Summary
De fleste svømmende fotoautotrofiske organismer viser fotoinduserte atferdsendringer (fotobehavior). Den nåværende protokollen observerer nevnte fotobehavior i modellorganismen Chlamydomonas reinhardtii.
Abstract
For motile fototrofiske mikroorganismers overlevelse er det avgjørende å være under riktige lysforhold. Følgelig viser de fotoindusert atferd (eller fotobehavior) og endrer bevegelsesretningen som svar på lys. Typiske fotobehaviors inkluderer photoshock (eller fotofobisk) respons og fototaxis. Photoshock er et svar på en plutselig endring i lysintensiteten (f.eks. blitsbelysning), der organismer midlertidig slutter å bevege seg eller beveger seg bakover. Under fototaxis beveger organismer seg mot lyskilden eller i motsatt retning (henholdsvis kalt positiv eller negativ fototaxis). Den encellede grønne algen Chlamydomonas reinhardtii er en utmerket organisme for å studere fotobehavior fordi den raskt endrer svømmemønsteret ved å modulere juling av cilia (også kalt flagella) etter fotoreception. Her vises ulike enkle metoder for å observere fotobehaviors i C. reinhardtii. Forskning på C. reinhardtiis fotobehaviors har ført til oppdagelsen av vanlige regulatoriske mekanismer mellom eukaryotisk cilia og channelrhodopsins, noe som kan bidra til en bedre forståelse av ciliopatier og utvikling av nye optogenetiske metoder.
Introduction
Lys er en uunnværlig energikilde for fotosyntetiske organismer, men for mye lys kan forårsake fotooksidativ skade. Dermed må fototrofiske organismer overleve under moderat intensitetslys, hvor de kan fotosyntetisere, men ikke lide fotooksidativ skade1. I landplanter kan kloroplaster ikke bevege seg ut av bladet og vise fotobevegelser i cellen; kloroplaster beveger seg til periferien av cellen under høyt lys og celleoverflaten under lite lys2, mens mange motile alger viser fotobehaviors som gjør at de kan finne riktige lysforhold for fotosyntese og dermed lette deres overlevelse3.
Chlamydomonas reinhardtii er en unicellular grønn alge betraktet som en modellorganisme innen forskningsfelt som cilia (også kalt flagella), fotosyntese og fotobehavior. C. reinhardtii presenterer med en øyenskygge og to cilia per celle, som brukes til henholdsvis fotoreception og svømming. Øyepotten har to komponenter: channelrhodopsins (ChRs), lysportede ionkanaler i plasmamembranen og de karotenoidrike granulatlagene som ligger rett bak ChRs. Øyepotten fungerer som en retningslysreseptor siden de karotenoidrike granulatlagene fungerer som en lysreflektor 4,5.
ChRs ble opprinnelig identifisert som fotoreseptorer som forårsaker fotobehaviors i C. reinhardtii 6,7,8,9. Selv om to isoformer, ChR1 og ChR2, finnes i øyepotet, viste knock-down eksperimenter at ChR1 er den primære fotoreseptoren for fotobehaviors10. Til tross for dette har ChR2 fått mer oppmerksomhet og spilt en sentral rolle i utviklingen av optogenetikk, en teknikk for å kontrollere celleeksitasjon med lys11. Derfor vil det å studere reguleringsmekanismene som styrer fotobehaviors i C. reinhardtii fremme forståelsen av ChR-funksjonen og forbedre optogenetikken.
Etter fotoreception viser C. reinhardtii celler to typer fotobehaviors: fototaxis og photoshock respons12. Phototaxis er oppførselen til celler som svømmer i retning av lyskilden eller motsatt retning, henholdsvis kalt positiv eller negativ fototaxis. Photoshock-respons er en oppførsel som celler viser etter å ha merket en plutselig endring i lysintensiteten, for eksempel når de er opplyst av et blits. Celler slutter å svømme eller svømme bakover (dvs. svømme med cellekroppen fremover) i en kort periode, vanligvis <1 s.
Ciliary bevegelser i C. reinhardtii er involvert i sine fotobehaviors. To cilia slår vanligvis som et menneskes brystsvømming, og dette er modulert for fotobehaviors. For fototaxis er kreftene generert av de to cilia ubalansert ved modulering av slagfrekvensen og bølgeformamplituden til hvert cilium13. Cilium nærmest øyepotten kalles cis cilium, og den andre kalles trans cilium. Disse to ciliaene er forskjellige på ulike punkter. For eksempel er ciliary slåfrekvensen til trans cilium in vitro 30% -40% høyere14. I tillegg er deres Ca2 + følsomhet forskjellig. Reaktivering av demembranerte cellemodeller15 viste at cis cilium slår sterkere enn trans-ciliumet for Ca 2+ <1 x 10-8 M, mens det motsatte gjelder for Ca2+ >1 x 10−7 M. Denne asymmetrien i Ca2 + følsomhet er muligens viktig for fototaktiske svinger siden mutanter som mangler denne asymmetrien ikke viser normal fototaxis16,17. Omvendt er bølgeformkonvertering nødvendig for photoshock. Den ciliære bølgeformen forvandles fra den asymmetriske bølgeformen i fremoversvømming til den symmetriske bølgeformen i bakoversvømming. Denne bølgeformkonverteringen er også regulert av Ca2+, med en terskel på 1 x 10−4 M18,19. Siden defekter i regulering av ciliary bevegelser forårsaker primær ciliary dyskinesi hos mennesker, studere fotobehaviors i C. reinhardtii kan bidra til bedre forståelse av disse sykdommene og terapeutisk utvikling20.
Heri demonstreres fire enkle metoder for å observere fotobehaviors i C. reinhardtii . For det første vises en fototaxis-analyse ved hjelp av Petri-retter, og for det andre en fototaxis-analyse mot cellefjæringsdråper. Fenomenet observert i begge tilfeller er ikke strengt fototaxis, men fotoakkumulering, hvor cellene har en tendens til å samle seg nær lyskildesiden eller motsatt side. I C. reinhardtii er fotoakkumulering hovedsakelig forårsaket av fototaxis på en måte som kan brukes som en tilnærming til fototaxis. For det tredje vises en strengere analyse for fototaxis under et mikroskop, og sist er en photoshock-analyse under et mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
I den nåværende studien ble en villtype stamme av Chlamydomonas reinhardtii, et avkom av korset CC-124 x CC-125 med agg1 + mt-, brukt21. CC-124 og CC-125 ble hentet fra Chlamydomonas Resource Center (se Materialfortegnelser) og opprettholdt på et Tris-acetat-fosfat (TAP)22, 1,5% agarose medium ved 20-25 °C. Enhver motil stamme kan brukes til denne protokollen.
1. Cellekultur
- Kultur en interessestamme for Chlamydomonas reinhardtii i TAP flytende medium med lufting ved å boble steril luft i en 12 t/ 12 h lys-mørk periode (lys periode, ~ 50 μmol fotoner·m−2·s−1 hvitt lys) ved 20-25 °C i 2 dager.
MERK: Celler i en midt-logaritmisk vekstfase må brukes. Lang kultur (>3 dager, i sen-logaritmisk vekstfase) gjør cellene mindre følsomme for lys stimulansen og øker antall døde celler i kulturen, hindrer avlesning av resultater.
Figur 1: Flytende kultur etter 2-dagers dyrking. Fra en TAP-1,5% agarplate ble en del av ville celler som fylte platinaløkken inokulert i ~ 150 ml TAP flytende medium i en kolbe. Celletettheten etter 2-dagers kultur var ~ 5,0 x 106 celler / ml. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
2. Forbehandling av celler
- Bland ~10 μL av kulturen med et likt volum av desiliteringsløsning for å stoppe cellene fra svømming og måle celletettheten ved hjelp av en celleteller eller hemocytometer.
MERK: Det er omtrent 1-5 x 106 celler/ml etter en 2-dagers kultur (figur 1). Sammensetningen av desiliteringsløsningen er som følger23: 40 mM kaliumacetat, 1 mM CaCl2, pH 4,5 justert med HCl. - Sentrifuger den nødvendige mengden flytende kultur ved 1000 x g i 3 minutter ved romtemperatur.
MERK: Ett eksperiment krever 3 ml 2 x 107 celler/ml for standard forhold for fototaxisanalyse i en Petri-tallerken. Hvis to eksperimenter skal utføres med 1 x 106 celler / ml kultur, må 120 ml kultur sentrifugeres. - Suspender cellepelleten med den nødvendige mengden fotobehavior eksperimentell løsning til ~ 2 x 107 celler / ml (for parabolen fototaxisanalyse) eller 1 x 106 celler / ml (for fototaxisanalyse på cellenivå eller photoshock responsanalyse) og legg cellefjæringen i et konisk rør.
MERK: Celletetthet trenger ikke å kontrolleres veldig strengt for en grov estimering av fotobehaviors eller kan endres avhengig av formålet med analysen. Fotobehavior eksperimentell løsning14: 5 mM HEPES (pH 7,4), 0,2 mM EGTA, 1 mM KCl, 0,3 mM CaCl2. Dette bufferutvekslingstrinnet kan utelates for en enkel analyse av evnen til å stille ut fotobehaviors, og eksperimentet kan utføres med kulturmediet. Men fordi den ioniske sammensetningen av løsningen påvirker fototaktiske tegn24, og mediets ioniske sammensetning etter culturing kan ikke være konstant, anbefales det å bruke denne løsningen for en strengere analyse. Erstatning med fersk TAP-medium kan være et alternativ. - Plasser røret under svakt rødt lys (10-30 μmol fotoner·m−2·s−1) i ~1 t (figur 2).
MERK: Dette trinnet øker cellenes følsomhet overfor lysdemulansen.
Figur 2: Cellefjæring under rødt lys. Et vanlig fluorescerende hvitt lys dekket med et ark med rød cellofan. Et rør som inneholder cellefjæringen er plassert under ~ 10 μmol fotoner·m−2·s−1 rødt lys. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
3. Phototaxis-analyse ved hjelp av Petri-parabolen (såkalt "parabolanalyse")
- Legg 2-3 ml celleoppheng i en Petri-tallerken (3,5 cm), legg den på en lysboks (alternativt et hvitt ark eller en hvit plastplate), rist forsiktig for å fordele cellene jevnt og få et bilde før belysning.
MERK: Parabolens størrelse kan endres avhengig av formålet. Avhengig av belastningen og kulturens tilstand, kan cellene holde seg til bunnen av Petri-parabolen. I et slikt tilfelle må de fastlåste cellene fjernes ved pipettering før analysen. - Lys opp retten fra den ene siden med en grønn lysdiode (LED, se Materialbord) i et mørkerom på skrivebordet (figur 3).
MERK: Typiske lysforhold er λ = 525 nm og 50-100 μmol fotoner·m−2·s−1. Se diskusjonen om valg av lyskildebølgelengde i diskusjonsdelen. Dekk både oppvasken og LED-lampen med en eske eller svart klut når en liten LED brukes. - La dem være i ≥5 min og hent deretter bilder.
MERK: Tiden for lysbelysning kan endres avhengig av petriskålens størrelse eller formål (figur 4). - Importer bildefilen til Fiji (se Materialfortegnelse) for kvantifisering.
MERK: Fiji er en distribusjon av ImageJ2, bunting mange plugins. - Endre fargebildet til gråtoner via Bilde > Skriv inn > 8-biters (figur 5).
- Snu svart-hvitt gjennom Rediger > Inverter.
- Omgi hele retten som en region av interesse (ROI) og mål tettheten gjennom Analyze > Measure.
MERK: Tettheten til den totale parabolen kan beregnes som (Areal) x (gjennomsnitt). - Omgi halvparten av retten nærmest lyskilden som avkastning og mål tettheten.
- Beregn den fototaktiske indeksen som (tettheten av fototaktiske celler) per (tettheten av totalceller).
Figur 3: Sidebelysning for fototaxisrettanalyse. (A) En Petri-tallerken som inneholder en cellefjæring plassert på en lysboks i et mørkerom på skrivebordet. Grønt lys (525 nm LED-plate, ~100 μmol fotoner·m−2·s−1) opplyst fra siden. (B) Alternativ belysningsmetode. En 5 mm kanonkule-type LED. (C) For å blokkere lys fra utsiden, kan en boks med en svart klut på innsiden brukes i stedet for et stasjonært mørkerom. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Eksempel på negativ fototaxis etter 5 min sidebelysning. (A) Wild-type cellefjæring i en Petri-tallerken opplyst i 5 min. De fleste celler akkumulert på motsatt side av lyskilden. Disse dataene kan tolkes som negativ fototaxis. (B) Bilde av retten fra toppen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Kvantifisering av parabolens fototaxisanalyse. Et eksempel på celler som viser negativ fototaxis (lyskilden er på høyre side). Fargebildet konverteres til en gråtone (trinn 3.5.) og inverteres deretter (trinn 3.6.). Områder av interesse (ROI), hele parabolen (trinn 3.7.), og den lette kildesiden halvparten av parabolen (trinn 3.8.) ble avgrenset. Tettheten av hver avkastning ble målt (trinn 3.9.). I dette tilfellet er den fototaktiske indeksen (PI) omtrent 0,18 ([1 512 x 11,671] / [2 970 x 26,077]). PI er 1 eller 0 når alle celler viser henholdsvis positiv eller negativ fototaxis. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
4. Phototaxis-analyse ved hjelp av cellekulturdråper
- Plasser 25 μL cellefjæringsdråper (trinn 2.4.) direkte på en hvit plastplate ved hjelp av en mikropipette.
- Lys opp dråpene fra den ene siden med en grønn LED i et mørkerom på skrivebordet (figur 6).
MERK: Typiske lysforhold er λ = 525 nm og 50-100 μmol fotoner m−2 s−1. Dekk både plater og LED med en boks eller en svart klut når en liten LED brukes. - La dem stå i 3 min og hent deretter bilder.
MERK: Denne analysen er egnet for en rask kontroll av fototaxis av mange prøver samtidig, for eksempel i mutantscreening eller tetradanalyse. En cellekultur i midtloggfasen som vokser i en 96-brønnsplate, kan belyses direkte for enklere ytelse. I begge tilfeller kan trinn 2 (celleforbehandling) utelates.
Figur 6: Dråpefototaxisanalyse. (A) Ni dråper av en 25 μL cellefjæring plassert på et hvitt plastark og opplyst fra siden av en grønn LED. (B) Etter 3 min belysning. I hver dråpe akkumulerte celler enten på lyskildesiden (positiv fototaxis), akkumulert på motsatt side (negativ fototaxis), eller diffusert i dråpen (ingen fototaxis). Skalastang = 1 cm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
5. Phototaxis-analyse under et mikroskop
- Ta ~30 μL celleoppheng (1 x 106 celler/ml i fotobehavior eksperimentell løsning) på en glasssklie og legg en deksle (18 mm x 18 mm) med avstandsstykker på toppen (figur 7).
MERK: Avstandsstykkene kan gjøres med hvit petroleum eller dobbeltsidig tape på to motsatte sider av en dekslelip. Lyset må komme fra en retning der det ikke er avstandsstykker. - Lys prøven fra den ene siden av dekslene uten avstandsstykke med grønn LED og observer cellene under et mørkfeltmikroskop med en 10x objektivlinse under svakt rødt lys (λ > 630 nm, ~ 5 μmol fotoner·m−2·s−1, figur 8).
MERK: Unngå å utsette cellene på scenen for lys annet enn LED eller observasjonslys, for eksempel rombelysning eller lys fra en PC-skjerm. Den passende forstørrelsen av et objektiv avhenger av kameraets synsvinkel. Velg et objektiv med en forstørrelse som gjør at cellen kan svømme i ~2 s uten å forlate synsfeltet. Hvis du vil spore celler, er det ønskelig med et bilde med høy kontrast. Dermed anbefales bruk av en mørkfeltkondensator for mikroskopisk observasjon. Imidlertid kan andre kondensatorer, for eksempel bright-field, brukes til å observere fototaxis. Kontroller at lyset fra LED-lampen lyser på cellene. - Ta opp cellebevegelser i ca. 20 s etter lysbelysning ved hjelp av et kamerautstyrt mikroskop.
MERK: Noen sekunder etter utbruddet av grønn LED-belysning, kan det oppstå en photoshock-respons, og / eller den fototaktiske orienteringen (eller skiltet) er ikke stabil; Dermed anbefales et opptak på 20 s for responsstabilisering (film 1).
Figur 7: Lage avstandsstykker på deksler. (A) Et tynt lag vaselin ble påført håndflaten. En liten mengde hvit petroleum ble skrapt av med kanten av en deksle. (B) Et avstandsstykke på kanten av en deksleslip. (C) Et annet avstandsstykke på motsatt kant. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Sidebelysning under et mikroskop. (A) Oppsett av en grønn LED. En kanonkule-type grønn LED er festet til muffen og festet til stativet ved siden av mikroskopet. Celler ble observert under et mørkfeltmikroskop med et skarpt kuttfilter (λ > 630 nm). (B) Sidebelysning ved den grønne LED-lampen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Film 1: Fototaxis-analyse under et mikroskop. Grønt lys opplyst på ~ 0 s fra høyre. På det tidspunktet hadde cellene en tendens til å svømme i en tilfeldig retning. Etter 0 s i tidstelleren svømte cellene enten til høyre eller venstre, og viste positiv eller negativ fototaxis. Lyset ble slått av ved ~ 15 s da cellene begynte å svømme i tilfeldig retning igjen. Skalalinje = 100 μm. Klikk her for å laste ned denne filmen.
6. Sporing av fototaktiske celler og polar histogramtegning
- Trekk ut 1,5 s fra den innspilte videoen, og start 15 s etter belysning.
MERK: Banevarigheten kan endres avhengig av cellens svømmehastighet. En video på 1,5 s inneholder 46 bilder med 30 bps opptak. - Importer filen til Fiji som en bildesekvens i tag-bildefilformat via Fil > Importer > bildesekvens.
- Kjør plugin-modulen "Manuell sporing" for cellesporing ved hjelp av plugins > Sporing > manuell sporing.
- Klikk på Legg til spor, og den første rammen vises.
- Klikk en celle av interesse, og den andre rammen vises.
- Flytt glidebryteren til den siste rammen, og klikk den samme cellen som i trinn 6.5.
MERK: Det er ikke nødvendig å spore celler i hver ramme. Bare vinkelen mellom lysaksen og linjesegmentet som dannes av start- og endepunktene, er avgjørende. - Gjenta trinn 6.4.-6.6. for ~30 celler.
MERK: Merk celler som forblir innenfor synsvinkelen for hele 1,5 s. Hvis celletettheten er tilstrekkelig lav og ingen cellesvømmingsbaner krysser i 1,5 s, kan automatisk sporing utføres. I så fall velger du plugin "MTrack2" (typiske innstillinger: Minimum objektstørrelse = 1; Maksimal objektstørrelse = 10 000. Maksimal hastighet = 100; Minimum tack lengde [Rammer] = 46). Det anbefales å bekrefte korrespondansen mellom celler på videoen og sporingsresultatene ved å hente dataene ved å merke av for Vis tekst? > Overleggspunkter og linjer. - Kopier og lim inn resultatene i regnearkprogramvare (f.eks.
MERK: Heri vises hvordan du tegner et polart histogram med Excel. - Mål vinkelen mellom lysaksen og svømmeretningen til en celle med "=grader(atan2(x2-x1),-(y2-y1))", der cellens startposisjon (sektor 1) er (x1, y1) og den siste plasseringen (sektor #46) er (x2, y1).
MERK: I et Fiji-bilde er øvre venstre hjørne opprinnelsen (0, 0). - Gjenta trinn 6.9. for alle cellene som måles (vanligvis ~30 celler).
- Forbered en frekvensfordelingstabell for alle dataene som er innhentet med hyllene fra −180° til +180°, delt inn i 15° i begge ender og 30° for resten av området ved hjelp av "FREKVENS" -funksjonen.
MERK: Når du har valgt kolonnene umiddelbart til hyllekolonnene, skriver du inn følgende i den øverste kolonnen =FREKVENS (data_array, bins_array) og trykker skift + CTRL + ENTER (Tilleggstall 1). - Opprett en frekvensfordelingstabell på nytt med verdiene som er beregnet i trinn 6.8. rotert −90° for å sette høyre side til 0° (dvs. konvertere tallet i området fra -15° til 15°, til området fra -105° til −75°), siden cellene som svømmer oppover med metoden ovenfor, anses å svømme i en vinkel på 0° til lyset (dvs. viser positiv fototaxis), selv om lyset kommer fra høyre (Supplerende figur 2).
- Angi vinkelverdien midt i området for en 30°-skuff (f.eks. 30° for 15°-45°), hopp over en kolonne, og skriv inn tilsvarende prøveantall til høyre (Tilleggs figur 3).
- Konverter hver utvalgsantallsverdi til en prosent, og angi 0 i kolonnen som tilsvarer den tomme kolonnen mellom hyller.
- Tegn et radardiagram ved hjelp av vinkelverdiene som de vannrette akseetikettene og de prosentvise (%) verdiene som forklaringen (Tilleggs figur 4).
- Beregn den fototaktiske indeksen (PI) for ytterligere kvantifisering ved å beregne cosθ (θ = vinkelen mellom lysaksen og svømmeretningen)16.
MERK: PI er 0 når cellene svømmer i tilfeldig retning og henholdsvis 1 eller −1 når 100 % av cellene viser positiv eller negativ fototaxi.
7. Photoshock responsanalyse under et mikroskop
- Plasser ~30 μL cellefjæring (1 x 106 celler/ml i fotobehavior eksperimentell løsning) på en glasssklie, og legg en deksle (18 mm x 18 mm) med avstandsstykker på toppen, som i trinn 4.1.
- Vær oppmerksom på cellene under et mikroskop med svakt rødt lys (λ > 630 nm, ~5 μmol fotoner·m−2·s−1).
- Påfør blitsbelysning med kamerablits (film 2,3).
MERK: En annen måte å fremkalle en photoshock-respons på er å raskt fjerne et rødt filter for hånd fra observasjonslysbanen. Denne metoden er imidlertid mer variabel ettersom hastigheten på filterfjerning varierer fra person til person (Film 4,5). - Ta opp cellebevegelser ved hjelp av et kamerautstyrt mikroskop.
- For kvantifisering, utfør ett eller begge av følgende: (1) beregne forholdet mellom celler som viser photoshock-responsen per totalceller16; (2) for celler som viser photoshock respons, måle tiden fra photoshock stimulus til utvinning av fremover svømming25.
Film 2: Photoshock-belysning med en kamerablits. Kamerablitsen ble holdt opp til mikroskopstadiet og slått på. Klikk her for å laste ned denne filmen.
Film 3: Photoshock-respons forårsaket av blits under et mikroskop. Celler ble observert under svakt rødt lys. Det ble sendt ut et blits på ~0 s. Nesten alle celler stoppet fremover svømming, svømte bakover i en kort periode, og gjenopprettet fremover svømming. Skalalinje = 100 μm. Klikk her for å laste ned denne filmen.
Film 4: Photoshock-respons forårsaket av å fjerne et rødt filter under et mikroskop. Celler ble observert under svakt rødt lys. Det røde filteret ble fjernet ved ~5 s. Nesten alle celler stoppet fremover svømming, svømte bakover i en kort periode, og gjenopprettet fremover svømming. Skalalinje = 100 μm. Klikk her for å laste ned denne filmen.
Film 5: Fjerne et rødt filter. Rask fjerning av et rødt filtersett i lysbanen for å levere photoshock. Klikk her for å laste ned denne filmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Typiske C. reinhardtii fototaxis og photoshock responsanalyser vises her. Etter celletetthetsestimering ble villtypecellekultur (et avkom av korset CC-124 × CC-125 med agg1 + mt -)23 vasket med fotobehavior eksperimentell løsning for fototaxis parabolen analysen. Celleopphenget ble plassert under svakt rødt lys i ~ 1 time. En 2 ml celle suspensjon ble plassert i en 3,5 cm Petri tallerken. Petri-parabolen ble ristet forsiktig, satt på en lysboks og fotografert med et kamera festet på et stativ. Cellene viste klare negative fototaksi i dette tilfellet (dvs. celler akkumulert til motsatt side av lyskilden) (figur 4B).
Fototaxis og photoshock responsanalyser under et mikroskop ble utført i et mørkt rom for å unngå lysforstyrrelser. En annen vill-type stamme, CC-125, som viser positiv fototaxis, ble brukt til disse analysene26. For fototaxis-analysen utføres opptaket vanligvis for ~ 25 s. Cellenes baner ble sporet fra plasseringen av hver celle på 15 s til det på 16,5 s av Fiji.
Fotohock-responsanalysen ble utført ved hjelp av en kamerablits. Nesten alle cellene viste photoshock-responsen, svømte bakover i en kort periode (~ 0,3 s), og gjenopprettet fremoversvømming (Film 3). For å kvantifisere dataene fra denne filmen ble to metoder fulgt (se tidligere publiserte rapporter16,25): beregne prosentandelen av celler som viser photoshock respons blant alle celler16, og måle tiden fra begynnelsen av hver celle bakover svømming til utvinning av fremover svømming25. Avhengigheten av disse verdiene på lysintensitet kan verifiseres ved å plassere nøytral tetthetsfiltre (ND) mellom lyskilden og prøve16.
Supplerende figur 1: Tabell for frekvensfordeling. Kolonne A viser eksempelnummeret, og kolonne B viser vinkelen i trinn 6.6. Kolonne D viser hyllene (12 hyller på 30°). Kolonne E viser vinkelområdet per skuff for referanse. Når du har valgt F2-F14, angis FREKVENS-funksjonen i F2 som vist i fx-vinduet, og Skift + Ctrl + Enter trykkes for å klargjøre frekvensfordelingstabellen. Summen (F15) må være lik det totale utvalgsantallet i kolonne A. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 2: Datarotasjon. For å matche retningen på polare histogrammer med den faktiske lysbelysningsretningen (fra høyre), roteres skuffenes vinkler i frekvensfordelingstabellen med −90°. Utvalgsantallet i området 165°-135° (F3) flyttes for eksempel til 75°-45° (I6). Tellingene i områdene 180°-165° (F2) og −165°-−180° (F14) kombineres i det nye området 105°-75° (I5). Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 3: Angi nye beholdere for tegning av polar histogrammet. Gi hyllene nytt navn ved hjelp av den midterste verdien for hver 30°-skuff (kolonne K: for eksempel endre navnet på beholderen på 165°-−165° som −180°). Radardiagrammet i Excel er satt opp med den første beholderen ved 90°. Endre utvalgsantallet (kolonne L) til en prosent (kolonne M) for å sammenligne forskjellige data uavhengig av antall eksempler. Angi 0 mellom hvert dato (for eksempel M3, M5, M7...) for å representere verdiene for hver skuff som en linje i radardiagrammet. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 4: Radardiagram som representerer et polart histogram for en fototaxisanalyse. Tegn et radardiagram ved hjelp av hyllene (stolpe K) som vannrette akseetiketter og prosentverdiene (kolonne M) som en forklaring. Et typisk polart histogram som viser prosentandelen av CC-125-celler som beveger seg i en bestemt retning i forhold til lys opplyst fra høyre (0°) (12 skuffer på 30°; n = 30 celler). Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nåværende protokollen er enkel og ikke tidkrevende. Hvis en C. reinhardtii mutant mistenkes for å presentere med feil i fotoreception eller ciliary bevegelse, kan denne metoden tjene som primær fenotypisk analyse.
Det finnes imidlertid noen kritiske trinn. Det ene er å bruke celler i eksperimentet i vekstfasen tidlig til midt i loggen. Etter dyrking i lange perioder blir cellene mindre motile, mindre lysfølsomme og danner til og med palmelloider (celleklumper)27. Et annet viktig trinn er å eksponere cellene for det røde lyset før eksperimentet (trinn 2.4.). Celler viser høy lysrespons og bevegelighet ved å unngå ChR-stimulering samtidig som fotosyntetisk aktivitet opprettholdes. Celleobservasjon under et mikroskop må bekrefte at lyset skinner på cellene. Spesielt når du bruker en liten, svært retningsstyrt LED, kan en liten avvik fra den optiske aksen forhindre at lyset lyser opp cellene.
En klar ulempe med parabolen og dråpefototaxisanalysene er at de er ganske kvalitative. Selv om resultatene kan kvantifiseres, som vist i trinn 3.4.-3.9., kan andre fenomener enn fototaxis påvirke resultatene. Celler kan for eksempel holde seg til tallerkener eller plastplater avhengig av kulturforhold eller tallerken/tallerkenmateriale. Dermed må forsiktighet utvises hvis data antyder ingen eller dårlig fototaxis. Å velge riktig metode i henhold til formålet er viktig fordi disse metodene viser den store fordelen med enkelhet.
Disse metodene er bemerkelsesverdige ved at de er enkle og enkle. Flere sofistikerte metoder er tilgjengelige for å vurdere fotobehavior i Chlamydomonas28 eller Euglena29. Imidlertid kan de være vanskelige å utføre i mange laboratorier. Metodene beskrevet her krever ikke et spesielt mikroskop, men en billig LED eller et kamerablits. På grunn av denne enkle innstillingen er metodene også svært allsidige. For eksempel, for å studere effekten av lysintensitet på fotobehavior, kan ND-filter plasseres mellom lyskilden ogprøven 16. For å undersøke handlingsspekteret av oppførselen, kan fargen på LED-lyskilden byttes30.
Begrunnelsen for bruk av grønt lys (λ = 525 nm) for fototaxisanalyser er at maksimal absorpsjonsbølgelengde av ChR1, fotoreseptoren for fototaxis, er ~ 485 nm, nær absorpsjonstoppen av klorofyll b ved ~ 470 nm10,31. Siden en endring i fotosyntetisk aktivitet kan påvirke fototaktiske tegn, anbefales det å bruke grønt, da det kan absorberes av ChR1, men ikke så bra av klorofyll32. Imidlertid, hvis bare fototaktisk evne testes, kan blått lys brukes som en lyskilde i stedet. For å undersøke tidsmessige endringer i fotosyntetisk aktivitet over fototaktiske tegn, anbefales det å bruke en hvit lyskilde som inneholder bølgelengdeområdet mellom 425-550 nm, som absorberes godt av ChR1.
Fototaktiske tegn reguleres av cellulære reaktive oksygenarter (ROS). Når ROS akkumuleres, viser celler positiv fototaxis, og når de er utarmet, viser cellene negativ fototaxis26. Membrangjennomtrengelige ROS-reagenser eller ROS-scavenging reagenser induserer henholdsvis positive eller negative fototaxis. Vanligvis brukes H2O2 eller t-BOOH som ROS-reagenser, mens dimetylthiourea (DMTU) brukes som ROS-scavenger. Dermed kan en fototaktisk analyse i disse reagensene brukes til å screene for mutanter med defekter i fototaxis sign-switching, som kan relateres til feil i fotoreception eller ROS-relatert metabolisme 4,21,33.
Photoshock-svar er forårsaket av Ca2 + tilstrømning fra spissen av cilia via spenningsavhengige Ca2 + kanaler etter ciliary waveform konvertering18,34. Selv om Ca2 + -avhengig bølgeformkonvertering av cilia er vanlig for mange eukaryote organismer, er dens molekylære mekanisme ennå ikke fullt ut forstått35. Hvis en C. reinhardtii mutant viser feil i photoshock-responsen, men normal fototaxis, vil det foreslå normal fotoreception evne. Kort sagt, den raske og enkle analysen for photoshock-responsen som vises her, kan bidra til å forstå den vanlige molekylære mekanismen for Ca2 + -avhengig bølgeformkonvertering i eukaryotisk cilia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av tilskudd fra Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI (https://www.jsps.go.jp/english/index.html) til NU (19K23758, 21K06295), TH (16H06556) og KW (19H03242, 20K21420, 21H00420), fra Ohsumi Frontier Science Foundation (https://www.ofsf.or.jp/en/) til KW, og fra Dynamic Alliance for Open Innovation Bridging Human, Environment and Materials (http://alliance.tagen.tohoku.ac.jp/english/) til NU, TH og KW.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical tube | SARSTEDT | 62.554.502 | |
| 5 mm Cannonball green LED | Optosupply | OSPG5161P | |
| 50 mL conical tube | SARSTEDT | 62.547.254 | |
| AC adaptor for the light box | ATTO | 2196161 | |
| Auto cell counter | DeNovix | CellDrop BF | |
| CaCl2 | Nakalai tesque | 06731-05 | |
| Camera flash | NEWWER | TT560 | |
| Centrifuge | KUBOTA | 2800 | |
| Chlamydomonas strains CC-124 and CC-125 | Chlamydomonas Resource Center | https://www.chlamycollection.org/ | |
| C-mout CCD camera | Wraymer | 1129HMN1/3 | |
| Desktop darkroom | Scientex | B-S8 | |
| Digital still camera | SONY | RX100II | |
| EGTA | Dojindo | G002 | |
| Fiji | https://fiji.sc/ | ||
| Green LED plate | CCS | ISLM-150X150-GG | |
| HCl | Fujifilm WAKO | 080-01066 | |
| HEPES | Dojindo | GB70 | |
| KCl | Nakalai tesque | 238514-75 | |
| Lightbox (Flat viewer) | ATTO | 2196160 | |
| Microscope | Olympus | BX-53 | |
| Petri dish (φ3.5 cm) | IWAKI | 1000-035 | |
| Pottasium acetate | Nakalai tesque | 28434-25 | |
| Power supply for the green LED plate | CCS | ISC-201-2 | |
| Red filter | Shibuya Optical | S-RG630 |
References
- Demmig-Adams, B., Adams, W. W. Photoprotection and other responses of plants to high light stress. Annual Reviews Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 43, 599-626 (1992).
- Wada, M.
- Sgarbossa, A., Checcucci, G., Lenci, F.
- Ueki, N., et al. Eyespot-dependent determination of the phototactic sign in Chlamydomonas reinhardtii. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 5299-5304 (2016).
- Foster, K. W., Smyth, R. D.
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae. Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Sineshchekov, O. A., Jung, K. -H., Spudich, J. L. Two rhodopsins mediate phototaxis to low- and high-intensity light in Chlamydomonas reinhardtii. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (13), 8689-8694 (2002).
- Suzuki, T., et al. Archaeal-type rhodopsins in Chlamydomonas: model structure and intracellular localization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 301 (3), 711-717 (2003).
- Berthold, P., et al. Channelrhodopsin-1 initiates phototaxis and photophobic responses in Chlamydomonas by immediate light-induced depolarization. Plant Cell. 20 (6), 1665-1677 (2008).
- Deisseroth, K., et al. Next-generation optical technologies for illuminating genetically targeted brain circuits. Journal of Neuroscience. 26 (41), 10380-10386 (2006).
- Wakabayashi, K., Isu, A., Ueki, N. Channelrhodopsin-dependent photo-behavioral responses in the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii. Optogenetics (Advances in Experimental Medicine and Biology), 2nd ed. , Springer. 21-33 (2021).
- Rüffer, U., Nultsch, W. Flagellar photoresponses of Chlamydomonas cells held on micropipettes: II. Change in flagellar beat pattern. Cell Motility and the Cytoskeleton. 18 (4), 269-278 (1991).
- Kamiya, R., Hasegawa, E. Intrinsic difference in beat frequency between the two flagella of Chlamydomonas reinhardtii. Experimental Cell Research. 173, 299-304 (1987).
- Kamiya, R., Witman, G. B. Submicromolar levels of calcium control the balance of beating between the two flagella in demembranated models of Chlamydomonas. Journal of Cell Biology. 98 (1), 97-107 (1984).
- Okita, N., Isogai, N., Hirono, M., Kamiya, R., Yoshimura, K. Phototactic activity in Chlamydomonas 'non-phototactic' mutants deficient in Ca2+-dependent control of flagellar dominance or in inner-arm dynein. Journal of Cell Science. 118, 529-537 (2005).
- Horst, C. J., Witman, G. B. ptx1, a nonphototactic mutant of Chlamydomonas, lacks control of flagellar dominance. Journal of Cell Biology. 120 (3), 733-741 (1993).
- Hyams, J. S., Borisy, G. G. Isolated flagellar apparatus of Chlamydomonas: characterization of forward swimming and alteration of waveform and reversal of motion by calcium ions in vitro. Journal of Cell Science. 33, 235-253 (1978).
- Bessen, M., Fay, R. B., Witman, G. B. Calcium control of waveform in isolated flagellar axonemes of Chlamydomonas. Journal of Cell Biology. 86 (2), 446-455 (1980).
- Reiter, J. F., Leroux, M. R. Genes and molecular pathways underpinning ciliopathies. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (9), 533-547 (2017).
- Ide, T., et al. Identification of the agg1 mutation responsible for negative phototaxis in a "wild-type" strain of Chlamydomonas reinhardtii. Biochemistry and Biophysics Reports. 7, 379-385 (2016).
- Gorman, D. S., Levine, R. P. Cytochrome f and plastocyanin: their sequence in the photosynthetic electron transport chain of Chlamydomonas reinhardi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 54 (6), 1665-1669 (1965).
- Finst, R. J., Kim, P. J., Quarmby, L. M.
- Morel-Laurens, N. Calcium control of phototactic orientation in Chlamydomonas reinhardtii: sign and strength of response. Photochemistry and Photobiology. 45 (1), 119-128 (1987).
- Wakabayashi, K., King, S. M. Modulation of Chlamydomonas reinhardtii flagellar motility by redox poise. Journal of Cell Biology. 173 (5), 743-754 (2006).
- Wakabayashi, K., Misawa, Y., Mochiji, S., Kamiya, R. Reduction-oxidation poise regulates the sign of phototaxis in Chlamydomonas reinhardtii. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 11280-11284 (2011).
- Harris, E. H. in The Chlamydomonas Sourcebook Second Edition. 1, Academic Press. Ch. 2 25-64 (2009).
- Mergenhagen, D. Circadian clock: genetic characterization of a short period mutant of Chlamydomonas reinhardii. European Journal of Cell Biology. 33 (1), 13-18 (1984).
- Ozasa, K., Lee, J., Song, S., Hara, M., Maeda, M. Two-dimensional optical feedback control of Euglena confined in closed-type microfluidic channels. Lab on a Chip. 11 (11), 1933-1940 (2011).
- Tanno, A., et al. The four-celled Volvocales green alga Tetrabaena socialis exhibits weak photobehavior and high-photoprotection ability. PLoS One. 16 (10), 0259138 (2021).
- Ueno, Y., Aikawa, S., Kondo, A., Akimoto, S. Adaptation of light-harvesting functions of unicellular green algae to different light qualities. Photosynthesis Research. 139 (1-3), 145-154 (2019).
- Takahashi, T., Watanabe, M. Photosynthesis modulates the sign of phototaxis of wild-type Chlamydomonas reinhardtii. Effects of red background illumination and 3-(3',4'-dichlorophenyl)-1,1-dimethylurea. FEBS Letters. 336 (3), 516-520 (1993).
- Morishita, J., Tokutsu, R., Minagawa, J., Hisabori, T., Wakabayashi, K. I. Characterization of Chlamydomonas reinhardtii mutants that exhibit strong positive phototaxis. Plants (Basel). 10 (7), (2021).
- Fujiu, K., Nakayama, Y., Yanagisawa, A., Sokabe, M., Yoshimura, K. Chlamydomonas CAV2 encodes a voltage- dependent calcium channel required for the flagellar waveform conversion. Current Biology. 19 (2), 133-139 (2009).
- Inaba, K. Calcium sensors of ciliary outer arm dynein: functions and phylogenetic considerations for eukaryotic evolution. Cilia. 4 (1), 6 (2015).
