Summary
Den foreliggende protokollen etablerer en peritonealdialyse (PD) musemodell av klorhexidinglukonat (CG)-indusert peritonealfibrose. Den nåværende modellen er enkel og enkel å bruke sammenlignet med andre PD-dyremodeller.
Abstract
Peritoneal fibrose er en viktig komplikasjon ved peritonealdialyse (PD). For å undersøke og løse dette problemet, er det nødvendig med en passende dyremodell av PD. Den nåværende protokollen etablerer en klorhexidinglukonat (CG) indusert peritoneal fibrosemodell som etterligner tilstanden til en pasient med PD. Peritoneal fibrose ble indusert ved intraperitoneal injeksjon av 0,1% av CG i 15% etanol i 3 uker (administrert annenhver dag), totalt ni ganger hos mannlige C57BL/6 mus. Peritoneale funksjonstester ble deretter utført dag 22. Etter at musene ble ofret, ble parietalbukhinnen i bukveggen og leverens viscerale peritoneum høstet. De var tykkere og mer fibrotiske når de ble analysert mikroskopisk etter Massons trichrome-farging. Ultrafiltreringshastigheten ble redusert, og glukosemassetransport indikerte en CG-indusert økning i peritoneal permeabilitet. PD-modellen som er etablert på denne måten, kan ha anvendelser i å forbedre PD-teknologi, dialyseeffekt og forlenge pasientoverlevelse.
Introduction
Peritonealdialyse (PD) er en type nyreerstatningsterapi. PD har imidlertid problemer som ikke kan løses. For eksempel kan langvarig PD-behandling forårsake peritoneal skade, som til slutt fører til ultrafiltreringssvikt og seponering av behandling 1,2,3,4,5,6. Peritoneal fibrose er en av de alvorligste komplikasjonene 7,8. Peritoneal fibrose karakteriseres ved avsetning og akkumulering av ekstracellulær matriks i interstitium, og neoangiogenese og vaskulopati av bukhinnen 9,10.
Hovedårsakene til disse peritoneale endringene er tilbakevendende peritonitt og ikke-biokompatibilitet av dialysatet, som er hyperosmotisk, høy glukose, lav pH og glukosenedbrytning produktakkumulering11,12. Derfor kan egnede dyreforsøksmodeller hjelpe forskere bedre å studere bukhinnens fysiologiske og patologiske endringer under PD-terapi. Derfor er etablering av en PD-modell for dyr viktig for å forbedre PD-teknologi og dialyseeffekt og forlenge pasientoverlevelse. Denne studien hadde som mål å generere en PD-musemodell ved intraperitoneal (i.p.) injeksjon av klorhexidinglukonat (CG), som beskrevet tidligere13,14. Denne PD-musemodellen er enkel, enkel å bruke og gjennomførbar sammenlignet med andre PD-dyremodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle museforsøk ble godkjent av Laboratory Animal Center ved E-DA Hospital / I-Shou University og ble håndtert i henhold til "Guide for Care and Use of Laboratory Animals" (NRC, USA 2011). Hannmus C57BL/6 mus, 7-8 uker gamle, ble brukt i denne studien.
1. Kjemisk forberedelse
- Forbered det kjemiske irriterende stoffet ved å fortynne 0,1% klorhexidinglukonat (CG, se materialtabell) i 15% etanol.
2. Dyrebehandling
- Tilordne tre mus som kontrollgruppe. Utfør intraperitoneal injeksjon (i.p.) på 1 ml/kg med 0,9 % normal saltvann (NS) annenhver dag i 3 uker, totalt ni ganger.
- Tilordne tre mus til gruppen peritoneal fibrose. Indusere peritoneal fibrose ved bruk av klorhexidinglukonat (CG) ved å administrere intravenøse injeksjoner på 0,1% CG i 15% etanol (trinn 1,1) i en dose på 12,5 μL / g kroppsvekt. Utfør dette annenhver dag i 3 uker, totalt ni ganger.
3. Peritoneale funksjonstester (modifisert peritoneal likevektstest)
- Forbered en dialyseoppløsning som inneholder 4,25% glukose. Trekk 0,5 ml dialysatprøve med en sprøyte, og kontroller deretter glukosekonsentrasjonen i dialysatprøven.
MERK: Glukosekonsentrasjonen bestemmes i henhold til heksokinase / G6PD-metoden. Dialysatprøver ble aksessert til L-type Glu 2-analyse og undersøkt med biokjemisk analysator (se materialtabell). Dette er den opprinnelige glukosekonsentrasjonen i dialysat. - Bedøv musene ved intramuskulær injeksjon av Zoletil og Xylazin (fremstilt i et forhold på 1:2 volumprosent, se materialtabell) i en dose på 20 μL/20 gw. I tillegg bruker veterinærsalve på øynene for å forhindre tørrhet under anestesi.
- Utfør intravenøs drypping av dialyseoppløsningen (2 ml/20 g kroppsvekt).
- Etter 30 min, vurder og verifiser anestesidybden med manglende tåklemmerefleks. Deretter utfører du et vertikalt snitt i midtlinjen av buken (under xiphoidprosessen), åpner deretter musens mage og samler intraperitonealvæsken med en sprøyte (definert som "volum 1"). Deretter måler du vekten av en ren og tørr bomull og legger bomullen inn i musens bukhule for å absorbere gjenværende intraperitoneal væske. Til slutt måler du bomullsvekten igjen.
MERK: Vektøkningen av bomull er lik vekten av gjenværende intraperitonealvæske. Deretter konverterer du til det oppnådde volumet (egenvekt: 1 g / cm3; definert som "volum 2"). Det endelige dialysatvolumet er volum 1 pluss volum 2. - Bruk 0,5 ml dialysatprøve (endelig dialysat) for å måle glukosekonsentrasjonen. Dette er den endelige glukosekonsentrasjonen i dialysat.
- Beregn netto ultrafiltrering ved hjelp av formelen15:
- Beregn peritoneal permeabilitet ved hjelp av følgende formel15:
4. Vevsforberedelse av bukveggmuskelen og leveren og histologisk analyse
- Ofre musene via hjertepunksjon (flebotomi)3,16.
- Klipp bukveggen (1 cm x 1 cm) og total hepatektomi. Fest musens bukvegg og levervev over natten i 10% nøytral bufret formalin.
- Klargjøre 3 μm tykke parafinsnitt av bukveggsmuskel og lever, og utføre histologiske analyser etter tidligere publisert rapport17.
- Evaluer parietal peritoneum i bukveggen og visceral peritoneum av leverflatene til musene ved hjelp av morfometri18.
- Utføre statistiske analyser ved hjelp av statistikk og grafisk programvare (se Materialfortegnelse). Uttrykk alle data som gjennomsnitt ± SD og analyser for statistisk signifikans ved hjelp av en t-test19. Definer verdier med P < 0,05 som signifikante resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I figur 1A,B var bukveggens parietale peritoneum markert tykkere og mer fibrotisk under Massons trikrome farging17, noe som indikerer at i den CG-eksponerte gruppen er peritoneal fibrose mer alvorlig enn i kontrollsaltgruppen (NS). I figur 2A,B var den viscerale bukhinnen i leverflatene også markert tykkere og mer fibrotisk, og viste dermed at i den CG-eksponerte gruppen er peritoneal fibrose mer alvorlig enn i kontrollsaltgruppen (NS). I figur 3A sank ultrafiltreringshastigheten i CG-gruppen, og glukosemassetransport indikerte at peritoneal permeabilitet økte i CG-indusert gruppe (figur 3B).
Figur 1 Fibrose av parietal peritoneum i bukveggen i peritonealdialyse (PD) musemodell. (A) For gruppen eksponert for CG er peritoneal fibrose mer alvorlig enn i kontrollgruppen (NS) under Massons trikrome farging. (B) Kvantifiserte data for (A) representert som gjennomsnitt ± standardavvik, n ≥ 3; P < 0,01. For (A), skala bar = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Fibrose av visceral peritoneum av leveroverflater i peritonealdialyse (PD) musemodell. (A) For gruppen eksponert for CG er peritoneal fibrose mer alvorlig enn i kontrollgruppen (NS) under Massons trikrome farging. (B) Kvantifiserte data for (A) representert som gjennomsnitt ± standardavvik, n ≥ 3; P < 0,005. For (A), skala bar = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Forverring av peritonealfunksjonen i PD-musemodellen. (A) I klorhexidinglukonateksponert gruppe (CG) var ultrafiltreringshastigheten signifikant lavere enn i kontrollsaltvannsgruppen (NS). (B) Glukosemassetransporten indikerte også at CG-induserte en økning i peritoneal permeabilitet. Data er representert som gjennomsnittet ± standardavvik, n ≥ 3; P < 0,005. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne studien presenteres en muse-PD-modell ved i.p. injeksjon av CG, og resultatene viste peritoneal fibrose og funksjonell forverring i denne modellen, som etterlignet PD-pasientens tilstand.
Det er flere kritiske trinn i protokollen. For det første, for å utføre en IP-injeksjon av CG eller NS, må bukvegghuden på musen plukkes opp ved hjelp av tang for å forhindre punkteringsindusert intraperitoneal organskade. For det andre, under innsamling av bukhinnen i bukveggen for histologiske analyser, må området som er skadet av intravenøse injeksjoner unngås.
Blant de flere eksperimentelle dyremodellene av peritoneal fibrose er den vanligste CG-modellen på grunn av dens brukervennlighet og tilpasningsevne. Suga et al.20 var de første som rapporterte en CG-indusert peritoneal fibrose rottemodell i 1995. i.p. injeksjoner på 0,1% CG og 15% etanol oppløst i 2 ml saltvann ble brukt daglig i 26 dager. IshiI et al.21 brukte C57BL/6 mus og administrerte 0,3 ml 0,1% CG med 15% etanol oppløst i saltvann i.p. injeksjon i totalt 56 dager, hvor en eksperimentell skleroserende innkapsling peritonitt ble indusert hos mus. Nishino et al.22 brukte Wistar-rotter som fikk i.p. injeksjoner på 0.1% CG daglig i 15% etanol oppløst i 2 ml saltvann i 28 dager. Mishima et al.23 brukte en lignende metode for å indusere peritoneal fibrose hos Sprague-Dawley (SD) rotter samme år. Kushiyama et al.24 brukte SD-rotter og administrerte 0,1% CG i 15% etanol oppløst i saltvann (1,5 ml / 100 g kroppsvekt) i.p. injeksjoner tre ganger i uken i 21 dager. Nishino et al.25 brukte mus daglig, administrerte en injeksjon på 0,1% CG i 15% etanol intraperitonealt, oppløst i 0,2 ml saltvann i 7 dager og 15 dager. Lua et al.26 brukte tamoxifen emulgert i sesamolje ved 12,5 mg / ml, oppløst i etanol, og i.p. injisert i mus ved 100 mg / g kroppsvekt i løpet av et 3-dagers intervall. Etter 2 uker ble 0,1% CG i 15% etanol / fosfatbufret saltvann (1,5 ml / 100 g) injisert til musene annenhver dag for totalt 10 doser. Yoh et al.14 brukte SD-rotter og administrerte 1,5 ml / 100 g kroppsvekt på 0,1% CG i 15 % etanol oppløst i saltvann i.p. injeksjoner tre ganger i uken i 21 dager. Yoh et al. brukte 10 uker gamle mus og administrerte 0,1% CG (0,01 ml / g kroppsvekt) i 15% etanol i.p. injeksjoner tre ganger i uken i totalt 21 dager. Samme år brukte lo et al.13 også en lignende metode.
Dagens modell har noen begrensninger. For det første, i denne dyremodellen, ble CG brukt som et kjemisk stimulerende middel for å indusere funksjonell forverring på grunn av peritoneal fibrose i stedet for dialysat. CG er et kjemisk irriterende middel, og gjentatt administrering kan føre til degenerasjon av mesotelceller og inflammatoriske responser, og dermed forårsake overdreven fibrose. Inflammasjon og neovaskularisering ble observert, og disse funnene lignet de som ble observert hos pasienter med PD. Selv om CG-injeksjoner gir betydelig peritoneal fortykkelse, viste en tidligere studie at fibrinavleiringen var relativt svakere27. For det andre hadde musene som ble brukt i denne studien ikke nyresykdom; Følgelig kunne effekten av uremiske toksiner på bukhinnen ikke vurderes. For det tredje evaluerte vi ikke inflammasjon, angiogenese og ekstracellulær matriksavleiring i bukhinnen. Men ifølge en tidligere studie13 har den samme dyremodellen allerede vist at antallet både F4/80-positive celler og CD31-positive kar økte etter CG-eksponering. Derfor må det bemerkes at resultatene oppnådd i denne dyremodellen ikke fullt ut kan representere tilstanden til PD hos peritonealdialysepasienter. Hos pasienter med PD er mekanismen for peritoneal skade kompleks og kan følge forskjellige mønstre.
Til tross for alle disse begrensningene er den nåværende modellen enkel, enkel å bruke og gjennomførbar sammenlignet med andre dyremodeller av PD, ifølge tidligere studier 3,13,14,16,18,25. Denne metoden representerer en PD-relatert peritoneal fibrosemodell som kan brukes på PD-feltforskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Shin-Han Tseng for den kritiske diskusjonen og delvis gjennomføringen av studien. Denne studien ble støttet av EDAHP110003 og NCKUEDA110002 fra Research Foundation of E-DA Hospital og National Cheng Kung University, Taiwan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Normal Saline | Y F CHEMICAL CORP., New Taipei City, Taiwan | - | |
| 10% neutral buffered formalin | Taiwan Burnett International Co., Ltd., Taipei City, Taiwan | 00002A | |
| Automatic biochemical analyzer | Hitachi Ltd., Tokyo, Japan | Labospect Series 008 | for determining glucose concentration |
| Chlorhexidine digluconate solution, 20% in H2O | Sigma-Aldrich, MO, USA | C9394 | diluted to 0.1% with 15% ethanol for injection |
| Ethanol | Avantor Performance Materials, LLC, PA, USA | BAKR8006-05 | diluted to 15% with normal saline for working concentration |
| Glucose (Dianeal) | Baxter International, Inc., IL, USA | FNB9896 | Commercial dialysis solution (4.25%) |
| GraphPad Prism 8.0 | GraphPad Software, Inc., CA, US | ||
| L-type Glu 2 assay | FUJIFILM Wako, Japan | 461-32403 | |
| Xylazine 20 | Juily Pharmaceutical Co., Ltd., New Taipei City, Taiwan | - | |
| Zoletil 50 | Virbac Laboratories, Carros, France | - |
References
- Han, S. H., et al. Improving outcome of CAPD: twenty-five years' experience in a single Korean center. Peritoneal Dialysis International. 27 (4), 432-440 (2007).
- Kawaguchi, Y., Hasegawa, T., Nakayama, M., Kubo, H., Shigematu, T. Issues affecting the longevity of the continuous peritoneal dialysis therapy. Kidney International Supplements. 62, 105-107 (1997).
- Lee, Y. C., et al. Vitamin D can ameliorate chlorhexidine gluconate-induced peritoneal fibrosis and functional deterioration through the inhibition of epithelial-to-mesenchymal transition of mesothelial cells. BioMed Research International. 2015, 595030 (2015).
- Nakamoto, H., Kawaguchi, Y., Suzuki, H. Is technique survival on peritoneal dialysis better in Japan. Peritoneal Dialysis International. 26 (2), 136-143 (2006).
- Schaefer, F., Klaus, G., Muller-Wiefel, D. E., Mehls, O. Current practice of peritoneal dialysis in children: results of a longitudinal survey. Mid European Pediatric Peritoneal Dialysis Study Group (MEPPS). Peritoneal Dialysis International. 19, Suppl 2 445-449 (1999).
- Woodrow, G., Turney, J. H., Brownjohn, A. M. Technique failure in peritoneal dialysis and its impact on patient survival. Peritoneal Dialysis International. 17 (4), 360-364 (1997).
- Schmidt, D. W., Flessner, M. F. Pathogenesis and treatment of encapsulating peritoneal sclerosis: basic and translational research. Peritoneal Dialysis International. 28, Suppl 5 10-15 (2008).
- Augustine, T., Brown, P. W., Davies, S. D., Summers, A. M., Wilkie, M. E. Encapsulating peritoneal sclerosis: clinical significance and implications. Nephron Clinical Practice. 111 (2), 149-154 (2009).
- Di Paolo, N., Nicolai, G. A., Garosi, G. The peritoneum: from histological studies to mesothelial transplant through animal experimentation. Peritoneal Dialysis International. 28, Suppl 5 5-9 (2008).
- Fusshoeller, A. Histomorphological and functional changes of the peritoneal membrane during long-term peritoneal dialysis. Pediatric Nephrology. 23 (1), 19-25 (2008).
- Goffin, E. Peritoneal membrane structural and functional changes during peritoneal dialysis. Seminars in Dialysis. 21 (3), 258-265 (2008).
- Ito, T., Yorioka, N. Peritoneal damage by peritoneal dialysis solutions. Clinical and Experimental Nephrology. 12 (4), 243-249 (2008).
- Io, K., et al. SAHA suppresses peritoneal fibrosis in mice. Peritoneal Dialysis International. 35 (3), 246-258 (2015).
- Yoh, K., Ojima, M., Takahashi, S. Th2-biased GATA-3 transgenic mice developed severe experimental peritoneal fibrosis compared with Th1-biased T-bet and Th17-biased RORgammat transgenic mice. Experimental Animals. 64 (4), 353-362 (2015).
- Karl, Z. J. T., et al.
- Lee, Y. C., et al. The clinical implication of vitamin D nanomedicine for peritoneal dialysis-related peritoneal damage. International Journal of Nanomedicine. 14, 9665-9675 (2019).
- Goldner, J. A. Modification of the masson trichrome technique for routine laboratory purposes. The American Journal of Pathology. 14 (2), 237-243 (1938).
- Cheng, F. Y., et al. Novel application of magnetite nanoparticle-mediated vitamin D3 delivery for peritoneal dialysis-related peritoneal damage. International Journal of Nanomedicine. 16, 2137-2146 (2021).
- Ross, A., Willson, V. L. Basic and Advanced Statistical Tests: Writing Results Sections and Creating Tables and Figures. , SensePublishers. 13-16 (2017).
- Suga, H., et al. Preventive effect of pirfenidone against experimental sclerosing peritonitis in rats. Experimental and Toxicologic Pathology. 47 (4), 287-291 (1995).
- Ishii, Y., et al. An experimental sclerosing encapsulating peritonitis model in mice. Nephrology Dialysis Transplantation. 16 (6), 1262-1266 (2001).
- Nishino, T., et al. Antisense oligonucleotides against collagen-binding stress protein HSP47 suppress peritoneal fibrosis in rats. Kidney International. 64 (3), 887-896 (2003).
- Mishima, Y., et al. Enhanced expression of heat shock protein 47 in rat model of peritoneal fibrosis. Peritoneal Dialysis International. 23 (1), 14-22 (2003).
- Kushiyama, T., et al. Effects of liposome-encapsulated clodronate on chlorhexidine gluconate-induced peritoneal fibrosis in rats. Nephrology Dialysis Transplantation. 26 (10), 3143-3154 (2011).
- Nishino, T., et al. Involvement of lymphocyte infiltration in the progression of mouse peritoneal fibrosis model. Renal Failure. 34 (6), 760-766 (2012).
- Lua, I., Li, Y., Pappoe, L. S., Asahina, K. Myofibroblastic conversion and regeneration of mesothelial cells in peritoneal and liver fibrosis. The American Journal of Pathology. 185 (12), 3258-3273 (2015).
- Kitamura, M., et al. Epigallocatechin gallate suppresses peritoneal fibrosis in mice. Chemico-Biological Interactions. 195 (1), 95-104 (2012).
