit in de middellijn van de buik (onder het xiphoid-proces), open vervolgens de buik van de muis en verzamel de intraperitoneale vloeistof met een spuit (gedefinieerd als "volume 1"). Meet vervolgens het gewicht van een schoon en droog katoen en plaats het katoen in de buikholte van de muizen om de resterende intraperitoneale vloeistof te absorberen. Meet ten slotte het katoengewicht opnieuw.
    OPMERKING: De gewichtstoename van katoen is gelijk aan het gewicht van de resterende intraperitoneale vloeistof. Reken vervolgens om naar het verkregen volume (soortelijk gewicht: 1 g/cm3; gedefinieerd als "volume 2"). Het uiteindelijke dialysaatvolume is volume 1 plus volume 2.
  5. Gebruik 0,5 ml dialysaatmonster (einddialysaat) om de glucoseconcentratie te meten. Dit is de uiteindelijke glucoseconcentratie van dialysaten.
  6. Bereken de netto ultrafiltratie met behulp van de formule15:
    Equation 1
  7. Bereken de peritoneale permeabiliteit met behulp van de volgende formule15:
    Equation 2

4. Weefselvoorbereiding van de buikwandspier en lever en histologische analyse

  1. Offer de muizen op via hartpunctie (flebotomie)3,16.
  2. Snijd de buikwand (1 cm x 1 cm) en totale hepatectomie. Fixeer de buikwand en leverweefsels van de muizen 's nachts in 10% neutraal gebufferd formaline.
  3. Bereid 3 μm dikke paraffinesecties van de buikwandspier en lever voor en voer histologische analyse uit volgens eerder gepubliceerd rapport17.
  4. Evalueer het pariëtale peritoneum van de buikwand en het viscerale peritoneum van de leveroppervlakken van de muizen met behulp van morfometrie18.
  5. Voer statistische analyses uit met behulp van statistieken en grafische software (zie Materiaaltabel). Druk alle gegevens uit als gemiddelde ± SD en analyseer op statistische significantie met behulp van een t-test19. Definieer waarden met P < 0,05 als significante resultaten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

In figuur 1A,B was het pariëtale peritoneum van de buikwand aanzienlijk dikker en fibrotischer onder Masson's trichrome kleuring17, wat aangeeft dat in de CG-blootgestelde groep peritoneale fibrose ernstiger is dan in de controlezoutgroep (NS). In figuur 2A,B was het viscerale peritoneum van de leveroppervlakken ook aanzienlijk dikker en fibrotischer, wat bewijst dat in de CG-blootgestelde groep peritoneale fibrose ernstiger is dan in de controlezoutgroep (NS). In figuur 3A nam de ultrafiltratiesnelheid af in de CG-groep en gaf het glucosemassatransport aan dat de peritoneale permeabiliteit toenam in de CG-geïnduceerde groep (figuur 3B).

Figure 1
Figuur 1: Fibrose van het pariëtale peritoneum van de buikwand in peritoneale dialyse (PD) muismodel. (A) Voor de groep blootgesteld aan CG is peritoneale fibrose ernstiger dan in de controlegroep (NS) onder Masson's trichrome kleuring. B) gekwantificeerde gegevens van (A) weergegeven als de gemiddelde ± standaardafwijking, n ≥ 3; P < 0,01. Voor (A), schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Fibrose van het viscerale peritoneum van leveroppervlakken in peritoneale dialyse (PD) muismodel . (A) Voor de groep blootgesteld aan CG is peritoneale fibrose ernstiger dan in de controlegroep (NS) onder Masson's trichrome kleuring. B) gekwantificeerde gegevens van (A) weergegeven als de gemiddelde ± standaardafwijking, n ≥ 3; P < 0,005. Voor (A), schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Verslechtering van de peritoneale functie in het PD-muismodel. (A) In de aan chloorhexidinegluconaat blootgestelde groep (CG) was de ultrafiltratiesnelheid significant lager dan in de controlezoutgroep (NS). (B) Het glucosemassatransport gaf ook aan dat CG-geïnduceerde een toename van de peritoneale permeabiliteit veroorzaakte. De gegevens worden weergegeven als de gemiddelde ± standaardafwijking, n ≥ 3; P < 0,005. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In deze studie wordt een muis PD-model gepresenteerd door i.p. injectie van CG, en de resultaten toonden peritoneale fibrose en functionele achteruitgang in dit model, dat de toestand van de PD-patiënt nabootste.

Er zijn verschillende kritieke stappen in het protocol. Ten eerste moet voor het uitvoeren van een i.p. injectie van CG of NS de buikwandhuid van de muis worden opgepakt met een tang om door punctie geïnduceerde intraperitoneale orgaanschade te voorkomen. Ten tweede, bij het verzamelen van het peritoneum van de buikwand voor histologische analyses, moet het gebied dat is beschadigd door ip-injecties worden vermeden.

Van de verschillende experimentele diermodellen van peritoneale fibrose is de meest voorkomende het CG-model vanwege het gebruiksgemak en het aanpassingsvermogen. Suga et al.20 waren de eersten die in 1995 een CG-geïnduceerd peritoneale fibrose ratmodel rapporteerden. i.p. injecties van 0,1% CG en 15% ethanol opgelost in 2 ml zoutoplossing werden dagelijks gedurende 26 dagen gebruikt. IshiI et al.21 gebruikten C57BL/6-muizen en dienden 0,3 ml 0,1% CG toe met 15% ethanol opgelost in zoutoplossing ip-injectie gedurende in totaal 56 dagen, waarbij een experimentele scleroserende inkapselende peritonitis werd geïnduceerd bij muizen. Nishino et al.22 gebruikten Wistar-ratten die gedurende 28 dagen i.p. injecties van 0,1% CG per dag kregen in 15% ethanol opgelost in 2 ml zoutoplossing. Mishima et al.23 gebruikten een vergelijkbare methode om peritoneale fibrose te induceren bij Sprague-Dawley (SD) ratten in hetzelfde jaar. Kushiyama et al.24 gebruikten SD-ratten en dienden 0,1% CG toe in 15% ethanol opgelost in zoutoplossing (1,5 ml / 100 g lichaamsgewicht) i.p. injecties driemaal per week gedurende 21 dagen. Nishino et al.25 gebruikten muizen dagelijks en dienden een injectie van 0,1% CG in 15% ethanol intraperitoneaal toe, opgelost in 0,2 ml zoutoplossing gedurende 7 dagen en 15 dagen. Lua et al.26 gebruikten tamoxifen geëmulgeerd in sesamolie met 12,5 mg / ml, opgelost in ethanol en i.p. geïnjecteerd in muizen met een lichaamsgewicht van 100 mg / g gedurende een interval van 3 dagen. Na 2 weken werd 0,1% CG in 15% ethanol/fosfaat gebufferde zoutoplossing (1,5 ml/100 g) om de dag in de muizen geïnjecteerd voor een totaal van 10 doses. Yoh et al.14 gebruikten SD-ratten en dienden 1,5 ml/100 g lichaamsgewicht van 0,1% CG toe in 15 % ethanol opgelost in zoutoplossing i.p. injecties driemaal per week gedurende 21 dagen. Yoh et al. gebruikten muizen van 10 weken oud en dienden drie keer per week gedurende in totaal 21 dagen 0,1% CG (0,01 ml/g lichaamsgewicht) toe in 15% ethanol i.p. injecties. In hetzelfde jaar gebruikten ook lo et al.13 een soortgelijke methode.

Het huidige model heeft enkele beperkingen. Ten eerste werd CG in dit diermodel gebruikt als een chemisch stimulerend middel om functionele achteruitgang als gevolg van peritoneale fibrose te induceren in plaats van dialysaat. CG is een chemische irriterende stof en de herhaalde toediening ervan kan leiden tot degeneratie van mesotheliale cellen en ontstekingsreacties, waardoor overmatige fibrose wordt veroorzaakt. Ontsteking en neovascularisatie werden waargenomen en deze bevindingen waren vergelijkbaar met die waargenomen bij patiënten met PD. Hoewel CG-injecties resulteren in een significante peritoneale verdikking, toonde een eerdere studie aan dat de fibrineafzetting relatief zwakker was27. Ten tweede hadden de muizen die in deze studie werden gebruikt geen nierziekte; Bijgevolg kon het effect van uremische toxines op het peritoneum niet worden beoordeeld. Ten derde evalueerden we geen ontsteking, angiogenese en extracellulaire matrixafzetting in het peritoneum. Volgens een eerdere studie13 heeft hetzelfde diermodel echter al aangetoond dat het aantal F4/80-positieve cellen en CD31-positieve vaten toenam na CG-blootstelling. Daarom moet worden opgemerkt dat de resultaten verkregen in dit diermodel de toestand van PD bij peritoneale dialysepatiënten niet volledig kunnen weergeven. Bij patiënten met PD is het mechanisme van peritoneale schade complex en kan het verschillende patronen volgen.

Ondanks al deze beperkingen is het huidige model eenvoudig, gemakkelijk te gebruiken en haalbaar in vergelijking met andere diermodellen van PD, volgens de eerdere studies 3,13,14,16,18,25. Deze methode vertegenwoordigt een PD-gerelateerd peritoneale fibrosemodel dat kan worden toegepast op PD-veldonderzoek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

We bedanken Shin-Han Tseng oprecht voor de kritische discussie en gedeeltelijke uitvoering van het onderzoek. Deze studie werd ondersteund door EDAHP110003 en NCKUEDA110002 van de Research Foundation of E-DA Hospital en de National Cheng Kung University, Taiwan.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% Normal Saline Y F CHEMICAL CORP., New Taipei City, Taiwan -
10% neutral buffered formalin Taiwan Burnett International Co., Ltd., Taipei City, Taiwan 00002A
Automatic biochemical analyzer Hitachi Ltd., Tokyo, Japan Labospect Series 008 for determining glucose concentration
Chlorhexidine digluconate solution, 20% in H2O Sigma-Aldrich, MO, USA C9394 diluted to 0.1% with 15% ethanol for injection
Ethanol Avantor Performance Materials, LLC, PA, USA BAKR8006-05 diluted to 15% with normal saline for working concentration
Glucose (Dianeal) Baxter International, Inc., IL, USA FNB9896 Commercial dialysis solution (4.25%)
GraphPad Prism 8.0 GraphPad Software, Inc., CA, US
L-type Glu 2 assay FUJIFILM Wako, Japan 461-32403
Xylazine 20 Juily Pharmaceutical Co., Ltd., New Taipei City, Taiwan -
Zoletil 50 Virbac Laboratories, Carros, France -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Han, S. H., et al. Improving outcome of CAPD: twenty-five years' experience in a single Korean center. Peritoneal Dialysis International. 27 (4), 432-440 (2007).
  2. Kawaguchi, Y., Hasegawa, T., Nakayama, M., Kubo, H., Shigematu, T. Issues affecting the longevity of the continuous peritoneal dialysis therapy. Kidney International Supplements. 62, 105-107 (1997).
  3. Lee, Y. C., et al. Vitamin D can ameliorate chlorhexidine gluconate-induced peritoneal fibrosis and functional deterioration through the inhibition of epithelial-to-mesenchymal transition of mesothelial cells. BioMed Research International. 2015, 595030 (2015).
  4. Nakamoto, H., Kawaguchi, Y., Suzuki, H. Is technique survival on peritoneal dialysis better in Japan. Peritoneal Dialysis International. 26 (2), 136-143 (2006).
  5. Schaefer, F., Klaus, G., Muller-Wiefel, D. E., Mehls, O. Current practice of peritoneal dialysis in children: results of a longitudinal survey. Mid European Pediatric Peritoneal Dialysis Study Group (MEPPS). Peritoneal Dialysis International. 19, Suppl 2 445-449 (1999).
  6. Woodrow, G., Turney, J. H., Brownjohn, A. M. Technique failure in peritoneal dialysis and its impact on patient survival. Peritoneal Dialysis International. 17 (4), 360-364 (1997).
  7. Schmidt, D. W., Flessner, M. F. Pathogenesis and treatment of encapsulating peritoneal sclerosis: basic and translational research. Peritoneal Dialysis International. 28, Suppl 5 10-15 (2008).
  8. Augustine, T., Brown, P. W., Davies, S. D., Summers, A. M., Wilkie, M. E. Encapsulating peritoneal sclerosis: clinical significance and implications. Nephron Clinical Practice. 111 (2), 149-154 (2009).
  9. Di Paolo, N., Nicolai, G. A., Garosi, G. The peritoneum: from histological studies to mesothelial transplant through animal experimentation. Peritoneal Dialysis International. 28, Suppl 5 5-9 (2008).
  10. Fusshoeller, A. Histomorphological and functional changes of the peritoneal membrane during long-term peritoneal dialysis. Pediatric Nephrology. 23 (1), 19-25 (2008).
  11. Goffin, E. Peritoneal membrane structural and functional changes during peritoneal dialysis. Seminars in Dialysis. 21 (3), 258-265 (2008).
  12. Ito, T., Yorioka, N. Peritoneal damage by peritoneal dialysis solutions. Clinical and Experimental Nephrology. 12 (4), 243-249 (2008).
  13. Io, K., et al. SAHA suppresses peritoneal fibrosis in mice. Peritoneal Dialysis International. 35 (3), 246-258 (2015).
  14. Yoh, K., Ojima, M., Takahashi, S. Th2-biased GATA-3 transgenic mice developed severe experimental peritoneal fibrosis compared with Th1-biased T-bet and Th17-biased RORgammat transgenic mice. Experimental Animals. 64 (4), 353-362 (2015).
  15. Karl, Z. J. T., et al. Peritoneal Equilibration Test. Peritoneal Dialysis International. 7 (3), 138-148 (1987).
  16. Lee, Y. C., et al. The clinical implication of vitamin D nanomedicine for peritoneal dialysis-related peritoneal damage. International Journal of Nanomedicine. 14, 9665-9675 (2019).
  17. Goldner, J. A. Modification of the masson trichrome technique for routine laboratory purposes. The American Journal of Pathology. 14 (2), 237-243 (1938).
  18. Cheng, F. Y., et al. Novel application of magnetite nanoparticle-mediated vitamin D3 delivery for peritoneal dialysis-related peritoneal damage. International Journal of Nanomedicine. 16, 2137-2146 (2021).
  19. Ross, A., Willson, V. L. Basic and Advanced Statistical Tests: Writing Results Sections and Creating Tables and Figures. , SensePublishers. 13-16 (2017).
  20. Suga, H., et al. Preventive effect of pirfenidone against experimental sclerosing peritonitis in rats. Experimental and Toxicologic Pathology. 47 (4), 287-291 (1995).
  21. Ishii, Y., et al. An experimental sclerosing encapsulating peritonitis model in mice. Nephrology Dialysis Transplantation. 16 (6), 1262-1266 (2001).
  22. Nishino, T., et al. Antisense oligonucleotides against collagen-binding stress protein HSP47 suppress peritoneal fibrosis in rats. Kidney International. 64 (3), 887-896 (2003).
  23. Mishima, Y., et al. Enhanced expression of heat shock protein 47 in rat model of peritoneal fibrosis. Peritoneal Dialysis International. 23 (1), 14-22 (2003).
  24. Kushiyama, T., et al. Effects of liposome-encapsulated clodronate on chlorhexidine gluconate-induced peritoneal fibrosis in rats. Nephrology Dialysis Transplantation. 26 (10), 3143-3154 (2011).
  25. Nishino, T., et al. Involvement of lymphocyte infiltration in the progression of mouse peritoneal fibrosis model. Renal Failure. 34 (6), 760-766 (2012).
  26. Lua, I., Li, Y., Pappoe, L. S., Asahina, K. Myofibroblastic conversion and regeneration of mesothelial cells in peritoneal and liver fibrosis. The American Journal of Pathology. 185 (12), 3258-3273 (2015).
  27. Kitamura, M., et al. Epigallocatechin gallate suppresses peritoneal fibrosis in mice. Chemico-Biological Interactions. 195 (1), 95-104 (2012).

Tags

Geneeskunde chloorhexidinegluconaat peritoneaal dialysemodel peritoneale fibrose
Een muizenmodel van chloorhexidine gluconaat-geïnduceerde peritoneale schade
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chang, M. Y., Wang, H. H., Chen, L.… More

Chang, M. Y., Wang, H. H., Chen, L. H., Gao, J., Hung, S. Y., Chiou, Y. Y., Lee, Y. C. A Mice Model of Chlorhexidine Gluconate-Induced Peritoneal Damage. J. Vis. Exp. (182), e63903, doi:10.3791/63903 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter