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Neuroscience

Entraînement en résistance ajusté en fonction de la posologie chez les souris présentant un risque réduit de lésions musculaires

Published: August 31, 2022 doi: 10.3791/64000
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Physical Therapy Program, Department of Health Care Sciences, Eugene Applebaum College of Pharmacy and Health Sciences, Wayne State University, 2Department of Pharmacology, University of Nevada, Reno School of Medicine

Summary

Le présent protocole décrit une technique unique appelée entraînement en résistance ajustée à la dose (DART), qui peut être incorporée dans des études de réadaptation de précision effectuées sur de petits animaux, tels que des souris.

Abstract

L’entraînement progressif en résistance (PRT), qui consiste à effectuer des contractions musculaires contre des charges externes progressivement plus importantes, peut augmenter la masse musculaire et la force chez les individus en bonne santé et dans les populations de patients. Il existe un besoin d’outils de réadaptation de précision pour tester l’innocuité et l’efficacité de la PRT afin de maintenir et/ou de restaurer la masse musculaire et la force dans les études précliniques sur des modèles animaux de petite et de grande taille. La méthodologie et le dispositif PRT décrits dans cet article peuvent être utilisés pour effectuer un entraînement de résistance ajusté à la posologie (DART). Le dispositif DART peut être utilisé comme dynamomètre autonome pour évaluer objectivement le couple contractile concentrique généré par les fléchisseurs dorsoles de la cheville chez la souris ou peut être ajouté à un système de dynamométrie isocinétique préexistant. Le dispositif DART peut être fabriqué avec une imprimante 3D standard basée sur les instructions et les fichiers d’impression 3D open source fournis dans ce travail. L’article décrit également le flux de travail d’une étude visant à comparer les lésions musculaires induites par la contraction causées par un seul épisode d’EICC aux lésions musculaires causées par un épisode comparable de contractions isométriques (OMA) dans un modèle murin de dystrophie musculaire de type 2B / R2 (souris BLAJ). Les données de huit souris BLAJ (quatre animaux pour chaque condition) suggèrent que moins de 10% du muscle antérieur du tibial (TA) a été endommagé par un seul épisode de DART ou d’ISOM, le DART étant moins dommageable que l’ISOM.

Introduction

L’exercice confère de nombreux avantages pour la santé des muscles squelettiques (examinés dans Vina et al.1). Plus précisément, l’entraînement progressif en résistance (PRT), qui consiste à effectuer des contractions musculaires contre des charges externes progressivement plus importantes (p. ex. haltères, haltères, circuits câble-poulie-poids), est connu pour aider à augmenter la masse musculaire et la force chez les personnes en bonne santé et les populations de patients (revue dans des publications antérieures 2,3 ). La PRT est basée sur le principe de surcharge, selon lequel, lorsque le muscle se contracte contre des charges externes de plus en plus importantes, il s’adapte en augmentant sa section transversale physiologique ainsi que sa capacité de production de force4. Les modèles existants de PRT chez les rongeurs comprennent l’escalade d’échelle avec résistance appliquée à la queue, la co-contraction des muscles agonistes contre la résistance des antagonistes, la course avec un harnais lesté, un exercice accroupi provoqué par un choc électrique et la résistance à la marche des roues 5,6,7,8,9,10 (revue dans des publications antérieures 11,12 ). Cependant, il n’existe actuellement aucun outil de recherche permettant d’effectuer une PRT ciblée avec précision et ajustée en fonction de la posologie chez la souris qui ressemble étroitement aux méthodes et dispositifs PRT utilisés dans la recherche et la pratique cliniques humaines12,13. Cela limite la capacité des chercheurs à étudier l’innocuité et l’efficacité de la PRT à dose précise dans les études fondamentales et précliniques chez la souris.

Pour surmonter cet obstacle, une méthodologie et un dispositif PRT sont développés dans cette étude sur la base des conceptions de circuits câble-poulie utilisées dans les équipements d’entraînement en résistance dans les gymnases modernes14,15,16. Cette méthode de PRT est appelée entraînement de résistance ajusté à la dose (DART), et le dispositif est appelé dispositif DART. En plus de sa fonctionnalité en tant qu’outil d’entraînement de réadaptation de précision, le dispositif DART peut également être utilisé comme instrument autonome pour évaluer objectivement le couple contractile concentrique maximal qui peut être généré par le muscle tibial antérieur (TA) chez une souris, de la même manière que le maximum d’une répétition (1RM, la charge maximale qui peut être soulevée / déplacée / pressée / accroupie avec succès une seule fois tout en maintenant une bonne forme) est évaluée chez l’homme17, 18. Le dispositif DART peut également être couplé à un dynamomètre isocinétique fabriqué sur mesure ou commercial pour mesurer la force tétanique isométrique maximale produite par le muscle TA chez une souris (comparable à la contraction volontaire maximale [MVC] chez l’homme), puis effectuer une PRT ajustée à la dose avec une résistance basée sur la force tétanique maximale (p. ex., 50 % de la force de crête).

Cet article décrit la construction du dispositif DART et explique comment il peut être couplé à un dynamomètre sur mesure, qui a été décrit dans les publications antérieures 19,20,21,22, pour évaluer le couple contractile et effectuer l’EICC. L’étude décrit également comment le dispositif DART a été utilisé pour comparer les dommages musculaires induits par l’exercice causés par un seul épisode de DART (4 séries de 10 contractions concentriquement biaisées avec 50% 1RM) aux dommages causés par un épisode comparable de contractions isométriques (4 séries de 10 contractions isométriques) dans un modèle murin de dystrophie musculaire de type 2B (LGMD2B, ou LGMDR2)23,24. Le modèle murin étudié manque d’une protéine appelée dysferline, qui joue un rôle important dans la protection du muscle squelettique contre les lésions musculaires d’apparition retardée à la suite de contractions excentriques nuisibles 22,25,26,27,28,29,30 . Il a également été démontré chez des souris mâles déficientes en dysferline que l’exercice forcé concentré n’est pas aussi dommageable que l’exercice forcé excentrique et que l’exposition antérieure à un entraînement concentriquement biaisé offre une protection contre les blessures résultant d’un épisode ultérieur de contractions excentriquementbiaisées 22. Étant donné que la présente étude a été menée pour tester la faisabilité de la méthodologie et du dispositif DART actuels pour effectuer un entraînement de résistance à dosage ajusté et biaisé concentriquement, des souris mâles déficientes en dysferline ont été choisies pour l’étude afin de comparer les nouvelles données du dispositif DART avec les données précédentes. Dans les études futures, des souris BLAJ femelles seront incluses pour étudier l’effet du sexe en tant que variable biologique par rapport à la réponse à l’EICC. Les souris âgées de ~ 1,5 an ont été étudiées car elles présentent déjà des changements dystrophiques dans de nombreux groupes musculaires et, par conséquent, modélisent l’état physiopathologique dans lequel les muscles pourraient être chez les patients qui ont déjà une faiblesse musculaire et une atrophie musculaire et qui recherchent des soins de réadaptation pour maintenir la masse musculaire et la force26.

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Protocol

Les expériences décrites dans cet article ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de la Wayne State University, Detroit, Michigan, États-Unis, conformément au Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (1996, publié par National Academy Press, 2101 Constitution Ave. NW, Washington, DC 20055, États-Unis). B6. Des souris A-Dysfprmd/GeneJ (alias souris BLAJ, mâles, ~1,5 ans) qui modélisent LGMD2B/R2 ont été utilisées pour la présente étude. Les souris ont été obtenues d’une source commerciale (voir le tableau des matériaux).

1. Plan d’étude

  1. Choisissez la ou les souches de souris pertinentes pour la ou les questions de recherche — p. ex., étude B6. Souris A-Dysfprmd / GeneJ (souris BLAJ) si vous essayez de répondre à la question de savoir si oui ou non DART concentriquement biaisé induit des lésions musculaires généralisées chez les souris qui modélisent LGMD2B / R2.
  2. Assigner les souris aux groupes d’étude en fonction du plan d’étude - p. ex., assigner au hasard les souris à un groupe d’entraînement en résistance ajustée à la dose (EICC) ou à un groupe d’entraînement isométrique (ISOM), et tenter d’équilibrer les groupes le mieux possible en fonction de l’appariement par portée et/ou âge (p. ex., tableau 1).

2. Fabrication de l’appareil DART

  1. Concevez les composants de l’appareil DART à l’aide d’un logiciel d’assistance par ordinateur (CAO) approprié (Figure 1) en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Boîtier de conception pour roulement de roue à faible frottement (voir le tableau des matériaux, basé sur la conception du roulement de bloc d’oreiller) avec rapporteur intégré (à utiliser comme goniomètre pour mesurer les angles des articulations de la cheville).
    2. Concevez une tour pour le palier de roue et un rapporteur.
    3. Concevez une plaque de pied pour positionner le pied de la souris. Concevez un essieu pour relier le repose-pieds au roulement de roue.
  2. Fabriquez les composants du dispositif DART avec une imprimante 3D appropriée (Figure 1).
    1. Enregistrez les conceptions créées avec un logiciel de CAO en stéréolithographie (. STL) fichiers.
      REMARQUE : le fichier . Les fichiers STL (Supplementary Coding Files 1-4) peuvent être utilisés et modifiés en créditant l’auteur correspondant de cet article et en citant cet article.
    2. Ouvrez le fichier . STL avec un logiciel de tranchage approprié (voir le tableau des matériaux).
      REMARQUE: Le logiciel de découpage convertit un modèle 3D virtuel en une pile de tranches, qui peuvent être imprimées séquentiellement par une imprimante 3D pour générer un objet 3D.
    3. Avec un logiciel de tranchage, générez la fabrication assistée par ordinateur G-CODE (CAM, . GCODE), qui sont spécifiques à l’imprimante 3D et au filament qui sera utilisé.
    4. Suivez le manuel de l’imprimante 3D (voir Tableau des matériaux) pour imprimer les composants du périphérique DART avec . GCODE.
    5. Choisissez un filament d’imprimante 3D approprié, tel que l’acide polylactique (PLA) 1,75 mm 1 kg/bobine, Gris (voir Tableau des matériaux).
  3. Assemblez le dispositif DART en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Insérez un roulement de roue 608 à faible frottement (diamètre de l’alésage de 8 mm, diamètre extérieur de 22 mm, tel qu’un roulement avec billes en céramique en nitrure de silicium logées en acier inoxydable 420, voir le tableau des matériaux) dans le carter de roulement de roue (Figure 1).
    2. Insérez l’essieu dans l’alésage du roulement de roue (Figure 1).
    3. Collez le repose-pieds sur l’essieu avec de la colle (voir le tableau des matériaux) qui convient pour coller le PLA (Figure 1).
    4. Placez le palier de roulement de roue au-dessus de la tour de palier de roue et fixez l’ensemble à une base en acrylique avec des fixations à vis (Figure 1).
      REMARQUE: Il n’y a pas d’exigences de taille spécifiques pour la base en acrylique - elle doit juste être assez grande pour accueillir l’animal et l’appareil DART et assez petite pour tenir sur une surface de travail. La base acrylique utilisée pour la présente étude mesure environ 30 cm de large, 45 cm de long et 0,5 cm d’épaisseur.

3. Préparation des souris pour DART ou ISOM

  1. Placer chaque souris sous anesthésie générale avec de l’isoflurane inhalé administré par un système d’anesthésie approprié (voir le tableau des matériaux, 2% -5% pour l’induction; 1%-4% pour l’entretien; à effet) pour réduire le stress et la douleur.
    1. Induire une anesthésie dans la chambre d’induction du système d’anesthésie (2% -5% isoflurane).
    2. Transférer la souris dans un cône nasal pour maintenir l’anesthésie tout en effectuant des procédures sur l’animal (1% -4% isoflurane). Confirmer l’efficacité de l’anesthésie en fonction de l’absence de retrait des membres postérieurs à une pincée d’orteil d’une paire de pincettes.
    3. Fournir un soutien thermique – p. ex., avec un coussin chauffant en gel isotherme et une lampe chauffante placée à ~1 m au-dessus de la souris. Vérifiez avec un thermomètre que la température sur et autour de la base acrylique est maintenue à ~38 °C, afin que la souris ne surchauffe pas.
  2. Préparez la peau sur le muscle antérieur du tibial gauche (TA) de la souris et sur tous les aspects antérieurs et latéraux du membre postérieur gauche pour l’DART ou l’ISOM.
    1. Enlevez la fourrure de la souris avec une crème dépilatoire (crème dépilatoire, voir Tableau des matières). Appliquez la crème dépilatoire et laissez-la agir pendant ~2 min.
    2. Nettoyez la jambe avec des lingettes imbibées d’eau distillée pour enlever la fourrure et toute la crème résiduelle de la peau. Les crèmes dépilatoires peuvent irriter et / ou endommager la peau si elles sont laissées sur la peau de la souris pendant de longues périodes et, par conséquent, éliminer complètement.
    3. Après l’enlèvement de la fourrure, désinfectez la peau avec une méthode de lavage approuvée, comme avec une solution de gommage povidone iodée et 70% d’éthanol.
  3. Appliquez un protecteur (p. ex. vaseline) sur les yeux et la peau épilée avec un coton-tige propre pour protéger les yeux et la peau épilée du dessèchement.
  4. Placez une épingle stabilisatrice à travers la métaphyse tibiale.
    1. Appliquez 5% de crème de lidocaïne sur le tibia pour engourdir la zone.
    2. Passez une aiguille hypodermique stérile de 26 G, d’un demi-pouce, dans la partie la plus large de la partie proximale de l’os tibial (c.-à-d. la métaphyse tibiale, également connue sous le nom de tête tibiale). Une fois la goupille stabilisatrice fixée, retirez la partie en plastique de l’aiguille hypodermique en tenant l’aiguille avec un hémostatique stérile et en pliant la partie en plastique jusqu’à ce qu’elle se détache.
  5. Positionnez la souris pour la formation DART ou OMI.
    1. Posez la souris en décubitus dorsal. Assurez-vous que la souris est toujours bien connectée au cône nasal pour maintenir l’anesthésie.
    2. À l’aide d’une paire de pinces à épiler stériles, introduisez la goupille tibiale dans une pince crocodile en métal (voir le tableau des matériaux), de sorte que les extrémités de la goupille tibiale soient maintenues par la pince crocoditaire. Déplacez le bras réglable de la pince crocodile pour vous assurer que le pied de la souris est placé sur la plaque de pied du dispositif DART.
    3. Attachez le pied de souris sur la plaque de pied de l’appareil DART avec du ruban adhésif de laboratoire.
    4. Placez le pied de la souris à un angle de 90° par rapport au long axe de l’os tibial de la souris. Si elle est placée correctement, la plaque de pied sera perpendiculaire à la base en acrylique (c.-à-d. le plancher ou ce qui est considéré comme le plan horizontal).
    5. Posez la plaque plantaire sur la butée de flexion plantaire créée en plaçant une aiguille hypodermique de 18 G, 1,5 po de long à travers les trous prépercés du rapporteur du dispositif DART (Figure 1).

4. Formation DART ou ISOM

  1. Optimisez le placement de l’électrode en plaçant une électrode bipolaire, transcutanée et neuromusculaire de stimulation électrique (NMES, voir le tableau des matériaux) sur la face inférolatérale de l’articulation du genou de la souris (Figure 1B).
    1. Avec des impulsions uniques (1 Hz) provenant d’un stimulateur électrique de laboratoire (voir le tableau des matériaux), stimuler la branche fibulaire du nerf sciatique, qui fournit une innervation motrice aux muscles fléchisseurs de la cheville (Figure 1B).
    2. Étant donné que le muscle tibial antérieur (TA) représente plus de 90% de la force contractile totale produite par les muscles fléchisseurs dorso-dorsaux de la cheville31, observez le ventre et le tendon du muscle TA pour détecter des signes de contractions de contraction provoquées électriquement.
      REMARQUE: Une légère proéminence osseuse qui correspond à l’os du péroné peut aider à placer l’électrode si le testeur peut le sentir à travers l’électrode. Cela nécessite un peu de pratique et d’apprentissage de la part du testeur pour avoir une idée du placement optimal des électrodes.
    3. Déplacez la butée de flexion plantaire vers le trou du rapporteur qui correspond à 20° de flexion plantaire de la position où le pied est orthogonal (90°) au tibia — c’est la position à laquelle le couple contractile maximal du muscle TA est généralement observé sur la base des rapports précédents21. Cela peut devoir être personnalisé par l’utilisateur en fonction de facteurs spécifiques aux souris étudiées.
    4. Visualisez le couple de contraction à l’aide d’un banc à souris en reliant la plaque plantaire du dispositif DART à la plaque de pied du dynamomètre — p. ex., reliez la plaque de pied du dispositif DART à une plaque de pied robotisée du banc dynamométrique de cheville construite sur mesure avec une suture en soie non élastique (semblable à la figure 1A) et attachez la suture à la plaque de pied du dynamomètre (voir le tableau des matériaux).
      REMARQUE: La plaque de pied a des trous intégrés dans la conception d’impression 3D. En plaçant la suture à travers la paire de trous qui se trouvent dans la deuxième rangée à partir de l’extrémité du pied de la plaque plantaire, la suture se trouve à ~20 mm de l’axe dorsiflexion/flexion plantaire (Figure 1A, B). Le banc dynamométrique a été décrit dans les rapports précédents 19,20,21,22.
  2. Optimisez la tension de sortie du stimulateur NMES.
    1. Après avoir optimisé le placement de l’électrode, optimisez l’amplitude de la tension de sortie du stimulateur électrique - cela est nécessaire pour confiner NMES au nerf fibulaire commun et au muscle TA et réduire le risque de provoquer des co-contractions chez les plantarflexors.
      REMARQUE: Si des co-contractions sont obtenues, elles peuvent être visualisées à travers le couple de sortie du dynamomètre et également être vues dans la flexion plantaire des orteils.
  3. Réglez le stimulateur NMES pour l’entraînement DART ou OMI.
    REMARQUE: Les paramètres suivants peuvent devoir être personnalisés par l’utilisateur en fonction de facteurs spécifiques aux souris étudiées et au but des études.
    1. Réglez le stimulateur pour produire des trains d’impulsions répétés de fréquence de 125 Hz - cette fréquence produit des contractions tétaniques fusionnées maximales sans débordement de NMES dans d’autres groupes musculaires chez les souris BLAJ21. Pour ce faire, réglez les cadrans en fonction de la fréquence d’impulsion (125 Hz), de la durée du train (500 ms) et des trains par seconde (1 train/s) et en activant l’interrupteur à bascule pour les trains d’impulsions répétitifs.
    2. Réglez le stimulateur pour produire des trains d’impulsions d’une durée de 500 ms entrecoupés de 500 ms de repos entre les trains d’impulsions.
    3. Déplacer la butée de flexion plantaire vers le trou du rapporteur qui correspond à 160° par rapport à l’axe long du tibia (flexion plantaire de 70° du pied orthogonale au tibia). C’est la position dans laquelle le pied de la souris BLAJ peut être déplacé passivement sans résistance des tissus mous21.
    4. Pour l’EICC, appliquer une résistance appropriée contre laquelle le muscle TA doit travailler concentriquement — p. ex. 5 g comme illustré à la figure 1A, B; voir la courbe d’étalonnage poids/couple dans le dossier supplémentaire 1.
    5. Appliquez une résistance en suspendant le poids à l’aide d’une suture en soie non élastique attachée au repose-pieds du dispositif DART (Figure 1A, B).
    6. Ajustez la résistance - c’est-à-dire appliquez ~50% du maximum d’une répétition (1RM) (par exemple, 5 g si la souris peut soulever un poids maximum de 10 g avec une seule contraction), ce qui tire le pied à travers au moins la moitié de la plage active disponible de dorsiflexion.
    7. Effectuer un entraînement DART approprié chez des souris assignées au groupe DART – p. ex., effectuer un seul entraînement DART, qui implique quatre séries de 10 répétitions de contractions concentriques avec 2 minutes de repos entre les séries, semblables aux programmes d’entraînement en résistance progressive utilisés chez les humains32 (voir la vidéo supplémentaire 1).
    8. Effectuer une formation ISOM appropriée chez les souris assignées au groupe ISOM – p. ex., effectuer une seule période d’entraînement ISOM, qui implique quatre séries de 10 répétitions de contractions isométriques avec 2 minutes de repos entre les séries, semblable à l’EICC (voir la vidéo supplémentaire 2).
    9. Pour l’entraînement ISOM, placez le pied de la souris à 160° par rapport à l’axe long du tibia (flexion plantaire de 70° du pied orthogonal au tibia) et maintenez cette position statique en collant la suture de soie à la plaque plantaire du banc robotisé.
      REMARQUE: Comme la suture ne peut pas glisser, la plaque plantaire du dispositif DART ne peut pas se déplacer en dorsiflexion, contraignant ainsi les dorsiflexeurs à se contracter isométriquement.

5. Soins post-opératoires pour les souris

  1. Prenez des précautions pour maintenir une bonne hygiène du membre postérieur exercé et réduire la douleur au site de l’aiguille.
    1. Après l’entraînement DART ou OMI, enduisez la partie visible de la broche tibiale avec une pommade antibiotique triple (400 U/g de bacitracine, 3,5 mg/g de néomycine et 5000 U/g de polymixine-B, voir le tableau des matériaux), puis retirez soigneusement la broche du côté médial du tibia. Rincer la peau sur la cuisse latérale et le haut de la jambe avec de la povidone iodée et de l’eau stérile. Appliquer 5% de crème de lidocaïne sur le tibia pour contrôler la douleur au site de l’aiguille.
  2. Laissez les souris se remettre de l’anesthésie.
    1. Retirez la souris du cône nasal et laissez-la récupérer de l’anesthésie dans une cage de récupération exempte de litière. Fournir un soutien thermique à la souris pendant qu’elle se remet de l’anesthésie, par exemple avec un coussin chauffant en gel isotherme.
  3. Remettez la souris dans sa cage d’origine après qu’elle se soit complètement remise de l’anesthésie. Ensuite, retournez la cage à l’animalerie, où les souris d’étude sont hébergées jusqu’à ce que des expériences de suivi soient effectuées. Surveillez les souris quotidiennement.

6. Prélèvement de tissus

  1. Récoltez le muscle TA de souris dans son intégralité et congelez pour la cryoconservation en suivant les étapes ci-dessous.
    1. En fonction de la ou des questions de recherche, à un moment approprié après l’entraînement (p. ex., 3 jours après l’EICC ou l’ISOM), euthanasier les souris selon les protocoles approuvés.
      REMARQUE : Pour la présente étude, des souris ont été euthanasiées par luxation cervicale sous anesthésie générale (isoflurane inhalé, 2 % à 5 % à effet). La thoracotomie bilatérale a assuré la mort.
    2. Disséquez les membres postérieurs de la souris pour enlever le muscle TA exercé (à gauche) et le muscle TA non exercé (à droite). Pesez les muscles récoltés. Ensuite, trempez chaque muscle dans de l’huile minérale pour la cryoprotection et placez le muscle sur une lingette de laboratoire propre pour éponger l’excèsd’huile 21.
  2. Placez le muscle sur un morceau de papier d’aluminium. Tenez le bord de la feuille avec un long hémostatique et immergez rapidement la feuille et le muscle dans l’azote liquide contenu dans un récipient en plastique approprié pour geler le muscle.
    1. Après environ 2 minutes d’immersion dans l’azote liquide, transférer le muscle congelé dans des flacons cryogéniques marqués. Conservez les flacons dans un congélateur à −80 °C jusqu’à ce que cela soit nécessaire pour d’autres études.

7. Études histologiques sur le tissu musculaire

  1. Préparer des sections cryostat de muscle TA d’une épaisseur de 5 μm. Recueillir les sections de cryostat sur des lames de microscope chargées. Fixez les sections avec de l’acétone maintenue froide à −30 °C et laissez sécher les sections à l’air.
  2. Colorer les sections de tissu musculaire avec de l’hématoxyline suivie d’éosine (coloration H & E, voir le tableau des matériaux).
    1. Plongez les sections pendant 5 min dans de l’hématoxyline (coloration nucléaire bleu foncé) dans un pot de coloration en verre. Enlevez l’excès d’hématoxyline en rinçant les sections à l’eau du robinet jusqu’à ce qu’on ne voie plus de bleuissement de l’eau.
    2. Immerger les sections pendant 5 min dans un réactif bleuissant dans un bocal en verre. Aspirer l’excès de réactif bleuissant des sections avec une pipette d’aspiration en verre.
    3. Plongez les sections pendant 5 min dans de l’éosine (coloration cytoplasmique rose) dans un pot de coloration en verre. Enlevez l’excès d’éosine en trempant les sections rapidement et à plusieurs reprises (~ 10 fois) dans de l’éthanol à 95% dans un pot de coloration en verre.
    4. Laissez les sections sécher à l’air libre et procédez à la visualisation au microscope optique.
  3. Préparez des images en mosaïque haute résolution de coupes transversales entières de muscle TA grâce à l’imagerie au microscope.
    REMARQUE: L’utilisateur devra peut-être personnaliser les étapes d’imagerie et d’analyse d’image qui suivent en fonction de son microscope et de son logiciel d’acquisition et d’analyse d’images.
    1. Capturez des images numériques avec l’objectif 10x d’un microscope optique et d’un appareil photo numérique monté sur le microscope.
    2. Capturez environ 15 à 20 images, en vous déplaçant le long de la coupe transversale de chaque muscle de manière à une grille, de sorte que chaque nouvelle image chevauche ~25% avec l’image précédente.
      REMARQUE : ce processus permet de capturer un ensemble d’images pouvant être pavées numériquement (également appelé assemblage d’images) pour créer une image composite haute résolution de l’ensemble de la section transversale du muscle TA (Figure 2).
    3. Enregistrez des images numériques dans . Format TIFF.
    4. Ouvrez les images numériques avec un logiciel de traitement et d’analyse d’images approprié (voir le tableau des matériaux).
    5. Mosaïquez ou assemblez des images individuelles en une image composite de l’ensemble du muscle TA en procédant comme suit : avec toutes les images individuelles qui se chevauchent de chaque muscle TA ouvertes dans le logiciel, cliquez sur Fichier > sélectionnez Automatiser > sélectionnez Photomerge > sélectionnez Collage > sélectionnez Ajouter des fichiers ouverts > cliquez sur OK.
    6. Lorsqu’une nouvelle image en mosaïque/cousue du muscle TA est préparée et affichée, enregistrez l’image dans . Format TIFF pour des analyses plus approfondies.
  4. Quantifier les dommages musculaires par analyse visuelle dans les images en mosaïque de l’ensemble du muscle TA avec un logiciel d’analyse d’image approprié.
    1. Dans le logiciel d’analyse d’images, sélectionnez la fonction Mesure dans le menu Analyser pour délimiter et mesurer la surface de l’ensemble de la section transversale du muscle TA (Figure 2).
    2. Dans le logiciel d’analyse d’images, sélectionnez la fonction Mesure dans le menu Analyser pour définir et mesurer les zones de chaque muscle TA qui sont endommagées, c’est-à-dire les zones qui présentent une perturbation cytoplasmique des fibres musculaires, des fibres musculaires absentes et une infiltration de cellules inflammatoires22 (Figure 2).
    3. Exprimez la somme de la surface totale endommagée en pourcentage de la section transversale totale du muscle TA (figure 2, tableau 2).

8. Analyses statistiques

  1. Organiser les données comme le montrent les tableaux 1 à 3 et effectuer des tests T non appariés (si des tests de normalité et de variances homogènes sont réussis)33 ou des tests de somme de rang de Mann-Whitney (si les tests de normalité et de variances homogènes ne sont pas réussis)21 avec un logiciel approprié (voir le tableau des matériaux).

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Representative Results

Des souris mâles BLAJ, âgées de ~1,5 an, ont été étudiées. Les souris BLAJ modélisent la maladie musculaire humaine, LGMD2B/R2. Ces souris sont particulièrement sensibles aux lésions musculaires d’apparition retardée lors d’un seul épisode de contractions musculaires excentriques22,29. Les souris BLAJ ont donc été choisies pour ces études afin d’apprendre si l’EICC pouvait être réalisée de manière non préjudiciable en ajustant précisément la résistance contre laquelle le muscle TA doit travailler de manière concentrique. S’il s’avérait que l’EICC n’était pas nocive pour les souris BLAJ, elle serait probablement utile comme forme d’entraînement de résistance non préjudiciable, qui pourrait être appliquée seule ou en complément de la médecine régénérative, des interventions génétiques, pharmacologiques et autres.

L’âge et le poids des souris BLAJ étaient étroitement appariés entre les groupes DART et ISOM (tableau 1). Au jour 3 (~72 h), après un seul entraînement, le muscle TA exercé présentait de faibles niveaux de dommages dans les groupes DART et ISOM (<10% de zone endommagée) - ceci contraste avec les études antérieures21,22 de la réponse des souris BLAJ aux contractions musculaires excentriques, où ~40% de fibres endommagées ont été rapportées au jour 3 (Figure 2, Tableau 2). Lorsque l’on a comparé la zone des lésions musculaires entre les muscles TA exercés des groupes DART et OMI, il a été constaté que le groupe DART présentait des niveaux de lésions musculaires inférieurs à ceux du groupe ISOM (figure 2, tableau 2). Le couple tétanique maximal enregistré le jour 0 (ligne de base) et le jour 3 n’était pas statistiquement différent entre les groupes DART et ISOM (tableau 3).

Figure 1
Figure 1 : Fabrication du dispositif DART et application de celui-ci dans une étude d’entraînement. (A,B) Le dispositif DART est basé sur une conception de circuit câble-poulie-poulie, qui est commune à l’équipement d’entraînement en résistance conçu pour les humains. (A) L’appareil DART avec un animal pendant une séance de formation DART. (B) La plaque plantaire se déplaçant en dorsiflexion lors d’une contraction concentrique du muscle TA (flèche verte incurvée, à droite). La contraction concentrique fait que la résistance de 5 g se déplace verticalement contre la gravité (flèche verte verticale, à gauche). Les contractions musculaires ont été provoquées par une stimulation électrique appliquée à travers une électrode bipolaire transcutanée. (C) Divers composants du dispositif DART ont été conçus avec un logiciel de stéréolithographie pour générer . STL, qui pourraient être ouverts avec un logiciel de tranchage. Avec le logiciel de tranchage, des fichiers G-CODE ont été générés spécifiques à l’imprimante 3D et au filament utilisé. Les composants imprimés en 3D du dispositif DART comprenaient (C) un boîtier pour un roulement de roue 608 à faible frottement, (D) une tour pour le palier de roue, (E) un repose-pied et (F) un essieu pour relier le repose-pied au roulement de roue. Les composants imprimés en 3D ont été combinés et montés sur une base en acrylique avec de la colle et des attaches à vis, comme décrit dans le texte et illustré en (A). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Étude histologique. Changements histologiques dans le muscle TA au jour 3 (A) post-DART ou (B) post-ISOM. Les cryosections, d’une épaisseur de 5 μm, ont été colorées à l’hématoxyline et à l’éosine. Plusieurs images numériques superposées ont été capturées et fusionnées avec un logiciel d’imagerie pour générer des images en mosaïque haute résolution de l’ensemble de la section transversale du muscle TA. Les données histologiques qualitatives indiquaient que l’étendue des lésions musculaires était faible dans les groupes DART et OMI, mais que les lésions musculaires étaient légèrement plus évidentes dans le groupe OMI. Les flèches jaunes pointent vers certaines des régions endommagées dans les sections transversales du muscle TA. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Âges et poids corporels des souris. Les souris BLAJ étudiées étaient étroitement appariées en âge et en poids corporel, sans différence significative entre les groupes DART et OMI. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Analyse quantitative des lésions musculaires TA. L’étendue des lésions musculaires a été exprimée en pourcentage de la surface totale de la section transversale du muscle TA et analysée par un test T. L’entraînement DART et ISOM a entraîné un faible niveau de lésions musculaires au jour 3 par rapport aux études antérieures impliquant un épisode similaire de contractions excentriques chez les souris BLAJ. Bien que l’ampleur des dommages musculaires ait été faible dans les groupes DART et OMI, l’étendue des dommages était statistiquement plus faible dans le groupe DART. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 3 : Données sur le couple contractile. Le couple contractile produit par les muscles fléchisseurs a été étudié à l’aide d’un banc à rouleaux robotisé connecté au dispositif DART. Il n’y avait pas de différence significative entre les groupes DART et ISOM dans le couple tétanique maximal de base mesuré le jour de l’exercice (A, Jour 0) ou 3 jours après l’exercice (B, Jour 3). Malgré l’absence de preuves histologiques de lésions musculaires généralisées, un seul épisode d’EICC et d’OMI a été associé à un déficit de couple contractile (~40%) le jour 3. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Vidéo supplémentaire 1 : Formation DART chez la souris. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo supplémentaire 2 : Formation ISOM chez la souris. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Fichier supplémentaire 1 : Données d’étalonnage poids/couple, courbe et configuration. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichiers de codage supplémentaires 1 à 4 : Conceptions des composants du dispositif DART. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Cet article présente des instructions étape par étape sur la façon de construire un appareil pour effectuer un type d’entraînement de réadaptation de précision appelé entraînement de résistance ajusté à la dose (DART). Le travail décrit également l’application du dispositif et de la méthodologie DART dans une étude d’entraînement pour comparer les dommages musculaires 3 jours après un seul épisode de DART (groupe DART) avec les dommages 3 jours après un entraînement isométrique comparable (groupe DART).

Les étapes critiques du protocole sont la construction correcte du dispositif DART 34,35, les étapes précises impliquées dans l’exécution de l’entraînement DART ou SIGMA, la récolte et la cryoconservation appropriées du tissu musculaire, la section appropriée du tissu musculaire avec un cryostat et la coloration appropriée des sections transversales musculaires avec de l’hématoxyline et de l’éosine 22,36 . Plus précisément, pour construire le dispositif DART, les pièces doivent être fabriquées avec les dimensions exactes et les propriétés optimales du matériau. Si les dimensions sont inexactes pour le palier de roulement de roue, le roulement de roue de type 608 ne s’adaptera pas parfaitement au palier de roulement de roue. Si les dimensions de la plaque de pied et de l’axe de la souris ne sont pas précises, cela pourrait avoir un impact négatif sur la capacité du roulement de roue à se déplacer avec le pied de la souris. Si les pièces du dispositif DART sont fabriquées avec un matériau et/ou des paramètres d’imprimante 3D inappropriés, les pièces du dispositif DART peuvent manquer de résistance mécanique suffisante, ce qui peut entraîner la flexion et/ou la rupture de divers composants34.

Il pourrait être nécessaire de modifier ce protocole en fonction des questions de recherche précises auxquelles les chercheurs souhaitent répondre. Le protocole actuel est spécifique à la conception et à la mise en œuvre du dispositif DART dans une étude qui a tenté de répondre à la question de savoir si un seul épisode de DART cause ou non des dommages importants au muscle TA chez les souris déficientes en dysferline, comme nous l’avons signalé précédemment avec un épisode similaire de contractions excentriques22. Étant donné que d’autres ont suggéré que l’exercice consistant en des contractions isométriques pourrait être non nocif et, par conséquent, convenir aux humains atteints de certaines maladies musculaires, nous avons comparé l’étendue des lésions musculaires causées par l’EICC à un épisode comparable de contractions isométriques (ISOM)37,38. Dans cette étude, nous avons constaté que l’EICC et l’ISOM induisent des dommages musculaires minimes, l’EICC montrant des niveaux de dommages légèrement mais significativement inférieurs à ceux de l’ISOM.

En ce qui concerne le dépannage, l’aspect le plus difficile du protocole est de stimuler précisément la branche fibulaire du nerf sciatique, ce qui donne une innervation motrice au muscle TA. Cette technique est particulièrement difficile car le testeur tient une électrode transcutanée et la place manuellement sur un endroit précis inférieur et latéral à l’articulation du genou de la souris20,39. Le testeur doit s’entraîner et apprendre à localiser cet endroit sur le membre postérieur de la souris en sentant une légère proéminence osseuse correspondant à la tête de l’os fibulaire de la souris40. Afin de confirmer qu’une stimulation électrique optimale de la branche fibulaire du nerf sciatique est atteinte, de sorte que des contractions maximales du muscle TA sont atteintes, il est préférable d’utiliser un système dynamométrique fiable20,21,22,41. De plus, des électrodes transcutanées ou sous-cutanées stabilisées par une pince peuvent également être envisagées pour un placement fiable et reproductible des électrodes afin de minimiser la variabilité et les erreurs induites par l’utilisateur 20,41,42,43.

La principale limitation du protocole est qu’il est spécifiquement conçu pour étudier l’effet de l’EICC sur le muscle TA chez la souris. Avec des méthodes qui ont été développées pour effectuer des évaluations dynamométriques et des exercices forcés sur le groupe musculaire quadriceps fémoral chez les rongeurs, le dispositif DART peut facilement être adapté pour le groupe musculaire quadriceps fémoral42,43. L’application du dispositif DART à d’autres groupes musculaires peut être plus difficile; cependant, la conception du circuit câble-poulie-poids, qui a été utilisée dans le dispositif DART, peut être incorporée dans des dispositifs adaptés à d’autres groupes musculaires. Une autre limite est que le protocole est effectué sous anesthésie générale, ce qui rend l’exercice forcé et non volontaire; Ceci est différent de la plupart des paradigmes d’entraînement en résistance développés pour les humains12,21.

L’importance du dispositif et de la méthodologie DART par rapport aux méthodes existantes ou alternatives est que le dosage pour l’entraînement en résistance peut être ajusté avec précision et que l’exercice peut être ciblé avec précision sur un groupe musculaire particulier12. La réadaptation de précision est une nouvelle priorité stratégique pour les National Institutes of Health des États-Unis et, puisque l’EICC permet d’effectuer un entraînement de résistance de précision chez la souris, l’EICC se prête bien aux études fondamentales et précliniques sur la réadaptation physique de précision44,45.

L’importance et l’application potentielle de la méthode actuelle d’entraînement en résistance ajustée à la posologie réside dans le fait qu’elle permet d’effectuer des études d’entraînement en résistance chez la souris de manière comparable aux protocoles d’essai et d’entraînement humains utilisés dans la recherche et la pratique en réadaptation clinique. Par exemple, tout comme le maximum d’une répétition (1RM, la charge maximale qui peut être soulevée / déplacée / pressée / accroupie avec succès une seule fois tout en maintenant une bonne forme) est utilisée pour les humains pour ajuster l’ampleur de la résistance pour les combats d’entraînement17,18, la charge maximale que le muscle TA peut soulever avec succès peut être utilisée pour régler la résistance à l’entraînement chez les souris avec le dispositif DART. En plus d’ajuster la résistance en fonction de la capacité de l’animal, l’avantage supplémentaire est que les contractions sont polarisées concentriquement, ce qui aide à réduire les lésions musculaires induites par la contraction22. Les résultats représentatifs suggèrent qu’un épisode d’EICC est encore moins nocif qu’un épisode comparable de contractions isométriques (groupe OMI). La nature non préjudiciable de l’EICC la rend appropriée pour les études d’entraînement où il est préférable d’éviter les contractions nuisibles – p. ex. les études d’entraînement chez les souris qui modélisent les dystrophies musculaires et les études d’entraînement conçues pour recharger progressivement les muscles à la suite d’interventions chirurgicales expérimentales sur les muscles et/ou les tendons 22,46,47.

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Disclosures

Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Acknowledgments

Cette étude a été financée par des subventions de la Jain Foundation Inc., R03HD091648 du NICHD, une subvention pilote de AR3T sous NIH P2CHD086843, un prix FRAP de l’EACPHS à Wayne State University, un Faculty Startup Package de Wayne State University et un contrat de sous-traitance de 1R01AR079884-01 (Peter L. Jones PI) à JAR. Cette étude a également été financée par une subvention de recherche de l’American Physical Therapy Association - Michigan (APTA-MI) à JMB, MEP et JAR. Les auteurs remercient la Dre Renuka Roche (professeure agrégée, Eastern Michigan University, MI) pour avoir lu le manuscrit de manière critique et fourni des commentaires. Les auteurs remercient M. Anselm D. Motha pour ses conseils sur l’impression 3D. Les auteurs remercient les patients atteints de dysferlinopathies qui ont partagé leurs histoires sur le site Web de la Fondation Jain à https://www.jain-foundation.org/patient-physician-resources/patient-stories, en particulier leurs expériences avec l’exercice.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AnMiao Star 608 Ceramic Ball Bearing Anmiao Star (N/A) AMS127 High precision, low friction wheel bearing.  If make and model is not commercially available, an alternative version of a 608 low-friction wheel bearing, 8 mm bore diameter,  22 mm outside diameter, with silicon nitride ceramic balls in 420 stainless steel housing should suffice.  Excess friction in the wheel bearing will adversely impact performance of the DART device and will increase overall resistance to muscle contractions.
Axio Scope.A1 microscope Carl Zeiss (Peabody, MA) Product #Axio Scope.A1 Light and fluorescence microscope
B6.A-Dysfprmd/GeneJ (a.k.a. BLAJ mice) The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME).  Special colony maintained by The Jain Foundation Inc. for collaborators who study dysferlin. Stock #012767 Dysferlin deficient mice that model human limb girdle muscular dystrophy type 2B/R2.
Bipolar, transcutaneous, neuromuscular electrical stimulation (NMES) electrode Harvard Apparatus, Holliston, MA BS4 50–6824 Electrode for NMES.  If this electrode is not commercially available, please contact corresponding author for alternatives.
Coplin Staining Dish ThermoFisher (Waltham, MA) Catalog No. S17495 Staining dish/jar for hematoxylin and eosin (H&E) staining of sections
Cura 4.4.1. Software Ultimaker, Utrecht, Netherlands Ultimaker Cura 4.4.1. Slicing software to convert stereolithography files into G-CODE files
Deltaphase isothermal gel heating pad Braintree Scientific (Braintree, MA) Item #39DP Heating pad to provide thermal support to animals while under anesthesia
Eosin Y Millipore Sigma (Burlington, MA) HT110132-1L Pink cytoplasmic stain
Gorilla Super Glue The Gorilla Glue Company (Cincinnati, OH) Gorilla Super Glue Micro Precise Cyanoacrylate adhesive to bond PLA components
Hematoxylin solution, Gill No.3 Millipore Sigma (Burlington, MA) GHS332-1L Dark blue stain for nuclei
HM525NX cryostat ThermoFisher (Waltham, MA) Catalog #HM525NX Cryostat to make frozen sections of muscle
Lab Wipes.  Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply ThermoFisher (Waltham, MA) Catalog No. 06-666.  Manufacturer #34120 Laboratory wipes to blot mineral oil from muscle tissue before snap freezing and for other purposes.
Labview 2014 National Instruments, Austin, Texas, USA Labview 2014 Software for custom-written programs/routines that operate the dynamometer and trigger the NMES stimulator.
Liquid nitrogen HDPE Dewar Flasks ThermoFisher (Waltham, MA) S34074B.  Thermo Scientific 41502000/EMD Flask to hold liquid nitrogen for snap freezing muscle or other tissue
Magic depilatory cream Softsheen Carson (New York, NY) N/A Razorless hair removal cream
Metal alligator clip JINSHANGTOPK (web-based business) 24Pcs 51mm Metal Alligator Clip Spring Clamps Spring clamp to hold tibial pin
Micrscope slides Globe Scientific (Mahwah, NJ) 1354W. Diamond White Glass Slides Charged microscope slides
Mineral Oil ThermoFisher (Waltham, MA) BP26291 Mineral oil to cryoprotect muscle tissue before snap freezing
Monoprice Premium 3D Printer Filament PLA Monoprice (Rancho Cucamonga, CA) #11778 Premium 3D Printer Filament PLA 1.75mm 1 kg/spool, Gray.  This is the material used to 3D print device components.
Monoprice Select Mini V2 3D printer Monoprice (Rancho Cucamonga, CA) Mini V2 3D 3D printer for computer-aided fabrication of device components.
NIH Image software National Instritues of Health (NIH, Bethesda, MD) NIH Image for Windows Image processing and analysis software used to quantify area of muscle damage.  NIH Image is also known as Image J.
Photoshop CS4 Adobe (San Jose, CA) Creative Suite (CS4). 64 bit version for Windows Image processing and analysis software used to generate tiled/stiched images of entire muscle cross-section from images of indvidual overlapping fields
PSIU6 stimulation isolation unit Grass Instruments (West Warwick, RI) PSIU6 isolation unit Isolation unit for NMES.  Stimulators, such as Model 4100 from A-M come with a built in stimulation isoloation unit
Roboz 4-0 silk black braided suture material Roboz Surgical (Gaithersburg, MD) Roboz Surgical SUT152 Suture material to connect DART device footplate to dynamometer footplate or resistance for resistance training
S48 square pulse stimulator Grass Instruments (West Warwick, RI) S48 Stimulator Laboratory electrical stimulator for NMES .  If this stimulator is not commercially available, Model 4100 Isolated High Power Stimulator from A-M systems could be an alternative.  Please contact co-author Jones for more information.
Scott’s bluing reagent Ricca Chemical Company (Arlington, TX) 6697-32 Bluing solution that intensifies hematoxylin nuclear staining
SigmaStat version 3.5 Systat Software (San Jose, CA) SigmaStat version 3.5 Statistical software package for statistical analyses
Tabletop isoflurane vaporizer VetEquip (Livermore, CA) Item #901801 Inhaled tabletop anesthesia system
Triple antibiotic first aid ointment Global Health Products (wed-based business) Globe Triple Antibiotic First Aid Ointment, 1 oz (2-Pack) First Aid Antibiotic Ointment Antibiotic ointment applied on tibial pin as part of post-procedural care

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References

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Neurosciences numéro 186 Muscle squelettique entraînement en résistance réadaptation régénérative réadaptation de précision blessure musculaire dysferline dystrophie musculaire des ceintures
Entraînement en résistance ajusté en fonction de la posologie chez les souris présentant un risque réduit de lésions musculaires
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