Summary
Detta protokoll fastställer en peritonealdialys (PD) musmodell av klorhexidinglukonat (CG)-inducerad peritoneal fibros. Den nuvarande modellen är enkel och lätt att använda jämfört med andra PD-djurmodeller.
Abstract
Peritoneal fibros är en viktig komplikation av peritonealdialys (PD). För att undersöka och åtgärda detta problem krävs en lämplig djurmodell av PD. Detta protokoll etablerar en klorhexidinglukonat (CG) inducerad peritoneal fibrosmodell som efterliknar tillståndet hos en patient med PD. Peritoneal fibros inducerades genom intraperitoneal injektion av 0,1% CG i 15% etanol i 3 veckor (administrerad varannan dag), totalt nio gånger hos manliga C57BL / 6-möss. Peritoneala funktionstester utfördes sedan på dag 22. Efter att mössen offrades skördades bukväggens parietala bukhinnan och leverns viscerala peritoneum. De var tjockare och mer fibrotiska när de analyserades mikroskopiskt efter Massons trikromfärgning. Ultrafiltreringshastigheten minskade och glukosmasstransport indikerade en CG-inducerad ökning av peritoneal permeabilitet. Den sålunda etablerade PD-modellen kan ha tillämpningar för att förbättra PD-tekniken, dialyseffektiviteten och förlänga patientens överlevnad.
Introduction
Peritonealdialys (PD) är en typ av njurersättningsterapi. PD har dock problem som inte kan lösas. Till exempel kan långvarig PD-behandling orsaka peritoneal skada, vilket så småningom leder till ultrafiltreringsfel och utsättande av behandling 1,2,3,4,5,6. Peritoneal fibros är en av de allvarligaste komplikationerna 7,8. Peritoneal fibros kännetecknas av avsättning och ackumulering av extracellulär matris inom interstitium och neo-angiogenes och vaskulopati i bukhinnan 9,10.
De främsta orsakerna till dessa peritoneala förändringar är återkommande peritonit och icke-biokompatibilitet hos dialysatet, som är hyperosmotisk, hög glukos, lågt pH och glukosnedbrytningsproduktackumulering11,12. Därför kan lämpliga djurexperimentella modeller hjälpa forskare att bättre studera bukhinnans fysiologiska och patologiska förändringar under PD-behandling. Därför är det viktigt att etablera en PD-modell för djur för att förbättra PD-tekniken och dialyseffektiviteten och förlänga patientens överlevnad. Denna studie syftade till att generera en PD-musmodell genom intraperitoneal (i.p.) injektion av klorhexidinglukonat (CG), som beskrivits tidigare13,14. Denna PD-musmodell är enkel, lätt att använda och genomförbar jämfört med andra PD-djurmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla musexperiment godkändes av Laboratory Animal Center vid E-DA Hospital / I-Shou University och hanterades enligt "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" (NRC, USA 2011). Möss av typen C57BL / 6, 7-8 veckor gamla, användes för den aktuella studien.
1. Kemisk beredning
- Förbered det kemiska irriterande ämnet genom att späda 0,1% klorhexidinglukonat (CG, se materialförteckning) i 15% etanol.
2. Behandling av djur
- Tilldela tre möss som kontrollgrupp. Utför intraperitoneal injektion (i.p.) på 1 ml / kg 0,9% normal saltlösning (NS) varannan dag i 3 veckor, totalt nio gånger.
- Tilldela tre möss till peritonealfibrosgruppen. Inducera peritoneal fibros med klorhexidinglukonat (CG) genom att administrera intravenösa injektioner av 0,1 % CG i 15 % etanol (steg 1,1) i en dos på 12,5 μl/g kroppsvikt. Utför detta varannan dag i 3 veckor, totalt nio gånger.
3. Peritoneala funktionstester (modifierat peritonealt jämviktstest)
- Förbered en dialyslösning innehållande 4,25% glukos. Dra 0,5 ml dialysatprov med en spruta och kontrollera sedan glukoskoncentrationen i dialysatprovet.
OBS: Glukoskoncentrationen bestäms enligt hexokinas/G6PD-metoden. Dialysatprover erhölls till L-typ Glu 2-analys och undersöktes med en biokemisk analysator (se materialtabell). Detta är den initiala glukoskoncentrationen i dialysat. - Bedöva mössen genom intramuskulär injektion av Zoletil och Xylazin (beredda i förhållandet 1:2 i volym, se Materialtabell) i en dos av 20 μl/20 gw. Använd dessutom veterinärsalva på ögonen för att förhindra torrhet under anestesi.
- Utför i.p. instillation av dialyslösningen (2 ml/20 g kroppsvikt).
- Efter 30 min, bedöma och verifiera anestesidjupet med avsaknad av tåklämreflex. Utför sedan ett vertikalt snitt i bukens mittlinje (under xiphoidprocessen), öppna sedan mössens buk och samla intraperitonealvätskan med en spruta (definierad som "volym 1"). Mät sedan vikten av en ren och torr bomull och lägg bomullen i mössens bukhålighet för att absorbera resterande intraperitonealvätska. Slutligen mäta bomullsvikten igen.
OBS: Viktökningen av bomull är lika med vikten av den kvarvarande intraperitoneala vätskan. Konvertera sedan till den erhållna volymen (specifik vikt: 1 g/cm3; definierad som "volym 2"). Den slutliga dialysatvolymen är volym 1 plus volym 2. - Använd 0,5 ml dialysatprov (slutdialysat) för att mäta glukoskoncentrationen. Detta är den slutliga glukoskoncentrationen i dialysatet.
- Beräkna netto ultrafiltrering med formeln15:
- Beräkna peritonealpermeabiliteten med följande formel15:
4. Vävnadsberedning av bukväggen, muskeln och levern och histologisk analys
- Offra mössen via hjärtpunktion (flebotomi)3,16.
- Skär bukväggen (1 cm x 1 cm) och total hepatektomi. Fixa mössens bukvägg och levervävnader över natten i 10% neutralt buffrat formalin.
- Bered 3 μm tjocka paraffinsektioner av bukväggsmuskeln och levern och utför histologisk analys enligt tidigare publicerad rapport17.
- Utvärdera parietal peritoneum i bukväggen och visceral peritoneum hos musens leverytor med hjälp av morfometri18.
- Utföra statistiska analyser med hjälp av statistik och grafprogram (se Materialförteckning). Uttryck alla data som medelvärde ± SD och analysera för statistisk signifikans med hjälp av ett t-test19. Definiera värden med P < 0,05 som signifikanta resultat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I figur 1A,B var bukväggens parietala bukhinnan markant tjockare och mer fibrotisk under Massons trikromfärgning17, vilket indikerar att i den CG-exponerade gruppen är peritoneal fibros allvarligare än i kontrollsaltlösningsgruppen (NS). I figur 2A,B var leverytornas viscerala bukhinnan också markant tjockare och mer fibrotisk, vilket bevisar att i den CG-exponerade gruppen är peritoneal fibros svårare än i kontrollsaltlösningsgruppen (NS). I figur 3A minskade ultrafiltreringshastigheten i CG-gruppen och glukosmasstransport indikerade att peritonealpermeabiliteten ökade i den CG-inducerade gruppen (figur 3B).
Figur 1: Fibros av bukväggens parietala bukhinnan i peritonealdialys (PD) musmodell. (A) För gruppen som exponerats för CG är peritoneal fibros svårare än i kontrollgruppen (NS) under Massons trikromfärgning. b) Kvantifierade data om (A) representerade som medelvärdet ± standardavvikelsen, n ≥ 3. P < 0,01. För (A) är skalstapeln = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Fibros av leverytors viscerala bukhinnan i peritonealdialys (PD) musmodell . (A) För gruppen som exponerats för CG är peritoneal fibros svårare än i kontrollgruppen (NS) under Massons trikromfärgning. b) Kvantifierade data om (A) representerade som medelvärdet ± standardavvikelsen, n ≥ 3. P < 0,005. För (A) är skalstapeln = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Försämring av peritonealfunktionen i PD-musmodellen. (A) I den klorhexidinglukonatexponerade gruppen (CG) var ultrafiltreringshastigheten signifikant lägre än i kontrollsaltlösningsgruppen (NS). (B) Glukosmasstransporten indikerade också att CG-inducerade en ökning av peritoneal permeabilitet. Data representeras som medelvärdet ± standardavvikelsen, n ≥ 3; P < 0,005. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna studie presenteras en PD-modell hos möss genom i.p. injektion av CG, och resultaten visade peritoneal fibros och funktionell försämring i denna modell, vilket efterliknade PD-patientens tillstånd.
Det finns flera kritiska steg i protokollet. För det första, för att utföra en ip-injektion av CG eller NS, måste musens bukväggshud plockas upp med pincett för att förhindra punkteringsinducerad intraperitoneal organskada. För det andra, medan bukhinnans bukhinnan samlas in för histologiska analyser, måste det område som skadats av ip-injektioner undvikas.
Bland de flera experimentella djurmodellerna av peritoneal fibros är den vanligaste CG-modellen på grund av dess användarvänlighet och anpassningsförmåga. Suga et al.20 var de första som rapporterade en CG-inducerad peritoneal fibros-råttmodell 1995. i.p. injektioner av 0,1% CG och 15% etanol upplöst i 2 ml saltlösning användes dagligen i 26 dagar. IshiI et al.21 använde C57BL / 6-möss och administrerade 0,3 ml 0,1% CG med 15% etanol upplöst i saltlösning i.p. injektion i totalt 56 dagar, där en experimentell skleroserande inkapslande peritonit inducerades hos möss. Nishino et al.22 använde Wistar-råttor som fick ip-injektioner av 0,1% CG dagligen i 15% etanol upplöst i 2 ml saltlösning i 28 dagar. Mishima et al.23 använde en liknande metod för att inducera peritoneal fibros hos Sprague-Dawley (SD) råttor samma år. Kushiyama et al.24 använde SD-råttor och administrerade 0,1% CG i 15% etanol upplöst i saltlösning (1,5 ml / 100 g kroppsvikt) i.p. injektioner tre gånger i veckan i 21 dagar. Nishino et al.25 använde möss dagligen och administrerade en injektion av 0,1% CG i 15% etanol intraperitonealt, upplöst i 0,2 ml saltlösning i 7 dagar och 15 dagar. Lua et al.26 använde tamoxifen emulgerat i sesamolja vid 12,5 mg / ml, upplöst i etanol och i.p. injiceras i möss vid 100 mg / g kroppsvikt under ett 3-dagars intervall. Efter 2 veckor injicerades 0,1% CG i 15% etanol/fosfatbuffrad saltlösning (1,5 ml/100 g) till mössen varannan dag i totalt 10 doser. Yoh et al.14 använde SD-råttor och administrerade 1,5 ml / 100 g kroppsvikt på 0,1% CG i 15 % etanol upplöst i saltlösning i.p. injektioner tre gånger i veckan i 21 dagar. Yoh et al. använde 10 veckor gamla möss och administrerade 0,1% CG (0,01 ml / g kroppsvikt) i 15% etanol i.p. injektioner tre gånger i veckan i totalt 21 dagar. Samma år använde lo et al.13 också en liknande metod.
Den nuvarande modellen har vissa begränsningar. Först användes CG i denna djurmodell som ett kemiskt stimulerande medel för att inducera funktionell försämring på grund av peritoneal fibros istället för dialysat. CG är en kemisk irriterande, och dess upprepade administrering kan leda till degenerering av mesotelceller och inflammatoriska svar, vilket orsakar överdriven fibros. Inflammation och neovaskularisering observerades, och dessa fynd liknade dem som observerats hos patienter med PD. Även om CG-injektioner resulterar i signifikant peritoneal förtjockning, visade en tidigare studie att fibrinavsättningen var relativt svagare27. För det andra hade mössen som användes i den aktuella studien inte njursjukdom; Följaktligen kunde effekten av uremiska toxiner på bukhinnan inte bedömas. För det tredje utvärderade vi inte inflammation, angiogenes och extracellulär matrisavsättning i bukhinnan. Enligt en tidigare studie13 har dock samma djurmodell redan visat att antalet både F4/80-positiva celler och CD31-positiva kärl ökade efter CG-exponering. Därför måste det noteras att resultaten erhållna i denna djurmodell inte helt kan representera tillståndet för PD hos peritonealdialyspatienter. Hos patienter med PD är mekanismen för peritoneal skada komplex och kan följa olika mönster.
Trots alla dessa begränsningar är den nuvarande modellen enkel, lätt att använda och genomförbar jämfört med andra djurmodeller av PD, enligt de tidigare studierna 3,13,14,16,18,25. Denna metod representerar en PD-relaterad peritoneal fibrosmodell som kan tillämpas på PD-fältforskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Shin-Han Tseng för den kritiska diskussionen och det partiella genomförandet av studien. Denna studie stöddes av EDAHP110003 och NCKUEDA110002 från Research Foundation of E-DA Hospital och National Cheng Kung University, Taiwan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Normal Saline | Y F CHEMICAL CORP., New Taipei City, Taiwan | - | |
| 10% neutral buffered formalin | Taiwan Burnett International Co., Ltd., Taipei City, Taiwan | 00002A | |
| Automatic biochemical analyzer | Hitachi Ltd., Tokyo, Japan | Labospect Series 008 | for determining glucose concentration |
| Chlorhexidine digluconate solution, 20% in H2O | Sigma-Aldrich, MO, USA | C9394 | diluted to 0.1% with 15% ethanol for injection |
| Ethanol | Avantor Performance Materials, LLC, PA, USA | BAKR8006-05 | diluted to 15% with normal saline for working concentration |
| Glucose (Dianeal) | Baxter International, Inc., IL, USA | FNB9896 | Commercial dialysis solution (4.25%) |
| GraphPad Prism 8.0 | GraphPad Software, Inc., CA, US | ||
| L-type Glu 2 assay | FUJIFILM Wako, Japan | 461-32403 | |
| Xylazine 20 | Juily Pharmaceutical Co., Ltd., New Taipei City, Taiwan | - | |
| Zoletil 50 | Virbac Laboratories, Carros, France | - |
References
- Han, S. H., et al. Improving outcome of CAPD: twenty-five years' experience in a single Korean center. Peritoneal Dialysis International. 27 (4), 432-440 (2007).
- Kawaguchi, Y., Hasegawa, T., Nakayama, M., Kubo, H., Shigematu, T. Issues affecting the longevity of the continuous peritoneal dialysis therapy. Kidney International Supplements. 62, 105-107 (1997).
- Lee, Y. C., et al. Vitamin D can ameliorate chlorhexidine gluconate-induced peritoneal fibrosis and functional deterioration through the inhibition of epithelial-to-mesenchymal transition of mesothelial cells. BioMed Research International. 2015, 595030 (2015).
- Nakamoto, H., Kawaguchi, Y., Suzuki, H. Is technique survival on peritoneal dialysis better in Japan. Peritoneal Dialysis International. 26 (2), 136-143 (2006).
- Schaefer, F., Klaus, G., Muller-Wiefel, D. E., Mehls, O. Current practice of peritoneal dialysis in children: results of a longitudinal survey. Mid European Pediatric Peritoneal Dialysis Study Group (MEPPS). Peritoneal Dialysis International. 19, Suppl 2 445-449 (1999).
- Woodrow, G., Turney, J. H., Brownjohn, A. M. Technique failure in peritoneal dialysis and its impact on patient survival. Peritoneal Dialysis International. 17 (4), 360-364 (1997).
- Schmidt, D. W., Flessner, M. F. Pathogenesis and treatment of encapsulating peritoneal sclerosis: basic and translational research. Peritoneal Dialysis International. 28, Suppl 5 10-15 (2008).
- Augustine, T., Brown, P. W., Davies, S. D., Summers, A. M., Wilkie, M. E. Encapsulating peritoneal sclerosis: clinical significance and implications. Nephron Clinical Practice. 111 (2), 149-154 (2009).
- Di Paolo, N., Nicolai, G. A., Garosi, G. The peritoneum: from histological studies to mesothelial transplant through animal experimentation. Peritoneal Dialysis International. 28, Suppl 5 5-9 (2008).
- Fusshoeller, A. Histomorphological and functional changes of the peritoneal membrane during long-term peritoneal dialysis. Pediatric Nephrology. 23 (1), 19-25 (2008).
- Goffin, E. Peritoneal membrane structural and functional changes during peritoneal dialysis. Seminars in Dialysis. 21 (3), 258-265 (2008).
- Ito, T., Yorioka, N. Peritoneal damage by peritoneal dialysis solutions. Clinical and Experimental Nephrology. 12 (4), 243-249 (2008).
- Io, K., et al. SAHA suppresses peritoneal fibrosis in mice. Peritoneal Dialysis International. 35 (3), 246-258 (2015).
- Yoh, K., Ojima, M., Takahashi, S. Th2-biased GATA-3 transgenic mice developed severe experimental peritoneal fibrosis compared with Th1-biased T-bet and Th17-biased RORgammat transgenic mice. Experimental Animals. 64 (4), 353-362 (2015).
- Karl, Z. J. T., et al.
- Lee, Y. C., et al. The clinical implication of vitamin D nanomedicine for peritoneal dialysis-related peritoneal damage. International Journal of Nanomedicine. 14, 9665-9675 (2019).
- Goldner, J. A. Modification of the masson trichrome technique for routine laboratory purposes. The American Journal of Pathology. 14 (2), 237-243 (1938).
- Cheng, F. Y., et al. Novel application of magnetite nanoparticle-mediated vitamin D3 delivery for peritoneal dialysis-related peritoneal damage. International Journal of Nanomedicine. 16, 2137-2146 (2021).
- Ross, A., Willson, V. L. Basic and Advanced Statistical Tests: Writing Results Sections and Creating Tables and Figures. , SensePublishers. 13-16 (2017).
- Suga, H., et al. Preventive effect of pirfenidone against experimental sclerosing peritonitis in rats. Experimental and Toxicologic Pathology. 47 (4), 287-291 (1995).
- Ishii, Y., et al. An experimental sclerosing encapsulating peritonitis model in mice. Nephrology Dialysis Transplantation. 16 (6), 1262-1266 (2001).
- Nishino, T., et al. Antisense oligonucleotides against collagen-binding stress protein HSP47 suppress peritoneal fibrosis in rats. Kidney International. 64 (3), 887-896 (2003).
- Mishima, Y., et al. Enhanced expression of heat shock protein 47 in rat model of peritoneal fibrosis. Peritoneal Dialysis International. 23 (1), 14-22 (2003).
- Kushiyama, T., et al. Effects of liposome-encapsulated clodronate on chlorhexidine gluconate-induced peritoneal fibrosis in rats. Nephrology Dialysis Transplantation. 26 (10), 3143-3154 (2011).
- Nishino, T., et al. Involvement of lymphocyte infiltration in the progression of mouse peritoneal fibrosis model. Renal Failure. 34 (6), 760-766 (2012).
- Lua, I., Li, Y., Pappoe, L. S., Asahina, K. Myofibroblastic conversion and regeneration of mesothelial cells in peritoneal and liver fibrosis. The American Journal of Pathology. 185 (12), 3258-3273 (2015).
- Kitamura, M., et al. Epigallocatechin gallate suppresses peritoneal fibrosis in mice. Chemico-Biological Interactions. 195 (1), 95-104 (2012).
