Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para criar xenoenxertos de carcinoma hepatocelular ortotópico com e sem ligadura da artéria hepática e realizamos tomografia por emissão de pósitrons (PET) não invasiva de hipóxia tumoral usando [18 F]Fluoromisonidazol ([18 F]FMISO) e [18 F]Fluorodesoxiglicose ([18F]FDG).
Abstract
Modelos experimentais pré-clínicos de carcinoma hepatocelular (CHC) que recapitulam a doença humana representam uma ferramenta importante para estudar a tumorigênese e avaliar novas abordagens terapêuticas. A imagem não invasiva de corpo inteiro usando tomografia por emissão de pósitrons (PET) fornece insights críticos sobre as características in vivo dos tecidos no nível molecular em tempo real. Apresentamos aqui um protocolo para a criação de xenoenxertos ortotópicos de CHC com e sem ligadura da artéria hepática (HAL) para induzir hipóxia tumoral e a avaliação de seu metabolismo tumoral in vivo usando [18 F]Fluoromisonidazol ([18 F]FMISO) e [18F]Fluorodesoxiglicose ([18F]FDG) PET/RESSONÂNCIA MAGNÉTICA (MR) de imagem. A hipóxia tumoral pôde ser prontamente visualizada usando o marcador de hipóxia [18 F]FMISO, e verificou-se que a captação de [18 F]FMISO foi maior em camundongos com CHC submetidos a HAL do que no grupo não-HAL, enquanto [18F]FDG não conseguiu distinguir a hipóxia tumoral entre os dois grupos. Os tumores HAL também apresentaram um nível mais alto de expressão do fator induzível por hipóxia (HIF)-1α em resposta à hipóxia. A quantificação dos tumores HAL mostrou um aumento de 2,3 vezes na captação de [18F]FMISO com base na abordagem padronizada de captação de valor (SUV).
Introduction
O carcinoma hepatocelular (CHC) é o sexto câncer mais diagnosticado e a terceira causa mais comum de morte por câncer em todo o mundo, com mais de 900.000 novos casos e 800.000 mortes em 20201. O principal fator de risco é a cirrose, que ocorre como resultado de infecções virais (vírus das hepatites B e C), abuso de álcool, diabetes e esteato-hepatite não alcoólica2. O manejo do CHC é bastante complexo, e várias opções de tratamento estão disponíveis, incluindo ressecção cirúrgica, ablação térmica ou química, transplante, quimioembolização transarterial, radiação e quimioterapia, dependendo do estadiamento da doença 2,3. O CHC é um tumor refratário à quimioterapia com recorrência da doença em até 70% dos pacientes após terapia curativade intenção 2.
Apesar do alto grau de heterogeneidade tumoral, o CHC está associado a dois desfechos comuns: (i) o CHC é muito hipóxico e (ii) a hipóxia tumoral está ligada a maior agressividade tumoral e falha no tratamento. A proliferação descontrolada de células CHC resulta em uma alta taxa de consumo de oxigênio que precede a vascularização, criando assim um microambiente hipóxico. Baixos níveis intratumorais de oxigênio, em seguida, desencadeiam uma série de respostas biológicas que influenciam a agressividade do tumor e a resposta ao tratamento. Os fatores induzíveis por hipóxia (HIFs) são frequentemente reconhecidos como os reguladores transcricionais essenciais na resposta à hipóxia 2,3. Assim, a capacidade de detectar hipóxia é crucial para visualizar tecidos neoplásicos e identificar os locais inacessíveis, que requerem procedimentos invasivos. Também ajuda a entender melhor as mudanças moleculares que levam à agressividade do tumor e melhoram os resultados do tratamento do paciente.
A imagem molecular usando tomografia por emissão de pósitrons (PET) é comumente usada no diagnóstico e estadiamento de muitos tipos de câncer, incluindo o CHC. Em particular, o uso combinado de imagens PET de traçador duplo envolvendo [18 F]Fluorodesoxiglicose ([18F]FDG) e [11C]Acetato pode aumentar significativamente a sensibilidade geral no diagnóstico de CHC 4,5. A imagem da hipóxia, por outro lado, pode ser obtida usando o marcador hipóxico comumente usado [18 F]Fluoromisonidazol ([18F]FMISO). Na prática clínica, a avaliação não invasiva da hipóxia é importante para diferenciar entre vários tipos de tumores e regiões para o planejamento da radioterapia6.
A imagem pré-clínica tornou-se uma ferramenta indispensável para a avaliação não invasiva e longitudinal de modelos de camundongos para diferentes doenças. Um modelo de CHC robusto e altamente reprodutível representa uma plataforma importante para a pesquisa pré-clínica e translacional sobre a fisiopatologia do CHC humano e a avaliação de novas terapias. Juntamente com a imagem PET, os comportamentos in vivo podem ser elucidados para fornecer informações importantes no nível molecular para qualquer ponto de tempo. Aqui, descrevemos um protocolo para a geração de xenoenxertos ortotópicos de CHC de ligadura da artéria hepática (HAL) e análise de seu metabolismo tumoral in vivo usando [18 F]FMISO e [18F]FDG PET/MR. A incorporação de HAL faz um modelo adequado de xenoenxertos de camundongos com CHC transgênicos ou quimicamente induzidos para estudar a hipóxia tumoral in vivo, uma vez que a HAL pode efetivamente bloquear o suprimento sanguíneo arterial para induzir hipóxia intratumoral 7,8. Além disso, ao contrário da coloração imuno-histoquímica ex vivo com pimonidazol, as alterações no metabolismo tumoral como resultado da hipóxia podem ser prontamente visualizadas e quantificadas com precisão de forma não invasiva usando imagens PET, permitindo a avaliação longitudinal da resposta ao tratamento ou a aferição do surgimento de resistência 3,7,8 . Nosso método mostrado aqui permite a criação de um modelo robusto de CHC hipóxico juntamente com o monitoramento não invasivo da hipóxia tumoral usando imagens PET/MR para estudar a biologia do CHC in vivo.
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Protocol
Todos os estudos em animais foram realizados de acordo com o Comitê sobre o Uso de Animais Vivos no Ensino e Pesquisa (CULATR) no Centro de Pesquisa em Medicina Comparada (CCMR) da Universidade de Hong Kong, um programa credenciado pela Associação para a Avaliação e Acreditação de Cuidados com Animais de Laboratório Internacional (AAALAC). Os animais utilizados no estudo foram fêmeas de camundongos BALB/cAnN-nu (Nude) com idade entre 6-8 semanas, pesados a 20 g ± 2 g. Comida e água foram fornecidas ad libitum.
1. Injeção subcutânea de linhagens celulares de carcinoma hepatocelular humano
NOTA: MHCC97 é uma linhagem celular de CHC humano que é usada para gerar o modelo de xenoenxerto de HCC subcutâneo. As células MHCC97L são obtidas do Instituto do Câncer de Fígado, Hospital Zhongshan da Universidade de Fudan, Xangai, República Popular da China9 e autenticadas por perfil de repetição curta em tandem (STR).
- Cultivar células MHCC97L e manter em meio de cultura suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina e estreptomicina em um frasco de cultura de células T-75 a 37 °C em uma incubadora umidificada fornecida com 5% de CO2 (ver Tabela de Materiais). Mudar o meio de cultura a cada 2 dias e colher as células a 80%-90% de confluência.
NOTA: O número de célula inicial é 1,5 x 10 6 células, e as células são usadas dentro de6-8 passagens. - Conservar o meio de cultura e o ácido tripsina-etilenodiaminotetracético (tripsina-EDTA) a 4 °C no escuro até à utilização. Pré-aqueça o meio de cultura a 37 °C e a tripsina-EDTA à temperatura ambiente antes do uso. Consulte a Tabela de Materiais para todos os reagentes e consumíveis utilizados nesta seção.
- Remova a mídia cultural. Enxaguar a camada celular com 10 mL de solução salina tamponada com fosfato estéril (DPBS, ver Tabela de Materiais).
- Adicionar 5 ml de tripsina-EDTA ao balão de cultura e incubar as células a 37 °C. Verificar as células ao microscópio invertido com uma ampliação de 20x (ver Tabela de materiais) até que a camada celular esteja dispersa e completamente separada do balão. Certifique-se de que as células não são deixadas em tripsina-EDTA por mais de 15 minutos.
- Adicionar 5 ml de meios de cultura ao balão de cultura. Aspirar as células pipetando suavemente. Transfira a suspensão da célula para um tubo de centrífuga e gire a 1.107 x g durante 5 min (ver Tabela de Materiais).
- Remova o sobrenadante e ressuscite suavemente o pellet celular com 1 mL de PBS. Pipetar cuidadosamente para obter uma suspensão de célula única. Determine o número de células utilizando o contador de células automatizado (ver Tabela de Materiais) e prepare a suspensão celular para uma concentração de 5 x 106 células/ml em PBS.
- Retirar 200 μL de suspensão celular com uma agulha de 25 G numa seringa de 1 ml. Cada seringa contém 1 x 106 células MHCC97L (em 200 μL). Mantenha a seringa no gelo molhado.
- Anestesiar o rato com uma injeção intraperitoneal (i.p.) de uma mistura de cetamina (87,5 mg/kg) e xilazina (12,5 mg/kg). Garanta a anestesia adequada usando o reflexo da pinça do dedo do pé. Certifique-se de aplicar lubrificante ocular no rato para evitar a secagem e a formação potencial de úlceras de córnea. Coloque o rato em decúbito dorsal sobre uma almofada estéril (ver Tabela de Materiais).
- Esterilizar a região dorsal perto do flanco inferior (lado esquerdo ou direito) do rato com etanol a 70% (ver Tabela de Materiais). Levante a pele com pinça e insira suavemente o bisel da agulha por baixo da pele.
- Avançar a agulha 4-5 mm ao longo do plano subcutâneo a partir do local da punção para evitar fugas acidentais da suspensão celular do local de injeção após a retirada da agulha. Certifique-se de que a inserção da agulha não seja muito profunda sob a pele, o que pode causar danos acidentais aos órgãos.
- Solte a pinça e descarregue com cuidado e lentamente o conteúdo da seringa, tomando cuidado para não penetrar no lado oposto. Puxe a agulha para verificar se há um inchaço na injeção. Coloque o rato de volta na gaiola sentado em cima de uma almofada de aquecimento pré-aquecida para ajudar na recuperação da anestesia e recuperar a mobilidade. Continue a monitorar o mouse até que ele esteja totalmente acordado e mantenha a decúbito esternal.
- Monitore o crescimento do tumor e o bem-estar do rato semanalmente. Meça o volume do tumor (V) usando um paquímetro (ver Tabela de Materiais). Calcule e registre o volume do tumor usando a seguinte fórmula10:
V = (W 2× L)/2
onde W é a largura e L é o comprimento do tumor. - Entre 4-6 semanas após a injeção, verifique se um tamanho significativo do tumor subcutâneo, entre 800-1000 mm3, é obtido. Certifique-se de que a carga total do tumor não exceda 10% do peso corporal.
2. Implante hepático ortotópico e ligadura da artéria hepática
- Prepare os seguintes reagentes cirúrgicos e ferramentas em um armário de segurança biológica desinfetada: 10 mL de meio de cultura em um prato, solução de iodopovidona a 10%, etanol a 70%, instrumentos cirúrgicos autoclavados, ou seja, tesoura afiada, tesoura de mola, pinça (curva fina e reta), suporte de agulha, lâmina de bisturi, sutura de nylon 6-0 e 5-0, uma almofada de aquecimento.
- Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos e manuseie-os apenas em um banco estéril. Fornecer os cuidados pré, intra e pós-operatórios adequados e necessários aos ratos durante os procedimentos cirúrgicos (ver passos abaixo).
- Para alívio da dor pré-operatória, injete no rato uma injeção subcutânea de buprenorfina (0,1 mg/kg) pelo menos 30 minutos antes do início do procedimento cirúrgico. Para cuidados pós-operatórios e manejo, injete no rato uma injeção subcutânea de buprenorfina (0,1 mg/kg) durante 3 dias de forma contínua, uma vez a cada 8-12 h. Consulte a Tabela de Materiais para todos os reagentes e consumíveis utilizados nesta seção.
- Eutanasiar o rato portador de tumor subcutâneo com uma injeção i.p. de pentobarbital (330 mg/kg). Faça uma incisão na pele do local do tumor usando uma lâmina de bisturi. Excise o bloqueio tumoral subcutâneo e transfira-o imediatamente para o meio de cultura. Execute esta etapa o mais rápido possível.
- Corte o bloco tumoral em 1 mm3 pequenos cubos tumorais usando tesoura cirúrgica afiada. Mantenha todos os cubos tumorais nos meios de cultura. Evite usar a região central do bloqueio tumoral subcutâneo.
- Anestesiar o rato que será submetido à subsequente cirurgia de implante de tumor ortotópico com uma injeção i.p. de uma mistura de cetamina (87,5 mg/kg) e xilazina (12,5 mg/kg). Certifique-se de que pelo menos 30 minutos se passaram depois de dar a buprenorfina antes de anestesiar o rato. Certifique-se de aplicar lubrificante ocular no rato para evitar a secagem e a formação potencial de úlceras de córnea.
- Coloque o rato numa posição supina sobre uma almofada estéril que esteja em cima de uma almofada de aquecimento pré-aquecida. Monitore e registre o estado fisiológico do camundongo a cada 15 minutos até o final do procedimento cirúrgico.
- Estenda os membros do rato. Prenda-os com fita adesiva para maximizar a exposição do abdômen ventral e do tórax. Esterilizar toda a pele abdominal do rato com uma solução de iodopovidona a 10%, seguida de etanol a 70%. Avalie a profundidade anestésica do rato, verificando se não há resposta ao beliscar do dedo do pé - o reflexo de retirada do pedal.
- Realizar uma laparotomia fazendo uma incisão de aproximadamente 10 mm na linha média para acessar o peritônio usando uma tesoura afiada. Prenda e puxe o processo xifoide em direção à cabeça com pinça e aplique os afastadores subcostais para abrir o campo cirúrgico. Certifique-se de que uma incisão adequada é feita para permitir uma boa visão cirúrgica do local da operação.
- Retraia os lobos mediano e esquerdo para cima com um cotonete de gaze molhado. Mova os intestinos para fora do abdômen para o lado esquerdo do rato e cubra-os com um cotonete de gaze molhado. Realizar ligadura da artéria hepática (HAL) na artéria hepática comum (ACS), que se origina da cabeça pancreática até sua raiz no pedículo hepático, sob uma lâmpada de aumento para visualização otimizada.
- Retraia os lobos mediano e esquerdo para trás/para baixo com um cotonete de gaze molhado para expor o lobo esquerdo. Faça uma incisão de aproximadamente 2 mm de comprimento e profundidade na superfície do lobo esquerdo com uma lâmina de bisturi estéril.
NOTA: Também é possível usar o lobo mediano do fígado para implantação de tumor para minimizar lágrimas acidentais ou laceração por trauma em órgãos abdominais vizinhos. - Insira imediatamente um fragmento de tumor na incisão hepática com pinça estéril. Enterre o tumor para que ele fique seguro no fígado. Aplique uma sutura de figura de oito com uma sutura de nylon 6-0 sobre o local da incisão para garantir o implante adequado de fragmentos tumorais no fígado e hemostasia. Realize esta operação o mais rápido possível para evitar sangramento excessivo. Após a conclusão, feche a incisão do abdômen com suturas 5-0 interrompidas.
- Coloque o rato de volta na gaiola sentado em cima de uma almofada de aquecimento pré-aquecida para ajudar na recuperação da anestesia e recuperar o reflexo de endireitamento. Continue a monitorar e registrar o estado fisiológico do camundongo a cada 15 minutos até que o rato esteja totalmente acordado e mantenha a decúbito esternal.
- Repita o procedimento até que todos os ratos tenham passado por implante de tumor ortotópico. Fornecer cuidados pós-operatórios a todos os camundongos, monitorando continuamente seu estado fisiológico diariamente pelos próximos 3 dias após a operação cirúrgica. Dê buprenorfina (0,1 mg/kg) a cada 8-12 h.
3. Configuração de calibrações PET/MR e fluxo de trabalho
NOTA: A imagem é realizada usando um sistema pré-clínico PET/MR 3T (consulte Tabela de Materiais).
- Use isoflurano a 5% (1 L/min médico O2) para anestesiar o rato em uma câmara de indução. Para cada varredura, coloque cuidadosamente o mouse anestesiado em uma cama de imagem com aquecimento contínuo; primeiro, a varredura com RM (scout view) como referência anatômica para exames estáticos de [18 F]FMISO ou [18F]FDG PET, seguido de ressonância magnética de referência anatômica.
- Crie um fluxo de trabalho sequencial de imagens PET/MR no software (consulte Tabela de Materiais) para incluir uma tomografia por emissão de pósitrons (PET estático), RM ponderada em T1 (correção de atenuação) e ponderada em T2 (referência anatômica) e reconstrução de PET 1 dia antes da sessão de imagem agendada.
- Para adquirir PET, selecione discriminação de nível de 400-600 keV, isótopo de estudo F-18, modo de coincidência de 1-5 e varreduras de 20 minutos.
- Para adquirir RM ponderada em T1 de corpo inteiro, use gradiente eco-3D com TE = 4,3 ms, TR = 16 ms, campo de visão (FOV) = 90 mm x 60 mm, número de excitações (NEX) = 3, 28 fatias com 0,9 mm de espessura e tamanho de voxel = 0,375 mm 3 x 0,375 mm 3 x 0,9 mm3.
- Para adquirir RM ponderada em T2 de corpo inteiro, use eco de spin rápido 2D com TE = 71,8 ms, TR = 3000 ms, FOV = 90 mm x 60 mm, NEX = 5, 28 fatias com 0,9 mm de espessura, tamanho do voxel = 0,265 mm 3 x 0,268 mm 3 x 0,9 mm3.
- Para reconstruir o PET, selecione o algoritmo Tera-Tomo (TT3D), iterações = 8, subconjuntos = 6, modo de coincidência 1-3 e com correções de decaimento, tempo morto, aleatório, atenuação e dispersão para criar imagens com um tamanho geral de voxel de 0,3 mm3.
- Realizar um teste de atividade de PET antes do início do experimento para verificar a precisão da quantificação de PET11.
- Encha uma seringa de 5 ml com 5-8 MBq [18F]FMISO diluído em água ou solução salina de acordo com a recomendação do fabricante. Utilize um calibrador de dose para registar a atividade da seringa (ver Tabela de Materiais). Anote o tempo de medição.
- Desenhe um volume de interesse (VOI) na imagem reconstruída para cobrir toda a seringa. Compare a atividade recuperada da imagem com o valor obtido do calibrador de dose. Prossiga com os estudos de imagem quando a atividade recuperada for precisa dentro de ±5%.
4. [18 F]FMISO e [18F]FDG injeção
- Obter uma dose clínica de [18F]FMISO do fornecedor 30 min antes do início dos estudos de imagem. Use o equipamento de proteção individual (EPI) apropriado, como um jaleco, luvas, óculos sobrepostos, um crachá de filme e dosímetros de anel ao manusear materiais radioativos. Troque as luvas com frequência para evitar a contaminação cruzada das substâncias radioativas.
- Coloque as soluções de estoque radioativo no recipiente de armazenamento de chumbo atrás de um escudo de mesa de bloco L. Dispensar uma alíquota de [18F]FMISO e diluir com solução salina esterilizada. Certifique-se de que a concentração de atividade total é de 18-20 MBq em 100 μL.
- Elaborar o [18F]FMISO com uma seringa de 1 ml com agulha (ver Tabela de Materiais). Registar a radioatividade e a hora indicada no calibrador de dose.
- Registar o peso do rato antes da injeção do radiotraçador. Use isoflurano a 5% (1 L/min médico O2) para anestesiar o rato, em seguida, injete cuidadosamente o [18F]FMISO preparado através da veia da cauda. Registar o tempo de injeção e a atividade residual da seringa para ter em conta a correção do decaimento. Coloque o rato de volta na gaiola durante 180 minutos para permitir a captação de [18F]FMISO antes da PET scan. Deixe o rato recuperar durante 1 dia após [18F]FMISO PET.
NOTA: Apesar dos perfis farmacocinéticos in vivo muito diferentes para [18 F]FMISO e [18 F]FDG, ambos os radiotraçadores são radiomarcados com F-18, que é um radionuclídeo PET com uma meia-vida de 109,77min (< 2 h). Como o sinal PET se origina do F-18, metade da radioatividade inicial injetada será perdida a cada 2 h. Neste caso, o sinal residual 24 h após a injeção não pode mais ser detectado pelo scanner PET. Além disso, o intervalo de 1 dia entre as injeções [18 F]FMISO (dia 1) e [18 F]FDG (dia 3) permitirá o decaimento completo de [18 F]FMISO quando [18 F]FDG PET for realizado, portanto, nenhuma sobreposição do sinal [18 F]FMISO na varredura [18F]FDG PET. - Repita as etapas 4.1.-4.4. para a injeção de [18F]FDG no dia 3, com a exceção de que uma concentração de atividade total de 6-8 MBq em 100 μL é injetada com uma captação de 60 minutos antes do início do PET scan.
- Calcular a actividade injectada [18 F]FMISO ou [18F]FDG utilizando a seguinte fórmula 11:
Atividade injetada (MBq) = Atividade na seringa antes da injeção - Atividade na seringa após a injeção
5. Aquisição de PET/MR
- Ligue o aquecedor de ar para aquecer a cama de imagem do rato antes da PET scan programada. Use isoflurano a 5% (1 L/min médico O2) para anestesiar o rato em uma câmara de indução.
- Uma vez devidamente anestesiado e verificado usando a resposta de beliscar o dedo do pé, transfira cuidadosa e imediatamente o rato para o leito de aquecimento e mantenha a anestesia com isoflurano a 2%-2,5%. Coloque o rato propenso à cabeça na barra de mordida e aplique lubrificante ocular em ambos os olhos para evitar a secagem e a potencial formação de úlceras de córnea. Cubra a cama de imagem com um lençol de plástico para manter a temperatura circundante da cama.
- Monitore e registre a frequência respiratória e a temperatura corporal do mouse usando a almofada respiratória interna e a sonda térmica, respectivamente. Certifique-se de que a temperatura corporal do rato é mantida a 37 °C, enquanto a frequência respiratória é mantida na faixa de 40-50 respirações por minuto (bpm), ajustando o nível de isoflurano.
- Execute uma visualização de reconhecimento para localizar a posição do mouse dentro do scanner. Ajuste a posição do leito do mouse para cobrir todo o corpo do mouse, com a região do tronco localizada no FOV central da RM.
- Para iniciar uma tomografia por emissão de pósitrons (PET), selecione Aquisição de PET na janela da lista de estudos e, em seguida, escolha Faixa de varredura na aquisição anterior para usar a posição pré-determinada do leito do mouse na visualização do escoteiro. Clique em Preparar > OK para mover automaticamente o leito do mouse de MR para PET e iniciar a aquisição.
- No Editor de Radiofármacos, selecione o radionuclídeo apropriado e, em seguida, introduza os detalhes da dose de injeção e do tempo antes e depois da injeção de [18F]FMISO ou [18F]FDG, conforme medido no passo 4.3. e passo 4.4. Insira a espessura do mouse no menu Informações do assunto .
- Prossiga com as aquisições de RM após a conclusão do PET scan. Para fazer isso, selecione Preparar para mover o mouse para MR do PET. Clique em OK para continuar.
- Depois que todas as varreduras estiverem concluídas, selecione Início para mover o leito de imagem de volta para a posição padrão.
- Desligue a anestesia e lave o leito de imagem com o médico O2. Verifique o reflexo de retirada do pedal do mouse. Transfira o mouse da cama de imagem de volta para uma gaiola de alojamento limpa colocada em cima de uma almofada de aquecimento para ajudar na recuperação da anestesia e recuperar o reflexo de endireitamento.
- Na Varredura bruta, selecione Aquisição de PET para carregar os dados brutos de PET adquiridos para reconstrução de PET . Selecione MM para uso como um mapa de material. Prossiga com a reconstrução do PET utilizando o parâmetro descrito no passo 3.6.
- Aderir estritamente às diretrizes locais e institucionais ao manusear camundongos após estudos de imagem PET. Trate todos os consumíveis usados, por exemplo, seringas, agulhas, luvas, lenços umedecidos e resíduos biológicos, por exemplo, cama de gaiola e matéria fecal, que estiveram em contato direto com o rato como resíduos radioativos e manuseie com cuidado de acordo com os regulamentos locais.
6. Análise de imagens PET
- Abra o software de Análise de Imagem (consulte Tabela de Materiais) e selecione Carregar Dados DICOM para abrir as imagens PET e MR.
- Arraste as imagens PET e MR correspondentes para a janela de exibição do software e selecione Registro automático para executar o co-registro automático das imagens PET e MR resultantes.
- No menu Configuração de registro , selecione Transformação rígida . Use Shift e Rotation no menu Rígido/Afim .
- No menu Seleção de Função Global , clique em MM como Referência e PET Scan estático como Reslice.
- Inspecione as imagens PET/MR co-registradas para garantir o alinhamento adequado. Se necessário, use o Registro Manual para ajustar as imagens manualmente.
- Localize o tumor ortotópico no fígado usando a imagem de RM. Use ROI de elipse interpolada para desenhar um VOI no tumor, usando a imagem de RM como referência. Transfira o VOI tumoral criado da RM para a imagem PET. Selecione a Ferramenta Pincel e a Ferramenta Borracha para definir cuidadosamente a borda do VOI deslize por slide. Certifique-se de evitar o transbordamento da captação de radioatividade do fígado na imagem PET.
- Use o VOI elipsoide para criar um VOI de 3 mm 3 no fígado como órgãode referência. Certifique-se de evitar áreas de estruturas vasculares e biliares hepáticas visíveis usando a imagem de RM como guia.
- Selecione Mostrar tabela de ROI para renomear todos os VOIs desenhados. Registre todos os dados necessários, por exemplo, radioatividade (kBq/mL) e volume tumoral (mm3), em uma planilha. Salve uma cópia dos desenhos VOI e arquive os dados de imagem brutos e reconstruídos em um disco rígido externo quando concluído.
- Calcule o valor de absorção padronizado (SUV) para todas as VOIs usando a seguinte equação11:
SUV = CPET(t)/(ID/BW)
onde CPET(t) é a atividade medida na VOI, ID é a dose injetada medida em kBq e BW é o peso corporal do rato em kg, assumindo uma densidade tecidual de 1 g/mL.
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Representative Results
Para obter um bloqueio tumoral adequado para o implante ortotópico sucessivo, clones estáveis foram primeiramente gerados por injeção subcutânea de 200 μL de suspensão celular em DPBS (contendo células MHCC97L) no flanco inferior de camundongos nus (Figura 1A). O crescimento do tumor foi monitorado e, quando o tamanho do tumor atingiu 800-1000 mm 3 (cerca de 4 semanas após a injeção), os camundongos foram sacrificados e o bloqueio tumoral resultante foi cortado em aproximadamente 1 mm3 fragmentos para posterior implantação ortotópica hepática em outro lote de camundongos nus (n = 6). Os camundongos foram randomizados em dois grupos: controle (C1, n = 3) e ligadura da artéria hepática (H2, n = 3). A HAL foi realizada amarrando um fio fino ao redor do ramo principal da artéria hepática. Os camundongos C1 foram poupados da HAL antes do implante ortotópico. Essa manipulação levou à hipóxia tumoral em camundongos H2, mas não C1, e o estado hipóxico do tumor pôde ser monitorado de forma não invasiva usando o traçador hipóxico PET [18F]FMISO. Estudos PET/MR mostraram que um aumento na captação tumoral [18 F]FMISO foi observado apenas nos camundongos H2, enquanto que, usando o marcador glicolítico [18F]FDG, a captação tumoral permaneceu semelhante entre os dois grupos (Figura 1B).
A hipóxia induzida por HAL em tumores foi validada por sondagem dos níveis de expressão de HIF-1α12, e comparações foram feitas entre os grupos. Consistente com um tumor mais hipóxico após a HAL, o grupo H2 apresentou maior expressão de HIF-1α do que o grupo C1 (densidade óptica: 0,17 vs. 0,13, H2 vs. C1, respectivamente), o que corrobora com a captação do tumor [18F]FMISO (Figura 2A). [18F] A aceitação do FMISO foi quantificada usando a abordagem baseada em SUV. Os tumores H2 apresentaram um aumento de 2,3 vezes na captação de [18F]FMISO quando comparados aos tumores C1 (SUVmax: 1,2 vs. 2,8, respectivamente, Figura 2B). Da mesma forma, o HAL também resultou em uma maior captação de SUV hepático em camundongos H2 do que C1 (Figura 2C). Tomados em conjunto, mostramos aqui que a HAL pode efetivamente induzir hipóxia tumoral em xenoenxertos ortotópicos de CHC, e a hipóxia tumoral pode ser monitorada de forma não invasiva usando imagens [18F]FMISO PET, apoiadas pela expressão do marcador imuno-histoquímico ex vivo HIF-1α. Além disso, a incorporação de imagens de RM oferece um excelente contraste de tecidos moles para permitir o delineamento claro do tumor a partir do fígado, possibilitando a quantificação precisa da PET.
Figura 1: Imagem in vivo PET/MR de xenoenxertos ortotópicos de camundongos com CHC. (A) Esquema das criações de xenoenxertos subcutâneos e ortotópicos e estudos de imagem PET em tumores ortotópicos MHCC97L. (B) Imagens representativas de PET de projeção de intensidade máxima (PImáx) de [18 F]FMISO e [18F]FDG em camundongos portadores de tumores ortotópicos MHCC97L (C1) sem ou (H2) com HAL. Círculos azuis indicam a localização do tumor. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Análise de camundongos portadores de tumores ortotópicos MHCC97L com e sem HAL. (A) Imagens representativas co-registradas [18F]FMISO PET/MR, coloração imuno-histoquímica para HIF-1α e hematoxilina e eosina (HE) em cortes tumorais. (B-C) Análise quantitativa da captação de [18F]FMISO no tumor e fígado. N = 3 para cada grupo. Os valores de SUV são apresentados como média ± erro padrão da média (EPM). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste estudo, descrevemos os procedimentos para a realização de HAL em xenoenxertos ortotópicos hepáticos de CHC utilizando tumores subcutâneos, juntamente com métodos para o monitoramento não invasivo da hipóxia tumoral em xenoenxertos ortotópicos utilizando [18 F]FMISO e [18F]FDG PET/MR. Nosso interesse está na imagem metabólica de vários modelos de câncer e doença para diagnóstico precoce e avaliação da resposta ao tratamento11,13,14,15. Até o momento, a criação de xenoenxertos de HCC HAL e seu metabolismo tumoral in vivo têm sido raramente descritos na literatura, o que nos levou a investigar as características metabólicas desses modelos tumorais usando imagens PET.
O estabelecimento bem-sucedido de xenoenxertos ortotópicos com HAL como um modelo robusto de camundongos para estudar a hipóxia no CHC representa um aspecto importante para o estudo da biologia do HCC in vivo. A hipóxia é conhecida por estimular a malignidade do câncer. Além disso, a hipóxia intratumoral tem sido associada a maior proliferação, metástase e quimiorresistência e justifica uma caracterização completa da resposta a condições hipóxicas7. Embora os xenoenxertos subcutâneos sejam frequentemente utilizados para estudar a tumorigênese ou estratégias de tratamento do CHC, os modelos ortotópicos podem recapitular melhor o desenvolvimento do CHC humano, uma vez que refletem com mais precisão o microambiente tumoral, particularmente as influências na vascularização e nas interações tumor-estroma em direção à metástase do CHC12. A incorporação de HAL em camundongos ortotópicos do CHC permite a indução de hipóxia intratumoral, bloqueando o suprimento sangrento arterial hepático ao tumor7. Tais modelos animais permitem que os mecanismos subjacentes aos efeitos da HAL no CHC sejam elucidados e criem novos caminhos para terapias eficazes visando a via da hipóxia no CHC. Para o implante ortotópico, utilizou-se o cubo tumoral do tumor subcutâneo em vez da injeção direta de suspensões celulares do CHC. Descobrimos que as injeções diretas de células geralmente causam um pequeno volume de vazamento do local da injeção, mesmo que o procedimento tenha sido realizado o mais lentamente possível com um baixo volume de injeção. Isso pode potencialmente levar à metástase peritoneal, que é prejudicial ao bem-estar animal, afetando o resultado geral do estudo. Por outro lado, a implantação de um pequeno bloco tumoral superaria o problema, embora seja necessário tomar cuidado para garantir que o tumor seja suturado com segurança após a implantação. Ao isolar pequenos cubos tumorais do bloqueio tumoral subcutâneo, também é aconselhável evitar as regiões centrais do tumor sólido, que são relativamente menos vascularizadas e mais metabolicamente estressadas devido à hipóxia e à privação de nutrientes. Isso reduzirá a inclusão de células tumorais mortas que parecem ser necróticas dentro do pequeno cubo tumoral e manterá taxas de crescimento tumoral mais consistentes em camundongos individuais.
A hipóxia é um fator prognóstico de resistência ao câncer, e o monitoramento de alterações na hipóxia usando PET permite a detecção e quantificação de tecidos hipóxicos em alta sensibilidade e especificidade. Uma consideração importante para [18 F]FMISO e [18F]FDG PET envolve o tempo de captação do radiotraçador e a via de administração em camundongos. Ambos os radiotraçadores têm farmacocinética in vivo diferente, sendo uma a diferença fisiológica de absorção, observada no intestino/bexiga e coração/bexiga para [18 F]FMISO e [18 F]FDG, respectivamente, e a outra sendo que [18 F]FMISO se acumula na região hipóxica do tumor, e [18F]FDG é preferencialmente absorvido na região tumoral metabólica alta 16. A alta lipofilicidade e o lento clearance hepático do [18F]FMISO requerem um tempo de 2-4 h pós-injeção para obter um bom contraste tumor-hepático17. Descobrimos que 3 h após a injeção são suficientes para diferenciar e delinear a captação de tumor [18F]FMISO do fígado para os grupos hipóxico (H2) e controle (C1). No caso de [18 F]FDG PET, um tempo de 1 h pós-injeção é adequado para produzir bom contraste, como descrito anteriormente13,15, e foi empregado neste estudo. No entanto, manter um tempo de captação consistente do radiotraçador é imperativo para garantir a confiabilidade dos resultados do PET, especialmente para análises baseadas em SUV. Aqui, foram utilizadas técnicas intravenosas para administrar radiotraçador aos camundongos. A injeção bem-sucedida da veia caudal é indicada por um flashback de sangue visível antes da infusão de radiotraçador, onde a agulha é posicionada com precisão dentro da veia. Uma grande desvantagem deste método é que o flashback sanguíneo esperado pode ser difícil de observar devido à hipotensão, com variabilidade observada entre camundongos. No entanto, essa dificuldade pode ser superada aquecendo a cauda por um curto período de 1-2 min antes da inserção da agulha, seja com um pano quente ou com uma lâmpada de calor para aumentar o fluxo sanguíneo e melhorar a visibilidade da veia para uma injeção bem-sucedida.
Com o crescente uso de imagens PET para quantificar a biodistribuição de radiotraçadores em pequenos animais, uma consideração importante a ser observada é o uso de um scanner PET preciso e bem calibrado para produzir dados PET bons, reprodutíveis e quantificáveis. Um sistema PET preciso permite que os estudos de imagem sejam realizados de maneira mais eficiente em termos de tempo e custo-benefício e permite a implementação dos princípios 3Rs (Substituição, Redução e Refinamento) em pesquisas com animais. Por essa razão, inspeções de controle de qualidade de rotina devem ser realizadas, de preferência semanalmente, para examinar os componentes PET e MR do sistema de imagem, de acordo com a recomendação do fabricante. Em particular, a precisão da atividade da PET deve ser verificada e registada com frequência, bem como antes do início de uma experiência de imagiologia, a fim de garantir a fiabilidade da quantificação da PET. Isso é imperativo para que quaisquer estudos longitudinais que envolvam a avaliação quantitativa do tumor e dos tecidos durante um período de exame produzam resultados significativos e comparáveis. A calibração do sistema é necessária quando a precisão da atividade do PET é encontrada fora da faixa recomendada, bem como quando o desalinhamento das imagens de PET e MR é descoberto.
Embora as técnicas aqui descritas possibilitem a PET dos xenoenxertos hipóxicos do CHC para uma ampla gama de investigações in vivo , algumas limitações devem ser consideradas ao contemplar o uso desses protocolos. A criação de xenoenxertos de HCC HAL é um procedimento cirúrgico intra-abdominal complexo para realizar em camundongos imunodeficientes de 6-8 semanas de idade. Além disso, a artéria hepática diminuta nesses camundongos jovens pode ser difícil de localizar, tornando o processo de ligadura tecnicamente desafiador. Esses procedimentos exigem pessoal adequadamente treinado para melhorar a taxa de sucessão da cirurgia, bem como a sobrevivência dos camundongos durante um período de tempo, ou seja, 4-6 semanas antes da formação dos xenoenxertos, enquanto a prestação de cuidados extensivos com os animais é esperada durante todo o período de cirurgia, que são intensivos em tempo e recursos. Prevê-se também que a criação de xenoenxertos ortotópicos de CHC usando este método exigirá cerca de 8 semanas antes da imagem PET bem-sucedida, uma vez que a implantação do cubo tumoral é usada em vez da injeção direta de suspensões celulares para evitar metástases peritoneais. No entanto, essas limitações podem ser superadas com planejamento e treinamento adequados da equipe de pesquisa. Além disso, o tamanho da amostra dos grupos experimentais aqui relatados é pequeno, o que pode não ser adequado para análise estatística. No entanto, nossas observações revelam subjetivamente uma tendência em que a hipóxia induzida por HAL foi medida tanto no tumor quanto no fígado no grupo H2 em comparação com o grupo C1, o que é apoiado pela coloração HIF-1α mais proeminente nas amostras de tumor H2. Atualmente, estamos trabalhando na expansão dos modelos tumorais com outras linhagens celulares de HCC humano. Além disso, estudos terapêuticos visando a via da hipóxia no CHC envolvendo esses xenoenxertos estão em andamento.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.
Acknowledgments
Reconhecemos o apoio do Fundo Fiduciário Anticâncer de Hong Kong, do Fundo de Pesquisa Colaborativa do Conselho de Bolsas de Pesquisa de Hong Kong (CRF C7018-14E) para os experimentos de imagem de pequenos animais. Também agradecemos o apoio do Molecular Imaging and Medical Cyclotron Center (MIMCC) da Universidade de Hong Kong pelo fornecimento de [18 F]FMISO e [18F]FDG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% sterile saline | BBraun | N/A | 0.9% sodium chloride intravenous infusion, 500 mL |
| 10# Scalpel blade | RWD Life Science Co.,ltd | S31010-01 | Animal surgery tool |
| 10% povidone-iodine solution | Banitore | 6.425.678 | For disinfection |
| 25G needle with a 1 mL syringe | BD PrecisionGlide | N/A | 1 mL syringe with 25G needle for cell suspensions injections |
| 5 mL syringe | Terumo | SS05L | 5 mL syringe Luer Lock |
| 70% Ethanol | Merck | 1.07017 | For disinfection |
| Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF2000 | For automated cell counting |
| Buprenorphine | HealthDirect | N/A | Subcutaneous injection (0.05-0.2 mg/kg/12 hours) for analgesic after surgery |
| Cell Culture Dish (60 mm diameter) | Thermo Scientific | 150462 | For tumor tissue processing |
| Centrifuge | Sigma | 3-16KL, fixed-angle rotor 12311 | For cell suspensions collection |
| Centrifuge Conical Tube | Eppendorf | EP0030122151 | For cell suspensions collection |
| Culture media (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) | Gibco | 10566024 | high glucose, GlutaMAX™ Supplement |
| Digital Caliper | RS PRO | 841-2518 | For subcutaneous tumor size measurement |
| Direct heat CO2 incubator | Techcomp Limited | NU5841 | For cell culture |
| Dose calibrator | Biodex | N/A | Atomlab 500 |
| DPBS (Dulbecco’s phosphate-buffered saline) | Gibco | 14287072 | For cell wash and injection |
| Eye lubricant | Alcon Duratears | N/A | Sterile ocular lubricant ointment, 3.5 g |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | A4766801 | Used for a broad range of cell types, especially sensitive cell lines |
| Forceps (curved fine and straight blunt) | RWD Life Science Co.,ltd | F12012-10 & F12011-13 | Animal surgery tool |
| Heating pad | ALA Scientific Instruments | N/A | Heat pad for mice during surgery |
| Insulin syringe | Terumo | 10ME2913 | 1 mL insulin syringe with needle for radiotracer injections |
| InterView fusion software | Mediso | Version 3.03 | Post-processing and image analysis software |
| Inverted microscope | Yu Lung Scientific Co., Ltd | BM-209G | For cells morphology visualization |
| Isoflurane | Chanelle Pharma | N/A | Iso-Vet, inhalation anesthetic, 250 mL |
| Ketamine | Alfasan International B.V. | HK-37715 | Ketamine 10% injection solution, 10 mL |
| Medical oxygen | Linde HKO | 101-HR | compressed gas, 99.5% purity |
| nanoScan PET/MR Scanner | Mediso | N/A | 3 Tesla MR |
| Needle holder | RWD Life Science Co.,ltd | F31026-12 | Animal surgery tool |
| Nucline nanoScan software | Mediso | Version 3.0 | Scanner operating software |
| Nylon Suture (6/0 and 5/0) | Healthy Medical Company Ltd | 000524 & 000526 | Animal surgery tool |
| Penicillin- Streptomycin | Gibco | 15140122 | Culture media for a final concentration of 50 to 100 I.U./mL penicillin and 50 to 100 µg/mL streptomycin. |
| Pentabarbital | AlfaMedic | 13003 | Intraperitoneal injection (330 mg/kg) to induce cessation of breathing of mice |
| Sharp scissors | RWD Life Science Co.,ltd | S14014-10 | Animal surgery tool |
| Spring Scissors | RWD Life Science Co.,ltd | S11005-09 | Animal surgery tool |
| Trypan Blue Solution, 0,4% | Gibco | 15250061 | For cell counting |
| Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, 0.25%), phenol red. | Gibco | 25200072 | For cell digestion |
| Xylazine | Alfasan International B.V. | HK-56179 | Xylazine 2% injection solution, 30 mL |
References
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