Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

लंबाई के पैमाने पर क्रोमोसोम रचना कैप्चर करना

Published: January 20, 2023 doi: 10.3791/64001
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1
1Department of Systems Biology, University of Massachusetts Medical School, 2Howard Hughes Medical Institute

Summary

हाई-सी 3.0 एक बेहतर हाई-सी प्रोटोकॉल है जो सिग्नल-टू-शोर अनुपात और क्रोमैटिन इंटरैक्शन डिटेक्शन के रिज़ॉल्यूशन को बढ़ाने के लिए डीपीएनआई और डीडीईआई प्रतिबंध एंजाइमों के कॉकटेल के साथ फॉर्मलाडेहाइड और डिसुसिनिमिडिल ग्लूटारेट क्रॉसलिंकर को जोड़ता है।

Abstract

क्रोमोसोम अनुरूपता कैप्चर (3 सी) का उपयोग त्रि-आयामी क्रोमैटिन इंटरैक्शन का पता लगाने के लिए किया जाता है। आमतौर पर, फॉर्मलाडेहाइड (एफए) के साथ रासायनिक क्रॉसलिंकिंग का उपयोग क्रोमैटिन इंटरैक्शन को ठीक करने के लिए किया जाता है। फिर, एक प्रतिबंध एंजाइम के साथ क्रोमैटिन पाचन और बाद में टुकड़े के सिरों का पुन: बंधाव तीन आयामी (3 डी) निकटता को अद्वितीय बंधाव उत्पादों में परिवर्तित करता है। अंत में, क्रॉसलिंक, प्रोटीन हटाने और डीएनए अलगाव के उलट के बाद, डीएनए को कतरनी किया जाता है और उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण के लिए तैयार किया जाता है। लोकी के जोड़े की निकटता बंधाव की आवृत्ति एक सेल आबादी में त्रि-आयामी अंतरिक्ष में उनके सह-स्थानीयकरण की आवृत्ति का एक उपाय है।

एक अनुक्रमित हाई-सी लाइब्रेरी लोकी के सभी जोड़े के बीच बातचीत आवृत्तियों पर जीनोम-व्यापक जानकारी प्रदान करती है। हाई-सी का संकल्प और परिशुद्धता कुशल क्रॉसलिंकिंग पर निर्भर करती है जो क्रोमैटिन संपर्कों और क्रोमैटिन के लगातार और समान विखंडन को बनाए रखती है। यह पेपर एक बेहतर सीटू हाई-सी प्रोटोकॉल, हाई-सी 3.0 का वर्णन करता है, जो दो क्रॉसलिंकर (फॉर्मलाडेहाइड [एफए] और डिसुसिनिमिडिल ग्लूटारेट [डीएसजी]) के संयोजन से क्रॉसलिंकिंग की दक्षता को बढ़ाता है, इसके बाद दो प्रतिबंध एंजाइमों (डीपीएनआई और डीडीईआई) का उपयोग करके बेहतर पाचन होता है। हाई-सी 3.0 छोटे पैमानों जैसे लूप और टोपोलॉजिकल रूप से संबद्ध डोमेन (टीएडी) पर जीनोम फोल्डिंग सुविधाओं की सटीक मात्रा का ठहराव करने के लिए एक एकल प्रोटोकॉल है, साथ ही साथ डिब्बों जैसे बड़े नाभिक-व्यापक पैमाने पर विशेषताएं भी हैं।

Introduction

क्रोमोसोम अनुरूपता कैप्चर का उपयोग 2002 1 से किया गयाहै। मौलिक रूप से, प्रत्येक रचना कैप्चर संस्करण 3 डी क्रोमैटिन संगठन को संरक्षित करने के लिए डीएनए-प्रोटीन और प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के निर्धारण पर निर्भर करता है। इसके बाद डीएनए विखंडन होता है, आमतौर पर प्रतिबंध पाचन द्वारा, और अंत में, पास के डीएनए का पुनर्ग्रहण स्थानिक रूप से समीपस्थ लोकी को अद्वितीय सहसंयोजक डीएनए अनुक्रमों में परिवर्तित करने के लिए समाप्त होता है। प्रारंभिक 3 सी प्रोटोकॉल ने विशिष्ट, "वन-टू-वन" इंटरैक्शन का नमूना लेने के लिए पीसीआर का उपयोग किया। बाद के 4 सी परीक्षणों ने "वन-टू-ऑल" इंटरैक्शन2 का पता लगाने की अनुमति दी, जबकि 5 सी ने "कई-से-कई" इंटरैक्शन3 का पता लगाया। अगली पीढ़ी, उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण (एनजीएस) को लागू करने के बाद क्रोमोसोम रचना कैप्चर पूर्ण रूप से फलीभूत हुआ, जिसने जीनोम-वाइड हाई-सी4 और तुलनीय तकनीकों जैसे 3 सी-सेक5, टीसीसी6 और माइक्रो-सी 7,8 का उपयोग करके "ऑल-टू-ऑल" जीनोमिक इंटरैक्शन का पता लगाने की अनुमति दी (डेंकर और डी लाट9 द्वारा समीक्षा भी देखें)।

हाई-सी में, बायोटिनाइलेटेड न्यूक्लियोटाइड का उपयोग पाचन के बाद और बंधाव से पहले 5 ' ओवरहैंग को चिह्नित करने के लिए किया जाता है (चित्रा 1)। यह स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित मोतियों का उपयोग करके ठीक से पचने वाले और पुनर्निर्मित टुकड़ों के चयन की अनुमति देता है, इसे जीसीसी10 से अलग करता है। हाई-सी प्रोटोकॉल के लिए एक महत्वपूर्ण अद्यतन राव एट अल .11 द्वारा लागू किया गया था, जिन्होंने नकली बंधाव उत्पादों को कम करने के लिए बरकरार नाभिक (यानी, सीटू में) में पाचन और पुनरावृत्ति का प्रदर्शन किया था। इसके अलावा, एमबीओआई (या डीपीएनआई) पाचन के साथ हिंद III पाचन को प्रतिस्थापित करने से टुकड़े का आकार कम हो गया और हाई-सी की संकल्प क्षमता में वृद्धि हुई। इस वृद्धि ने अपेक्षाकृत छोटे पैमाने पर संरचनाओं का पता लगाने और संपर्क के बिंदुओं के अधिक सटीक जीनोमिक स्थानीयकरण की अनुमति दी, जैसे कि छोटे सीआईएस-तत्वों के बीच डीएनए लूप, उदाहरण के लिए, लूप एक्सट्रूज़न11,12 द्वारा उत्पन्न सीटीसीएफ-बाध्य साइटों के बीच लूप। हालांकि, यह क्षमता एक कीमत पर आती है। सबसे पहले, रिज़ॉल्यूशन में दो गुना वृद्धि के लिए अनुक्रमण में चार गुना (22) वृद्धिकी आवश्यकता होती है। दूसरा, छोटे टुकड़े के आकार से पचे हुए और पुनर्निर्मित टुकड़ों के लिए बिना पचे हुए पड़ोसी टुकड़ों को गलत समझने की संभावना बढ़जाती है। जैसा कि उल्लेख किया गया है, हाई-सी में, पचा हुआ और पुनर्निर्मित टुकड़े बंधाव जंक्शन पर बायोटिन की उपस्थिति से बिना पचे हुए टुकड़ों से भिन्न होते हैं। हालांकि, यह सुनिश्चित करने के लिए कि केवल बंधाव जंक्शनों को14,15 से नीचे खींचा जाता है, अनलिगेटेड सिरों से उचित बायोटिन हटाने की आवश्यकता होती है।

एनजीएस की घटती लागत के साथ, क्रोमोसोम फोल्डिंग का अधिक विस्तार से अध्ययन करना संभव हो जाता है। डीएनए टुकड़ों के आकार को कम करने के लिए, और इस प्रकार रिज़ॉल्यूशन बढ़ाने के लिए, हाई-सी प्रोटोकॉल को प्रतिबंध एंजाइमों 16 को अधिक बार काटने या प्रतिबंध एंजाइम17,18,19 के संयोजन का उपयोग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, माइक्रो-सी में एमनेस 7,8 और डीनेस हाई-सी20 में डीनेस को इष्टतम पाचन प्राप्त करने के लिए टाइटरेट किया जा सकता है।

3 सी विधियों के मूल सिद्धांतों के हालिया व्यवस्थित मूल्यांकन से पता चला है कि हर लंबाई के पैमाने पर क्रोमोसोम फोल्डिंग सुविधाओं का पता लगाने में 1% एफए के साथ अनुक्रमिक क्रॉसलिंकिंग के साथ बहुत सुधार हुआ, जिसके बाद 3 एमएम डीएसजी17 था। इसके अलावा, हिंद III पाचन के साथ हाई-सी बड़े पैमाने पर फोल्डिंग सुविधाओं का पता लगाने के लिए सबसे अच्छा विकल्प था, जैसे कि डिब्बे, और माइक्रो-सी डीएनए लूप जैसे छोटे पैमाने पर फोल्डिंग सुविधाओं का पता लगाने में बेहतर था। इन परिणामों ने एक एकल, उच्च-रिज़ॉल्यूशन "हाई-सी 3.0" रणनीति के विकास को जन्म दिया, जो एफए और डीएसजी क्रॉसलिंकर के संयोजन का उपयोग करता है, जिसके बाद डीपीएनआई और डीडीईआई एंडोन्यूक्लिज़21 के साथ डबल पाचन होता है। हाई-सी 3.0 सामान्य उपयोग के लिए एक प्रभावी रणनीति प्रदान करता है क्योंकि यह सभी लंबाई तराजू17 में फोल्डिंग सुविधाओं का सटीक रूप से पता लगाता है। हाई-सी 3.0 प्रोटोकॉल का प्रयोगात्मक भाग यहां विस्तृत है और अनुक्रमण के बाद अपेक्षित विशिष्ट परिणाम दिखाए जा सकते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: छह चरणों में हाई-सी प्रक्रिया। कोशिकाओं को पहले एफए के साथ तय किया जाता है, और फिर डीएसजी (1)। फिर, लाइसिस डीडीईआई और डीपीएनआई (2) के साथ दोहरे पाचन से पहले होता है। बायोटिन को ओवरहैंग फिल-इन द्वारा जोड़ा जाता है और समीपस्थ कुंद सिरों को डीएनए शुद्धिकरण (4) से पहले (3) किया जाता है। बायोटिन को सोनिकेशन और आकार चयन से पहले अनलिगेटेड सिरों से हटा दिया जाता है (5). अंत में, बायोटिन का पुल-डाउन पीसीआर द्वारा एडाप्टर लिगेशन और लाइब्रेरी प्रवर्धन की अनुमति देता है (6). संक्षेप: एफए = फॉर्मलाडेहाइड; डीएसजी = डिसुकिनिमिडिल ग्लूटारेट; बी = बायोटिन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Protocol

1. क्रॉसलिंकिंग द्वारा निर्धारण

  1. फॉर्मलाडेहाइड निर्धारण: मोनोलेयर में कोशिकाओं से शुरू
    1. प्रति 150 मिमी प्लेट में 5 × 106 कोशिकाओं की कटाई के लिए उपयुक्त माध्यम में बीज वाली कोशिकाएं हों।
      नोट: उपयोगकर्ता किसी भी पसंदीदा कंटेनर का चयन कर सकते हैं जो किसी भी स्तनधारी सेल लाइन के इष्टतम विकास को सुनिश्चित करता है। इसके अतिरिक्त, कोशिकाओं को ऊतक से अलग किया जा सकता है।
    2. 150 मिमी प्लेट से वैक्यूम ट्रैप के साथ युग्मित पाश्चर पिपेट के साथ माध्यम को एस्पिरेट करें, ~ 10 एमएल एचबीएसएस के साथ 2 गुना धोएं।
    3. क्रॉसलिंकिंग से तुरंत पहले, 22.5 एमएल एचबीएसएस और 37% एफए के 625 आरएल को अंतिम 1% एकाग्रता में जोड़कर 50 एमएल ट्यूब में 1% एफए क्रॉसलिंकिंग समाधान तैयार करें। धीरे-धीरे हिलाकर मिलाएं।
      सावधानी: फ्यूम हुड का उपयोग करें; फॉर्मलाडेहाइड विषाक्त है।
    4. कोशिकाओं को क्रॉसलिंक करने के लिए, प्रत्येक 15 सेमी प्लेट में 1% एफए समाधान का 23.125 एमएल डालें।
    5. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें और धीरे से हर 2 मिनट में हाथ से प्लेटों को हिलाएं।
    6. 2.5 एम ग्लाइसिन (128 एमएम फाइनल) के 1.25 एमएल जोड़ें और क्रॉसलिंकिंग प्रतिक्रिया को बुझाने के लिए प्लेट को धीरे से घुमाएं।
    7. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें और क्रॉसलिंकिंग को रोकने के लिए कम से कम 15 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेशन जारी रखें।
    8. सेल स्क्रैपर या रबर पुलिसकर्मी के साथ प्लेटों से कोशिकाओं को खुरचें।
    9. सेल निलंबन को पाइप के साथ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 1,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें और आकांक्षा से सतह पर तैरने वाले को त्याग दें।
    10. सेल पेलेट को एक बार डलबेको के फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (डीपीबीएस) के 10 एमएल के साथ धो लें, फिर से निलंबित करने के लिए एक पाइप का उपयोग करें। फिर, कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 1,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज। डीएसजी क्रॉसलिंकिंग के लिए तुरंत आगे बढ़ें।
      नोट: सेल गोली को धोते समय सावधान रहें क्योंकि सेल छर्रों को ढीला किया जा सकता है, और कोशिकाएं खो सकती हैं।
  2. फॉर्मलाडेहाइड निर्धारण: निलंबन में कोशिकाओं से शुरू
    1. प्रति पोत 5 से 106 कोशिकाओं की कटाई के लिए उपयुक्त माध्यम में बीज × कोशिकाएं लें।
      नोट: उपयोगकर्ता किसी भी पसंदीदा कंटेनर का चयन कर सकते हैं जो किसी भी स्तनधारी सेल लाइन के इष्टतम सेल विकास को सुनिश्चित करता है।
    2. फसल से ठीक पहले, कोशिकाओं की गिनती करें और 5 × 106 कोशिकाओं को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    3. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजिंग करके कोशिकाओं को धीरे से गोली मार दें।
    4. एचबीएसएस के 45 एमएल में 37% एफए के 1.25 एमएल जोड़कर 1% एफए क्रॉसलिंकिंग समाधान तैयार करें और ट्यूब को कई बार इनवर्ट करके मिलाएं।
      नोट: राशि को विभाजित किए बिना एफए के पूरे 1.25 एमएल जोड़ें।
      सावधानी: फॉर्मलाडेहाइड अत्यधिक विषाक्त है।
    5. पिछले चरण में तैयार किए गए 1% एफए क्रॉसलिंकिंग समाधान के 46.25 एमएल में सेल पेलेट को ऊपर और नीचे करके पुन: निलंबित करें।
    6. कमरे के तापमान पर हर 1-2 मिनट में घूर्णन, रॉकर, या ट्यूब के कोमल मैनुअल व्युत्क्रमण द्वारा ठीक 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    7. 2.5 एम ग्लाइसिन (128 एमएम फाइनल) के 2.5 एमएल जोड़कर क्रॉसलिंकिंग प्रतिक्रिया को बुझाएं और ट्यूब को उलटकर अच्छी तरह से मिलाएं।
    8. क्रॉसलिंकिंग को पूरी तरह से रोकने के लिए कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए और फिर कम से कम 15 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
    9. कमरे के तापमान पर सेंट्रीफ्यूज 10 मिनट के लिए 1,000 × ग्राम पर क्रॉसलिंक कोशिकाओं को पेलेट करने और आकांक्षा द्वारा सतह पर तैरने वाले को त्यागने के लिए।
    10. कोशिकाओं को 10 एमएल डीपीबीएस के साथ एक बार धोएं, और फिर कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 1,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें। पाइप का उपयोग करके सुपरनैटेंट को पूरी तरह से छोड़ दें और तुरंत डीएसजी क्रॉसलिंकिंग पर आगे बढ़ें।
      नोट: सेल गोली को धोते समय सावधान रहें क्योंकि सेल छर्रों को ढीला किया जा सकता है, और कोशिकाएं खो सकती हैं।
  3. डिसुकिनिमिडिल ग्लूटारेट के साथ क्रॉसलिंकिंग
    1. 300 mM DSG (3 mM फाइनल) के 100 μL जोड़ने से पहले डीपीबीएस के 9.9 एमएल में पेलेट कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। व्युत्क्रमण द्वारा मिश्रण करें।
      नोट: डीएसजी नमी के प्रति संवेदनशील है। क्रॉसलिंकिंग के दिन डीएमएसओ में 300 एमएम डीएसजी का नया स्टॉक तैयार करना जरूरी है।
      चेतावनी: डीएमएसओ में डीएसजी अत्यधिक विषाक्त है।
    2. एक घूर्णन पर 40 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर कोशिकाओं को क्रॉसलिंक करें।
    3. 2.5 M ग्लाइसिन (400 mM फाइनल) का 1.925 mL जोड़ें, मिश्रण करने के लिए इनवर्ट करें, और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    4. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 2,000 × ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें।
      नोट: ढीले सेल छर्रों से सतह पर तैरने वाले को हटाते समय सावधान रहें।
    5. 0.05% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए)-डीपीबीएस के 1 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें और 1.7 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
      नोट: बीएसए के अतिरिक्त सेल क्लंपिंग को कम करने में मदद मिल सकती है।
    6. कोशिकाओं को 2,000 × ग्राम पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें और पाइप द्वारा सतह पर तैरने वाले को हटा दें।
      नोट: गोली खोने से बचने के लिए, जल्दी और पूरी तरह से सतह पर तैरने वाले को हटा दें।
    7. तरल नाइट्रोजन में गोली को स्नैप-फ्रीज करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें या तुरंत अगले चरण पर आगे बढ़ें।

2. क्रोमोसोम रचना कैप्चर

  1. सेल लाइसिस और क्रोमैटिन पाचन
    1. क्रॉसलिंक्ड सेल एलिकोट (~ 5 × 106 कोशिकाएं) को 1 एमएल आइस-कोल्ड लाइसिस बफर ( पूरक तालिका एस 1 में नुस्खा) में पुन: निलंबित (पाइपेट) जिसमें 10 μL प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल होता है और बर्फ पर 15 मिनट इनक्यूबेशन के लिए एक डूंस होमोजेनाइज़र में स्थानांतरित होता है।
      नोट: उपयोग से तुरंत पहले लाइसिस बफर में प्रोटीज इनहिबिटर जोड़ें।
    2. धीरे-धीरे पेस्टल ए को बर्फ पर कोशिकाओं को समरूप बनाने के लिए 30 बार ऊपर और नीचे ले जाएं और 1 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें ताकि कोशिकाओं को ठंडा किया जा सके, इससे पहले कि अन्य 30 स्ट्रोक से पहले।
    3. लाइसेट को 1.7 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
      नोट: निलंबन को चालू रखें क्योंकि कभी-कभी कोशिकाएं पिपेट टिप में चिपक जाती हैं।
    4. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 2,500 × ग्राम पर लाइस्ड सस्पेंशन को सेंट्रीफ्यूज करें।
    5. सतह पर तैरने वाले को त्याग दें और गीली गोली को फिर से निलंबित करने के लिए फ्लिक या भंवर करें। न्यूनतम झुरमुट के साथ दही जैसा पदार्थ प्राप्त करने के लिए जितना संभव हो उतना सुपरनैटेंट को हटा दें।
    6. पेलेट को 500 μL बर्फ-ठंडा 1x प्रतिबंध बफर (10x से; पूरक तालिका S1 में नुस्खा देखें) में पुन: निलंबित करें और 2,500 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें। इस चरण को दूसरे धोने के लिए दोहराएं।
      नोट: 1x प्रतिबंध बफर में गोली लाइसिस बफर में पिछले गोली की तुलना में अधिक दानेदार है।
    7. पेलेट के कैरीओवर वॉल्यूम में ~ 340 μL जोड़ने के बाद पाइपिंग द्वारा 1x प्रतिबंध बफर के 360 μL की अंतिम मात्रा में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें, जो सेल के आकार पर निर्भर करता है।
    8. क्रोमैटिन अखंडता (सीआई) के परीक्षण के लिए प्रत्येक लाइसेट के 18 μL को अलग रखें। सीआई नमूने को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    9. प्रत्येक हाई-सी ट्यूब (380 μL की कुल मात्रा) में 1% सोडियम डोडेसिल सल्फेट (SDS) का 38 μL जोड़ें और बुलबुले पेश किए बिना पाइपिंग द्वारा सावधानीपूर्वक मिलाएं।
      चेतावनी: एसडीएस विषाक्त है।
    10. क्रोमैटिन को खोलने के लिए ठीक 10 मिनट के लिए हिलाए बिना 65 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को इनक्यूबेट करें।
    11. ट्यूबों को तुरंत बर्फ पर रखें और तालिका 1 में वर्णित एसडीएस को बुझाने के लिए ट्राइटन एक्स -100 के साथ पाचन मिश्रण तैयार करें।
    12. अंतराल झटकों के साथ थर्मोमिक्सर में रात भर (~ 16 घंटे) क्रोमैटिन को 37 डिग्री सेल्सियस पर पचाने के लिए हाई-सी-ट्यूब (487 μL कुल) में पाचन मिश्रण का 107 μL जोड़ें (उदाहरण के लिए, 900 आरपीएम, 30 s ऑन, 4 मिनट की दूरी)।
      नोट: 1% की अंतिम एकाग्रता में ट्राइटन को जोड़ना एसडीएस को बुझाने का काम करता है।
  2. डीएनए का बायोटिनाइलेशन समाप्त होता है
    1. रात भर पाचन के बाद, शेष एंडोन्यूक्लिज़ गतिविधि को निष्क्रिय करने के लिए नमूनों को 20 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर स्थानांतरित करें।
    2. इनक्यूबेशन के दौरान, तालिका 2 में दिखाए गए अनुसार एक फिल-इन मास्टर मिक्स तैयार करें।
    3. इनक्यूबेशन के बाद, नमूने को तुरंत बर्फ पर रखें।
    4. प्रत्येक नमूने के लिए 10 μL पाचन नियंत्रण (DC) अलग रखें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    5. एक पाइप के साथ या घूमकर ढक्कन से संघनन को हटा दें। प्रत्येक नमूने में, बायोटिन फिल-इन मिक्स (कुल नमूना मात्रा 535 μL) के 58 μL जोड़ें और बुलबुले बनाए बिना धीरे से पाइप करें।
    6. थर्मोमिक्सर में 4 घंटे के लिए 23 डिग्री सेल्सियस पर नमूने को इनक्यूबेट करें (उदाहरण के लिए, 900 आरपीएम, 30 एस ऑन, 4 मिनट ऑफ)।
  3. समीपस्थ डीएनए टुकड़ों का बंधाव
    1. तालिका 3 में दिखाए गए अनुसार बंधाव मिश्रण तैयार करें, जबकि बायोटिन फिल-इन इनक्यूबेट हो रहा है।
    2. प्रत्येक नमूने में बंधाव मिश्रण का 665 μL जोड़ें (कुल नमूना मात्रा 1,200 μL)। पाइपिंग द्वारा धीरे से मिलाएं।
    3. अंतराल झटकों के साथ थर्मोमिक्सर में 4 घंटे के लिए 16 डिग्री सेल्सियस पर नमूने को इनक्यूबेट करें (उदाहरण के लिए, 900 आरपीएम, 30 सेकंड, 4 मिनट की दूरी)। सहसंयोजक रूप से जुड़े क्रोमैटिन वाले इन नमूनों को कुछ दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. क्रॉसलिंकिंग का उलट
    1. सीआई और डीसी नमूनों की मात्रा को 1x Tris Low EDTA (TLE; पूरक तालिका S1 में नुस्खा देखें) के साथ 50 μL तक लाएं।
    2. सीआई और डीसी नमूनों में 10 मिलीग्राम / एमएल प्रोटीनेज के 10 μL जोड़ें।
    3. अंतराल झटकों के साथ रात भर 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें (उदाहरण के लिए, 900 आरपीएम, 30 सेकंड ऑन, 4 मिनट की दूरी)। वैकल्पिक रूप से, हाई-सी नमूनों के डीएनए शुद्धिकरण के दौरान इन नियंत्रणों के लिए क्रॉसलिंकिंग का 30 मिनट का उलट प्रदर्शन करें।
    4. प्रत्येक हाई-सी नमूने में, 10 मिलीग्राम / एमएल प्रोटीनेज के 50 डिग्री सेल्सियस जोड़ें और अंतराल झटकों के साथ कम से कम 2 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें (उदाहरण के लिए, 900 आरपीएम, 30 सेकंड, 4 मिनट की दूरी)।
    5. प्रत्येक हाई-सी ट्यूब (कुल नमूना मात्रा 1,300 μL) में 10 मिलीग्राम / एमएल प्रोटीनेज के एक और 50 μL जोड़ें और रात भर 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन जारी रखें। डीएनए शुद्धिकरण तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: प्रोटीन के ऊष्मायन को विभाजित करने से कुल प्रोटीन पाचन सुनिश्चित होता है।
  5. डीएनए शुद्धिकरण
    1. ट्यूबों को कमरे के तापमान तक 65 डिग्री सेल्सियस से ठंडा होने दें।
    2. प्रत्येक नमूने को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें और प्रत्येक ट्यूब में फिनोल: क्लोरोफॉर्म: आइसोएमिल अल्कोहल का 2.6 एमएल (2 एक्स वॉल्यूम) जोड़ें।
      चेतावनी: फिनोल: क्लोरोफॉर्म: आइसोएमिल अल्कोहल एक बहुत ही विषाक्त अड़चन है और संभावित रूप से कार्सिनोजेनिक है।
    3. वोर्टेक्स प्रत्येक ट्यूब को 1 मिनट के लिए और फिर इसकी सामग्री को 15 एमएल फेज-लॉक ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    4. एक बेंचटॉप सेंट्रीफ्यूज में अधिकतम गति (1,500-3,500 × ग्राम) पर 5 मिनट के लिए नमूने सेंट्रीफ्यूज करें।
    5. जलीय चरण को सावधानीपूर्वक 35 एमएल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब में डालें और 1,250 μL की अंतिम मात्रा में अल्ट्राप्योर पानी जोड़ें।
      नोट: उपलब्ध अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज को फिट करने या कई माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में विभाजित करने के लिए ट्यूबों का उपयोग करें।
    6. 3 M सोडियम एसीटेट का 1/10वां आयतन (~ 125 μL) जोड़ें और व्युत्क्रमण द्वारा अच्छी तरह मिलाएं।
    7. प्रत्येक नमूने में बर्फ-ठंडा 100% इथेनॉल का 2.5x वॉल्यूम (~ 3.4 एमएल) जोड़ें, बर्फ-ठंडा 100% इथेनॉल जोड़कर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के लिए ट्यूबों को संतुलित करें, और व्युत्क्रमण द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं।
    8. ~ 15 मिनट के लिए सूखी बर्फ पर ट्यूबों को इनक्यूबेट करें (जमने से बचें)।
    9. ट्यूबों को 18,000 × ग्राम पर 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें।
      नोट: कोण वाले रोटर के लिए: ट्यूबों को चिह्नित करें जहां गोली होगी।
    10. पिपेट का उपयोग करके, सुपरनैटेंट को गैर-गोली पक्ष से पूरी तरह से हटा दें और छोड़ दें।
      नोट: इस बिंदु पर, गोली दिखाई देनी चाहिए और ट्यूब पर चिह्नित की जा सकती है, क्योंकि यह अगले चरण में सूखने के बाद स्पष्ट रूप से दिखाई नहीं दे सकती है।
    11. नमूनों को लगभग 10 मिनट के लिए या जब तक वे स्पष्ट रूप से सूख न जाएं, तब तक हवा में सुखाएं।
    12. प्रत्येक गोली को पाइपिंग या चक्कर लगाकर 1x TLE के 450 μL में घुलनशील करें और 3 kDA आणविक भार कट-ऑफ के साथ 0.5 mL केन्द्रापसारक फ़िल्टर यूनिट (CFU) में स्थानांतरित करें।
    13. सीएफयू को 10 मिनट के लिए अधिकतम गति से सेंट्रीफ्यूज करें और प्रवाह को छोड़ दें। प्रत्येक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब को 1x TLE के अतिरिक्त 450 μL के साथ धोएं और एक और धोने के लिए अपने CFU में स्थानांतरित करें।
      नोट: इस तरह से सीएफयू को धोने से नमक एकाग्रता को कम करते हुए डीएनए हानि सीमित हो जाती है।
    14. सीएफयू को 10 मिनट के लिए अधिकतम गति से सेंट्रीफ्यूज करें और प्रवाह को छोड़ दें।
    15. कॉलम में 1x TLE का 80 μL जोड़ें और ~ 100 μL की अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए अधिकतम गति पर 2 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूजिंग करने से पहले कॉलम को एक नए संग्रह ट्यूब में बदल दें।
    16. प्रत्येक नमूने में 1 μL RnaseA (1 mg/mL; 10 mg/mL स्टॉक का 10 गुना कमजोर होना) जोड़ें और कम से कम 30 मिनट के लिए हीट ब्लॉक पर, पानी के स्नान में, या थर्मोमिक्सर में 37 °C पर इनक्यूबेट करें।
    17. आरएनएस उपचार के बाद, नमूने को 37 डिग्री सेल्सियस से हटा दें और गुणवत्ता नियंत्रण चरण तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  6. क्रोमैटिन गुणवत्ता, एंजाइम पाचन और नमूना बंधाव की जांच
    1. चरण 2.4.5 में क्रॉसलिंक को उलटने के बाद सीआई और डीसी नमूनों को कमरे के तापमान पर ठंडा करें। फिर, एक प्रीस्पन 2 एमएल चरण-लॉक ट्यूब में स्थानांतरित करें।
      नोट: सुनिश्चित करें कि चरण लॉक सामग्री को पेलेट (2 मिनट के लिए अधिकतम गति) में सेंट्रीफ्यूज किया गया है।
    2. फिनोल: क्लोरोफॉर्म: आइसोएमिल अल्कोहल का 200 μL जोड़ें और 1 मिनट के लिए भंवर द्वारा नमूने मिलाएं।
    3. अधिकतम गति पर 5 मिनट के लिए ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें।
    4. जलीय चरण को प्रत्येक नमूने (~ 50 μL) से एक नए 1.7 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    5. 1 μL Rnase A (1 mg/mL से) जोड़ें और कम से कम 30 मिनट के लिए 37 °C पर इनक्यूबेट करें।
    6. तालिका 4 में अनुशंसित 0.8% अगारोस जेल पर नमूने लोड करें।
      नोट: गुणवत्ता नियंत्रण से अपेक्षित परिणाम चित्रा 2 में दिखाए गए हैं।
    7. जेल से डेंसिटोमेट्री द्वारा या क्यूबिट या नैनोड्रॉप का उपयोग करके डीएनए की मात्रा निर्धारित करें।
      नोट: सटीक परिमाणीकरण प्रोटोकॉल के अगले भाग में सही इनपुट वॉल्यूम सुनिश्चित करता है। एक मानक वक्र बनाने के लिए एक ज्ञात मात्रा के साथ कई मानकों का उपयोग करें।

तालिका 1: पाचन अभिकर्मक। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 2: बायोटिन फिल-इन अभिकर्मकों। * ध्यान दें कि एंजाइमों को बदलने के लिए विभिन्न बफर और बायोटिनिलेटेड डीएनटीपी की आवश्यकता हो सकती है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 3: लिगेशन मिक्स अभिकर्मकों। संक्षिप्त नाम: बीएसए = गोजातीय सीरम एल्बुमिन। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 4: गुणवत्ता और आकार चयन मूल्यांकन के लिए जेल लोडिंग पैरामीटर। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: Agarose gel विशिष्ट पोस्टडीएनए शुद्धिकरण गुणवत्ता नियंत्रण परिणाम दिखा रहा है। (A) CI नियंत्रण को उच्च आणविक भार डीएनए के एक बैंड को इंगित करना चाहिए। (बी) डीसी और हाई-सी नमूने डीएनए आकार की एक श्रृंखला दिखाते हैं। हाई-सी नमूना, बड़े टुकड़ों में संयुक्त होने के बाद, डीसी की तुलना में उच्च आणविक भार का होना चाहिए। मार्करों की एकाग्रता सीमा एक मानक वक्र उत्पन्न करने की अनुमति देती है। ध्यान दें, इस उदाहरण में, सीआई को एक अलग जेल पर लोड किया गया था, लेकिन सभी नमूनों और नियंत्रणों को एक साथ लोड करने और चलाने की सलाह दी जाती है। संक्षेप: सीआई = क्रोमैटिन अखंडता; डीसी = पाचन नियंत्रण; हाय-सी = निकटता-लिगेट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

3. हाई-सी अनुक्रमण पुस्तकालय तैयारी

  1. अनलिगेटेड सिरों से बायोटिन को हटाना
    1. तालिका 5 में दिखाए गए अनुसार बायोटिन हटाने की प्रतिक्रियाएं तैयार करें।
      नोट: आमतौर पर, डीएनए का 10 μg पर्याप्त है, लेकिन 30 μg तक उपयोग किया जा सकता है।
    2. प्रत्येक 130 μL प्रतिक्रिया से 2 x 65 μL एलिकोट को दो पीसीआर ट्यूबों में वितरित करें।
    3. एक थर्मोसाइक्लर या पीसीआर मशीन में स्थानांतरित करें और तालिका 5 में वर्णित के रूप में इनक्यूबेट करें।
      नोट: नमूने यहां 4 डिग्री सेल्सियस (दिनों से सप्ताह), -20 डिग्री सेल्सियस (दीर्घकालिक), या तुरंत सोनिकेशन के लिए ले जाया जा सकता है।
  2. सोनिकेशन
    1. बायोटिन हटाने के चरण (130 μL कुल नमूना मात्रा) से नमूना डुप्लिकेट को सोनिकेशन के लिए 130 μL सोनिकेटर ट्यूब में पूल करें।
    2. 500 बीपी से नीचे एक तंग संकीर्ण वितरण प्राप्त करने के लिए तालिका 6 में दिए गए मापदंडों का उपयोग करके नमूने को सोनिकेट करें।
      नोट: विभिन्न सोनिकेटर प्रकारों का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन एक संकीर्ण टुकड़ा वितरण (100-500 बीपी) के लिए, सोनिकेटर सेटिंग्स को अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है।
  3. चुंबकीय मोतियों के साथ आकार चयन
    1. सोनिकेटर ट्यूब (ओं) से सोनिकेटेड डीएनए को 1.7 एमएल कम बाइंडिंग ट्यूब में पाइप करें।
    2. प्रत्येक नमूने को 1x TLE के साथ 500 μL की कुल मात्रा में लाएं। वॉल्यूम को यथासंभव 500 μL के करीब लाने का प्रयास करें, क्योंकि आकार चयन के लिए नमूने से चुंबकीय मोतियों के मिश्रण का अनुपात आवश्यक है।
    3. 0.8 के नमूना आयतन में चुंबकीय मोतियों के मिश्रण का अनुपात प्राप्त करने के लिए प्रत्येक ट्यूब में 400 μL चुंबकीय मोती मिश्रण जोड़ें।
      नोट: इन शर्तों के तहत, मोती डीएनए टुकड़े >300 बीपी को कैप्चर करते हैं, जो ऊपरी अंश होगा। सुपरनैटेंट में <300 बीपी के टुकड़े होंगे, जो लोअर फ्रैक्शन होगा।
    4. ट्यूबों को भंवर द्वारा मिलाएं और एक घूर्णन पर कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। इस और अन्य आकार चयन अनुपात के लिए, सुनिश्चित करें कि नमूने की पूरी मात्रा अच्छी तरह से मिश्रित होती है। "अनियमित मोड" की तलाश करें जो कुछ रोटर के पास है, जो छोटी मात्रा के लिए अच्छी तरह से काम करता है।
    5. चुंबकीय कण विभाजक (एमपीएस) पर कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    6. इनक्यूबेट करते समय, प्रत्येक नमूने के लिए एक ताजा 1.7 μL कम बाइंडिंग ट्यूब में चुंबकीय मोतियों के मिश्रण का 500 μL जोड़ें।
      नोट: इन ट्यूबों का उपयोग 1.1: 1 के नमूना अनुपात में चुंबकीय मोती मिश्रण उत्पन्न करके निचले अंश के अगले आकार के चयन के लिए किया जाएगा।
    7. ट्यूबों को एमपीएस पर 5 मिनट के लिए छोड़ दें।
    8. मोतियों से सतह पर तैरने वाले को निकालें और चुंबकीय मोतियों के मिश्रण के 150 μL के साथ पुन: निलंबित करें।
      नोट: यह कदम मात्रा में वृद्धि के बिना मोतियों की संख्या बढ़ाकर डीएनए के साथ मोतियों की संतृप्ति से बचता है।
    9. निचले अंश (चरण 3.3.8) का चयन करने के लिए तैयार लेबल ट्यूब पर सुपरनैटेंट को चरण 3.3.5 से स्थानांतरित करें।
      नोट: 150 μL चुंबकीय मोतियों का मिश्रण + 0.8x चुंबकीय मोतियों के मिश्रण का 400 μL (550 μL कुल) प्रारंभिक नमूने के 500 μL से विभाजित = नमूना अनुपात में 1.1x चुंबकीय मोती मिश्रण।
    10. निचले अंश ट्यूबों को भंवर द्वारा मिलाएं और एक घूर्णन पर कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट: मोती डीएनए टुकड़ों को 100 बीपी > बांध देंगे, जिसके परिणामस्वरूप 100-300 बीपी का अंतिम मोती-बाध्य अंश होगा।
    11. लोअर फ्रैक्शन ट्यूबों को एमपीएस पर 5 मिनट (कमरे का तापमान) के लिए रखें।
    12. सतह पर तैरने वाले को हटा दें और ट्यूबों को संक्षेप में सेंट्रीफ्यूज करें ताकि सतह पर तैरने वाले को जितना संभव हो सके हटा दिया जा सके।
    13. 70% इथेनॉल के 200 μL का उपयोग करके दोनों अंशों से मोतियों को दो बार धोएं और हर बार एमपीएस पर 5 मिनट के लिए मोतियों को पुनः प्राप्त करें।
    14. सेंट्रीफ्यूज में एक त्वरित स्पिन के बाद, इथेनॉल को पूरी तरह से हटा दें और एमपीएस पर मोतियों को और सुखाएं।
      नोट: जब तक शराब पूरी तरह से वाष्पित न हो जाए तब तक सूखें। गोली को क्रैकिंग के बिना डार्क चॉकलेट की तरह दिखना चाहिए (~ 10 मिनट लग सकता है)।
    15. 1x TLE बफर के 50 μL में दोनों अंशों को पुन: निलंबित करें। 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें और मिश्रण और क्षालन को प्रोत्साहित करने के लिए हर दूसरे मिनट ट्यूबों को टैप या फ्लिक करें।
    16. दोनों अंशों के लिए 5 मिनट के लिए एमपीएस पर सतह पर तैरने वाले से मोतियों को अलग करें।
    17. प्रत्येक नमूने से सतह पर तैरने वाला रखें। सतह पर तैरने वाले को 1.7 एमएल कम बाइंडिंग ट्यूब में डालें।
      नोट: नमूने को कुछ दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस या लंबी अवधि के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है।
    18. नमूना गुणवत्ता और मात्रा निर्धारित करने के लिए तालिका 4 में 2% अगारोस जेल चलाएं। इस तरह के जेल के उदाहरण के लिए चित्रा 3 देखें।
      नोट: यदि अनुभव से, सोनिकेशन अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, तो कोई भी इस जेल को छोड़ सकता है और तुरंत मरम्मत समाप्त करने के लिए आगे बढ़ सकता है। यह अनुशंसा की जाती है कि उपयोगकर्ता अनुमापन पीसीआर के बाद तक ऊपरी अंशों को पकड़ें। उप-मानक डीएनए मात्रा जिसके लिए बहुत अधिक पीसीआर प्रवर्धन की आवश्यकता होगी, को ऊपरी अंश में सामग्री से बचाया जा सकता है।
    19. ज्ञात डीएनए सीढ़ी इनपुट से एक मानक वक्र उत्पन्न करने के बाद या क्यूबिट या नैनोड्रॉप का उपयोग करके सीधे जेल से डीएनए की मात्रा निर्धारित करें।
  4. अंत की मरम्मत
    1. तालिका 7 (प्रति प्रतिक्रिया दी गई मात्रा) के अनुसार अंतिम मरम्मत मिश्रण तैयार करें।
    2. शेष 46 μL एल्यूटेड डीएनए को निचले अंश से पीसीआर ट्यूबों में स्थानांतरित करें और तैयार अंत मरम्मत मिश्रण का 24 μL जोड़ें। एक पीसीआर मशीन में इनक्यूबेट करें, जैसा कि तालिका 7 में प्रस्तावित है।
    3. एक बार कार्यक्रम पूरा हो जाने के बाद, नमूने को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें जब तक कि पुल-डाउन न हो जाए।
  5. स्ट्रेप्टाविडिन लेपित मोतियों के साथ बायोटिनिलेटेड लिगेशन उत्पादों का पुल-डाउन
    1. परिमाणित आकार चयन (चरण 3.3.19) से प्रत्येक पुस्तकालय के लिए स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित मोतियों की मात्रा निर्धारित करें।
      नोट: ये स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित मोती (10 मिलीग्राम / एमएल समाधान) प्रति मिलीग्राम मोतियों में 20 μg डबल-फंसे डीएनए को बांध सकते हैं (= 20 μg / 100 μL मोती)। हाई-सी डीएनए के प्रत्येक 1 μg के लिए 2 μL का उपयोग करें लेकिन 10 μL से कम नहीं।
    2. स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित मोतियों को मिलाएं और प्रत्येक पुस्तकालय (पिछले चरण में गणना) के लिए आवश्यक मोतियों की मात्रा को व्यक्तिगत 1.7 एमएल कम बाइंडिंग ट्यूबों में मिलाएं।
    3. ट्वीन वॉश बफर (TWB; पूरक तालिका S1 में नुस्खा देखें) के 400 μL में मोतियों को फिर से निलंबित करें और एक घूर्णन पर कमरे के तापमान पर ~ 3 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें (चरण 3.3.4 में निर्देश देखें)।
    4. 1 मिनट के लिए एमपीएस पर सुपरनैटेंट से मोतियों को अलग करें और सुपरनैटेंट को हटा दें।
    5. टीडब्ल्यूबी के एक और 400 μL को पाइप करके मोतियों को धो लें।
    6. 1 मिनट के लिए एमपीएस पर सुपरनैटेंट से मोतियों को अलग करें और सुपरनैटेंट को हटा दें।
    7. मोतियों में 2x बाइंडिंग बफर (BB) ( पूरक तालिका S1 में नुस्खा) का 400 μL जोड़ें और पुन: निलंबित करें। इसके अतिरिक्त, 1x TLE का 330 μL जोड़ें और अंत-मरम्मत से समाधान (चरण 3.4.3 से)।
    8. एक घूर्णन पर मिश्रण करते समय कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए नमूने को इनक्यूबेट करें।
    9. 1 मिनट के लिए एमपीएस पर सुपरनैटेंट से मोतियों को अलग करें और सुपरनैटेंट को हटा दें।
    10. मोतियों में 1x BB का 400 μL जोड़ें और पुन: निलंबित करें।
    11. 1 मिनट के लिए एमपीएस पर सुपरनैटेंट से मोतियों को अलग करें और सुपरनैटेंट को हटा दें।
    12. मोतियों को धोने के लिए 1x TLE का 100 μL जोड़ें।
    13. 1 मिनट के लिए एमपीएस पर सुपरनैटेंट से मोतियों को अलग करें और सुपरनैटेंट को हटा दें।
    14. अंत में, मोतियों को फिर से निलंबित करने के लिए 1x TLE का 41 μL जोड़ें।
  6. ए-टेलिंग
    1. तालिका 8 के अनुसार ए-टेलिंग मिश्रण तैयार करें।
    2. पीसीआर ट्यूबों में प्रतिक्रियाओं को पाइप करें और तालिका 8 के अनुसार इनक्यूबेट करें।
    3. थर्मोसाइक्लर से हटाने के तुरंत बाद पीसीआर ट्यूबों को बर्फ पर रखें और सामग्री को 1.7 एमएल कम बाइंडिंग ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
    4. 1 मिनट के लिए एमपीएस पर सुपरनैटेंट से मोतियों को अलग करें और सुपरनैटेंट को त्याग दें।
    5. अल्ट्राप्योर पानी के साथ 5x T4 डीएनए लिगेज बफर से पतला 1x लिगेशन बफर का 400 μL जोड़ें।
    6. 1 मिनट के लिए एमपीएस पर सुपरनैटेंट से मोतियों को अलग करें, और फिर सुपरनैटेंट को छोड़ दें।
    7. 40 μL की अंतिम मात्रा में 1x लिगेशन बफर जोड़ें।
  7. एनीलिंग एडाप्टर ऑलिगोस
    1. 100 μM के एडाप्टर ऑलिगो स्टॉक तैयार करें (तालिका 9)।
      नोट: एचपीएलसी-शुद्ध ऑलिगोस के 250 एनमोल ऑर्डर करें।
    2. तालिका 9 में वर्णित पीसीआर ट्यूबों में एडाप्टर को एनाल करें।
    3. तापमान को धीरे-धीरे 0.5 डिग्री सेल्सियस /सेकंड से 97.5 डिग्री सेल्सियस तक बढ़ाने के लिए पीसीआर थर्मोसाइक्लर का उपयोग करें। 2.5 मिनट के लिए 97.5 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो।
    4. 775 चक्रों (20 डिग्री सेल्सियस तक पहुंचने) के लिए 0.1 डिग्री सेल्सियस / सेकंड पर तापमान को धीरे-धीरे बढ़ाने के लिए पीसीआर थर्मोसाइक्लर का उपयोग करें। आगे के उपयोग तक तापमान को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    5. एडाप्टर को 15 μM तक पतला करने के लिए 1x Annealing Buffer ( पूरक तालिका S1 में नुस्खा) का 83 μL जोड़ें। एडाप्टर को -20 °C पर स्टोर करें।
  8. अनुक्रमण एडाप्टर लिगेशन
    1. एडाप्टर बंधाव मिश्रण को 1.7 एमएल कम बाइंडिंग ट्यूब (तालिका 10) में तैयार करें।
    2. कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए लिगेट करें।
    3. 1 मिनट के लिए एमपीएस पर सुपरनैटेंट से मोतियों को अलग करें और सुपरनैटेंट को त्याग दें।
    4. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए रोटेटर पर इनक्यूबेशन से पहले 400 μL TWB जोड़ें और मोतियों को सावधानी से ऊपर और नीचे करें। एमपीएस पर सुपरनैटेंट से मोतियों को अलग करें और इस चरण को एक बार फिर दोहराएं।
    5. एमपीएस (~ 1 मिनट) पर सुपरनैटेंट से मोतियों को अलग करें, सुपरनैटेंट को छोड़ दें, और 1x BB के 200 μL जोड़ें।
    6. एमपीएस (~ 1 मिनट) पर सुपरनैटेंट से मोतियों को अलग करें और सुपरनैटेंट को त्याग दें।
    7. 1x प्री-पीसीआर बफर (10x से; पूरक तालिका S1 में नुस्खा से) का 200 μL जोड़ें और एक नई 1.7 mL कम बाइंडिंग ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    8. एमपीएस (~ 1 मिनट) पर सुपरनैटेंट से मोतियों को अलग करें और सुपरनैटेंट को त्याग दें।
    9. 1x प्री-पीसीआर बफर का 20 μL जोड़ें और पाइप द्वारा मिलाएं।
    10. उपयोग में रहते हुए ट्यूबों को बर्फ पर रखें या 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  9. अनुमापन द्वारा पीसीआर चक्र संख्या का अनुकूलन
    1. तालिका 11 (प्रति प्रतिक्रिया दी गई मात्रा) के अनुसार प्रति नमूना मास्टर मिक्स प्रतिक्रियाओं के 30 μL सेट करें।
    2. सबसे कम चक्र चलाएं और 5 μL एलिकोट लें। अगले 5 μL एलिकोट लेने से पहले शेष प्रतिक्रिया पर अतिरिक्त 2-3 चक्र चलाएं। चार एलिकोट इकट्ठा करने के लिए दोहराएं।
    3. प्रत्येक एलिकोट के लिए तालिका 11 से पीसीआर पैरामीटर का उपयोग करें।
    4. प्रत्येक 5 μL नमूने में 5 μL पानी और 2 μL 6x डाई जोड़ें। कम आणविक भार सीढ़ी के 25-150 एनजी के साथ 2% अगारोस टीबीई जेल ( पूरक तालिका एस 1 में नुस्खा) पर चलाएं। अपेक्षित परिणामों के लिए चित्र 4 देखें।
      नोट: अंतिम पुस्तकालय पीसीआर प्रवर्धन [चरण 3.10] के लिए चक्रों की एक इष्टतम संख्या जेल माइनस एक चक्र पर दृश्यमान उत्पाद प्राप्त करने के लिए चक्रों की सबसे कम संख्या है।
  10. अंतिम पुस्तकालय पीसीआर प्रवर्धन
    1. तालिका 11 के अनुसार अनुक्रमण के लिए प्रत्येक अंतिम पुस्तकालय को बढ़ाने के लिए 12 x 30 μL प्रतिक्रियाओं को सेट करें।
    2. पीसीआर अनुमापन (चरण 3.9.3) के बाद चक्रों की संख्या निर्धारित करने के बाद तालिका 11 के अनुसार पीसीआर प्रतिक्रियाओं को चक्रित करें।
    3. एक बार पीसीआर पूरा हो जाने के बाद, प्रतिकृति नमूनों को 1.7 एमएल कम बाइंडिंग माइक्रोफ्यूज ट्यूब में पूल करें।
    4. ट्यूबों को एमपीएस पर रखें और सुपरनैटेंट को एक नए 1.7 एमएल कम बाइंडिंग माइक्रोफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    5. बचे हुए स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित मोतियों को 1x प्री-पीसीआर बफर के 20 μL में पुन: निलंबित करें।
      नोट: इस टेम्पलेट का पुन: उपयोग किया जा सकता है जब इसे दिनों से हफ्तों तक या -20 डिग्री सेल्सियस पर दीर्घकालिक रूप से संग्रहीत किया जाता है।
  11. चुंबकीय मोतियों के मिश्रण के साथ प्राइमरों को हटाना
    1. चरण 3.10.4 से ठीक 360 μL तक मात्रा को समायोजित करने के लिए 1x TLE बफर ( पूरक तालिका S1 में नुस्खा) का उपयोग करें।
    2. प्रत्येक नमूने में, चुंबकीय मोतियों के मिश्रण के 360 μL जोड़ें और मिश्रण करने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट करें।
    3. एक घूर्णन पर, कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए नमूने मिलाएं।
    4. कमरे के तापमान (3-5 मिनट) पर एमपीएस पर सतह पर तैरने वाले से मोतियों को अलग करें।
    5. 70% इथेनॉल के 200 μL का उपयोग करके मोतियों को दो बार धोएं और हर बार एमपीएस पर 5 मिनट के लिए मोतियों को पुनः प्राप्त करें।
    6. सेंट्रीफ्यूज में त्वरित स्पिन करें और इथेनॉल को पूरी तरह से बंद करें। इथेनॉल को और वाष्पित करने के लिए एमपीएस पर हवा में मोतियों को सुखाएं।
      नोट: गोली को क्रैकिंग के बिना डार्क चॉकलेट की तरह दिखना चाहिए (~ 10 मिनट लग सकता है)।
    7. अल्ट्राप्योर पानी का 30 μL जोड़ें और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए डीएनए को हटाने के लिए फिर से निलंबित करें। मिश्रण में मदद करने के लिए ट्यूबों को हर 2 मिनट में फ्लिक करें।
    8. 5 मिनट के लिए एमपीएस पर सुपरनैटेंट से मोतियों को अलग करें।
    9. एक ताजा 1.7 एमएल ट्यूब में प्रत्येक नमूने से सुपरनैटेंट एकत्र करें।
    10. टुकड़े के आकार का वितरण प्राप्त करने और अंतिम पुस्तकालय की मात्रा निर्धारित करने के लिए 2% अगारोस टीबीई ( पूरक तालिका एस 1 में नुस्खा) जेल पर पुस्तकालय का 1 μL चलाएं (चित्रा 5)।
      नोट: सीएलएआई पाचन केवल DpnII-DpnII जंक्शनों के लिए हो सकता है और एक सकारात्मक बंधाव नियंत्रण के रूप में कार्य करता है जिसके परिणामस्वरूप अंतिम पुस्तकालय के लिए कम टुकड़ा आकार वितरण होना चाहिए। अंतिम पुस्तकालयों को कुछ दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है, -20 डिग्री सेल्सियस पर दीर्घकालिक, या तुरंत पतला किया जा सकता है और अनुक्रमण के लिए प्रस्तुत किया जा सकता है।

तालिका 5: बायोटिन हटाने अभिकर्मकों और तापमान कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 6: सोनिकेशन के लिए पैरामीटर। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 7: मरम्मत अभिकर्मकों और तापमान को समाप्त करें। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 8: ए-टेलिंग अभिकर्मक और तापमान। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 9: पीसीआर प्राइमर और पेयर-एंड-एडाप्टर ऑलिगोस के साथ अभिकर्मकों के साथ एनीलिंग के लिए। संक्षिप्त नाम: 5PHOS = 5 'फॉस्फेट। तारांकन फॉस्फोरोथियोटेड डीएनए बेस का संकेत देते हैं। # एक अनुक्रमित एडाप्टर में एनाईल करने के लिए यूनिवर्सल ऑलिगो के साथ एक अनुक्रमित ऑलिगो को मिलाएं। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 10: एडाप्टर लिगेशन अभिकर्मकों। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 11: पीसीआर अभिकर्मकों और साइकिल िंग पैरामीटर। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: एगारोस जेल विशिष्ट पोस्ट-आकार चयन परिणाम दिखा रहा है। DpnII-DDEI Hi-C के चार नमूनों (संख्या 1-4) के लिए ऊपरी और निचले अंश दिखाए गए हैं। प्रत्येक नमूने के लिए पहली लेन में ऊपरी अंश होता है, जो 0.8x चुंबकीय मोतियों के मिश्रण से प्राप्त होता है, और दूसरे और तीसरे लेन में 1.1x चुंबकीय मोतियों के मिश्रण से प्राप्त निचले अंश का कमजोर पड़ना होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: पीसीआर अनुमापन परिणामों के साथ एगारोस जेल। पीसीआर के 5 चक्रों से शुरू होकर, चार पुस्तकालयों में से प्रत्येक के लिए प्रत्येक 2 चक्रों (5, 7, 9 और 11 चक्रों) के बाद नमूने लिए जाते हैं। इस आंकड़े के आधार पर, प्रत्येक नमूने के लिए इष्टतम चक्र के रूप में 6 चक्र चुने गए थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: अंतिम पीसीआर उत्पाद। सफाई और आकार-चयन के बाद, पीसीआर उत्पादों (हाई-सी) को उसी पुस्तकालय (सीएलएआई) के सीएलएआई-डाइजेस्ट अंश के बगल में लोड किया गया था। सीएलएआई-पचने वाले टुकड़े मांग वाले DpnII-DpnII बंधाव की उपस्थिति का संकेत देते हैं। ध्यान दें कि सीएलएआई डीपीएनआई-डीडीईआई जंक्शनों को पचाता नहीं है और इसलिए, सभी बंधाव इस प्रतिबंध से आकार में कमी में योगदान नहीं देंगे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Representative Results

इस पांडुलिपि में आंकड़े लाफोंटेन एट अल.21 द्वारा पहले प्रकाशित एक के एक अलग, प्रतिकृति प्रयोग से उत्पन्न हुए थे। उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण डेटा प्राप्त करने के बाद, हाई-सी डेटा को संसाधित करने के लिए ओपन क्रोमैटिन कलेक्टिव (ओपन 2 सी: https://github.com/open2c) का उपयोग किया गया था। 4 डी न्यूक्लियोम प्रोजेक्ट (https://data.4dnucleome.org/resources/data-analysis/hi_c-processing-pipeline) के डेटा पोर्टल पर एक समान पाइपलाइन पाई जा सकती है। संक्षेप में, नेक्स्टफ्लो पाइपलाइन डिस्टिलर (https://github.com/open2c/distiller-nf) को (1) हाई-सी अणुओं के अनुक्रमों को संदर्भ जीनोम में संरेखित करने के लिए लागू किया गया था, (2) .sam संरेखण को पार्स करें और हाई-सी जोड़े के साथ फ़ाइलों का निर्माण करें, (3) पीसीआर डुप्लिकेट फ़िल्टर करें, और (4) कुल जोड़े को हाई-सी इंटरैक्शन के बिन्ड मैट्रिसेस में। इन एचडीएफ 5 स्वरूपित मैट्रिक्स, जिन्हें कूलर कहा जाता है, को तब (1) हाइग्लास सर्वर (https://higlass.io/) पर देखा जा सकता है और (2) ओपन क्रोमैटिन कलेक्टिव (https://github.com/open2c/cooltools) द्वारा बनाए गए "कूलटूल्स" संग्रह में मौजूद ओपन सोर्स कम्प्यूटेशनल टूल के एक बड़े सेट का उपयोग करके विश्लेषण किया जा सकता है ताकि डिब्बों, टीएडी और लूप जैसी फोल्डिंग विशेषताओं को निकाला और मात्रा निर्धारित की जा सके।

हाई-सी 3.0 पुस्तकालयों के कुछ गुणवत्ता संकेतकों का मूल्यांकन कुछ सरल मैट्रिक्स / संकेतकों का उपयोग करके, संदर्भ जीनोम में पढ़ने वाले जोड़े को मैप करने के तुरंत बाद किया जा सकता है। सबसे पहले, आमतौर पर ~ 50% अनुक्रमित पठन जोड़े मानव कोशिकाओं के लिए विशिष्ट रूप से मैप किए जा सकते हैं। क्रोमोसोम की बहुलक प्रकृति के कारण, इनमें से अधिकांश मैप किए गए रीड (~ 60% -90%) एक क्रोमोसोम (सीआईएस) के भीतर इंटरैक्शन का प्रतिनिधित्व करते हैं, जिसमें इंटरैक्शन आवृत्तियों तेजी से बढ़ती जीनोमिक दूरी (दूरी-निर्भर क्षय) के साथ क्षय होती हैं। दूरी-निर्भर क्षय को "स्केलिंग प्लॉट" में सबसे अच्छी तरह से देखा जा सकता है, जो जीनोमिक दूरी के कार्य के रूप में संपर्क संभावना (प्रति गुणसूत्र हाथ) को दर्शाता है। हमने पाया कि विभिन्न क्रॉसलिंकर और एंजाइमों का उपयोग लंबी और छोटी दूरी की दूरी पर दूरी-निर्भर क्षय को बदल सकताहै। डीएसजी क्रॉसलिंकिंग के अलावा कम दूरी पर इंटरैक्शन की पहचान क्षमता बढ़ जाती है जब एमएनसे जैसे एंजाइमों और डीपीएनआई-डीडीईआई के संयोजन के साथ जोड़ा जाता है जो छोटे टुकड़े पैदा करते हैं (चित्रा 6 ए)।

दूरी-निर्भर क्षय को सीधे 2 डी इंटरैक्शन मैट्रिसेस से भी देखा जा सकता है: केंद्रीय विकर्ण से दूर स्थित होने पर इंटरैक्शन अधिक असंगत हो जाते हैं (चित्रा 6 बी)। इसके अतिरिक्त, जीनोमिक फोल्डिंग विशेषताओं, जैसे कि डिब्बों, टीएडी और लूप को हाई-सी मैट्रिसेस और स्केलिंग प्लॉट से सामान्य जीनोम-वाइड औसत दूरी-निर्भर क्षय से विचलन के रूप में पहचाना जा सकता है। महत्वपूर्ण रूप से, एफए के अलावा डीएसजी के साथ क्रॉसलिंकिंग यादृच्छिक बंधाव को कम करती है, जो गुणसूत्रों की बहुलक प्रकृति के कारण अप्रतिबंधित हैं और इसलिए, गुणसूत्रों (ट्रांस में) के बीच होने की अधिक संभावना है (चित्रा 6 सी)। यादृच्छिक बंधाव को कम करने से सिग्नल-टू शोर अनुपात में वृद्धि होती है, विशेष रूप से अंतर-क्रोमोसोमल और बहुत लंबी दूरी (>10-50 एमबी) इंट्राक्रोमोसोमल इंटरैक्शन के लिए।

Figure 6
चित्र 6: मैप किए गए और फ़िल्टर किए गए हाई-सी पुस्तकालयों के प्रतिनिधि परिणाम। (A) विभिन्न एंजाइमों के लिए संपर्क संभाव्यता और इसके व्युत्पन्न के साथ स्केलिंग प्लॉट, टुकड़े की लंबाई (ऊपर) और एफए या एफए + डीएसजी (नीचे) के साथ क्रॉसलिंकिंग द्वारा आदेशित। एमएनई (माइक्रोसी) या डीपीएनआई-डीडीईआई (हाई-सी 3.0) के साथ पाचन छोटी दूरी के संपर्कों (ऊपर) को काफी बढ़ाता है जैसा कि डीएसजी को एफए (नीचे) में जोड़ता है। (बी) कॉलम एफए क्रॉसलिंकिंग के बाद डीपीएनआई पाचन के हाई-सी हीटमैप दिखाते हैं और एफए + डीएसजी क्रॉसलिंकिंग के बाद डीपीएनआई या डीडीईआई पाचन दिखाते हैं। सफेद तीर डीएसजी क्रॉसलिंकिंग और डीडीईआई पाचन के बाद "डॉट्स" की बढ़ती ताकत दिखाते हैं, जिसका अर्थ है डीएनए लूप का बेहतर पता लगाना। पंक्तियाँ बढ़ते रिज़ॉल्यूशन पर क्रोमोसोम 3 के विभिन्न हिस्सों को दिखाती हैं, पैनल सी के साथ संरेखित: शीर्ष पंक्ति: संपूर्ण गुणसूत्र 3 (0-198,295,559 एमबी); मध्य पंक्ति: 186-196 एमबी; नीचे पंक्ति: 191.0-191.5 एमबी (सी) ए में दर्शाए गए क्षेत्रों के लिए कवरेज ग्राफ। काले तीर एफए-ओनली क्रॉसलिंकिंग के लिए कम कवरेज (%सीआईएस पढ़ता है) दिखाते हैं। संक्षेप: एफए = फॉर्मलाडेहाइड; डीएसजी = डिसुकिनिमिडिल ग्लूटारेट; chr = क्रोमोसोम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

सभी मैप किए गए पाठ उपयोगी नहीं हैं। एक दूसरा गुणवत्ता संकेतक पीसीआर डुप्लिकेट की संख्या है। सटीक डुप्लिकेट रीड बंधाव और सोनिकेशन के बाद संयोग से होने की संभावना नहीं है। इस प्रकार, इस तरह के पठन संभवतः पीसीआर प्रवर्धन के परिणामस्वरूप होते हैं और उन्हें फ़िल्टर करने की आवश्यकता होती है। डुप्लिकेट अक्सर तब उत्पन्न होते हैं जब कम जटिलता पुस्तकालयों को बढ़ाने के लिए बहुत सारे पीसीआर चक्रों की आवश्यकता होती है। आम तौर पर, हाई-सी के लिए, अधिकांश पुस्तकालयों को केवल अंतिम पीसीआर प्रवर्धन के 5-8 चक्रों की आवश्यकता होती है, जैसा कि अनुमापन पीसीआर द्वारा निर्धारित किया जाता है (चरण 3.9 देखें; चित्र 4)। हालांकि, पीसीआर प्रवर्धन के 14 चक्रों के बाद भी पर्याप्त जटिलता वाले पुस्तकालय प्राप्त किए जा सकते हैं।

डुप्लिकेट रीडिंग की एक और श्रेणी, तथाकथित ऑप्टिकल डुप्लिकेट, इलुमिना अनुक्रमण प्लेटफार्मों पर प्रवर्धन प्रक्रिया से उत्पन्न हो सकती है जो पैटर्न प्रवाह कोशिकाओं (जैसे HiSeq4000) का उपयोग करते हैं। ऑप्टिकल डुप्लिकेट या तो प्रवाह सेल को ओवरलोड करने से पाए जाते हैं, जिससे (बड़े) समूहों को दो अलग-अलग क्लस्टर कहा जाता है, या पीसीआर के पहले दौर के बाद मूल युग्मित-अंत अणु के स्थानीय पुनरावृत्ति से। क्योंकि दोनों प्रकार के ऑप्टिकल डुप्लिकेट स्थानीय हैं, उन्हें प्रवाह सेल पर उनके स्थान से पीसीआर डुप्लिकेट से पहचाना और अलग किया जा सकता है। जबकि >15% पीसीआर डुप्लिकेट वाले पुस्तकालयों को पुनर्जनन की आवश्यकता होगी, ऑप्टिकल डुप्लिकेट वाले पुस्तकालयों को लोडिंग प्रक्रिया को अनुकूलित करने के बाद फिर से लोड किया जा सकता है।

पूरक तालिका एस 1: बफर और समाधान। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

सेल हैंडलिंग के लिए महत्वपूर्ण कदम
यद्यपि इनपुट कोशिकाओं की कम संख्या का उपयोग करना संभव है, इस प्रोटोकॉल को गहन अनुक्रमण के बाद उचित जटिलता सुनिश्चित करने के लिए ~ 5 × 106 कोशिकाओं प्रति अनुक्रमण लेन (~ 400 एम रीड) के लिए अनुकूलित किया गया है। निर्धारण से पहले कोशिकाओं को सबसे अच्छी तरह से गिना जाता है। अल्ट्राडीप पुस्तकालयों की पीढ़ी के लिए, हम आम तौर पर लेन (और कोशिकाओं) की संख्या को गुणा करते हैं जब तक कि वांछित पठन-गहराई तक नहीं पहुंच जाता है। इष्टतम निर्धारण के लिए, सीरम युक्त माध्यम को एफए निर्धारण से पहले पीबीएस के साथ बदल दिया जाना चाहिए, और फिक्सेटिव समाधानों को तुरंत और एकाग्रता ग्रेडिएंट15,22 के बिना जोड़ा जाना चाहिए। सेल कटाई के लिए, ट्रिप्सिनाइजेशन पर स्क्रैपिंग को प्राथमिकता दी जाती है, क्योंकि ट्रिप्सिनाइजेशन के बाद चापलूसी से गोलाकार आकार में संक्रमण परमाणु रचना को प्रभावित कर सकता है। डीएसजी को जोड़ने के बाद, ढीले और झुरमुट सेल छर्रों को आसानी से खो दिया जाता है। इस स्तर पर कोशिकाओं को संभालते समय सावधान रहें और झुरमुट को कम करने के लिए 0.05% बीएसए जोड़ें।

विधि में संशोधन
यह प्रोटोकॉल मानव कोशिकाओं17 का उपयोग करके विकसित किया गया था। फिर भी, क्रोमोसोम रचना कैप्चर के साथ अनुभव के आधार पर, यह प्रोटोकॉल अधिकांश यूकेरियोटिक कोशिकाओं के लिए काम करना चाहिए। काफी कम इनपुट (~ 1 × 106 कोशिकाओं) के लिए, हम लाइसिस और अनुरूपता कैप्चर प्रक्रियाओं [चरण 2.1-2.4] के लिए आधे वॉल्यूम का उपयोग करने की सलाह देते हैं। यह डीएनए अलगाव [चरण 2.5] को 1.7 एमएल ट्यूबों के साथ टेबलटॉप सेंट्रीफ्यूज में करने की अनुमति देगा, जो कम डीएनए सांद्रता के लिए पेलेटिंग में सुधार कर सकता है। डीएनए की मात्रा (चरण 2.6.6) इंगित करेगी कि कैसे आगे बढ़ना है। पृथक डीएनए (1-5 μg) की कम मात्रा के लिए, हम आकार चयन (चरण 3.3) को छोड़ने का सुझाव देते हैं और सीएफयू के साथ मात्रा को 130 μL से ~ 45 μL तक कम करने के बाद बायोटिन हटाने के साथ आगे बढ़ते हैं।

इस प्रोटोकॉल को विशेष रूप से एफए और डीएसजी के साथ क्रॉसलिंकिंग और डीपीएनआई और डीडीईआई के साथ पाचन के बाद उच्च गुणवत्ता वाले डेटा को सुनिश्चित करने के लिए विकसित किया गया था। हालांकि, वैकल्पिक क्रॉसलिंकिंग रणनीतियाँ जैसे कि एफए के बाद ईजीएस (एथिलीन ग्लाइकोल बिस (सक्सिनिमिडिल सक्सिनेट)), जिसका उपयोग CHIP-seq23 और CHIA-PET24 में भी किया जाता है, समान रूपसे अच्छी तरह से काम कर सकता है। इसी तरह, विभिन्न एंजाइम संयोजन, जैसे कि DpnII और HinfI18 या MBOI , MSEI, और NLAIII19 का उपयोग पाचन के लिए किया जा सकता है। एंजाइम संयोजनों को अपनाते समय, बायोटिनिलेटेड न्यूक्लियोटाइड का उपयोग करना सुनिश्चित करें जो विशिष्ट 5 'ओवरहैंग्स को भर सकते हैं और प्रत्येक कॉकटेल के लिए सबसे इष्टतम बफर का उपयोग कर सकते हैं। DpnII अपने स्वयं के बफर के साथ आता है और एंजाइम निर्माता डीडीईआई पाचन के लिए एक विशिष्ट बफर की सिफारिश करता है। फिर भी, इस प्रोटोकॉल में DpnII और DDEI के साथ डबल-पाचन के लिए, प्रतिबंध बफर की सिफारिश की जाती है क्योंकि यह दोनों एंजाइमों के लिए 100% गतिविधि पर रेट किया गया है।

समस्या निवारण रचना कैप्चर
क्रोमोसोम रचना कैप्चर में तीन प्रमुख चरण: जेल पर परिणामों की कल्पना करने से पहले क्रॉसलिंकिंग, पाचन और रिलिगेशन सभी किए गए हैं। इन तीन चरणों में से प्रत्येक की गुणवत्ता निर्धारित करने और यह समझने के लिए कि समस्याएं कहां उत्पन्न हो सकती हैं, पाचन से पहले (सीआई) और बाद में (डीसी) एलिकोट लिए जाते हैं और लिगेटेड हाई-सी नमूने (चित्रा 2) के साथ जेल पर लोड किए जाते हैं। इस जेल का उपयोग हाई-सी नमूने की गुणवत्ता निर्धारित करने के लिए किया जाता है और क्या यह प्रोटोकॉल जारी रखने के लायक होगा। सीआई और डीसी के बिना, संभावित उप-मानक चरण (ओं) को इंगित करना मुश्किल है। यह ध्यान देने योग्य है कि उप-बंधाव लिगेशन में समस्या, फिल-इन, या क्रॉसलिंकिंग के साथ समस्या के कारण हो सकता है। क्रॉसलिंकिंग की समस्या का निवारण करने के लिए, सुनिश्चित करें कि प्रति पुस्तकालय 107 कोशिकाओं × 1 से अधिक का उपयोग न करें और ताजा क्रॉसलिंकिंग अभिकर्मकों और स्वच्छ कोशिकाओं (यानी, पीबीएस से धोया गया) के साथ शुरू करें। बंधाव के लिए, सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं और बंधाव मिश्रण को बर्फ पर रखा गया है। 4 घंटे से ठीक पहले टी 4 डीएनए लिगेज जोड़ें इनक्यूबेशन 16 डिग्री सेल्सियस पर और अच्छी तरह मिलाएं।

लायब्रेरी तैयारी में समस्या का निवारण
यदि पीसीआर अनुमापन (चित्रा 4) के बाद जेल पर 10 से अधिक पीसीआर चक्रों की आवश्यकता होती है या कोई पीसीआर उत्पाद नहीं देखा जा सकता है, तो हाई-सी नमूने को बचाने के लिए कुछ विकल्प हैं। पीसीआर अनुमापन से वापस काम करते हुए, पहला विकल्प पीसीआर को फिर से आज़माना है। यदि अभी भी पर्याप्त उत्पाद नहीं है, तो 1x TLE बफर के साथ दो बार मोतियों को धोने के बाद ए-टेलिंग और एडाप्टर लिगेशन (चरण 3.6) के एक और दौर का प्रयास करना संभव है। इस अतिरिक्त ए-टेलिंग और एडाप्टर लिगेशन के बाद, कोई भी पहले की तरह पीसीआर अनुमापन के लिए आगे बढ़ सकता है। यदि अभी भी कोई उत्पाद नहीं है, तो अंतिम विकल्प चरण 3.3 से 0.8x अंश को पुन: व्यवस्थित करना और वहां से आगे बढ़ना है।

हाई-C3.0 की सीमाएं और फायदे
यह महसूस करना महत्वपूर्ण है कि हाई-सी एक जनसंख्या-आधारित विधि है जो सेल आबादी में लोकी के जोड़े के बीच बातचीत की औसत आवृत्ति को पकड़ती है। कुछ कम्प्यूटेशनल विश्लेषण25 की आबादी से अनुरूपता के संयोजन को अलग करने के लिए डिज़ाइन किए गए हैं, लेकिन सिद्धांत रूप में, हाई-सी कोशिकाओं के बीच अंतर के लिए अंधा है। यद्यपि एकल-सेल हाई-सी26,27 करना संभव है और कम्प्यूटेशनल निष्कर्ष28 बनाए जा सकते हैं, एकल-सेल हाई-सी अल्ट्राहाई-रिज़ॉल्यूशन 3 सी जानकारी प्राप्त करने के लिए उपयुक्त नहीं है। हाई-सी की एक अतिरिक्त सीमा यह है कि यह केवल जोड़ीवार इंटरैक्शन का पता लगाता है। मल्टीकॉन्टैक्ट इंटरैक्शन का पता लगाने के लिए, कोई या तो शॉर्ट-रीड सीक्वेंसिंग (इलुमिना) 16 के साथ संयुक्त लगातार कटर का उपयोग कर सकता है या पैकबायो या ऑक्सफोर्ड नैनोपोर प्लेटफार्मों से लंबे समय तक पढ़े जाने वाले अनुक्रमण का उपयोग करके मल्टीकॉन्टैक्ट 3 सी29 या 4 सी30 कर सकता है। विशेष रूप से बहन क्रोमैटिड के बीच और उसके साथ संपर्कों का पता लगाने के लिए हाई-सी डेरिवेटिव भी31,32 विकसित किए गए हैं।

यद्यपि हाई-सी19 और माइक्रो-सी33 का उपयोग सबकिलोबेस रिज़ॉल्यूशन पर संपर्क मानचित्र उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है, दोनों को बड़ी मात्रा में अनुक्रमण पढ़ने की आवश्यकता होती है और यह एक महंगा उपक्रम बन सकता है। लागत के बिना समान या उच्च रिज़ॉल्यूशन प्राप्त करने के लिए, विशिष्ट जीनोमिक क्षेत्रों (कैप्चर-सी34) या विशिष्ट प्रोटीन इंटरैक्शन (चिया-पीईटी35, पीएलएसी-सेक36, हाई-सीएचआईपी37) के लिए संवर्धन लागू किया जा सकता है। इन संवर्धन अनुप्रयोगों की ताकत और नकारात्मक पक्ष यह है कि केवल सीमित संख्या में इंटरैक्शन का नमूना लिया जाता है। इस तरह के संवर्धन के साथ, हाई-सी का वैश्विक पहलू (और वैश्विक सामान्यीकरण का विकल्प) खो जाता है।

हाय-C3.0 का महत्व और संभावित अनुप्रयोग
इस प्रोटोकॉल को उच्च-रिज़ॉल्यूशन, अल्ट्राडीप 3 सी को सक्षम करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, जबकि साथ ही टीएडी और डिब्बों17 (चित्रा 6) जैसे बड़े पैमाने पर फोल्डिंग सुविधाओं का पता लगाया गया था। यह प्रोटोकॉल प्रत्येक हाई-सी लाइब्रेरी के लिए प्रति ट्यूब 5 × 106 कोशिकाओं के साथ शुरू होता है, जो 1 बिलियन युग्मित-अंत पठन प्राप्त करने के लिए प्रवाह सेल पर एक या दो लेन अनुक्रमित करने के लिए पर्याप्त सामग्री से अधिक होना चाहिए। अल्ट्राडीप अनुक्रमण के लिए, मैप किए गए रीड और पीसीआर डुप्लिकेट की संख्या के आधार पर 5 × 106 कोशिकाओं के कई ट्यूब तैयार किए जाने चाहिए। उच्चतम रिज़ॉल्यूशन (<1 केबी) पर, लूपिंग इंटरैक्शन ज्यादातर सीटीसीएफ साइटों के बीच पाए जाते हैं, लेकिन प्रमोटर-एन्हांसर इंटरैक्शन का भी पता लगाया जा सकता है। पाठक डेटा विश्लेषण के विस्तृत विवरण के लिए एकगोल ओकसुज़ एट अल .17 का उल्लेख कर सकते हैं।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम प्रोटोकॉल विकास के लिए डेनिस लाफोंटेन और जैव सूचना विज्ञान सहायता के लिए सर्गेई वेनेव को धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ कॉमन फंड 4 डी न्यूक्लियोम प्रोग्राम से जेडी (यू 54-डीके 107980, यूएम 1-एचजी 011536) के अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। जेडी हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट के एक अन्वेषक हैं।

यह लेख HHMI की प्रकाशनों के लिए खुली पहुँच नीति के अधीन है। एचएचएमआई प्रयोगशाला प्रमुखों ने पहले अपने शोध लेखों में जनता को एक गैर-विशिष्ट सीसी बीवाई 4.0 लाइसेंस और एचएचएमआई को एक उप-लाइसेंस योग्य लाइसेंस दिया है। उन लाइसेंसों के अनुसार, इस लेख की लेखक-स्वीकृत पांडुलिपि को प्रकाशन के तुरंत बाद सीसी बीवाई 4.0 लाइसेंस के तहत स्वतंत्र रूप से उपलब्ध कराया जा सकता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 kb Ladder New England Biolabs N3232L
Agarose Invitrogen 16500100
Agencourt AMPure XP magnetic beads , 60 mL Beckman Coulter A63881
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit (CFU) EMD Millipore UFC500396
Annealing Buffer (5x) See recipe in supplemental materials
ATP 10 mM ThermoFisher R0441
Avanti J-25i High Speed Refrigerated ultra-centrifuge Beckman Coulter
beckman ultracentrifuge tube 35 mL Beckman Coulter 357002
Binding Buffer (2x) See recipe in supplemental materials
biotin-14-dATP 0.4 mM Invitrogen 19524-016
BSA 10 mg/mL New England Biolabs B9000S dilute from 20 mg/mL
Cell scraper Falcon 353089
Cell scraper Corning 3008
Conical polypropylene tubes 50 mL Denville C1062-P
Conical tube 15 mL Denville C1017-P
Covaris micro tube AFA fiber with snap-cap 130 µL Covaris 520045/520077
Covaris Sonicator Covaris E220/E220evolution/M220
Culture flask 175 cm2 Falcon 353112
Culture plates 150 mm x 25 mm Corning 430599
dATP 1 mM Invitrogen 56172
dATP 10 mM Invitrogen 56172
dCTP 10 mM Invitrogen 56173
DdeI New England Biolabs R0175L
dGTP 10 mM Invitrogen 56174
DMSO Sigma D2650-5x10ML
dNTP mix 25 mM Invitrogen 10297117
Dounce homogenizer DWK Life Sciences 8853010002/8853030002
DPBS Gibco 14190-144
DpnII New England Biolabs R0543M
DSG ThermoScientific 20593
dTTP 10 mM Invitrogen 56175
Ethanol 70% Fisher A409-4 Diluted from 100%
Ethidium Bromide Fisher BP1302-10
Formaldehyde (37%) Fisher BP531-500
Gel loading dye (6x ) New England Biolabs B7024S
Glycine in ultrapure water 2.5 M Sigma G8898-1KG
HBSS Gibco 14025-092
Igepal CA-630 detergent MP Biomedicals 198596
Klenow DNA polymerase 5 U/µL New England Biolabs M0210L
Klenow Fragment 3-->5’ exo-, 5 U/µL New England Biolabs M0212L
ligation buffer (10x) New England Biolabs B7203S
Liquid nitrogen
LoBind microcentrifuge tube 1.7 mL Eppendorf 22431021
Low Molecular Weight DNA Ladder New England Biolabs N3233L
Lysis buffer See recipe in supplemental materials
Magnetic Particle separator ThermoFisher 12321D
Microfuge tubes 1.7 mL Axygen MCT-175-C
MyOne Streptavidin C1 beads Invitrogen 65001
NEBuffer 2.1 (10x) New England Biolabs B7002S
NEBuffer 3.1 (10x) New England Biolabs B7203S
PBS Gibco 70013-032
PCR (strip) tubes Biorad TBS0201/ TCS0803
PCR thermocycler Biorad T100
Pfu Ultra II Buffer (10x) Agilent Comes with Pfu Ultra
PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase  Agilent 600674
Phase lock tube 15 mL Qiagen 129065
Phase lock tubes 2 mL Qiagen 129056
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol Invitrogen 15593-049
Protease inhibitor cocktail ThermoFisher 78440
Proteinase K in ultrapure water 10 mg/mL Invitrogen 25530-031
Refrigerated Centrifuge Eppendorf 5810R
RNase A, DNase and protease-free 10 mg/mL Thermo Scientific EN0531
Rotator Argos technologies EW-04397-40 or rocking platform
SDS 1% Fisher BP13111
Sodium acetate pH = 5.2, 3 M Sigma
Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System Biorad 1704401
T4 DNA ligase 1 U/µL Invitrogen 100004817
T4 DNA polymerase New England Biolabs M0203L
T4 DNA polymerase New England Biolabs M0203L
T4 DNA polymerase 3 U/µL New England Biolabs M0203L
T4 ligation buffer (5x) Invitrogen Y90001
T4 polynucleotide kinase 10 U/µL New England Biolabs M0201L
Tabletop centrifuge Eppendorf 5425
TBE buffer See recipe in supplemental materials
Tris Low EDTA Buffer (TLE) See recipe in supplemental materials
Triton X-100 (10%) Sigma 93443
Truseq adapter oligos Integrated DNA Technologies (IDT)) https://www.idtdna.com/site/order/oligoentry 250 nmole and HPLC purified
Tween 20 detergent Fisher 9005-64-5
Tween Wash Buffer See recipe in supplemental materials
Vortex Scientific Industries (G560)SI-0236

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. Capturing chromosome conformation. Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).
  2. Simonis, M., et al. Nuclear organization of active and inactive chromatin domains uncovered by chromosome conformation capture-on-chip (4C). Nature Genetics. 38 (11), 1348-1354 (2006).
  3. Dostie, J., et al. Chromosome Conformation Capture Carbon Copy (5C): a massively parallel solution for mapping interactions between genomic elements. Genome Research. 16 (10), 1299-1309 (2006).
  4. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
  5. Stadhouders, R., et al. Multiplexed chromosome conformation capture sequencing for rapid genome-scale high-resolution detection of long-range chromatin interactions. Nature Protocols. 8 (3), 509-524 (2013).
  6. Kalhor, R., Tjong, H., Jayathilaka, N., Alber, F., Chen, L. Genome architectures revealed by tethered chromosome conformation capture and population-based modeling. Nature Biotechnology. 30 (1), 90-98 (2012).
  7. Hsieh, T. H., et al. Mapping nucleosome resolution chromosome folding in yeast by micro-C. Cell. 162 (1), 108-119 (2015).
  8. Hsieh, T. -H. S., Fudenberg, G., Goloborodko, A., Rando, O. J. Micro-C XL: assaying chromosome conformation from the nucleosome to the entire genome. Nature Methods. 13 (12), 1009-1011 (2016).
  9. Denker, A., de Laat, W. The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization. Genes & Development. 30 (12), 1357-1382 (2016).
  10. Rodley, C. D., Bertels, F., Jones, B., O’Sullivan, J. M. Global identification of yeast chromosome interactions using Genome conformation capture. Fungal Genetics and Biology. 46 (11), 879-886 (2009).
  11. Rao, S. S., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
  12. Alipour, E., Marko, J. F. Self-organization of domain structures by DNA-loop-extruding enzymes. Nucleic Acids Research. 40 (22), 11202-11212 (2012).
  13. Lajoie, B. R., Dekker, J., Kaplan, N. The Hitchhiker’s guide to Hi-C analysis: Practical guidelines. Methods. 72, 65-75 (2015).
  14. Belaghzal, H., Dekker, J., Gibcus, J. H. Hi-C 2.0: An optimized Hi-C procedure for high-resolution genome-wide mapping of chromosome conformation. Methods. 123, 56-65 (2017).
  15. Golloshi, R., Sanders, J. T., McCord, R. P. Iteratively improving Hi-C experiments one step at a time. Methods. 142, 47-58 (2018).
  16. Darrow, E. M., et al. Deletion of DXZ4 on the human inactive X chromosome alters higher-order genome architecture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (31), 4504-4512 (2016).
  17. Akgol Oksuz, B., et al. Systematic evaluation of chromosome conformation capture assays. Nature Methods. 18 (9), 1046-1055 (2021).
  18. Ghuryeid, J., et al. Integrating Hi-C links with assembly graphs for chromosome-scale assembly. PLoS Computational Biology. 15 (8), 1007273 (2019).
  19. Gu, H., et al. Fine-mapping of nuclear compartments using ultra-deep Hi-C shows that active promoter and enhancer elements localize in the active A compartment even when adjacent sequences do not. bioRxiv. , (2021).
  20. Ramani, V., et al. Mapping 3D genome architecture through in situ DNase Hi-C. Nature Protocols. 11 (11), 2104-2121 (2016).
  21. Lafontaine, D. L., Yang, L., Dekker, J., Gibcus, J. H. Hi-C 3.0: Improved Protocol for Genome-Wide Chromosome Conformation Capture. Current Protocols. 1 (7), 198 (2021).
  22. Belton, J. -M. M., et al. Hi-C: A comprehensive technique to capture the conformation of genomes. Methods. 58 (3), 268-276 (2012).
  23. Truch, J., Telenius, J., Higgs, D. R., Gibbons, R. J. How to tackle challenging ChIP-Seq, with long-range cross-linking, Using ATRX as an example. Methods in Molecular Biology. 1832, Clifton, N.J. 105-130 (2018).
  24. Wang, P., et al. In situ chromatin interaction analysis using paired-end tag sequencing. Current Protocols. 1 (8), 174 (2021).
  25. Tjong, H., et al. Population-based 3D genome structure analysis reveals driving forces in spatial genome organization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1663-1672 (2016).
  26. Nagano, T., et al. Cell-cycle dynamics of chromosomal organization at single-cell resolution. Nature. 547 (7661), 61-67 (2017).
  27. Ramani, V., et al. Massively multiplex single-cell Hi-C. Nature Methods. 14 (3), 263-266 (2017).
  28. Meng, L., Wang, C., Shi, Y., Luo, Q. Si-C is a method for inferring super-resolution intact genome structure from single-cell Hi-C data. Nature Communications. 12 (1), 4369 (2021).
  29. Tavares-Cadete, F., Norouzi, D., Dekker, B., Liu, Y., Dekker, J. Multi-contact 3C reveals that the human genome during interphase is largely not entangled. Nature Structural & Molecular Biology. 27 (12), 1105-1114 (2020).
  30. Vermeulen, C., et al. Multi-contact 4C: long-molecule sequencing of complex proximity ligation products to uncover local cooperative and competitive chromatin topologies. Nature Protocols. 15 (2), 364-397 (2020).
  31. Oomen, M. E., Hedger, A. K., Watts, J. K., Dekker, J. Detecting chromatin interactions between and along sister chromatids with SisterC. Nature Methods. 17 (10), 1002-1009 (2020).
  32. Mitter, M., et al. Conformation of sister chromatids in the replicated human genome. Nature. 586 (7827), 139-144 (2020).
  33. Krietenstein, N., et al. Ultrastructural Details of Mammalian Chromosome Architecture. Molecular Cell. 78 (3), 554-565 (2020).
  34. Hughes, J. R., et al. Analysis of hundreds of cis-regulatory landscapes at high resolution in a single, high-throughput experiment. Nature Genetics. 46 (2), 205-212 (2014).
  35. Fullwood, M. J., et al. An oestrogen-receptor-alpha-bound human chromatin interactome. Nature. 462 (7269), 58-64 (2009).
  36. Fang, R., et al. Mapping of long-range chromatin interactions by proximity ligation-assisted ChIP-seq. Cell Research. 26 (12), 1345-1348 (2016).
  37. Mumbach, M. R., et al. HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nature Methods. 13 (11), 919-922 (2016).

Tags

जेनेटिक्स अंक 191 क्रोमोसोम रचना कैप्चर क्रॉसलिंकिंग प्रतिबंध पाचन क्रोमैटिन लूप डॉट्स टोपोलॉजिकल रूप से संबद्ध डोमेन कंपार्टमेंटलाइजेशन
लंबाई के पैमाने पर क्रोमोसोम रचना कैप्चर करना
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, L., Akgol Oksuz, B., Dekker,… More

Yang, L., Akgol Oksuz, B., Dekker, J., Gibcus, J. H. Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales. J. Vis. Exp. (191), e64001, doi:10.3791/64001 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter