Summary
Cerebrale organoider gir enestående muligheter for å studere organutvikling og menneskelig sykdomspatologi. Selv om stor suksess er oppnådd med cerebrale organoidkultursystemer, er det fortsatt operasjonelle vanskeligheter med å anvende denne teknologien. Denne protokollen beskriver en cerebral organoid prosedyre som muliggjør medium endring og organoidoverføring.
Abstract
For tiden er cerebral organoid kulturteknologi fortsatt komplisert å operere og vanskelig å anvende i stor skala. Det er nødvendig å finne en enkel og praktisk løsning. Derfor foreslås en mer gjennomførbar cerebral organoidprotokoll i denne studien. For å løse den uunngåelige ulempen ved mediumendring og organoidoverføring i tidlig fase, optimaliserer dagens forskning operasjonsteknologien ved å anvende ingeniørprinsippet. En myk lyslampe ble vedtatt for å lateralt belyse embryoidlegemet (EB) prøver, slik at EB-ene kan ses med det blotte øye gjennom den forbedrede diffuse refleksjonseffekten. Ved å bruke prinsippet om sekundær strømning generert ved rotasjon, samles organoider mot midten av brønnen, noe som letter driften av mediumendring eller organoidoverføring. Sammenlignet med den dispergerte cellen, legger den embryoide kroppen seg raskere i pipetten. Ved hjelp av dette fenomenet kan de fleste frie celler og døde cellefragmenter effektivt fjernes på en enkel måte, og forhindrer at EB-er pådrar seg skade fra sentrifugering. Denne studien letter driften av cerebral organoidkultur og bidrar til å fremme anvendelsen av hjerneorganoider.
Introduction
Sammenlignet med todimensjonale (2D) kultursystemer har tredimensjonale (3D) kultursystemer flere fordeler, inkludert ekte replikasjon og effektiv reproduksjon av komplekse strukturer i visse organer1. Derfor er cerebrale organoider en av de viktige hjelpemetodene for forskningsfeltene menneskelig hjerneutvikling og sykdom2, narkotikascreening og celleterapi.
Dyrking av cerebrale organoider ved den roterende suspensjonsmetoden bidrar til deres utvikling og modning3. Selv om cerebrale organoidkultursystemer har oppnådd stor suksess, står de fortsatt overfor kritiske utfordringer som begrenser deres anvendelse. For eksempel innebærer manuell dyrking kompliserte manipulasjonstrinn og introduserer hindringer for å oppnå store applikasjoner. I tillegg, i hvert utviklingsstadium i kulturen av cerebrale organoider, er det nødvendig med endringer i forskjellige medier og cytokiner4. Men i det tidlige stadiet har organoider eller EB små størrelser (ca. 200 μm til 300 μm) og er nesten visuelt utilgjengelige uten passende apparater. Uunngåelig skylles en viss mengde dyrebare organoidprøver bort når mediet endres. Mange teknikker har blitt utforsket for å overvinne dette i andre typer organoidkulturer, og noen eksempler inkluderer nedsenking av hele organoid chips i et kulturmedium i 3 dager uten inngrep5; tilsett et nytt medium gjennom dekslene etter at det gamle mediet er absorbert ved bruk av absorberende papir5; eller bruk av komplekse mikrofluidiske rørledninger for væskeutveksling 6,7,8. En annen hindring som oppstår i det tidlige stadiet av organoid dyrking er vanskeligheten med å oppnå direkte observasjoner med det blotte øye, noe som kan forårsake dårlige operasjoner som fører til organoid skade og tap under organoidoverføringstrinnene. Derfor er det nødvendig å etablere en mer gjennomførbar protokoll som letter medium forandring og organoidoverføring for å generere organoider.
En tilsvarende optimalisert operasjon basert på tekniske prinsipper foreslås for å overvinne disse problemene, noe som betydelig og praktisk letter mange organoidprosedyrer. I naturen, når solen skinner inn i et hus gjennom et vindusgap, kan det blotte øye se støvet danse i lysstrålen. På grunn av den diffuse refleksjonen av sollys på støv, brytes noe lys inn i øyebollet for å produsere et visuelt bilde. Inspirert av prinsippet om dette fenomenet 9,10, gjorde denne studien en myk lyslampe og opplyste EB-ene sideveis. Det ble funnet at EB-er kunne være visuelt klare uten å påvirke visningsomfanget. En sekundær strømning som peker mot midten genereres i væsken ved å rotere kulturplaten på grunn av virvelstrømmer11. Opprinnelig dispergerte EB-er akkumuleres i midten av platen. Basert på dette, og fenomenet at sedimenteringshastigheten til organoider er raskere enn cellenes, foreslås en enkel operasjonsmetode for mediumendring og organoidoverføring uten sentrifugering. Organoidene i kulturmediet kan effektivt skilles fra frie celler og døde cellefragmenter gjennom denne overføringsoperasjonen.
Her foreslås en protokoll som er enkel å betjene for å generere cerebrale organoider fra humane pluripotente stamceller. Operasjonsteknologien ble optimalisert ved å bruke ingeniørprinsippet, noe som gjorde operasjoner i 3D-kultur like enkle og gjennomførbare som de i 2D-kulturen. Den forbedrede væskeutvekslingsmetoden og organoidoverføringsoperasjonen er også nyttig for andre typer organoidkultur og utformingen av automatiske kulturmaskiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen ble gjennomført etter Helsinkideklarasjonen. Godkjenning ble gitt av etikkomiteen for det tredje tilknyttede sykehuset i Guangzhou Medical University (medisinsk og etisk gjennomgang [2021] nr. 022). Før forsøket ble hvert medium utarbeidet i henhold til Juergen A. Knoblichs formel12 (tilleggstabeller 1-4), eller et kommersielt tilgjengelig cerebralt organoidsett ble brukt (se materialtabell). IPSCene som ble brukt i denne studien er tidligere etablert av vårt laboratorium og har fått et informert unntak. SCA3-iPSC-ene ble generert fra en 31 år gammel kvinnelig spinocerebellar ataksi type 3 (SCA3) pasient genotypet som å ha 26/78 CAG-repetisjoner i ATXN3-genet13 (supplerende figur 1A). De normale humane iPSCene nevnt i en tidligere artikkel ble valgt som NC-iPSCs14, og ATXN3-genet ble identifisert som å ha 14/14 CAG-repetisjoner (supplerende figur 1B).
1. Fremstilling av induserte pluripotente stamceller (iPSCs)
- Samle 3 ml perifert blod ved venepunksjon med informert samtykke fra frivillige og pasienter.
- Isoler mononukleære celler i perifert blod i henhold til Ficoll-Paque-metoden15.
- Etabler iPSC-er i henhold til protokollen til Sendai Reprogramming Kit (se Materialtabell).
- Dyrk iPSC-ene med mTeSR1-medium i 35 mm petriskåler dekket med Matrigel (en kjellermembranmatrise, se Materialtabell). Bytt medium hver dag. iPSC-veksttettheten må ikke overstige 75%.
- Fordøye cellene med PSC dissosiasjon løsning (se tabell over materialer) og subkultur dem i et forhold på 1: 5 hver 3-5 dag.
FORSIKTIG: Sendai-viruset brukes her. Det må betjenes i biosikkerhetsskapet, og selvbeskyttelsestiltak må tas. Det bør være klart om det kan brukes lovlig i det lokale landet. Lokale biosikkerhetslover og forskrifter må følges nøye når de brukes.
2. EB forberedelse (dag 0-1)
- Fjern mTeSR1-mediet fra iPSC-ene med en pipette og vask det 2x med 1 ml 1x PBS.
- Fjern PBS med en pipette, og tilsett 300 μL celleløsning (se materialtabell) for å fordøye iPSCene i enkeltceller i 3-4 minutter ved 37 ° C.
- Resuspender cellene i 2 ml EB-formasjonsmedium (tilleggstabell 1) og sentrifuger deretter prøven i 5 minutter ved 300 x g (romtemperatur).
- Forbehandle den spesialiserte 24-brønnsplaten med anti-adherence skylleløsning (500 μL / brønn) i 5 minutter (se materialtabell).
MERK: Anti-adherence skylleløsning er avgjørende for optimal EB og sfæroiddannelse. - Resuspender cellene i EB-formasjonsmedium inneholdende Y-27632 (endelig konsentrasjon, 10 μM, se materialtabell), med en celletetthet på 1,5 x 106 celler/ml.
- Fjern skylleløsningen mot tilslutning, og skyll hver brønn med 2 ml EB-formasjonsmedium.
- Legg cellene til de spesialiserte 24-brønns platene med en tetthet på 3 x 106 celler / brønn (figur 1A, venstre).
MERK: Normalt kan 300 EB klargjøres i hver brønn. Denne metoden kan forberede store mengder EB av samme størrelse. - Sentrifuger platen ved 100 x g i 2 minutter ved romtemperatur. Fordel cellene jevnt i hvert kammer nederst på platen (figur 1A, til høyre).
MERK: Hvis det ikke er noen egnet sentrifuge, kan platen også plasseres direkte i inkubatoren for statisk kultur, men formasjonstiden til EB-ballen vil være flere timer senere enn den under normal sentrifugering. - Inkuber prøvene ved 37 °C og 5 % CO2 i 24 timer. Hvis sentrifugering ikke ble brukt i forrige trinn, inkuberes i 36 timer. Hold prøven stabil, og ikke ta den ut av inkubatoren i denne perioden.
3. Klargjøring av den myke lyslampen (dag 1)
- Bruk et gjennomsiktig akrylbrett med en tykkelse på 0,3-0,5 cm i størrelsen på A5-papir. Lim inn hvite pads på forsiden og baksiden av akrylplaten.
- Monter en rad med hvite LED-lys på kanten av platen slik at lysene kan komme inn fra siden av akrylplaten og deretter skyte ut parallelt (supplerende figur 2A-F, figur 1B).
MERK: Siden diametrene til EB-er i det tidlige stadiet er omtrent 200 μm til 300 μm, er det vanskelig å observere dem tydelig med det blotte øye under fluorescerende lampen på rene benker. I motsetning til dette, på grunn av forbedring av diffus refleksjon, kan vi oppdage EB-ene tydelig ved å bruke lateralt opplyst mykt lys (figur 1B, C). En 6-brønns plate anbefales for EB-kulturer i senere forsøk. Men for bedre å vise den visuelle effekten av mykt lys, brukes retter noen ganger til å ta bilder og videoer i denne studien i stedet for tallerkener, så vær så snill å ikke misforstå. Den lateralt opplyste myke lyslampen kan også brukes til 6-brønnsplaten.
- Monter en rad med hvite LED-lys på kanten av platen slik at lysene kan komme inn fra siden av akrylplaten og deretter skyte ut parallelt (supplerende figur 2A-F, figur 1B).
4. EB-overføring og medium utskifting (dag 2-5)
- Klargjør en ny 6-brønns plate med lav adhesjon, og tilsett 2 ml EB-formasjonsmedium til hver brønn.
- Fjern EB-ene sammen med mediet med en pipettespiss på 1000 μL brede boringer (se materialtabell) og overfør dem til 6-brønnsplaten med lav adhesjon (~100 EB/brønn).
MERK: Operasjonsprosessen vedtar en myk lyslampe (nevnt i trinn 3.) for å gjøre EB-ene ene enklere å observere. Slå av andre innendørs lyskilder for å få den visuelle effekten av det myke lyset bedre. - Bytt ut med samme volum friskt EB-formasjonsmedium hver dag. Bruk sekundærstrømmen til å samle EB-ene til midten og endre mediet.
- Aspirer det gamle mediet ved å pipettere sakte til kanten av brønnen. Ikke sug for hardt; Ellers vil EB-ene bli fjernet sammen. Deretter legger du til ferskt medium for å resuspendere EB-ene.
MERK: Prinsippet sekundærstrøm (figur 1D). Induser en virvelstrøm ved å rotere parabolen langs en sirkulær bane. På grunn av virvelstrømmen induseres en sekundær strømning rettet mot sentrum. EB-ene eller organoidene konvergerer til midten av brønnen på grunn av den sekundære strømmen som genereres gjennom rotasjon, hvoretter mediumendring eller embryoidoverføring lett kan utføres.
- Aspirer det gamle mediet ved å pipettere sakte til kanten av brønnen. Ikke sug for hardt; Ellers vil EB-ene bli fjernet sammen. Deretter legger du til ferskt medium for å resuspendere EB-ene.
5. Kontrollere pluripotens ved merking med pluripotensmarkør OCT4 (dag 4)
MERK: Når diameteren på EB-ene er større enn 300 μm, ta flere EB-er for OCT4-markørimmunfluorescensfarging for å oppdage pluripotensen.
- Fest EB-ene i 4 % paraformaldehyd ved 4 °C i 30 minutter, etterfulgt av vask i 1x PBS 3x i 10 minutter hver gang.
- Overfør EB-ene til romtemperatur PBS som inneholder 0,3 % Triton X-100 og 3 % BSA i 2 timer, etterfulgt av vask i PBS 3x i 10 minutter hver gang.
MERK: Etter å ha blitt behandlet medTriton X-100, flyter EB-ene på væskeoverflaten og kan lett suges bort med væsken under rengjøring. Drift under stereomikroskop anbefales. - Fortynn det primære OCT4-antistoffet (se materialtabellen) med 1 ml 1x PBS inneholdende 1 % BSA i forholdet 1:200 og tilsett EB-ene for inkubering ved 4 °C over natten, vask deretter i PBS 3x i 10 minutter hver gang.
- Fortynn det respektive sekundære antistoffet (se materialtabellen) med 1x PBS ved 1:500 og tilsett 1 ml til EB-ene.
- Etter inkubering ved romtemperatur i 2 timer, vask cellene i 1x PBS 3x i 10 minutter hver gang.
- Fjern PBS, tilsett 2 ml 1x PBS-oppløsning inneholdende 1 mikrogram/ml DAPI, inkuber ved romtemperatur i 10 minutter, og vask deretter i PBS 3x i 10 minutter hver gang.
- Flytt EB som inneholder en liten mengde væske på lysbildet, forsegl lysbildet med et dekselglass belagt med kommersielt tilgjengelig vaselin (se materialtabell) på kanten, og observer og samle deretter bildet under fluorescenskonfokalmikroskopet.
MERK: OCT4-uttrykket representerer EB-pluripotens12. Når uttrykket for OCT4 er mindre enn 90 %, skal EB-ene kastes, og EB-er skal klargjøres på nytt.
6. Nevral induksjon (dag 5-7)
- Klargjør en ny 6-brønns plate med lav vedheft, og tilsett 3 ml nevral induksjonsmedium (tilleggstabell 2) til hver brønn.
- Slå på det laterale myke lyset (nevnt i trinn 3) og slå av andre innendørs lyskilder.
- Overfør EB-ene til 6-brønnsplaten med tilsatt nevral induksjonsmedium (~ 100 EB / brønn). Tilsett så lite som mulig av det opprinnelige mediet til den nye brønnen.
MERK: Introduser enkle ferdigheter medorganoid overføring. Naturligvis, under tyngdekraften og med en relativt høyere tetthet enn mediet, vil de resuspenderte EB-ene gradvis synke ved å bruke operasjonen vist i figur 1E. Derfor kan EB-ene enkelt overføres. Siden frie celler og døde cellefragmenter synker saktere sammenlignet med EBer, kan dermed de fleste frie celler og døde cellefragmenter fjernes gjennom denne sedimenteringsmetoden (figur 1F). - Inkuber prøvene ved 37 °C og 5 % CO2 i 24 timer.
MERK: Under mikroskopet var diameteren på EB-ene ca. 500 μm, og kanten var gjennomsiktig, noe som indikerer at et nevroepitelialt lag dannet seg. - Fortsett til neste trinn.
7. Innebygging i kjellermembranmatrisen (dag 7-10)
- Plasser membranmatrisen i et kjøleskap på 4 °C i 60 minutter på forhånd for å løse den opp. Beregn mengden av den nødvendige matrisen på forhånd. Omtrent 100 EB ble innebygd i 1,5 ml av membranmatrisen.
- Slå på det laterale myke lyset og slå av lyskilden på toppen av konsollen.
- Hold membranmatrisen på is for å forhindre størkning.
- Overfør en liten mengde EB til en 60 mm tallerken som inneholder fersk ekspansjonsmedium (tilleggstabell 3) hver gang. Reduser antall EB-er for å gjøre det enklere å fjerne en enkelt EB.
- Bruk deretter en ny 6-brønns plate med lav vedheft. Sug en enkelt EB (som inneholder ca. 10 μL medium) med en 200 μL bredboret pipettespiss (se materialtabell) hver gang, og legg den deretter til bunnen av 6-brønnsplaten for å lage dråper. Bruk fem dråper per brønn.
MERK: Nøkkelen er å justere pipettepistolens rekkevidde til 50 μL og suge en EB, og deretter referere til driften av figur 1E. Når EB legger seg til boringen av pipettespissen, berører spissen raskt brønnbunnen på platen og skyver ut ca. 10 μL væske for å danne en dråpe. - Tilsett 15 μL av membranmatrisen til hver dråpe som inneholder EB og bland den raskt. Legg inn EB-ballen i midten av dråpen.
MERK: EB-er må ikke aspireres med en standard pipettespiss, noe som skader EB. Pipettespissen på 200 μL med bred boring må brukes i stedet. - Plasser 6-brønnsplaten i en inkubator på 37 °C i 30 minutter, og størkne membranmatrisedråpene som inneholder EB-er.
- Tilsett 3 ml ekspansjonsmedium til hver brønn og blås forsiktig opp de matriseinnstøpte UB-ene for å suspendere dem.
- Rug ved 37 °C og 5 % CO2 i 3 dager.
MERK: Hvis spirende på overflaten av EB observeres, betyr det at et utvidet nevroepitel har blitt dannet16.
8. Organoid modning (dag 10-40)
- Fjern forsiktig det opprinnelige mediet, og tilsett 3 ml modningsmedium (tilleggstabell 4) til hver brønn.
- Plasser organoidplaten på en horisontal shaker i en inkubator på 37 °C.
- Fortsett å rotere kulturen horisontalt. Sett shakeren til riktig hastighet.
MERK: Når du dyrker cerebrale organoider på en 6-brønns plate, er en relativ sentrifugalkraft (RCF) på 0,11808 x g mer hensiktsmessig, ifølge produsenten av den horisontale shakeren (se Materialtabell). I henhold til konverteringen mellom den relative sentrifugalkraften og rotasjonshastigheten 17,18, RCF = 1,118 x 10−5 × R × rpm2, hvor RCF = relativ sentrifugalkraft (g), rpm = omdreininger per minutt (r/min), og R = rotasjonsradius (cm), også kjent som shake throw. Ristingskastparametrene til forskjellige shakere kan være forskjellige. Derfor kan det anslås at rotasjonshastigheten er rpm = 299 x (RCF / R) 1/2. - Bytt det friske modningsmediet hver 2-3 dag.
- Etter 20-30 dager dyrker gradvis hjerneorganoider til modenhet.
MERK: I løpet av denne perioden kan organoider brukes til eksperimenter og deteksjon, for eksempel deteksjon av nevrale markører og transkriptomsekvensering 19,20,21.
9. Frosne seksjoner og immunfluorescens av cerebrale organoider
- Fest organoider i 4% paraformaldehyd ved 4 ° C i 16 timer og vask dem deretter 3x med 1x PBS i 10 minutter hver gang.
- Fjern PBS, og senk organoidene i 30% sukrose ved 4 ° C over natten.
- Legg organoidene i 10% / 7,5% gelatin / sukrose ved 37 ° C i 1 time og overfør dem deretter raskt til den innebygde formen.
- Tilsett tørris til 100% etanol for å tilberede en tørris / etanoloppslemming, og legg organoidprøvene i den for rask frysing.
- Oppbevar de frosne prøvene i en fryser på −80 °C. Når det er nødvendig, lag frosne seksjoner med en tykkelse på 20 μm.
- Se trinn 5.3.-5.5. for immunfluorescens. Bruk PAX6-antistoffet til å merke apikale stamceller, TUJ1-antistoffet (se materialtabell) for å merke nevronceller 22,23,24 og DAPI for nukleær DNA-farging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne studien induserte iPSC (figur 2B) til cerebrale organoider (figur 2C). EB-ene som ble dyrket i tidlig fase uttrykte OCT4-markøren (figur 2A), som indikerte god pluripotens. Senere utviklet EB-ene seg til modne cerebrale organoider (figur 2D). Forskningen dyrket iPSC fra normale friske individer og SCA3-pasienter til cerebrale organoider (figur 3A). SCA3, også kjent som Machado-Joseph sykdom (MJD), er en nevrodegenerativ lidelse forårsaket av en polyglutaminutvidelse i ATXN3-genet25. RNA-seq-dataene (lastet opp til et offentlig depot, se Materialtabell) viste signifikante forskjeller i genuttrykksprofiler mellom den normale cerebrale organoidgruppen og SCA3-cerebral organoidgruppen i veier som nevrotransmittertransport, synapsedannelse og regulering (figur 3B). Mansjettknapper programvare ble brukt til å beregne genuttrykk nivå og forskjell26. DEseq2 ble videre brukt til å analysere dataene27.
Figur 1: Optimalisert medium endring og overføring operasjoner av EBs. (A) EB forberedelse. IPSC-ene ble fordøyd og lagt til de spesialiserte 24-brønnplatene (venstre). Cellene dannet EB-er (til høyre). Skalalinjen er 400 μm. (B) Skjematisk diagram over lateralt opplyst mykt lys for å hjelpe til med å observere organoider. (C) EB-ene ble observert med forskjellige lyskilder. Gul pil: lateralt opplyst lys; rød pil: mørk bakgrunn; grønne piler: EBs. (D) En virvelstrøm induseres ved å rotere parabolen langs en sirkulær bane. På grunn av virvelstrømmen induseres en sekundær strømning rettet mot sentrum. EB-ene konvergerer til midten av parabolen drevet av den sekundære strømmen som genereres gjennom rotasjon. Hvite piler: EBs. (E) Organoid overføring. (I) Først brukes en bredmunnet pipettespiss til å suge opp blandingsløsningen, inkludert både EB-ene og kulturmediet. (II) Deretter, mens pipetten holdes oppreist, synker EB-ene gradvis under tyngdekraften og konvergerer mot pipettespissens munn. (III) Når munningen av pipettespissen berører væskeoverflaten (vanligvis det friske mediet) igjen, og på grunn av flytende overflatespenning synker (IV) EB-ene raskt ned i mediet (det er ikke behov for ytterligere utblåsning ved pipettering manuelt). Rød linje: væskenivået; gule piler: EBs. (F) Siden frie celler og døde cellefragmenter synker saktere enn EB, kan de fleste frie celler og døde cellefragmenter dermed fjernes gjennom ovennevnte sedimenteringsmetode for å lette embryoidoverføringen. Den røde boksen i øvre høyre hjørne er et forstørret bilde. Skalalinjen er 400 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Induksjon av iPSC i cerebrale organoider. (A) Immunfluorescensfarging av EB. OCT4: oktamerbindende transkripsjonsfaktor-4; DAPI: DAPI dihydroklorid. Skalaen er 100 μm. (B) iPSCs. Skalaen er 400 μm. (C) Cerebrale organoider. Skalaen er 200 μm. (D) Immunfluorescensfarging av cerebrale organoider. PAX6: parret boks 6 er markøren for apikale stamceller; TUJ1: nevronspesifikk klasse III β-tubulin er en nevronspesifikk markør. Skalaen er 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Dyrking av iPSC fra friske individer og SCA3-pasienter til cerebrale organoider. (A) Ulike stadier som dekker modning av cerebrale organoider med utgangspunkt i EB. NC: normal gruppe; SCA3: SCA3/MJD gruppe. Skalastenger for bilder med lav og høy forstørrelse er henholdsvis 400 μm og 200 μm. (B) GO-anrikningsanalysediagram over nedregulerte, differensielt uttrykte gener mellom normale organoider og SCA3-organoider. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur 1: Identifisering av ATXN3 CAG-repetisjoner ved kapillærelektroforese. (A) SCA3-pasienten iPSC (SCA3-iPSC) ble identifisert som å ha 26/78 CAG-repetisjoner i ATXN3-genet. (B) Den normale humane iPSC (NC-iPSC) ble identifisert som å ha 14/14 CAG-repetisjoner i ATXN3-genet. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 2: Klargjøring av den myke lyslampen. (A) Strømforsyningen og LED-lampene ble installert på den ene siden av akrylplaten (som vist i den røde stiplede boksen). LED-myklyslampens spredningsbølgelengde er 450-470 nm, lysstrømmen er 1300-1800 lm, og fargegjengivelsesindeksen er 75-85 Ra. (B) Det ble sjekket om LED-pærene kunne lyse normalt (som vist i den røde stiplede boksen). (C) En hvit pute ble limt på forsiden og baksiden av akrylplaten (som indikert med de røde pilene). (D) Det generelle utseendet til den myke lyslampen. (E) Den myke lyslampen kan også erstattes av en kommersiell LED-malingslyspute uten ramme, som vanligvis brukes til sporing ved kopiering av skisser. Et lag med hvit film må limes rett over LED-malingslysputen. (F) Den myke lyslampen på jobb. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende tabell 1: Sammensetning av EB-formasjonsmediet. Ved den innledende fasen av EB-dannelse (vanligvis de første 2 dagene), må Y-27632 (50 μM) og bFGF (4 ng / ml) tilsettes EB-formasjonsmediet. Mediet må filtreres med en filterenhet på 0,2 μm og oppbevares ved −20 °C. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Supplerende tabell 2: Sammensetning av nevrale induksjonsmedium. Mediet må filtreres med en filterenhet på 0,2 μm og oppbevares ved −20 °C. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Supplerende tabell 3: Sammensetning av ekspansjonsmediet. En 1:100-fortynning av 2-merkaptoetanol ble fremstilt i DMEM-F12, og 87,5 μL av dette ble tilsatt ekspansjonsmediet. B27 må ikke inneholde vitamin A. Mediet må filtreres med en filterenhet på 0,2 μm og oppbevares ved −20 °C. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Supplerende tabell 4: Sammensetning av modningsmediet. En 1:100-fortynning av 2-merkaptoetanol i DMEM-F12 ble fremstilt og 87,5 μL av dette ble tilsatt modningsmediet. B27 må ikke inneholde vitamin A. Mediet må filtreres med en filterenhet på 0,2 μm og oppbevares ved −20 °C. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cerebrale organoider åpner nye veier for medisinsk forskning. Mange nyttige anvendelser av denne teknologien begynner bare å bli utforsket28. Denne undersøkelsen fant at transkriptomsekvenseringsresultatene av genetisk syke cerebrale organoider og normale cerebrale organoider kan gjenspeile forskjellene mellom sykdom og helse. For eksempel er RNA-seq dataanalyseresultatene (figur 3B) i samsvar med mange rapporterte studier på SCA3 sykdommer 29,30,31,32. Eksperimentelle operasjoner, som medium endring, EB-overføring og innpakning, er avgjørende for å dyrke cerebrale organoider og avgjøre om organoider med god ensartethet kan fremstilles 33,34. I denne studien introduseres en cerebral organoidprotokoll som muliggjorde mediumendring og organoidoverføring. En lateral myk lyslampe kan i stor grad hjelpe til med driften av organoidkultur. Det er imidlertid ikke vanskelig å lage, LED-malingslysputen og enkel behandling kan også erstatte den. Den enkle væskeutvekslingsmetoden og organoidoverføringsoperasjonen gjør hele kulturprosessen enklere. Anvendelsen av cerebrale organoider påvirkes ofte av problemet med dårlig ensartethet35. Den største forskjellen mellom denne studien og andre retningslinjer for cerebral organoidkultur er at fokuset er på å optimalisere operasjonen for å gjøre eksperimentet mer repeterbart.
Det er svært viktig å opprettholde stabiliteten i kultursystemet. Hvis forholdene tillater det, foreslås det å prioritere det kommersielle cerebrale organoidmediet, som effektivt kan redusere de store forskjellene i eksperimentelle resultater i forskjellige partier på grunn av ustabiliteten til mediet. I tillegg bør cerebral organoid medium lagring ved 4 ° C ikke vare mer enn 2 uker; Ellers vil det påvirke stabiliteten i kultursystemet. Selvfølgelig er det også viktig å sikre at iPSCene som brukes er pluripotente i stedet for differensierte. OCT4 immunfluorescensdeteksjon kan brukes. Hvis OCT4-positive celler er mindre enn 90%, anbefales det å erstatte dem med iPSC-er av høyere kvalitet og cerebrale organoider av kultur igjen.
Det er noen begrensninger i den cerebrale organoidkulturteknologien som ble introdusert i denne studien. For eksempel kan cerebrale organoider ikke dyrkes intensivt i det senere utviklingsstadiet, noe som er sløsing med kulturrom. Dette er også et presserende problem som skal løses ved bruk av cerebrale organoider. Hvis mange cerebrale organoider utviser hul ekspansjon, reduseres antall organoider i hver brønn, middels utvekslingsfrekvens øker, og organoider er i en ikke-hypooksisk tilstand med tilstrekkelig næringsstoffer.
Denne studien er et operativt supplement til mange eksisterende cerebrale organoidkulturmetoder 12,36,37 og til og med andre typer organkulturmetoder 38,39. Dette vil bidra til å utvikle automatiserte organoidkultursystemer i fremtiden og fremme forskning og anvendelse av organoider. Hvis teknologien for å forbedre lysdiffusjonseffekten av organoider brukes i det automatiske intelligente dyrkingssystemet, kan det teoretisk erstatte det høypresisjons bildeforsterkningskameraet, og bare en vanlig bildegjenkjenningsenhet må installeres. I tillegg er mediumutveksling og organoidoverføring gjennom sekundærstrøm generert ved rotasjon og naturlig sedimentering på sugehodet teoretisk mer gjennomførbart enn sentrifugering i fremtidig automatisk kulturutstyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av Natural Science Foundation of Guangdong-provinsen (Grant No. 2020A0505100062), Guangzhou City Science and Technology Key Topics Project (Grant No. 201904020025), National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 31872800, 32070582, 82101937) og Guangzhou City Postdoctoral Research Grant-prosjektet (til Bangzhu Chen).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm Filter | NEST Biotechnology, China | 331001 | |
| 1000 μL wide-bore pipette tip | Thermo Fisher Scientific, USA | 9405163 | |
| 200 μL wide-bore pipette tip | Thermo Fisher Scientific, USA | 9405020 | |
| 2-Mercaptoethanol | Merck, Germany | 8057400005 | |
| 4% Paraformaldehyde | Servicebio, China | G1101 | |
| 6-well low adhesion plate | NEST Biotechnology, China | 703011 | It is used for EBs suspension cultures |
| Aaccute cell detachment solution | STEMCELL Technologies, Canada | 07920 | It is used to digest iPSC into single cells. |
| AggreWell800 24-well | STEMCELL Technologies, Canada | 34811 | Microporous culture plate for EBs preparation. |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL Technologies, Canada | 07010 | Rinsing solution for cultureware to prevent cell adhesion |
| B27-vit. A supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 12587010 | |
| bFGF | Peprotech, USA | GMP100-18B | |
| BSA | Beyotime Biotechnology, China | ST025 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5810 R | It can be used for centrifugation of various types of centrifuge tubes, reagent bottles and working plates. |
| Cover glass | Shitai Laboratory Equipment, China | 10212020C | |
| DAPI | Beyotime Biotechnology, China | C1002 | Used for nuclear staining. After DAPI was combined with double stranded DNA, the maximum excitation wavelength was 364nm and the maximum emission wavelength was 454nm. |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific, USA | 11330032 | |
| ES-quality FBS | Thermo Fisher Scientific, USA | 10270106 | |
| Ficoll Paque | General Electric Company, USA | 17-5442-02 | Isolate the peripheral blood mononuclear cells according to Ficoll-Paque method. |
| Gelatin | Sangon Bioteach, China | A609764 | |
| Glutamax supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 35050061 | |
| Glutamax supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 17504044 | |
| Goat anti-Chicken IgY secondary antibody | Abcam, UK | ab150171 | Goat anti-Chicken IgG. Conjugation: Alexa Fluor 647. Ex: 652 nm, Em: 668 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Goat anti-Mouse IgG secondary antibody | Abcam, UK | ab150120 | Goat anti-Mouse IgG. Conjugation: Alexa Fluor 594. Ex: 590 nm, Em: 617 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Goat anti-Rabbit IgG secondary antibody | Abcam, UK | ab150077 | Goat Anti-Rabbit IgG. Conjugation: Alexa Fluor 488. Ex: 495 nm, Em: 519 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Heparin | Merck, Germany | H3149 | |
| Horizontal shaker | Servicebio, China | DS-H200 | Relative centrifugal force (RCF) of 0.11808 x g is more appropriate, according to the manufacturer INFORS HT (Switzerland). |
| Insulin | Merck, Germany | I9278-5ML | |
| KOSR | Thermo Fisher Scientific, USA | 10828028 | |
| Matrigel | Corning, USA | 354277 | Matrigel will solidify in the environment higher than 4 °C, so it should be sub packed at low temperature. |
| MEM-NEAA | Thermo Fisher Scientific, USA | 11140050 | |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies, Canada | 85850 | iPSC culture medium |
| N2 supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 17502048 | |
| Neurobasal | Thermo Fisher Scientific, USA | 21103049 | |
| OCT4 primary antibody | Abcam, UK | ab19857 | Host: Rabbit. Dissolve with 500 μL PBS. Use at 1:200 dilution. |
| Pathological frozen slicer | Leica, Germany | Leica CM1860 | |
| PAX6 primary antibody | Abcam, UK | ab78545 | Host: Mouse. Use at 1:100 dilution. |
| PBS | STEMCELL Technologies, Canada | 37350 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, USA | 15140122 | |
| PSC dissociation solution | Beijing Saibei Biotechnology, China | CA3001500 | Enzyme free dissociation solution can be used for iPSC digestion and passage. |
| Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific, USA | A16518 | Establish iPSC according to the protocol of Sendai Reprogramming Kit. |
| Slide Glass | Shitai Laboratory Equipment, China | 188105W | |
| Soft light lamp | NUT | NUT | A simple self made device, refer to supplementary figure 2 for preparation. |
| STEMdiff Cerebral Organoid Kit | STEMCELL Technologies, Canada | 8570 | Contain: 1. EB Formation Medium; 2. Induction Medium; 3. Expansion Medium; 4. Maturation Medium. |
| STEMdiff Cerebral Organoid Maturation Kit | STEMCELL Technologies, Canada | 8571 | Maturation Medium |
| Sucrose | Sangon Bioteach, China | A502792 | |
| Triton X-100 | Merck, Germany | X100 | |
| TUJ1 primary antibody | Abcam, UK | ab41489 | Host: Chicken. Use at 1:1000 dilution. |
| Vaseline | Sangon Bioteach, China | A510146 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies, Canada | 72302 | Prepare a 5 mM stock solution in PBS, resuspend 1 mg in 624 µL of PBS. |
| Weblink | |||
| Raw sequencing data | Genome Sequence Archive (Genomics, Proteomics & Bioinformatics 2021) in National Genomics Data Center (Nucleic Acids Res 2022), China National Center for Bioinformation / Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences | GSA-Human: HRA002430 | https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/ |
References
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7 (33), (2020).
- Quadrato, G., et al. Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids. Nature. 545 (7652), 48-53 (2017).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Qian, X., et al. et al.Brain-region-specific organoids using mini-bioreactors for modeling ZIKV exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Hu, Y., et al. Lung cancer organoids analyzed on microwell arrays predict drug responses of patients within a week. Nature Communications. 12 (1), 2581 (2021).
- Jung, D. J., et al. A one-stop microfluidic-based lung cancer organoid culture platform for testing drug sensitivity. Lab on a Chip. 19 (17), 2854-2865 (2019).
- Jalili-Firoozinezhad, S., et al. A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 520-531 (2019).
- Gkatzis, K., Taghizadeh, S., Huh, D., Stainier, D. Use of three-dimensional organoids and lung-on-a-chip methods to study lung development, regeneration and disease. The European Respiratory Journal. 52 (5), 1800876 (2018).
- Ye, Y., Pui, D. Detection of nanoparticles suspended in a light scattering medium. Scientific Reports. 11 (1), 20268 (2021).
- Staven, V., Waaseth, M., Wang, S., Grønlie, I., Tho, I. Utilization of the tyndall effect for enhanced visual detection of particles in compatibility testing of intravenous fluids: Validity and reliability. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology. 69 (2), 270-283 (2015).
- Fukuma, Y., Inui, T., Imashiro, C., Kurashina, Y., Takemura, K. Homogenization of initial cell distribution by secondary flow of medium improves cell culture efficiency. PloS One. 15 (7), 0235827 (2020).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Ouyang, S., et al. CRISPR/Cas9-targeted deletion of polyglutamine in spinocerebellar ataxia type 3-derived induced pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 27 (11), 756-770 (2018).
- Xian, Y., et al. The safety and effectiveness of genetically corrected iPSCs derived from β-thalassaemia patients in nonmyeloablative β-thalassaemic mice. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 288 (2020).
- Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Current Protocols in Immunology. , Chapter 7, Unit 7.1 (2001).
- Knight, G. T., et al. Engineering induction of singular neural rosette emergence within hPSC-derived tissues. eLife. 7, 37549 (2018).
- Rieder, H. L., Smithwick, R. W.
- Dole, V. P., Cotzias, G. C. A nomogram for the calculation of relative centrifugal force. Science. 113 (2941), 552-553 (1951).
- Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
- Jacob, F., et al. Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium. Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).
- Kathuria, A., et al. Transcriptomic landscape and functional characterization of induced pluripotent stem cell-derived cerebral organoids in schizophrenia. JAMA Psychiatry. 77 (7), 745-754 (2020).
- Paşca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nature Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
- Hu, B. Y., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4335-4340 (2010).
- Tang, X. Y., et al. DSCAM/PAK1 pathway suppression reverses neurogenesis deficits in iPSC-derived cerebral organoids from patients with Down syndrome. The Journal of Clinical Investigation. 131 (12), 135763 (2021).
- Costa, M., Paulson, H. L.
- Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nature Biotechnology. 28 (5), 511-515 (2010).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Klockgether, T., et al. Age related axonal neuropathy in spinocerebellar ataxia type 3/Machado-Joseph disease (SCA3/MJD). Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 66 (2), 222-224 (1999).
- Khan, L. A., et al. Expanded polyglutamines impair synaptic transmission and ubiquitin-proteasome system in Caenorhabditis elegans. Journal of Neurochemistry. 98 (2), 576-587 (2006).
- Teixeira-Castro, A., et al. Serotonergic signalling suppresses ataxin 3 aggregation and neurotoxicity in animal models of Machado-Joseph disease. Brain: A Journal of Neurology. 138, Pt 11 3221-3237 (2015).
- Joers, J. M., et al. Neurochemical abnormalities in premanifest and early spinocerebellar ataxias. Annals of Neurology. 83 (4), 816-829 (2018).
- Sivitilli, A., Ghiasi, P., Attisano, L. Production of phenotypically uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Bio-protocol. 11 (8), 3985 (2021).
- Sivitilli, A. A., et al. Robust production of uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Life Science Alliance. 3 (5), (2020).
- Camp, J. G., Treutlein, B.
- Giandomenico, S. L., Sutcliffe, M., Lancaster, M. A. Generation and long-term culture of advanced cerebral organoids for studying later stages of neural development. Nature Protocols. 16 (2), 579-602 (2021).
- Yoon, S. J., et al. Reliability of human cortical organoid generation. Nature Methods. 16 (1), 75-78 (2019).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
