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Neuroscience

Rastreo de linaje de células madre inducibles marcadas fluorescentemente en el cerebro de ratón adulto

Published: May 20, 2022 doi: 10.3791/63998
Automatic Translation
1,2, 2, 3, 1,2
1Graduate School of Biomedical Science and Engineering, University of Maine, 2Department of Neurosurgery, Ohio State University Wexner Medical Center, 3Boston Children’s Hospital, Harvard Medical School

Summary

La capacidad de marcar permanentemente las células madre y su progenie con un fluoróforo utilizando una línea de ratón de rastreo de linaje transgénico inducible permite el análisis espacial y temporal de la activación, proliferación, migración y / o diferenciación in vivo. El rastreo de linaje puede revelar información novedosa sobre el compromiso del linaje, la respuesta a las intervenciones y la multipotencia.

Abstract

Se desarrolló una línea de ratón de rastreo de linaje de transcriptasa inversa (Tert) para investigar el comportamiento y el destino de las células madre de tejidos adultos, cruzando el sistema 'Tet-On' del ratón oTet-Cre con un nuevo transgén transactivador de tetraciclina inversa (rtTA) vinculado al promotor Tert, que hemos demostrado que marca una nueva población de células madre cerebrales adultas. Aquí, la administración del derivado de la tetraciclina doxiciclina a ratones mTert-rtTA::oTet-Cre marcará indeleblemente una población de células que expresan un fragmento de 4,4 kb de la región promotora del gen Tert. Cuando se combina el reportero Rosa-mTmG, los ratones mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG expresarán tdTomato de membrana (mTomato) hasta que el tratamiento con doxiciclina induzca el reemplazo de la expresión de mTomato con EGFP de membrana (mGFP) en células que también expresan Tert. Por lo tanto, cuando estos ratones de rastreo de linaje triple transgénico reciben doxiciclina (el período de "pulso" durante el cual se marcan las células que expresan TERT), estas células se convertirán en células mGFP + marcadas indeleblemente, que se pueden rastrear durante cualquier cantidad de tiempo deseable después de la eliminación de doxiciclina (el período de "persecución"), incluso si la expresión de Tert se pierde posteriormente. Los cerebros se fijan y procesan para la inmunofluorescencia y otras aplicaciones posteriores con el fin de interpretar los cambios en la activación de las células madre, la proliferación, el compromiso de linaje, la migración a varios nichos cerebrales y la diferenciación a tipos de células maduras. Usando este sistema, cualquier ratón rtTA se puede acoplar a oTet-Cre y un reportero Rosa para llevar a cabo experimentos de rastreo de linaje de "persecución de pulso" inducibles por doxiciclina utilizando marcadores de células madre.

Introduction

Valor de una línea de ratón de seguimiento de linaje
El análisis de células madre in vivo puede ser difícil ya que muchos ensayos que examinan dichas células solo se centran en caracterizar estas células en el momento de la muerte del animal, lo que representa una instantánea terminal en el tiempo. Para comprender mejor los procesos de proliferación, diferenciación y migración de progenitores, tipos de células intermedias /de transición y células maduras a lo largo del tiempo, se requiere un enfoque de análisis longitudinal. Esto se puede lograr con estudios de rastreo de linaje en los que las células madre/progenitoras se marcan indeleblemente y se pueden seguir durante cualquier período de tiempo después1.

En el cerebro de mamíferos adultos, el proceso de neurogénesis por el cual se crean neuronas nacidas de adultos a partir de células madre y progenitoras se analizó por primera veza través de la retención de etiquetas con timidina-H 3 2,3,4 o 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU)5,6,7,8 . En estos estudios, las células proliferativas se marcaron con el análogo de timina, que se incorporó al ADN de las células durante la replicación y la división / proliferación celular. Por lo tanto, la célula marcada, así como su progenie, contenían este análogo, que luego se identificaron post mortem. Sin embargo, mientras que la timidina-H3 y BrdU permitieron el marcado de células proliferativas y su progenie en regiones del cerebro donde las células madre eran poco conocidas, estos estudios se vieron obstaculizados por las desventajas de estas herramientas. La timidina-H3 induce la detención del ciclo celular, la apoptosis y la inhibición de la síntesis de ADN dependiente de la dosis9, mientras que BrdU marca las células en niveles variables según la vía de administración10 y es absorbida por las células durante la reparación o la apoptosis, así como durante la división celular11. Recientemente se han utilizado métodos de etiquetado más eficientes, como el etiquetado con 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU), pero muchos de los mismos problemas que BrdU siguen siendo12. Estos enfoques también son limitantes en el sentido de que marcan cualquier célula proliferativa, no solo las células madre, y por lo tanto la interpretación de los resultados puede confundirse. En el linaje neurogénico, todas las células madre y progenitoras conservan la capacidad mitótica, y solo las neuronas terminales / maduras no son proliferativas. Para los astrocitos y la microglía, pero no para los oligodendrocitos, la proliferación se mantiene indefinidamente 13,14,15.

Los ratones transgénicos utilizados para rastrear solo células que expresan una proteína de interés, como una confirmada para identificar células madre adultas como la que usamos aquí, se han vuelto más comunes cuando se investigan las células madre y su progenie. Si bien es difícil de generar a través de enfoques transgénicos de ratón, las líneas de ratón de rastreo de linaje permiten el rastreo de células específicamente marcadas en el cerebro y no dependen solo de la proliferación. En el sistema de ratón transgénico Tet-On, la administración de tetraciclina o doxiciclina (un derivado de la tetraciclina) induce la expresión de Cre-recombinasa en células que han sido diseñadas con un transactivador de tetraciclina inversa (rtTA), que es transcrito por un promotor de interés. La recombinación impulsada por Cre inducible por Tet activará la expresión de una proteína fluorescente o luminiscente indeleble en las células de interés, dependiendo del ratón Rosa-reporter empleado. Estas células marcadas indeleblemente continúan expresando este reportero después de la división, diferenciación o migración, permitiendo el seguimiento de estas células y su progenie a lo largo del tiempo o después de diferentes intervenciones16. Las ventajas de los enfoques de rastreo de linaje transgénico incluyen: 1) especificidad del rastreo a un linaje celular particular o célula progenitora / madre marcada por el rtTA, 2) expresión indeleble de la proteína fluorescente o luminiscente a pesar de la renovación o diferenciación celular, 3) baja toxicidad, 4) activación condicional durante cualquier punto del ciclo de vida del animal, y 5) facilidad de uso con ensayos comunes, incluyendo inmunotinción/inmunofluorescencia16.

Otros métodos de herramientas reporteras inducibles temporalmente en ratones incluyen el uso de ratones Cre-ERT2, que se pueden emparejar con ROSA-GFP, ROSA-mTmG u otros transgenes reporteros fluorescentes. En estos animales, un elemento regulador específico de la célula, como un promotor o potenciador de la región de interés, impulsa la producción de Cre recombinasa, que solo puede activarse mediante la administración de tamoxifeno. Si bien las líneas de ratón Cre-ERT2 permiten la inducción de Cre en líneas celulares específicas, existe una gran cantidad de conocimientos que detallan los efectos del tamoxifeno en la neurogénesis adulta17,18. Además, existen muchos genes fluorescentes reporteros impulsados por ROSA que se pueden utilizar en lugar de GFP o mTmG, incluidos YFP o CFP, lo que permitiría un etiquetado fluorescente alternativo en otras longitudes de onda fluorescentes. Estos genes reporteros fluorescentes se pueden utilizar con sistemas Tet-On o Cre-ERT2.

La telomerasa transcriptasa inversa (TERT) es el componente limitante de la velocidad de la holoenzima telomerasa, que trabaja para extender los telómeros después de que se acortan durante la división celular19,20. TERT se ha identificado como un marcador de células madre de tejido adulto en el intestino 21,22, médula ósea21, hígado23, adiposo24, endometrio25,26 y hueso1. Todavía se desconoce si la expresión de TERT en estas células madre adultas es únicamente para la actividad de extensión de la telomerasa o para realizar funciones TERT no canónicas27. Las células madre adultas inactivas que expresan TERT (qASC) se han identificado y rastreado en todo el cuerpo con ratones de rastreo de linaje transgénico para estudiar la capacidad de multipotencia y autorrenovación de estas células madre, así como su potencial para activarse, proliferar, diferenciarse y migrar 1,22,23,28. La creación del transgén Tert-rtTA se ha realizado previamente1. En este artículo, describiremos el uso de una línea de ratón TERT de rastreo de linaje para estudiar TERT + qASCs que hemos identificado como una nueva población de ASC en el cerebro de ratón adulto.

Generación de una línea de ratón de rastreo de linaje transgénico
Para generar una línea de ratón de rastreo de linaje utilizando el sistema Tet-On, se deben combinar tres transgenes dentro de un solo animal a través del apareamiento del ratón. El primero es un rtTA, expresado bajo el control del promotor del gen de interés (el nuestro es TERT-rtTA). En una célula que expresa este gen de interés, por lo tanto, se expresará el rtTA. El segundo es un gen oTet-Cre, que contiene un elemento de respuesta de tetraciclina (TRE) que permitirá la transcripción de la cre recombinasa en presencia de una transcripción de fusión rtTA y tetraciclina o doxiciclina. La tetraciclina o la doxiciclina se pueden administrar a un animal a través de agua potable o chow29. Finalmente, debe haber un gen que será activado por la escisión de la recombinasa Cre. En este manuscrito, el gen de etiquetado que describiremos es el gen Rosa26-mTmG, que hasta la recombinación de Cre transcribirá ubicuamente mTomato (fluorescencia roja de membrana en todas las células). Sin embargo, si una célula expresa la transcripción rtTA y contiene tetraciclina o doxiciclina, la recombinación cre de un conjunto de sitios lox P entre los sitios mTomato y mGFP cambiará el sitio R26 y hará que la célula produzca EGFP de membrana (mGFP, o fluorescencia verde de membrana) en lugar de tomate de membrana. La naturaleza indeleble de esta señal mGFP permitirá el etiquetado y rastreo in vivo de las células a medida que proliferan, migran y se diferencian. Siguiendo el rastro, las células se pueden analizar para la expresión de GFP a través de inmunofluorescencia en criosecciones estándar o cerebros ópticamente más gruesos.

En este artículo, describiremos el uso de la línea específica del ratón, mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG. Para crear esta línea de ratones transgénicos triples, primero apareamos animales oTet-Cre (la cepa Jackson Lab #006234) con animales Rosa-mTmG (la cepa Jackson Lab #007676) para crear ratones transgénicos dobles oTet-Cre::Rosa-mTmG. Estos animales fueron genotipados con cebadores y plantillas de PCR indicadas en las Tablas Complementarias 1 y 2. Los ratones mTert-rtTA (creados por David Breault1) se acoplaron a animales oTet-Cre::Rosa-mTmG para crear mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG ratones (Figura 1A)1,30. El mecanismo de acción de la línea de ratón mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG se ilustra en la Figura 1B.

Diseño de inducción de doxiciclina y persecución por pulsos
Al planificar experimentos, es importante considerar varios factores que afectarán el resultado de los experimentos de rastreo de linaje, incluida la edad del animal en la inducción de doxiciclina, la duración de la administración de doxiciclina (el período de "pulso"), el período de tiempo después de la extracción de doxiciclina antes de la recolección de tejido (el período de "persecución") y el momento de cualquier intervención durante estos procesos. Estas consideraciones de diseño del estudio son esenciales para comprender las células marcadas y su progenie al final del experimento. El primer paso en el proceso es identificar la edad de interés del animal y la duración de la administración de doxiciclina. Los períodos de pulso más largos permitirán que se exprese el potencial de que más células expresen el promotor vinculado a rtTA y que se marquen indeleblemente más células de interés. Un tipo de célula que exhibe una expresión transitoria del gen de interés puede requerir un período de pulso más largo que las células que expresan continuamente el gen de interés. Sin embargo, si el objetivo del estudio es comprender los efectos a corto plazo de la célula de interés o una intervención aguda, el período de pulso no puede ser demasiado largo, ya que una vez que se marca una célula, se rastreará a través de cualquier número de cambios durante el resto del período de pulso. En algunos de nuestros estudios, se utilizó un pulso de 2 días sin período de persecución para imitar más de cerca a un reportero directo para TERT. Esto se debe a que el tiempo mínimo para la recombinación del gen Rosa-mTmG es de 2 días31.

El siguiente período esencial en un experimento de persecución por pulso es la duración entre la eliminación de la doxiciclina y la perfusión del animal, también conocida como la "persecución". La vida media de la doxiciclina en ratones es de aproximadamente 170 minutos, independientemente de la vía de administración, lo que permite concluir que es probable que la inducción de doxiciclina ya no ocurra varias horas después de la extracción32. Sin embargo, es importante tener en cuenta que el metabolismo de la doxiciclina es más lento en ratones envejecidos, lo que puede conducir a períodos de "pulso" efectivos más largos que los animales jóvenes33.

Durante el período de persecución, las células marcadas continuarán siendo etiquetadas, incluso después de la proliferación, diferenciación o migración. La progenie de estas células también será etiquetada. El objetivo del estudio dará forma a la longitud del paradigma de la persecución de pulsos. Si el objetivo del estudio es comprender la regeneración de un tejido durante un largo período de tiempo con las células de interés, puede ser necesario un largo período de persecución. Finalmente, se debe decidir el momento de cualquier intervención o tratamiento. La administración durante el período de pulso afectará a las células que expresan el gen de interés, así como a cualquier progenie creada durante este tiempo, mientras que la administración durante el período de persecución puede afectar principalmente a la progenie de las células de interés, aunque esto dependerá de la rapidez con que las células marcadas se dividan o se diferencien. Los ejemplos de diseños experimentales de persecución de pulsos que hemos utilizado se describen en la Figura 2A.

También es importante tener en cuenta la posibilidad de una señal GFP de fondo debido a la expresión con fugas. La expresión permeable ocurre como resultado del potencial de unión inherente entre rtTA y las secuencias de Otet en ausencia de doxiciclina, y la actividad residual del transgén Otet en ausencia de rtTA (revisado en34). La expresión con fugas representa una debilidad de los sistemas Tet, y aunque la fuga es a menudo una desventaja aceptable para el sistema, las situaciones en las que la expresión con fugas puede conducir a toxicidad y mortalidad, como con la toxina de la difteria (DTA) en animales Otet-DTA pueden limitar el uso de estos sistemas35.

Procesamiento cerebral, seccionamiento e inmunofluorescencia de secciones delgadas para microscopía
Para analizar los cerebros de ratones después de un experimento de rastreo de linaje, los ratones primero deben ser perfundidos a través de la perfusión transcárdica para eliminar la sangre y el LCR que pueden conducir a una alta autofluorescencia en el cerebro. Hay dos fijadores de uso común con los que el animal puede ser perfundido: Histochoice Tissue Fixative, un fijador de glioxal (GF), o 4% de paraformaldehído (PFA). Los fijadores de glioxal permiten un proceso de fijación relativamente suave con menos reticulación que el PFA. Esto reduce la rigidez de los tejidos, reduce la necesidad de recuperación de antígenos y permite soluciones de anticuerpos menos concentradas durante la inmunotinción. Sin embargo, si contienen metanol esto puede servir para aumentar la autofluorescencia36. Por otro lado, la PFA a menudo permitirá una fijación más robusta, y aunque se requerirá la recuperación de antígenos durante la inmunotinción, hay anticuerpos que solo funcionarán con tejidos fijos con PFA, y se requiere perfusión con PFA al 4% para la técnica de limpieza óptica descrita más adelante.

Después de la perfusión es un paso posterior a la fijación, en el que los cerebros están inmersos en el mismo tipo de fijador utilizado durante la perfusión durante la noche. Esto permite que cualquier región del cerebro que puede no haberse fijado completamente durante la perfusión continúe arreglándose. A continuación, los cerebros se incubarán en sacarosa en solución salina tamponada con fosfato (PBS) para eliminar la mayor cantidad de agua posible antes del paso de congelación para evitar la formación de hielo dentro del tejido ("criopreservación"). Los cerebros pueden ser cortados en cualquier número de secciones de tejido sagital, coronal o transversal para su procesamiento. Tanto para la precisión como para la reproducibilidad, los bloqueos cerebrales calibrados deben usarse de una manera que garantice cortes de bregma consistentes entre animales. El factor más importante que puede afectar la forma en que se seccionan los cerebros es la región (s) del cerebro de interés. Por ejemplo, mientras que un corte sagital puede permitir que se analicen más regiones cerebrales en una sección de tejido, este corte no permitirá el análisis de regiones neuro/gliogénicas de la zona ventricular-subventricular (V-SVZ) ya que los lados lateral y medial del ventrículo lateral serán imposibles de discernir en esa dimensión y se observan mejor en el plano coronal. Esta puede ser una distinción importante a hacer en los estudios de neurogénesis en adultos, ya que el lado lateral del ventrículo lateral contiene la V-SVZ neurogénica, mientras que la pared medial del ventrículo lateral es un nicho más gliogénico37.

Después de que los tejidos se hayan dividido en secciones coronales, sagitales o transversales, se congelarán en bloques utilizando una solución de incrustación de temperatura de enfriamiento óptima (OCT). Aquí, los cerebros se congelan dentro de este material de incrustación, con el uso de una mezcla de hielo seco y etanol. Si se requiere un análisis de sección delgada, los bloques se cortarán en un criostato y, dependiendo del análisis posterior requerido, se pueden adherir a portaobjetos de vidrio cargados positivamente como secciones delgadas (<20 μm). También se pueden usar portaobjetos de vidrio que no están cargados, pero el uso de portaobjetos sin carga puede provocar que los tejidos se desatasquen de los portaobjetos38. Si se requieren secciones de tejido de flotación libre de espesor medio (>20 μm), los tejidos se recogerán como secciones de flotación libre. Si se requieren secciones gruesas (0.5-4 mm), se requiere cortar secciones cerebrales no congeladas con un vibratomo. Es importante tener en cuenta las diferencias de almacenamiento entre las secciones de las diapositivas, que requieren congelación a -20 a -80 °C y las secciones de flotación libre, que se almacenarán a 4 °C.

Limpieza cerebral y microscopía confocal inmunofluorescente de montaje completo
Si se desea un análisis más amplio, pero menos detallado, de las células trazadas por linaje en el cerebro del ratón, es posible un análisis exhaustivo de segmentos más gruesos de tejido cerebral con la limpieza cerebral iDISCO39 seguida de inmunotinción y microscopía confocal de pila Z en mosaico o microscopía de lámina de luz. Aquí, grandes secciones del cerebro del ratón se limpiarán ópticamente (un proceso de delipidación39), lo que permite obtener imágenes de señal fluorescente en una sección de tejido de 1 mm. Las desventajas de este proceso son la alta autofluorescencia y una capacidad disminuida para obtener imágenes de alta resolución de la morfología celular y un análisis detallado de tinción conjunta debido al aumento de las distancias de trabajo requeridas en comparación con los métodos más tradicionales (criosecciones delgadas o secciones de flotación libre). Por esta razón, recomendamos la limpieza cerebral para analizar los resultados del rastreo de linaje a gran escala en múltiples áreas del cerebro, en lugar de intentar caracterizar o analizar células individuales.

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Protocol

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Estatal de Ohio.

1. Creación de una línea de ratón Tet-On de rastreo de linaje, estrategias de reproducción y genotipado para ratones de cohorte experimentales

NOTA: Aquí, describimos la creación de un sistema de ratón Tet-On con Rosa-mTmG como el gen reportero fluorescente que se somete a la recombinación Cre, sin embargo, varias otras líneas reporteras impulsadas por la recombinación Cre también se pueden utilizar con el sistema Tet-On.

  1. Establezca una jaula de apareamiento de un macho oTet-Cre (+/-) con una o más hembras R26 (mTmG) (+/+). Consulte la Figura 1 para obtener información general sobre la configuración experimental de acoplamiento del ratón.
  2. Los cachorros resultantes (F1) serán oTet-Cre (+/-) u oTet-Cre (-/-) y R26 (mTmG) (+/-). Realizar genotipado según los cebadores de la Tabla Suplementaria 1 y los protocolos de la Tabla Suplementaria 2.
  3. En el destete, realice pruebas de la línea germinal tomando un golpe en el oído de cada destete. Examine el punzón de la oreja bajo un microscopio epifluorescente en el espectro GFP / FITC para determinar si el animal se había sometido a una recombinación de la línea germinal en desarrollo. Si es así, el animal expresará GFP en cada célula, y el golpe de oído fluorescenciará con la señal mGFP. Estos animales no pueden ser utilizados para apareamientos o experimentos.
    NOTA: Los clips para los oídos de ratones que no son de línea germinal muestran solo fluorescencia endógena bajo el microscopio (Figura 1C), mientras que los animales de la línea germinal muestran una señal GFP brillante (Figura 1D). Las orejas de control pueden ser de ratones que no contienen transgenes fluorescentes. Como nota, los pelos de las orejas tienen una alta fluorescencia endógena y no deben usarse como factor determinante (Figura 1C). Además, se observan diferencias en la fluorescencia endógena entre ratones de color de pelaje blanco vs. negro, y los controles de ratones del mismo color de pelaje que los ratones que se están probando deberán usarse en este análisis.
  4. Aparear un macho oTet-Cre (+/-) x R26 (mTmG) (+/-) con uno o más ratones hembra oTet-Cre (-/-) x R26 (mTmG).
  5. La generación resultante (F2) será de 1/4 R26 (mTmG) (+/+) y 1/2 Cre (+/-). Cruce estos animales con animales mTert-rtTA (+/+) apareando un oTet-Cre (+/-) x R26 (mTmG) (+/+) con uno o más animales mTert-rtTA (+/+).
    NOTA: Utilizamos animales mTert-rtTA (+/+), pero este proceso se puede realizar con cualquier línea de ratón rtTA30.
  6. Para los animales de experimentación, configure reproductores para generar mTert-rtTA (+/+) o (+/-) x oTet-Cre (+/-) x R26 (mTmG) (+/+) o (+/-).

2. Inducción de doxiciclina de Cre y diseño de persecución de pulsos

  1. Cuando los animales estén en la edad correcta para que comience el estudio, reemplace su agua potable con agua dox: agua potable que contiene 5% de sacarosa y 2 mg / ml de hiclato de doxiciclina. Utilice animales Cre-negativos que reciben la misma persecución de pulso de doxiciclina que los animales de experimentación como grupo de control para los patrones de expresión fluorescente resultantes.
    1. Después de la preparación, guarde el agua dox a 4 °C durante un máximo de 1 mes. Consulte la Tabla 1 para obtener más información. El agua Dox se puede administrar a los animales en botellas para beber hasta 5 días antes de cambiarse, ya que el crecimiento de hongos puede ocurrir si el agua Dox se deja fuera a temperatura ambiente durante períodos de tiempo más largos.
      NOTA: Se requiere un pulso de doxiciclina de al menos 2 días para la inducción de la señal mGFP cuando se utiliza el transgén mTmG (papel mTmG inicial).
      NOTA: No hemos probado concentraciones de doxiciclina que no sean de 2 mg/ml. La literatura previa ha identificado que esta concentración tiene los mayores efectos cuando se administra a través del agua potable29. La cantidad de doxiciclina administrada puede diferir dependiendo de la cantidad de bebida que beba cada animal. La inyección de doxiciclina o sonda también se puede hacer para ser consistente entre los animales40.
  2. Después de que el período de pulso haya terminado, retire el agua dox de las jaulas y reemplácela con agua potable normal. Los animales ahora estarán en el período de "persecución" hasta la muerte.

3. Perfusión transcárdica y disección cerebral

  1. Retire un ratón de su jaula y sujete al animal con el pulgar izquierdo y el índice. Inyectar al animal mediante inyección intraperitoneal (i.p.) con una solución de 100 mg/ml de ketamina y 20 mg/ml de xilazina en solución salina estéril al 0,9% para una concentración final de 200 mg/kg de ketamina y 20 mg/kg de xilazina. Consulte la Tabla 1 para obtener más información.
    PRECAUCIÓN: Los protocolos para la anestesia pueden diferir según el país. Además, existen efectos de los anestésicos en el cerebro, incluidos cambios en la morfología y acción microglial y los niveles de corticosterona que deben entenderse al realizar perfusiones con el propósito de recolectar y analizar el cerebro41,42.
  2. Después de aproximadamente 1-2 min, el animal perderá su reflejo de enderezamiento. Para probar esto, simplemente ruede al animal sobre su espalda y si no puede volver a rodar sobre sus pies, ha perdido el reflejo de enderezamiento.
  3. Después de aproximadamente 5-10 min el animal perderá su reflejo de pedaleo. Para comprobar el reflejo del pedal, use el pulgar y el índice para pellizcar cada uno de los pies del animal. Si no hay respuesta, en forma de salto o espasmo muscular, use las uñas del pulgar y el índice para pellizcar cada uno de los pies del animal. Si no hay respuesta, el animal ha perdido el reflejo del pedal.
    NOTA: Si el animal responde al reflejo del pedaleo durante más de 15 minutos después de la inyección, se puede requerir una inyección adicional de 1/2 de la inyección inicial de ketamina/xilazina. La edad, el sexo, el genotipo, el fenotipo y el tratamiento pueden afectar la respuesta del animal a este cóctel de medicamentos.
  4. Después de que se pierdan los reflejos de enderezamiento y pedaleo, pruebe el reflejo ocular contactando ligeramente el globo ocular del ratón con un dedo enguantado. La falta de respuesta indica que se ha perdido el reflejo ocular.
  5. Asegure el ratón en posición supina con las patas fijadas a una superficie de trabajo fijable.
  6. Haga una incisión a través de la piel con tijeras quirúrgicas a lo largo de la línea media torácica aproximadamente 1-2 cm por debajo del proceso xifoide. Corte superior hasta en el proceso xifoide.
  7. Agarre el cartílago del proceso xifoide con fórceps. Inserte tijeras y corte a través de la musculatura y la caja torácica en diagonal a lo largo del lado derecho del ratón hasta el nivel de las clavículas.
    1. Levante la musculatura torácica con fórceps y corte a través del diafragma hasta que se pueda visualizar el corazón. Luego haga un corte diagonal idéntico a lo largo del lado izquierdo del mouse, asegurándose de evitar cualquier contacto con el corazón. Use un hemostático para mantener la musculatura torácica lejos de la cavidad.
      NOTA: En este punto, el ratón ya no podrá respirar, así que trabaje rápidamente para evitar la muerte antes de los siguientes pasos.
  8. Asegure el corazón que late con fórceps romos e inserte una aguja dispensadora en el ventrículo izquierdo a través de la base del arco aórtico.
  9. Sujete la base de la aguja en el ventrículo izquierdo justo encima del sitio de inserción.
  10. Haga una incisión en la aurícula derecha y, a la primera señal de flujo sanguíneo, comience a perfundir al animal con 20 ml de 1x PBS a 8.11 ml / minuto.
  11. Después de que el PBS 1x haya perfundido el cuerpo, cambie al fijador apropiado para la aplicación posterior y perfunda el mouse con 20 ml de fijador.
    1. Para seccionamiento congelado e inmunotinción, perfundir animal con el fijador glioxal para la limpieza cerebral, perfusa animal con 4% pfa en 1x PBS (pH 7.4).
      NOTA: Los signos de una perfusión exitosa incluyen rigidez animal (ligera rigidez con glioxal, rigidez intensa con PFA) y falta de vasos sanguíneos visibles en todos los tejidos.
  12. Decapita al ratón y extrae el cerebro insertando tijeras en el tronco encefálico y cortando a lo largo de la sutura escamosa hasta la sutura frontomaxilar de cada lado. Luego corte la sutura fontonasal para quitar la tapa del cráneo, teniendo cuidado de no dañar el bulbo olfativo. A partir de ahí, gire el cráneo boca abajo y use fórceps curvos para eliminar el cerebro, asegurándose de cortar el nervio óptico.
  13. Coloque el cerebro perfundido en un cartucho de tejido y sumérjalo en el fijador utilizado para perfundir al animal durante la noche a 4 ° C.

4. Tratamiento cerebral, corte e inmunotinción

  1. Tratamiento cerebral y corte
    1. Retire los cartuchos cerebrales del fijador glioxal e incube en sacarosa al 15% en 1x PBS durante 2 días a 4 °C o hasta que los cerebros se hundan.
    2. Retire los cartuchos cerebrales de sacarosa al 15% e incube en sacarosa al 30% en 1x PBS durante 2 días a 4 °C o hasta que los cerebros se hundan.
      NOTA: Consulte la Tabla 1 para obtener más información.
    3. Elimine los cerebros del 30% de sacarosa en 1x PBS y separe el cerebro en varios "bloques" utilizando un bloqueo cerebral coronal o un bloqueo cerebral sagital.
    4. Incruste secciones cerebrales coronales o sagitales en el compuesto oct colocando secciones cerebrales en una mezcla de hielo seco y etanol (EtOH). Después de que la OCT se haya vuelto blanca y se haya vuelto sólida, retire de la mezcla de hielo seco y EtOH y guárdela envuelta en parafilm, dentro de una bolsa hermética a -20 °C.
    5. Retire los bloques congelados del congelador y colóquelos dentro de un criostato con una temperatura interna ajustada a -20 °C. Use OCT para unir el bloque a un mandril de metal para que el tejido esté sólidamente unido. Deje que ~ 5 minutos para que el tejido se congele en el mandril. Corte el tejido a 7 μm, colocando cada rebanada de tejido en un portaobjetos de vidrio cargado.
    6. Deje que los portaobjetos se horneen durante la noche a 37 ° C y luego colóquelos a -20 ° C hasta que se usen para la inmunotinción.
  2. Inmunotinción
    1. Se desliza caliente a temperatura ambiente (RT) y post-fijación con acetona helada durante 15 min.
    2. Lave las diapositivas durante 5 minutos en 1x tampón de enjuague (por ejemplo, IHC Select TBS Rinse Buffer), agitando a 60 rpm a RT entre cada paso.
    3. Permeabilizar para tinción de antígenos nucleares con 0,3% Tritón X-100 durante 10 min a RT. Permeabilizar para tinción de antígenos citoplasmáticos con 0,3% Tween-20 durante 10 min a RT.
    4. Realice la recuperación de antígenos mediante portaobjetos de microondas en 50-100 ml de 1 solución de recuperación de antígenos DAKO en baja durante 10 minutos, dos veces. Luego enjuague con tampón de enjuague durante 5 minutos en RT.
    5. Incubar diapositivas en 0.3% Typogen Black en 70% EtOH durante 20 min a RT y luego lavar con tampón de enjuague.
    6. Dibuje una barrera hidrofóbica alrededor de cada tejido sin permitir que los tejidos se sequen. Luego bloquee durante 20 minutos a 37 ° C con 1 gota de reactivo bloqueador de milipos por tejido. Luego agregue 100 μL de anticuerpo primario diluido en diluyente de anticuerpos a cada tejido e incube durante la noche a 4 ° C.
    7. Al día siguiente, incubar secciones en anticuerpos secundarios de Alexa Fluor durante 10 min a RT. Luego lave las diapositivas en el tampón de enjuague.
    8. Cubra las secciones cerebrales en 100 μL de anticuerpos anti-GFP 1:500 conjugados con AlexaFluor 488 para aumentar la señal endógena de GFP que marca las células trazadas e incubar durante la noche a 4 ° C.
    9. Al día siguiente, lavar con tampón de enjuague 2x, y luego lavar en agua corriente DI durante 5 min.
      NOTA: Asegúrese de lavar suavemente con agua DI, teniendo cuidado de evitar cualquier agua corriente en los toboganes que podrían eliminar las secciones cerebrales de los toboganes.
    10. Contratinción con 100 ng/mL 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) durante 5 min. Luego lavar en agua corriente DI durante 5 min.
    11. Agregue una gota de medio de montaje en la parte superior de cada sección de tejido y selle con un capa de 22 mm x 22 mm. Se recomiendan imágenes el día del montaje para garantizar una señal óptima.

5. Limpieza cerebral de iDISCO (adaptado de39)

  1. Fijación y seccionamiento
    1. Post-fijar cerebros en PFA al 4% durante la noche a 4 ° C y luego nuevamente durante 1 h en RT.
    2. Lave los cerebros en 1x PBS durante una hora, dos veces, en RT. Luego corte en secciones de 1 mm de espesor usando el bloqueo cerebral necesario y colóquelo en tubos de microcentrífuga de 5 ml que contengan 1x PBS.
  2. Pretratamiento con metanol (con metanol)
    NOTA: Debido a la posibilidad de que el metanol afecte la inmunotinción de ciertas proteínas, los autores desean señalar al lector a Renier et al. 2014 para un protocolo a una alternativa de protocolo iDISCO libre de metanol39. Consulte la Tabla 1 para obtener más información sobre las siguientes soluciones en esta sección.
    1. Lavar con 1x PBS durante 1 h dos veces (agitando) en RT.
    2. Lavar en metanol al 50% (en PBS) durante 1 h (agitación) en RT.
    3. Lavar en metanol al 80% durante 1 h (agitación) en RT.
    4. Lavar en 100% metanol durante 1 h dos veces (agitando) en RT.
    5. Muestras de lejía con peróxido de hidrógeno al 5% (H2O 2) en 20% de dimetilsulfóxido (DMSO)/metanol (1 volumen 30% H2O2/1 volumen DMSO/4 volumen metanol, helado) a 4 °C durante la noche (agitación).
    6. Después del blanqueo, lave las muestras en metanol durante 1 h dos veces (agitando) en RT.
    7. Lavar en 20% DMSO/metanol durante 1 h dos veces (agitando) en RT.
    8. Lavar en metanol al 80% durante 1 h (agitación) en RT.
    9. Lavar en metanol al 50% durante 1 h (agitación) en RT.
    10. Lavar en PBS durante 1 h dos veces (agitar) en RT.
    11. Lavar en PBS/0.2% Triton X-100 durante 1 h dos veces (agitando) en RT.
  3. Inmunotinción de cerebros despejados
    1. Incubar muestras en 1x PBS/0.2% Triton X-100/20% DMSO/0.3 M de glicina a 37 °C durante la noche en un agitador orbital.
    2. Bloqueo en 1x PBS/0.2% Triton X-100/10% DMSO/6% suero de cabra a 37 °C durante 3 días en un agitador orbitario.
    3. Lavar las muestras en 1x PBS/0.2% Tween-20/10 μg/mL de sal sódica de heparina de mucosa porcina durante 1 h dos veces a 37 °C, y luego incubar en 1x PBS/0.2% Tween-20/10 μg/mL de heparina/5% DMSO/3% de suero de cabra que contiene 1:500 concentración de conejo anti-GFP AlexaFluor 488 a 37 °C en un agitador orbital durante 2 días.
    4. Lave las muestras en 1x PBS/0.2% Tween-20 con 10 μg/ml de heparina durante 1 h a 37 °C en el agitador orbitario, tres veces, y luego una vez al día durante 2 días.
    5. Incubar muestras durante la noche en 10 mL de 50% v/v Tetrahidrofurano (THF)/H2O en un tubo cónico de 15 mL.
    6. Incubar muestras durante 1 h en 10 mL de 80% THF/H2O.
    7. Incubar muestras dos veces durante 1 h en 100% THF.
    8. Secar las muestras con una toallita estéril e incubar en diclorometano hasta que se hundan en el fondo del vial (aproximadamente 40 min). No incubar >60 min.
      NOTA: Asegúrese de manipular el diclorometano debajo de una campana extractora de humos.
    9. Incubar muestras en 18 mL de éter dibencil (DBE) hasta que estén claras (>2 h).
    10. Almacene muestras en DBE en RT hasta que estén listas para la imagen.
      NOTA: Para obtener los mejores resultados, es importante obtener muestras de imágenes lo antes posible después de que se complete el borrado.

6. Imágenes de diapositivas manchadas o cerebros despejados

  1. Para obtener imágenes de secciones cerebrales inmunoteñidas, analice las diapositivas a través de microscopía confocal, donde se puede confirmar la coexpresión de múltiples anticuerpos. Utilizamos un microscopio Leica Stellaris 5 con detectores híbridos HyD S, pero cualquier microscopio confocal de barrido puntual funcionará. Los objetivos incluyen HC PL APO 10x/0.40 CS2, HC PL APO 40x/1.30 OIL CS2 y HC PL APO 63x/1.40.
    1. Configure las líneas láser y los filtros de emisión correctos. Los láseres requeridos y las intensidades láser correspondientes están sujetos a las combinaciones de microscopio y fluoróforo que se utilizan.
      NOTA: Utilizamos una combinación de diodo de 405 nm y láseres de luz blanca para ajustar los espectros de excitación y emisión para cada fluoróforo, o grupos de fluoróforos, que se utilizan para reducir y eliminar la diafonía. También se pueden lograr resultados similares utilizando combinaciones tradicionales de láser / filtro, pero preste mucha atención al sangrado del canal. El sangrado se puede identificar activando una sola línea láser junto con cada una de las combinaciones de filtros de emisión deseadas para ver qué canales se ven afectados por cada láser específico. Por ejemplo, si el láser de diodo de 405 nm está produciendo fluorescencia visible en el filtro de emisión GFP, se produce un sangrado. Asegúrese de que se tomen imágenes secuencialmente de múltiples canales fotograma a fotograma para reducir en gran medida cualquier sangrado que se produzca.
    2. Para los cerebros Tet-On co-teñidos con un informador mTmG, seleccione DAPI (ex. 405 nm, em. 450 nm), GFP (ex. 488 nm, em. 509 nm), tdTomato (ex. 555 nm, em. 582 nm) y el fluoróforo rojo lejano correspondiente para que coincida con el fluoróforo utilizado en el anticuerpo secundario. Recomendamos Alexa Fluor 647 (por ejemplo, 651 nm, em. 667 nm).
    3. Establezca primero los ajustes con un cerebro de control Cre teñido tanto con GFP como con el secundario fluorescente. Estas rebanadas cerebrales controlarán la fluorescencia de fondo de los anticuerpos fluorescentes y no mostrarán ninguna señal real de GFP.
    4. Analice cada sección del cerebro de arriba a abajo, de izquierda a derecha, para verificar que no se haya perdido ninguna señal en el análisis. Si se toman imágenes de la misma sección cerebral con varios aumentos, se recomienda que primero se utilicen los aumentos más bajos, ya que el aumento más alto blanqueará más rápidamente la señal mTomato.
  2. Para obtener imágenes de cerebros despejados, use un microscopio confocal invertido con una etapa automatizada y una función de mosaico automatizada. Utilizamos el microscopio Leica Stellaris 5. Debido a que las muestras son tan gruesas (>500 μm), se requieren distancias de trabajo más grandes, lo que limita la ampliación que se puede lograr de manera efectiva. Utilizamos el objetivo HC PL APO 10x/0.40 CS2 para todas las imágenes cerebrales despejadas.
    1. Comience colocando una sección cerebral despejada plana contra un plato con fondo de vidrio y sumérjase en éter dibencil.
      NOTA: El éter de dibencil es corrosivo para la mayoría de las lentes objetivas y la mayoría de los plásticos. Por esta razón, cualquier plástico interior en el plato con fondo de vidrio debe recubrirse con elastómero de silicona de secado rápido.
    2. Configure las líneas láser y los filtros de emisión correctos. Para los cerebros Tet-On co-teñidos con un reportero mTmG, seleccione DAPI, GFP, tdTomato y el fluoróforo rojo lejano correspondiente para que coincida con el fluoróforo utilizado en el anticuerpo secundario. Establezca la resolución deseada, recomendamos al menos 1024 x 1024. Establezca el agujero de alfiler en 1 UA.
    3. Establezca la intensidad del láser y la ganancia del detector primero con un cerebro de control Cre teñido con GFP y el fluorescente secundario. Estas rebanadas cerebrales controlarán la fluorescencia de fondo de los anticuerpos fluorescentes y no mostrarán ninguna señal real de GFP.
    4. Una vez que se hayan optimizado las intensidades del láser y la ganancia del detector, mapee el cerebro para obtener imágenes. Comience por localizar todo el perímetro de la sección cerebral para establecer los ejes X e Y de la adquisición de la imagen. A continuación, identifique el eje Z estableciendo el punto focal aproximadamente en la profundidad central del tejido y use controles de posicionamiento Z para localizar el punto "más alto" del tejido (valor Z más positivo). Escanee varias regiones del tejido aumentando la altura máxima del eje Z según sea necesario.
      1. Repita para el punto "más bajo" (valor Z más negativo) requerido para obtener todo el grosor del tejido. El Stellaris 5 tiene un límite de ± 250 mmm del punto focal. Esto limita las secciones ópticas a 500 μm de espesor en el eje Z. El área 3D de la sección del cerebro ahora se conoce.
    5. Establezca el tamaño del paso Z en 6 μm y comience a adquirir la imagen. El tiempo de adquisición depende de varios factores y puede variar de horas a días dependiendo de los parámetros deseados. Para disminuir el tiempo de adquisición de imágenes, intente disminuir las resoluciones, aumentar la velocidad de escaneo láser o aumentar el tamaño de los pasos.
    6. Una vez que se haya capturado la imagen en mosaico de toda la sección cerebral despejada, analice según lo desee.

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Representative Results

Si bien la señal fluorescente resultante de un sistema Tet-On con un reportero fluorescente variará dependiendo del promotor de interés y los fluoróforos utilizados, describiremos cómo se analizaron los hallazgos con animales mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG. El análisis de cerebros adultos después de una persecución de pulsos dio como resultado células que expresan GFP de membrana en varios nichos anatómicos. Se debe tener en cuenta la diferencia en la intensidad fluorescente entre varios tipos de células. Una variable con respecto a la intensidad fluorescente es el tamaño de la membrana celular. Por ejemplo, las células epiteliales coroideas (CPIC) en el plexo coroideo tienen una membrana celular gruesa y una fuerte señal fluorescente que se distinguió fácilmente de las células circundantes (Figura 4A, B). Sin embargo, otros tipos de células más pequeñas y actualmente no identificadas en el estroma del plexo coroideo tenían una señal GFP más débil (Figura 4C). En el cerebelo, las células gliales de Bergmann expresaron niveles más altos de mGFP que las células de la canasta, e incluso existió variación en la expresión de mGFP entre las células de la canasta individuales (Figura 4D). Los axones de las neuronas sensoriales olfativas dentro de la capa glomerular del bulbo olfatorio también expresaron altos niveles de mGFP (Figura 4A, E). Para garantizar que se identifiquen todas las células mGFP +, es importante identificar células GFP + brillantes y tenues en todo el cerebro de los animales mTmG. En animales mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG, observamos una baja expresión de mGFP de fondo en todas las regiones del cerebro, incluida la corteza cerebral (Figura 4A). Curiosamente, el cerebelo y el tronco encefálico mostraron una expresión de mGFP de fondo más baja de esta manera (Figura 4A).

Durante el análisis del tejido cerebral después de un rastro de linaje, habrá diferencias en los patrones de expresión de mGFP y mTomato en las regiones del cerebro y los tipos de células. Los axones de las neuronas sensoriales olfativas que llenan la capa glomerular del bulbo olfatorio expresaron altos niveles de tomate de membrana en comparación con la mayoría de las otras regiones del cerebro, incluso cuando las mismas neuronas son mGFP +, lo que indica que algunas células parecían perder la señal de mTomato más lentamente (Figura 4D). Por el contrario, en el plexo coroideo, las células mGFP+ expresaron mTomato bajo (Figura 4B,C). En la mayoría de las otras regiones del cerebro, la señal del tomate se distribuye uniformemente entre los tipos de células, siendo las células endoteliales algunas de las únicas células cuya señal fluorescente era lo suficientemente brillante como para destacarse del fondo fluorescente rojo (Figura 4B). La activación de la expresión de mGFP y la escisión de mTomato del genoma durante la recombinación resulta en una pérdida de la expresión de mTomato, pero los fluoróforos de mTomato que se expresan en la membrana se retienen hasta que se degradan. Por esta razón, las células mGFP + a menudo expresarán una señal variable de mTomato, que dependerá de la actualidad de la recombinación, el tipo de célula y el tamaño de la membrana celular. Por lo tanto, es importante analizar las células en función de la expresión de mGFP y no excluirlas del análisis si expresan tanto mGFP como mTomato.

Los reporteros alternativos también se pueden utilizar junto con el sistema Tet-On. La recombinación de Cre puede actuar para inducir la expresión de GFP o RFP en células que normalmente no expresarán ninguna etiqueta fluorescente en animales Rosa-GFP o Rosa-RFP. Aquí, el análisis de GFP o RFP indicará la expresión del promotor de interés, y no se eliminará ninguna señal de fluoróforo, como con los animales mTmG. Los reporteros de fluoróforo único permiten la inmunotinción con combinaciones de anticuerpos más fluorescentes, ya que el tomate de membrana en animales mTmG evita la tinción en la longitud de onda roja.

Figure 1
Figura 1. Generación de una línea de ratón Tet-On. (A) Esquema del esquema de reproducción para la creación de mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG ratones a partir de líneas de ratones individuales. (B) Esquema del sistema Tet-On en la línea de ratón mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG. (C-D) Imágenes representativas de clips para los oídos fotografiados con el canal FITC de un microscopio epifluorescente de ratones no germinales (C) y de línea germinal (D) mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2. Diseños experimentales con trazabilidad de linaje de ratones Tet-On. Ilustraciones de experimentos posibles con ratones Tet-On desde la proliferación basal, migración y diferenciación (1) hasta tratamientos durante el pulso dox sin persecución para la regeneración o el reequilibrio (2), intervenciones durante el pulso con la oportunidad de visualizar efectos a largo plazo (3). Un pulso corto de 2 días sin persecución posterior proporcionará información sobre un estado casi basal de las células TERT +, ya que estas células tendrán poco tiempo para activarse, proliferar, migrar o diferenciarse (4). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3. Limpieza cerebral de los cerebros de ratón mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG. (A) Seccionamiento sagital de secciones cerebrales de 1 mm después de la fijación. (B) Las secciones cerebrales individuales se colocan en tubos de 5 ml para la limpieza cerebral iDISCO39. (C) Los cerebros despejados se colocan en platos con fondo de vidrio y se sumergen en DBE para la coincidencia del índice de refracción durante la adquisición de imágenes. (D) Capture toda el área del cerebro como una serie de pilas Z que se colocarán juntas para formar una imagen 3D completa del cerebro. Esto puede ser la intensidad máxima Z proyectada para crear una imagen 2D a partir del conjunto de datos 3D. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4. Rastreo de linaje de cerebros de ratones adultos mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG después de un pulso de 3 semanas y 11 días de persecución de doxiciclina. (A) Sección cerebral despejada de mTert-rtTA adulto::oTet-Cre::Rosa-mTmG ratón con áreas específicas de señal mGFP mostradas con recuadros (N = 3 ratones machos). (B-C) Imagen representativa de mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG plexo coroideo que identifica CPPC mGFP+ (B) y tipos de células mGFP+ más pequeñas y débiles (C; N = 4 machos, N = 6 hembras). (D) Imagen representativa de mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG cerebelosa de Bergmann glia (brillante) y células cesta en la capa molecular del cerebelo (dim; N = 4 machos, N = 6 hembras). (E) Imagen representativa de la capa glomerular olfativa de los cerebros mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG. Las líneas punteadas indican compartimentos glomerulares (N = 4 machos, N = 6 hembras). Las barras de escala son de 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Cuadro complementario 1. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Cuadro complementario 2. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

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Discussion

Se describe un método para la creación, utilización y análisis de una línea de ratón de rastreo de linaje transgénico triple que marca las células madre dentro del cerebro del ratón adulto in vivo. Cuando se combina con la inmunotinción o la limpieza cerebral, se puede lograr la identificación y caracterización de células fluorescentes trazadas en todo el cerebro. Esta técnica ofrece la capacidad de comprender el potencial plástico / regenerativo / remodelante de las células madre marcadas a medida que se activan, migran, diferencian o proliferan. Si bien los datos anteriores obtenidos a través de la retención de etiquetas con timidina-H3 y BrdU concluyeron que el V-SVZ, el bulbo olfatorio y la zona subgranular del giro dentado eran las únicas regiones cerebrales neurogénicas en mamíferos adultos 2,3,4,5,6,7,8,43, ahora se entiende que la neurogénesis adulta también ocurre en la corteza44, hipotálamo45,46 y estriado 47,48,49, así como potencialmente otros nichos novedosos que no han sido bien estudiados. La gliogénesis adulta, el proceso por el cual las células precursoras gliales crean astrocitos y oligodendrocitos recién nacidos, ocurre en todo el cerebro también37, y se plantea la hipótesis de que la glía y las neuronas derivan de la misma célula madre multipotente. Por estas razones, los estudios de rastreo de linaje han sido integrales para comprender el papel de varios tipos de células madre que contribuyen a reponer y regenerar las neuronas y la glía en el cerebro de los mamíferos adultos (revisado en50).

Para los estudios en plasticidad cerebral adulta, la edad óptima es de 12 semanas de edad, cuando el cerebro murino ha completado el desarrollo51. Al planificar la longitud del pulso de doxiciclina y la persecución posterior, es crucial comprender el proceso de interés, de modo que el tiempo de persecución del pulso sea lo suficientemente largo como para permitir que ocurran los procesos de interés. Por ejemplo, la creación de neuronas recién nacidas en el bulbo olfatorio a partir de células madre neurales adultas (ANSC) en la V-SVZ es de aproximadamente 4 semanas, según lo determinado por estudios previos de rastreo de linaje52. Por lo tanto, un estudio de persecución de pulsos que etiquete los ANSC en el V-SVZ debe estar dentro de ese marco de tiempo para permitir que los ANSC en el V-SVZ se dividan, para que estos ANSC se diferencien en tipos de células intermedias y para que estos tipos de células intermedias migren al bulbo olfatorio y se diferencien en neuronas nacidas en adultos. La duración de la persecución determinará la cantidad de tiempo que las células marcadas y su progenie deben continuar su migración y diferenciación, aunque estos procesos también ocurrirán durante el pulso. En conjunto, es importante comprender los procesos involucrados, ya que la línea de tiempo de cada experimento de rastreo de linaje debe permitir que ocurran los procesos adecuados.

Si bien este manuscrito detalla el sistema Tet-On, existen otros transgenes de rastreo de linaje que pueden ser utilizados. El transgén CreERT2 permite la expresión de una Cre recombinasa que solo es activa en presencia de tamoxifeno o 4-OHT, un derivado del tamoxifeno. Cuando este Cre está regulado por un promotor de interés, la administración de 4-OHT o tamoxifeno solo producirá recombinación de Cre en células que expresan ese promotor. Cuando se combina con un gen reportero como Rosa-LSL-GFP o Rosa-mTmG, la recombinación de Cre-lox marcará indeleblemente las células que expresan Cre durante la administración de tamoxifeno. Una desventaja de este sistema es el uso de tamoxifeno, que tiene efectos adversos duraderos sobre la neurogénesis en cerebros prenatales y adultos17. Por esta razón, los estudios de rastreo de linaje con líneas CreERT2 deberán considerar las advertencias involucradas.

Los estudios de rastreo de linaje en el cerebro adulto a menudo se realizan con marcadores de células madre como Nestin o marcadores de células precursoras gliales, incluyendo NG253,54. Si bien los datos resultantes indican la renovación y diferenciación de estas células en tipos de células maduras recién nacidas, la expresión de estos marcadores por varios otros tipos de células en el cerebro adulto puede ser confusa. Por ejemplo, la nestina, una proteína de filamento intermedio involucrada en la mitosis55, también es expresada por las neuronas maduras56 y los tipos de células meníngeas57. Otros marcadores de células madre incluyen la proteína ácida fibrilar glial (GFAP)58,59 y el transportador de aspartato de glutamato 1 (GLAST)60, que también son expresados por astrocitos en todo el cerebro adulto61. Por esta razón, se necesitan estudios de rastreo de linaje con marcadores adicionales. A medida que aprendemos más sobre el amplio impacto de la plasticidad adulta en el cerebro, la caracterización y el análisis de las células que desempeñan un papel en estos procesos y su progenie siguen siendo de vital importancia para nuestra comprensión de las vías neurogénicas y gliogénicas involucradas en la salud neurodegenerativa y más.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Diana Carlone (Boston Children's Hospital, Harvard Medical School) y al Dr. Matthew Lynes (Joslin Diabetes Center; Maine Medical Center Research Institute) para orientación utilizando animales mTert-rtTA.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibody diluent Agilent S080983-2
Antigen Retrieval Solution Agilent S2367
anti-GFP antibody Invitrogen A2311 Use at 1:500-1:000
Acetone Fisher Scientific A18-4
B6.Cg-Tg(tet0-cre)1Jaw/J The Jackson Laboratory JAX:006234
B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J The Jackson Laboratory JAX:007676
Blocking Solution (IHC) Millipore Sigma 20773
Blunt needle BSTEAN X0012SYHIV
Coronal brain block Braintree BS-2000C
Cover slip Corning 2850-22
Cryostat Leica CM1900
DAPI Sigma-Aldrich D564
Dibenzyl ether Millipore Sigma 33630
Dichloromethane Sigma-Aldrich 270997
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich D8418
Donkey Serum Sigma-Aldrich D9663
Doxycycline Hyclate Sigma-Aldrich D9891
Glycine Bio-Rad 161-0718
Heparin Sodium Salt from Porcine Mucosa Sigma-Aldrich H3393
Histochoice Molecular Biology Tissue Fixative Amresco H120 This product has since been discontinued, but can be replaced with Glyo-Fixx (Thermo Scientific, 6764265)
Hydrogen Peroxide Solution Sigma-Aldrich 516813
IHC Select TBS Rinse Buffer Millipore Sigma 20845
Ketamine Westward 0143-95095-10 This product requires a DEA license for storage and use.
Methanol Fisher Scientific A452-4
Microscope Slides Fisherbrand 12-550-15
Milipore Block Millipore 20773
Mounting medium Millipore Sigma 5013
Optimal Cutting Temperature Solution Sakura 4583
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
PBS Solution (10X) Teknova P0496
Sagittal brain block Braintree RBM-2000S
Saline Braun S8004-5264
Sucrose Sigma-Aldrich S7903
Sudan (Typogen) Black Millipore Sigma 199664
Tetrahydrofuran Sigma-Aldrich 186562
Tissue cartridge Simport M512
Triton X-100 Bio-Rad 1610407
Tween-20 Millipore Sigma 655205
Xylazine AnaSed sc-362950Rx

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Neurociencia Número 183
Rastreo de linaje de células madre inducibles marcadas fluorescentemente en el cerebro de ratón adulto
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Jensen, G. S., Willows, J. W.,… More

Jensen, G. S., Willows, J. W., Breault, D. T., Townsend, K. L. Lineage Tracing of Inducible Fluorescently-Labeled Stem Cells in the Adult Mouse Brain. J. Vis. Exp. (183), e63998, doi:10.3791/63998 (2022).

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