Summary
Hi-C 3.0は、ホルムアルデヒドおよびジスクシンイミジルグルタル酸架橋剤をDpnIIおよびDdeI制限酵素のカクテルと組み合わせて、クロマチン相互作用検出のS/N比と分解能を高める改良されたHi-Cプロトコルです。
Abstract
染色体コンフォメーションキャプチャ(3C)は、3次元クロマチン相互作用を検出するために使用されます。通常、ホルムアルデヒド(FA)による化学架橋は、クロマチン相互作用を固定するために使用されます。次に、制限酵素によるクロマチン消化とそれに続くフラグメント末端のライゲーションにより、3次元(3D)近接性が独自のライゲーション産物に変換されます。最後に、架橋の逆転、タンパク質除去、およびDNA単離の後、DNAをせん断し、ハイスループットシーケンシング用に準備します。遺伝子座の対の近接ライゲーションの頻度は、細胞集団における三次元空間におけるそれらの共局在の頻度の尺度である。
配列決定されたHi-Cライブラリは、遺伝子座のすべてのペア間の相互作用頻度に関するゲノム全体の情報を提供します。Hi-Cの分解能と精度は、クロマチンの接触とクロマチンの頻繁で均一な断片化を維持する効率的な架橋に依存しています。この論文では、2つの架橋剤(ホルムアルデヒド[FA]とジスクシンイミジルグルタル酸[DSG])を組み合わせることで架橋効率を高め、2つの制限酵素(DpnIIとDdeI)を使用してより細かい消化を行うことで、改良された in situHi-C プロトコルHi-C 3.0について説明します。Hi-C 3.0は、ループやトポロジー関連ドメイン(TAD)などの小さなスケールでのゲノムフォールディングの特徴、およびコンパートメントなどの大きな核全体のスケールでの特徴を正確に定量化するための単一のプロトコルです。
Introduction
染色体コンフォメーションキャプチャーは、2002年から使用されています1。基本的に、すべてのコンフォメーションキャプチャバリアントは、3Dクロマチン組織を維持するためにDNA-タンパク質およびタンパク質-タンパク質相互作用の固定に依存しています。これに続いて、通常は制限酵素処理によるDNA断片化が行われ、最後に、近くのDNA末端がライゲーションされて、空間的に近位の遺伝子座が固有の共有DNA配列に変換されます。初期の3Cプロトコルでは、PCRを使用して特定の「1対1」の相互作用をサンプリングしていました。その後の4Cアッセイでは、「1対すべて」の相互作用2の検出が可能になり、5Cは「多対多」の相互作用3を検出できました。染色体コンフォメーションキャプチャは、ゲノムワイドなHi-C4および3C-seq5、TCC6、Micro-C 7,8などの同等の技術を使用して「オールツーオール」ゲノム相互作用の検出を可能にする次世代のハイスループットシーケンシング(NGS)を実装した後に完全に実を結びました(DenkerとDe Laat9によるレビューも参照)。
Hi-Cでは、ビオチン化ヌクレオチドを使用して、消化後およびライゲーション前に5'オーバーハングをマークします(図1)。これにより、ストレプトアビジンコーティングビーズを使用して適切に消化およびライゲーションされたフラグメントを選択でき、GCC10とは一線を画しています。Hi-Cプロトコルの重要な更新は、スプリアスライゲーション生成物を減らすために無傷の核(すなわち、in situ)で消化とライゲーションを行ったRaoら11によって実装されました。さらに、HindIII消化をMboI(またはDpnII)消化に置き換えると、フラグメントサイズが小さくなり、Hi-Cの分解能の可能性が高まりました。この増加により、比較的小規模な構造の検出が可能になり、小さなシスエレメント間のDNAループ、例えばループ押出によって生成されたCTCF結合部位間のループなど、接触点のより正確なゲノム局在が可能になりました11,12。ただし、この可能性にはコストがかかります。まず、分解能を2倍に向上させるには、シーケンシングリードを4倍(22)に増やす必要があります13。第2に、断片サイズが小さいと、未消化の隣接断片を消化断片およびライゲーション断片と間違える可能性が高まります14。前述のように、Hi-Cでは、消化された断片およびライゲーションされた断片は、ライゲーション接合部におけるビオチンの存在によって未消化断片とは異なる。しかしながら、ライゲーション接合部のみが引き下げられることを保証するために、結紮されていない末端からの適切なビオチン除去が必要である14、15。
NGSのコストが下がるにつれて、染色体折り畳みをより詳細に研究することが可能になります。DNA断片のサイズを減少させ、それによって分離能を増加させるために、Hi−Cプロトコルは、より頻繁に切断制限酵素16を使用するか、または制限酵素17、18、19の組み合わせを使用するように適合させることができる。あるいは、マイクロC中のMNase 7,8およびDNase Hi-C20中のDNaseを滴定して、最適な消化を達成することができます。
3C法の基礎に関する最近の系統的評価では、1%FAとそれに続く3 mM DSG17による連続架橋により、あらゆる長さスケールでの染色体折り畳み機能の検出が大幅に改善されることが示されました。さらに、HindIII消化を伴うHi-Cは、コンパートメントなどの大規模なフォールディング機能を検出するための最良のオプションであり、Micro-CはDNAループなどの小規模なフォールディング機能の検出に優れていました。これらの結果は、FA架橋剤とDSG架橋剤の組み合わせを使用し、その後DpnIIおよびDdeIエンドヌクレアーゼ21で二重消化する単一の高分解能「Hi-C 3.0」戦略の開発につながりました。Hi-C 3.0は、すべての長さスケールで折り畳み機能を正確に検出するため、一般的な使用に効果的な戦略を提供します17。Hi-C 3.0プロトコルの実験部分はここで詳述され、シーケンシング後に期待できる典型的な結果が示されています。
図1:6つのステップでのHi-C手順。 セルは最初にFAで固定され、次にDSGで固定されます(1)。次に、溶解はDdeIとDpnIIによる二重消化に先行します(2)。ビオチンはオーバーハングフィルインによって添加され、近位平滑末端はDNA精製(4)の前にライゲーションされます(3)。ビオチンは、超音波処理およびサイズ選択の前に結紮されていない末端から除去される(5)。最後に、ビオチンのプルダウンにより、アダプターライゲーションとPCRによるライブラリ増幅が可能になります(6)。略語:FA =ホルムアルデヒド;DSG =ジスクシンイミジルグルタル酸;B =ビオチン。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Protocol
1.架橋による固定
- ホルムアルデヒド固定:単層の細胞から出発
- 細胞を適切な培地に播種して、150mmプレートあたり5×106 細胞を回収する。
注:ユーザーは、任意の哺乳類細胞株の最適な増殖を保証する任意の好ましい容器を選択することができます。さらに、細胞は組織から単離することができる。 - 150 mmプレートから真空トラップに結合したパスツールピペットで培地を吸引し、~10 mL HBSSで2回洗浄します。
- 架橋の直前に、22.5 mLのHBSSと625 μLの37%FAを最終濃度1%まで組み合わせて、50 mLチューブに1%FA架橋溶液を調製します。揺り動かして穏やかに混ぜます。
注意: ヒュームフードを使用してください。ホルムアルデヒドは有毒です。 - 細胞を架橋するには、23.125 mLの1%FA溶液を各15 cmプレートに注ぎます。
- 室温で10分間インキュベートし、2分ごとに手でプレートを静かに揺り動かします。
- 1.25 mLの2.5 Mグリシン(最終128 mM)を加え、プレートを静かに回転させて架橋反応を消光します。
- 室温で5分間インキュベートし、氷上で少なくとも15分間インキュベートして架橋を停止します。
- セルスクレーパーまたはゴム製の警官でプレートからセルをこすります。
- 細胞懸濁液をピペット付きの50 mLコニカルチューブに移します。室温で1,000×gで10分間遠心分離し、吸引により上清を廃棄します。
- 細胞ペレットを10 mLのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で1回洗浄し、ピペットを使用して再懸濁します。その後、室温で1,000 × g で10分間遠心分離します。すぐにDSG架橋に進みます。
注意: 細胞ペレットを洗うときは、細胞ペレットが緩んで細胞が失われる可能性があるため、注意してください。
- 細胞を適切な培地に播種して、150mmプレートあたり5×106 細胞を回収する。
- ホルムアルデヒド固定:懸濁中の細胞から始める
- 細胞を適切な培地に播種して、1容器あたり5×106 細胞を回収する。
注:ユーザーは、任意の哺乳類細胞株の最適な細胞増殖を保証する任意の好ましい容器を選択できます。 - 収穫直前に細胞を数え、5 × 106 細胞を50 mLのコニカルチューブに移します。
- 室温で10分間300 × g で遠心分離することにより、細胞を穏やかにペレット化します。
- HBSS45mLに1.25mLの37%FAを加えて1%FA架橋液を調製し、チューブを数回反転させて混合します。
注:量を分割せずに1.25mLのFA全体を追加します。
注意: ホルムアルデヒドは非常に有毒です。 - 前工程で調製した46.25 mLの1%FA架橋溶液に細胞ペレットを上下にピペッティングして再懸濁する。
- 室温でローテーター、ロッカーで正確に10分間、または1〜2分ごとにチューブを穏やかに手動で反転させてインキュベートします。
- 2.5 mLの2.5 Mグリシン(最終128 mM)を加えて架橋反応をクエンチし、チューブを反転させてよく混合します。
- 室温で5分間インキュベートした後、氷上で少なくとも15分間インキュベートして、架橋を完全に停止します。
- 室温で遠心分離し、架橋細胞を1,000 × g で10分間ペレット化し、吸引により上清を廃棄します。
- 細胞を10 mLのDPBSで1回洗浄した後、室温で1,000 × g で10分間遠心分離します。ピペットを使用して上清を完全に廃棄し、直ちにDSG架橋に進みます。
注意: 細胞ペレットを洗うときは、細胞ペレットが緩んで細胞が失われる可能性があるため、注意してください。
- 細胞を適切な培地に播種して、1容器あたり5×106 細胞を回収する。
- ジスクシンイミジルグルタル酸による架橋
- ペレット化した細胞を9.9 mLのDPBSに再懸濁してから、100 μLの300 mM DSG(3 mM最終)を加えます。反転で混ぜます。
注意: DSGは湿気に敏感です。架橋の日にDMSOで300 mM DSGの新鮮なストックを準備することが重要です。
注意: DMSOのDSGは非常に有毒です。 - 細胞をローテーター上で室温で40分間架橋します。
- 1.925 mLの2.5 Mグリシン(最終400 mM)を加え、転倒させて混合し、室温で5分間インキュベートします。
- 細胞を2,000 × g で室温で15分間遠心分離します。
注:緩い細胞ペレットから上清を除去するときは注意してください。 - ペレットを1 mLの0.05%ウシ血清アルブミン(BSA)-DPBSに再懸濁し、1.7 mLチューブに移します。
注:BSAを添加すると、細胞の凝集を減らすのに役立ちます。 - 細胞を2,000 × g で4°Cで15分間遠心分離し、ピペットで上清を除去します。
注:ペレットの損失を避けるために、上清を迅速かつ完全に除去します。 - ペレットを液体窒素で急速凍結し、-80°Cで保存するか、すぐに次のステップに進みます。
- ペレット化した細胞を9.9 mLのDPBSに再懸濁してから、100 μLの300 mM DSG(3 mM最終)を加えます。反転で混ぜます。
2. 染色体立体構造捕捉
- 細胞溶解とクロマチン消化
- 架橋細胞アリコート(~5 × 106 細胞)を、10 μLのプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む1 mLの氷冷溶解バッファー( 補足表S1のレシピ)に再懸濁(ピペット)し、ダウンスホモジナイザーに移して氷上で15分間インキュベートします。
注:使用直前にプロテアーゼ阻害剤を溶解バッファーに追加します。 - 乳棒Aをゆっくりと上下に30回動かして氷上で細胞を均質化し、氷上で1分間インキュベートして細胞を冷ましてから、さらに30ストロークします。
- ライセートを1.7 mLのマイクロ遠心チューブに移します。
注意: 細胞がピペットチップにくっつくことがあるので、懸濁液を動かし続けてください。 - 溶解した懸濁液を2,500 × g で室温で5分間遠心分離します。
- 上清を廃棄し、湿ったペレットをフリックまたはボルテックスして再懸濁する。できるだけ多くの上清を取り除き、塊を最小限に抑えたヨーグルト様物質を得る。
- ペレットを500 μLの氷冷1x制限バッファー(10xから; 補足表S1のレシピを参照)に再懸濁し、2,500 × gで5分間遠心分離します。この手順を繰り返して、2回目の洗浄を行います。
注:1x制限バッファーのペレットは、溶解バッファーの以前のペレットよりも粒状です。 - 細胞サイズに応じて、ペレットのキャリーオーバー容量に~340 μLを加えた後、ピペッティングにより、最終容量360 μLの1x制限バッファーに細胞を再懸濁します。
- クロマチンインテグリティ(CI)をテストするために、各ライセート18 μLを確保します。CIサンプルは4°Cで保存してください。
- 各Hi-Cチューブに38 μLの1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を加え(総容量380 μL)、気泡を導入せずにピペッティングで慎重に混合します。
注意: SDSは有毒です。 - サンプルを65°Cで正確に10分間振とうせずにインキュベートし、クロマチンを開きます。
- すぐにチューブを氷の上に置き、 表1に記載されているように、Triton X-100で消化混合物を調製してSDSを急冷します。
- 107 μLの消化混合物をHi-Cチューブ(合計487 μL)に加え、インターバル振とう(例:900 rpm、30秒オン、4分オフ)のサーモミキサーでクロマチンを37°Cで一晩(~16時間)消化します。
注:最終濃度1%にトリトンを添加すると、SDSを消光するのに役立ちます。
- 架橋細胞アリコート(~5 × 106 細胞)を、10 μLのプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む1 mLの氷冷溶解バッファー( 補足表S1のレシピ)に再懸濁(ピペット)し、ダウンスホモジナイザーに移して氷上で15分間インキュベートします。
- DNA末端のビオチン化
- 一晩消化した後、サンプルを65°Cで20分間移し、残りのエンドヌクレアーゼ活性を失活させます。
- インキュベーション中に、 表2に示すようにフィルインマスターミックスを調製する。
- インキュベーション後、サンプルをすぐに氷の上に置きます。
- 各サンプルに10 μLの消化コントロール(DC)を用意し、4°Cで保存します。
- ピペットまたは回転させて蓋から結露を取り除きます。各サンプルに、58 μLのビオチンフィルインミックス(総サンプル容量535 μL)を加え、気泡を形成せずに穏やかにピペットします。
- サンプルをサーモミキサーで23°Cで4時間インキュベートします(例:900 rpm、30秒オン、4分オフ)。
- 近位DNA断片のライゲーション
- ビオチンフィルインがインキュベートしている間に 表3 に示すようにライゲーションミックスを調製する。
- 各サンプルに665 μLのライゲーションミックスを加えます(総サンプル量1,200 μL)。ピペッティングで穏やかに混ぜます。
- サンプルを16°Cで4時間、インターバル振とうしながらサーモミキサーでインキュベートします(例:900 rpm、30秒オン、4分オフ)。共有結合したクロマチンを含むこれらのサンプルを4°Cで数日間保存します。
- 架橋の逆転
- CIおよびDCサンプルの容量を1xトリス低EDTA(TLE; 補足表S1のレシピを参照)で50μLにします。
- 10 μLの10 mg/mLプロテイナーゼKをCIおよびDCサンプルに加えます。
- 65°Cで一晩、インターバル振とう(例:900 rpm、30秒オン、4分オフ)でインキュベートします。あるいは、Hi-CサンプルのDNA精製中に、これらのコントロールに対して架橋の30分間の逆転を実行します。
- 各Hi-Cサンプルに50 μLの10 mg/mLプロテイナーゼKを加え、65°Cでインターバル振とうしながら少なくとも2時間インキュベートします(例:900 rpm、30秒オン、4分オフ)。
- さらに50 μLの10 mg/mLプロテイナーゼKを各Hi-Cチューブ(総サンプル量1,300 μL)に加え、65°Cで一晩インキュベートを続けます。DNA精製まで4°Cで保存する。
注:プロテイナーゼKインキュベーションを分割することで、タンパク質の総消化が保証されます。
- DNA精製
- チューブを65°Cから室温まで冷却します。
- 各サンプルを15 mLのコニカルチューブに移し、2.6 mL(2倍容量)のフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコールを各チューブに加えます。
注意:フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコールは非常に有毒な刺激物であり、発がん性の可能性があります。 - 各チューブを1分間ボルテックスしてから、その内容物を15 mLのフェーズロックチューブに移します。
- ベンチトップ遠心分離機で最高速度(1,500〜3,500 × g)でサンプルを5分間遠心分離します。
- 水相を35 mLの超遠心チューブに注意深く注ぎ、最終容量1,250 μLになるまで超純水を加えます。
注意: チューブを使用して、利用可能な超遠心分離機に合わせるか、複数のマイクロ遠心チューブに分割します。 - 3 M酢酸ナトリウムの1/10番目の 容量(~125 μL)を加え、転倒してよく混合します。
- 各サンプルに2.5倍容量(~3.4 mL)の氷冷100%エタノールを加え、氷冷した100%エタノールを加えて超遠心分離用のチューブのバランスを取り、反転してよく混合します。
- チューブをドライアイスで~15分間インキュベートします(固化を避けます)。
- チューブを18,000 × g で4°Cで30分間遠心分離します。
注意: 角度の付いたローターの場合:ペレットがある場所のチューブに印を付けます。 - ピペットを使用して、非ペレット側から上清を完全に除去して廃棄します。
注意: この時点で、ペレットは見えるようになり、次のステップで乾燥した後にはっきりと見えない可能性があるため、チューブにマークを付けることができます。 - サンプルを約10分間、または目に見えて乾くまで風乾します。
- 各ペレットをピペッティングまたは旋回によって1x TLEの450 μLに可溶化し、分子量3 kDaのカットオフで0.5 mL遠心フィルターユニット(CFU)に移します。
- CFUを最高速度で10分間遠心分離し、フロースルーを廃棄します。各超遠心チューブを追加450 μLの1x TLEで洗浄し、CFUに移して再度洗浄します。
注:この方法でCFUを洗浄すると、塩分濃度を下げながらDNAの損失を制限します。 - CFUを最高速度で10分間遠心分離し、フロースルーを廃棄します。
- 80 μLの1x TLEをカラムに加え、カラムを新しい回収チューブに回転させてから、最高速度で2分間遠心分離して、~100 μLの最終容量を得ます。
- 各サンプルに1 μLのRnaseA(1 mg/mL、10 mg/mLストックの10倍希釈)を加え、ヒートブロック、ウォーターバス、またはサーモミキサーで37°Cで少なくとも30分間インキュベートします。
- Rnase処理後、サンプルを37°Cから取り出し、品質管理ステップまで4°Cで保存します。
- クロマチン品質、酵素消化、サンプルライゲーションのチェック
- ステップ2.4.5で架橋を反転させた後、CIおよびDCサンプルを室温まで冷却します。その後、予め紡糸した2 mLフェーズロックチューブに移します。
注意: フェーズロックの内容物がペレットに遠心分離されていることを確認してください(最高速度2分間)。 - フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール200 μLを加え、1分間ボルテックスしてサンプルを混合します。
- チューブを最高速度で5分間遠心分離します。
- 各サンプル(~50 μL)の水相を新しい1.7 mLマイクロフュージチューブに移します。
- 1 μLのルナーゼA(1 mg/mLから)を加え、37°Cで少なくとも30分間インキュベートします。
- 表4で推奨されているように、サンプルを0.8%アガロースゲルにロードします。
注: 品質管理から期待される結果を 図 2 に示します。 - ゲルからのデンシトメトリー、またはキュービットまたはナノドロップを使用してDNAを定量します。
注:正確な定量により、プロトコルの次の部分で正しい入力ボリュームが保証されます。既知の量を持つ複数の標準を使用して、検量線を作成します。
- ステップ2.4.5で架橋を反転させた後、CIおよびDCサンプルを室温まで冷却します。その後、予め紡糸した2 mLフェーズロックチューブに移します。
表1:消化試薬。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表2:ビオチン充填試薬。 *酵素の変更には、異なるバッファーとビオチン化dNTPが必要になる場合があります。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表3:ライゲーションミックス試薬。 略称:BSA =ウシ血清アルブミン。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表4:品質およびサイズ選択評価のためのゲル負荷パラメータ。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
図2:典型的なポストDNA精製精度管理結果を示すアガロースゲル 。 (A)CIコントロールは、高分子量のDNAのバンドを示す必要があります。(B)DCおよびHi-Cサンプルは、さまざまなDNAサイズを示しています。より大きな断片に結合されたHi-Cサンプルは、DCよりも高い分子量でなければなりません。マーカーの濃度範囲により、検量線を生成できます。この例では、CIは別のゲルにロードされていますが、すべてのサンプルとコントロールを一緒にロードして実行することをお勧めします。略語:CI =クロマチン完全性;DC =消化制御;Hi-C = 近接結紮。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
3. Hi-Cシーケンシングライブラリの調製
- 結紮されていない末端からのビオチンの除去
- 表5に示すようにビオチン除去反応液を調製する。
注:通常、10 μgのDNAで十分ですが、最大30 μgを使用できます。 - 各130 μL反応から2 x 65 μLのアリコートを2本のPCRチューブに分配します。
- サーモサイクラーまたはPCRマシンに移し、 表5に記載のようにインキュベートします。
注:サンプルは、4°C(数日から数週間)、-20°C(長期)、またはすぐに超音波処理に持ち越してここに保存することができます。
- 表5に示すようにビオチン除去反応液を調製する。
- 超音波
- ビオチン除去ステップ(130μL総サンプル量)からサンプルの複製を超音波処理用の130μL超音波処理器チューブにプールします。
- 表6に与えられたパラメータを使用してサンプルを超音波処理し、500bp未満のタイトな狭い分布を達成します。
注:異なる超音波処理器タイプを使用することができますが、狭いフラグメント分布(100-500 bp)の場合、超音波処理器の設定は最適化が必要な場合があります。
- 磁気ビーズによるサイズ選択
- 超音波処理管から超音波処理されたDNAを1.7mLの低結合チューブにピペットします。
- 各サンプルを1x TLEで総容量500 μLにします。サイズの選択にはサンプルと磁気ビーズの混合物の比率が不可欠であるため、容量をできるだけ500μLに近づけるようにしてください。
- 各チューブに400 μLの磁気ビーズ混合物を加えて、サンプル量に対する磁気ビーズ混合物の比率を0.8にします。
注:これらの条件下では、ビーズはDNAフラグメント>300 bpを捕捉し、これが上部フラクションになります。上清には<300 bpの断片が含まれ、これが下部画分になります。 - ボルテックスによってチューブを混合し、ローテーター上で室温で10分間インキュベートします。このサイズ選択比と他のサイズ選択比については、サンプルの全量がよく混ざることを確認してください。一部のローターにある「不安定モード」を探してください。
- 磁性粒子分離器(MPS)上で室温で5分間インキュベートします。
- インキュベート中に、各サンプルの新しい1.7 μL低結合チューブに500 μLの磁気ビーズ混合物を追加します。
注:これらのチューブは、1.1:1のサンプル比に対する磁気ビーズ混合物を生成することにより、下部フラクションの次のサイズ選択に使用されます。 - チューブをMPSに5分間置いたままにします。
- ビーズから上清を取り除き、150 μLの磁気ビーズ混合物で再懸濁します。
注:この手順では、体積を増やさずにビーズの数を増やすことで、DNAによるビーズの飽和を回避します。 - ステップ3.3.5の上清を準備された標識チューブに移し、下部画分を選択する(ステップ3.3.8)。
注:150 μLの磁気ビーズ混合物+ 400 μLの0.8x磁気ビーズ混合物(合計550 μL)を初期サンプルの500 μLで割った値= 1.1x磁気ビーズ混合物とサンプルの比率。 - 下部フラクションチューブをボルテックスで混合し、ローテーター上で室温で10分間インキュベートします。
注:ビーズはDNAフラグメント>100 bpに結合し、最終的なビーズ結合画分は100〜300 bpになります。 - 下部フラクションチューブをMPSに5分間(室温)置きます。
- 上清を取り除き、チューブを短時間遠心分離して、上清をさらに可能な限り除去します。
- 200 μLの70%エタノールを使用して両方のフラクションのビーズを2回洗浄し、毎回MPSで5分間ビーズを回収します。
- 遠心分離機ですばやく回転させた後、エタノールを完全に除去し、MPSでビーズをさらに乾燥させます。
注意: アルコールが完全に蒸発するまで乾燥させます。ペレットは割れのないダークチョコレートのように見えるはずです(~10分かかる場合があります)。 - 両方のフラクションを50 μLの1x TLEバッファーに再懸濁します。室温で10分間インキュベートし、1分おきにチューブをタップまたはフリックして、混合と溶出を刺激します。
- 両方の画分について、MPSの上清からビーズを5分間分離します。
- 各サンプルの上清を保管してください。上清を1.7 mLの低結合チューブにピペットします。
注:サンプルは、数日間4°Cまたは-20°Cで長期間保持できます。 - 表4のように2%アガロースゲルを実行し、サンプルの品質と量を決定します。このようなゲルの例については、図3を参照してください。
注:経験から、超音波処理が非常に再現性が高い場合は、このゲルをスキップして、すぐに修復を終了することができます。滴定PCRが終わるまで、アッパーフラクションを保持することをお勧めします。多くのPCR増幅を必要とする最適ではないDNA量は、上部画分の材料から救うことができます。 - 既知のDNAラダー入力から標準曲線を生成した直後、または量子ビットまたはナノドロップを使用して、ゲルからのDNA量を定量します。
- 修理終了
- 表7のようにエンドリペアミックスを調製する(反応当たりの量を与える)。
- 残りの46 μLの溶出DNAを下部フラクションからPCRチューブに移し、調製したエンドリペアミックス24 μLを加えます。 表7で提案されているように、PCRマシンでインキュベートします。
- プログラムが完了したら、プルダウンするまでサンプルを4°Cに保ちます。
- ストレプトアビジンコーティングビーズを用いたビオチン化ライゲーション産物のプルダウン(英語)
- 定量されたサイズ選択から各ライブラリのストレプトアビジン被覆ビーズの量を決定します(ステップ3.3.19)。
注:これらのストレプトアビジンコーティングビーズ(10 mg/mL溶液)は、mgビーズあたり20 μgの二本鎖DNAに結合できます(= 20 μg / 100 μLビーズ)。Hi-C DNA 1 μg ごとに 2 μL を使用しますが、10 μL 以上を使用します。 - ストレプトアビジンでコーティングされたビーズを混合し、各ライブラリに必要なビーズの量(前のステップで計算)を個々の1.7 mL低結合チューブにピペットで入れます。
- ビーズを400 μLのトゥイーン洗浄バッファー(TWB、 補足表S1のレシピを参照)に再懸濁し、ローテーター上で室温で~3分間インキュベートします(ステップ3.3.4の手順を参照)。
- ビーズをMPSの上清から1分間分離し、上清を除去します。
- さらに400 μLのTWBをピペッティングしてビーズを洗浄します。
- ビーズをMPSの上清から1分間分離し、上清を除去します。
- 400 μLの2x結合バッファー(BB)( 補足表S1のレシピ)をビーズに加え、再懸濁します。さらに、330 μLの1x TLEとエンドリペアの溶液を追加します(ステップ3.4.3から)。
- ローテーターで混合しながら、室温で15分間サンプルをインキュベートします。
- ビーズをMPSの上清から1分間分離し、上清を除去します。
- 400 μLの1x BBをビーズに加え、再懸濁します。
- ビーズをMPSの上清から1分間分離し、上清を除去します。
- 100 μLの1x TLEを加えてビーズを洗浄します。
- ビーズをMPSの上清から1分間分離し、上清を除去します。
- 最後に、41 μLの1x TLEを加えてビーズを再懸濁します。
- 定量されたサイズ選択から各ライブラリのストレプトアビジン被覆ビーズの量を決定します(ステップ3.3.19)。
- Aテーリング
- 表8のようにAテーリングミックスを準備します。
- 反応物をPCRチューブにピペットし、 表8のようにインキュベートする。
- サーモサイクラーから取り出した直後にPCRチューブを氷上に置き、内容物を1.7 mLの低結合チューブに移します。
- ビーズをMPSの上清から1分間分離し、上清を廃棄します。
- 5x T4 DNAリガーゼバッファーから超純水で希釈した1xライゲーションバッファー400 μLを加えます。
- ビーズをMPSの上清から1分間分離し、上清を廃棄します。
- 最終容量40 μLに1xライゲーションバッファーを追加します。
- アニーリングアダプターオリゴ
- 100 μMのアダプターオリゴストックを準備します(表9)。
注:HPLC精製オリゴを250nmol注文します。 - 表9に記載のPCRチューブでアダプターをアニールします。
- PCRサーモサイクラーを使用して、0.5°C/sの温度を97.5°Cまで徐々に上昇させます。 97.5°Cで2.5分間保持します。
- PCRサーモサイクラーを使用して、0.1°C/sで775サイクル(20°Cに達する)で徐々に温度を上げます。さらに使用するまで、温度を4°Cに保持します。
- 83 μLの1xアニーリングバッファー( 補足表S1のレシピ)を加えて、アダプターを15 μMに希釈します。 アダプターは-20°Cで保管してください。
- 100 μMのアダプターオリゴストックを準備します(表9)。
- シーケンシングアダプターライゲーション
- アダプターライゲーションミックスを1.7 mLの低結合チューブで調製します(表10)。
- 室温で2時間リゲートします。
- ビーズをMPSの上清から1分間分離し、上清を廃棄します。
- 400 μLのTWBを加え、ビーズを慎重に上下にピペッティングしてから、ローテーター上で室温で5分間インキュベートします。MPSの上清からビーズを分離し、この手順をもう一度繰り返します。
- ビーズをMPSで上清から分離し(~1分)、上清を捨て、1x BBを200 μL加えます。
- ビーズをMPS上の上清から分離し(~1分)、上清を廃棄します。
- 200 μLの1xプレPCRバッファー(10xから; 補足表S1のレシピ)を追加し、新しい1.7 mL低結合チューブに移します。
- ビーズをMPS上の上清から分離し(~1分)、上清を廃棄します。
- 20 μLの1xプレPCRバッファーを加え、ピペッティングで混合します。
- 使用中はチューブを氷上に保管するか、4°Cで保管してください。
- 滴定によるPCRサイクル数の最適化
- 表11のように、サンプルあたり30 μLのマスターミックス反応を設定します(反応あたりの量は所定の量)。
- 最小サイクル数を実行し、5 μLのアリコートを取ります。次の5 μLアリコートを服用する前に、残りの反応をさらに2〜3サイクル実行します。繰り返して4つのアリコートを収集します。
- 各アリコートについて 表11 のPCRパラメータを使用する。
- 各5 μLのサンプルに5 μLの水と2 μLの6x色素を加えます。2%アガロースTBEゲル( 補足表S1のレシピ)で25〜150 ngの低分子量ラダーで実行します。予想される結果については、 図 4 を参照してください。
注:最終ライブラリPCR増幅に最適なサイクル数[ステップ3.10]は、ゲル上に目に見える生成物を得るための最小サイクル数から1サイクルを引いたものです。
- 最終ライブラリ PCR 増幅
- 表11に示すように、12 x 30 μLの反応をセットアップして、シーケンシング用の各最終ライブラリを増幅します。
- PCR滴定後のサイクル数を決定した後、 表11 に従ってPCR反応をサイクルする(ステップ3.9.3)。
- PCRが完了したら、複製サンプルを1.7 mLの低結合マイクロフュージチューブにプールします。
- チューブをMPSに置き、上清を新しい1.7 mL低結合マイクロフュージチューブに移します。
- 残りのストレプトアビジンコーティングビーズを20 μLの1xプレPCRバッファーに再懸濁します。
注:このテンプレートは、4°Cで数日から数週間、または-20°Cで長期間保管した場合に再利用できます。
- 磁気ビーズ混合物によるプライマーの除去
- 1x TLEバッファー( 補足表S1のレシピ)を使用して、ステップ3.10.4の容量を正確に360 μLに調整します。
- 各サンプルに、360 μLの磁気ビーズ混合物を加え、ピペットを上下に動かして混合します。
- ローテーター上で、サンプルを室温で10分間混合します。
- ビーズを室温(3〜5分)でMPSの上清から分離します。
- 200 μLの70%エタノールを使用してビーズを2回洗浄し、毎回MPSで5分間ビーズを回収します。
- 遠心分離機でクイックスピンし、エタノールを完全にピペットで除去します。ビーズをMPS上で空気中で乾燥させ、エタノールをさらに蒸発させます。
注:ペレットは割れのないダークチョコレートのように見えるはずです(~10分かかる場合があります)。 - 30 μLの超純水を加えて再懸濁し、室温で10分間DNAを溶出します。混合を助けるために2分ごとにチューブをフリックします。
- ビーズをMPSの上清から5分間分離します。
- 各サンプルから上清を新鮮な1.7 mLチューブに集めます。
- 1 μLのライブラリを2%アガロースTBE( 補足表S1のレシピ)ゲルで実行してフラグメントサイズ分布を取得し、最終的なライブラリを定量しました(図5)。
注:ClaI消化はDpnII-DpnIIジャンクションでのみ発生し、最終的なライブラリのフラグメントサイズ分布を小さくするポジティブライゲーションコントロールとして機能します。最終ライブラリは、4°Cで数日間、-20°Cで長期間保存するか、すぐに希釈してシーケンシングに提出することができます。
表5:ビオチン除去試薬と温度 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表6:超音波処理のためのパラメータ。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表7:エンドリペア試薬と温度。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表8:Aテーリング試薬と温度。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表9:PCRプライマーおよびアニーリング用の試薬アニーリングを含むペアエンドアダプターオリゴ。 略称:5PHOS = 5'リン酸。アスタリスクはホスホロチオ化DNA塩基を示す。 #インデックス付きオリゴとユニバーサルオリゴを組み合わせて、インデックス付きアダプターにアニールします。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表10:アダプターライゲーション試薬。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表11:PCR試薬とサイクリングパラメータ。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
図3:典型的なサイズ選択後の結果を示すアガロースゲル。 DpnII-DdeI Hi-Cの4つのサンプル(番号1〜4)の上位分率と下部画分を示します。各サンプルの最初のレーンには、0.8倍の磁気ビーズ混合物に由来する上部フラクションが含まれ、2番目と3番目のレーンには、1.1倍の磁気ビーズ混合物に由来する下部フラクションの希釈が含まれています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:PCR滴定結果を含むアガロースゲル。 5サイクルのPCRから始めて、4つのライブラリのそれぞれについて2サイクル(5、7、9、および11サイクル)ごとにサンプルを採取します。この図に基づいて、各サンプルの最適サイクルとして6サイクルが選択されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:最終PCR産物。 洗浄およびサイズ選択の後、PCR産物(Hi-C)を、同じライブラリー(ClaI)のClaI消化画分の隣にロードした。ClaI消化フラグメントは、求められているDpnII-DpnIIライゲーションの存在を示す。ClaIはDpnII-DdeI接合を消化しないため、すべてのライゲーションがこの制限によるサイズ縮小に寄与するわけではないことに注意してください。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Representative Results
この原稿の図は、Lafontaineらによって以前に発表されたものの別の複製実験から生成されました21。ハイスループットシーケンシングデータを取得した後、 オープンクロマチンコレクティブ (Open2C:https://github.com/open2c)を使用してHi-Cデータを処理しました。同様のパイプラインは、4D Nucleomeプロジェクト(https://data.4dnucleome.org/resources/data-analysis/hi_c-processing-pipeline)のデータポータルにあります。簡単に言うと、Nextflowパイプライン蒸留器(https://github.com/open2c/distiller-nf)は、(1)Hi-C分子の配列をリファレンスゲノムにアラインメントし、(2).samアライメントを解析し、Hi-Cペアでファイルを形成し、(3)PCR重複をフィルタリングし、(4)ペアをHi-C相互作用のビン化マトリックスに集約するために実装されました。クーラーと呼ばれるこれらのHDF5フォーマットのマトリックスは、(1)HiGlassサーバーで表示し(https://higlass.io/)、(2)Open Chromatin Collective(https://github.com/open2c/cooltools)によって維持されている「cooltools」コレクションに存在するオープンソースの計算ツールの大規模なセットを使用して分析し、コンパートメント、TAD、ループなどの折り畳みの特徴を抽出および定量化できます。
Hi-C3.0ライブラリのいくつかの品質指標は、いくつかの簡単な指標/指標を使用して、リードペアをリファレンスゲノムにマッピングした直後に評価できます。まず、通常、配列決定されたリードペアの~50%をヒト細胞に対して一意にマッピングできます。染色体のポリマー性により、これらのマッピングされたリード(~60%-90%)のほとんどは染色体内の相互作用(シス)を表し、相互作用の頻度はゲノム距離の増加とともに急速に減衰します(距離依存性崩壊)。距離依存の減衰は、ゲノム距離の関数として接触確率(染色体アームごと)を示す「スケーリングプロット」で最もよく視覚化できます。異なる架橋剤と酵素を使用すると、長距離距離と短距離での距離依存的な崩壊が変化する可能性があることがわかりました17。DSG架橋の添加は、Mnaseなどの酵素や、より小さな断片を生成するDpnII-DdeIの組み合わせと組み合わせると、短距離での相互作用の検出可能性を高めます(図6A)。
距離依存の減衰は、2D相互作用行列から直接観察することもできます:中心対角線から離れると、相互作用はよりまれになります(図6B)。さらに、コンパートメント、TAD、ループなどのゲノムフォールディングの特徴は、Hi-Cマトリックスとスケーリングプロットから、一般的なゲノム全体の平均距離依存減衰からの偏差として識別できます。重要なことに、FAに加えてDSGによる架橋は、染色体のポリマー特性のために制限されないランダムライゲーションを減少させ、したがって染色体間(トランス)で発生する可能性が高くなります(図6C)。ランダムライゲーションを減らすと、特に染色体間および非常に長い範囲(>10〜50 Mb)の染色体内相互作用において、シグナル対ノイズ比が増加します。
図6:マッピングおよびフィルタリングされたHi-Cライブラリの代表的な結果 。 (A)さまざまな酵素の接触確率とその誘導体を、フラグメントの長さ(上)とFAまたはFA + DSGのいずれかで架橋(下)で並べたスケーリングプロット。MNAse(マイクロC)またはDpnII-DdeI(Hi-C 3.0)による消化は、DSGをFAに追加する場合(下)と同様に、短距離接触(上)を大幅に増加させます。(B)カラムは、FA架橋直後のDpnII消化とFA+DSG架橋後のDpnIIまたはDdeI消化のHi-Cヒートマップを示しています。白い矢印は、DSG架橋およびDdeI消化後の「ドット」の強度の増加を示しており、DNAループの検出が優れていることを意味します。行は、パネルCと整列して、解像度を上げた3番染色体のさまざまな部分を示しています:一番上の行:3番染色体全体(0-198,295,559 Mb);中段:186〜196メガバイト;下段:191.0-191.5 Mb。 (C) Aに描かれている地域のカバレッジグラフ。黒い矢印は、FAのみの架橋のカバレッジ(%cisリード)が低いことを示しています。略語:FA =ホルムアルデヒド;DSG =ジスクシンイミジルグルタル酸;CHR =染色体。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
すべてのマップされた読み取りが役立つわけではありません。2番目の品質指標は、PCRの重複数です。正確な重複読み取りは、結紮および超音波処理後に偶然に発生する可能性は非常に低いです。したがって、このようなリードはPCR増幅に起因する可能性が高く、除外する必要があります。重複は、複雑度の低いライブラリを増幅するために必要なPCRサイクルが多すぎる場合によく発生します。一般に、Hi-Cの場合、ほとんどのライブラリは、滴定PCRによって決定されるように、5〜8サイクルの最終PCR増幅のみを必要とします(ステップ3.9; 図4)。ただし、14サイクルのPCR増幅後でも十分な複雑さのライブラリを取得できます。
重複リードの別のカテゴリ、いわゆる光学的重複は、パターン化されたフローセル(HiSeq4000など)を使用するIlluminaシーケンシングプラットフォームでの増幅プロセスから発生する可能性があります。光学的重複は、フローセルに過負荷がかかり、(大きな)クラスターが2つの別々のクラスターと呼ばれるようになるか、または最初のPCRラウンド後の元のペア末端分子の局所的な再クラスター化から見られます。どちらのタイプの光学重複も局所的であるため、フローセル上の位置によってPCR重複と識別および区別できます。PCR重複が>15%のライブラリは再生成が必要ですが、光学重複のあるライブラリはロードプロセスを最適化した後にリロードできます。
補足表S1:バッファーと溶液。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
セル処理の重要なステップ
より少ない数のインプットセルを使用することも可能ですが、このプロトコルは、シーケンシングレーンあたり~5×106セル(~400 Mリード)に最適化されており、ディープシーケンシング後の適切な複雑さを確保しています。細胞は固定前に最もよく数えられます。超深度ライブラリの生成では、通常、目的の読み取り深度に達するまでレーン(およびセル)の数を乗算します。最適な固定のためには、FA固定の前に血清含有培地をPBSに交換し、固定液を濃度勾配なしで直ちに添加する必要があります15,22。細胞回収では、トリプシン処理後の平坦形状から球形への遷移が核立体構造に影響を与える可能性があるため、トリプシン処理よりも掻き取りが好まれます。DSGの添加後、ゆるくて塊状の細胞ペレットは容易に失われる。この段階で細胞を取り扱うときは注意し、凝集を減らすために最大0.05%のBSAを追加します。
メソッドの変更
このプロトコルは、ヒト細胞17を用いて開発された。それでも、染色体立体配座捕捉の経験に基づいて、このプロトコルはほとんどの真核細胞で機能するはずです。入力量が著しく低い場合(~1 ×10 6 細胞)、溶解および立体構造捕捉手順に半分の体積を使用することをお勧めします[ステップ2.1-2.4]。これにより、1.7 mLチューブを備えた卓上遠心分離機でDNA単離[ステップ2.5]を行うことができ、低DNA濃度のペレット化を改善することができます。DNAの定量(ステップ2.6.6)は、進め方を示します。単離されたDNA(1-5 μg)の量が少ない場合は、サイズ選択をスキップし(ステップ3.3)、CFUで容量を130 μLから~45 μLに減らした後、ビオチン除去を進めることをお勧めします。
このプロトコルは、その後のFAおよびDSGによる架橋およびDpnIIおよびDdeIによる消化後の高品質のデータを確保するために特別に開発されました。ただし、ChIP-seq23 およびChIA-PET24でも使用されているFAとそれに続くEGS(エチレングリコールビス(スクシンイミジルコハク酸塩))などの代替架橋戦略も同様にうまく機能する可能性があります17。同様に、DpnIIとHinfI18 またはMboI、MseI、およびNlaIII19 などの異なる酵素の組み合わせを消化に使用できます。酵素の組み合わせを適応させるときは、特定の5'オーバーハングを埋めることができるビオチン化ヌクレオチドを使用し、各カクテルに最適なバッファーを使用してください。DpnIIには独自のバッファーが付属しており、酵素メーカーはDdeI消化用の特定のバッファーを推奨しています。ただし、このプロトコルのDpnIIとDdeIによる二重消化には、両方の酵素で100%の活性が評価されているため、制限バッファーが推奨されます。
コンフォメーションキャプチャのトラブルシューティング
染色体コンフォメーションキャプチャの3つの重要なステップである架橋、消化、ライゲーションはすべて、結果をゲルで視覚化する前に実行されました。これら3つのステップのそれぞれの品質を判断し、問題が発生した可能性のある場所を識別するために、消化前(CI)と消化後(DC)のアリコートを採取し、ライゲーションされたHi-Cサンプルとともにゲルにロードします(図2)。このゲルは、Hi-Cサンプルの品質を判断し、プロトコルを継続する価値があるかどうかを判断するために使用されます。CIとDCがなければ、潜在的な次善のステップを特定することは困難です。次善のライゲーションは、ライゲーション自体の問題、フィルイン、または架橋の問題が原因である可能性があることは注目に値します。架橋のトラブルシューティングを行うには、ライブラリあたり1×107 細胞以上を使用せず、新しい架橋試薬とクリーンな細胞(PBSですすいで)から始めてください。ライゲーションでは、細胞とライゲーション混合物が氷上に保たれていることを確認してください。16°Cで4時間インキュベートする直前にT4 DNAリガーゼを加え、よく混ぜます。
ライブラリ準備のトラブルシューティング
10回を超えるPCRサイクルが必要な場合、またはPCR滴定後にゲルにPCR産物が見られない場合(図4)、Hi-Cサンプルを保存するためのいくつかのオプションがあります。PCR滴定からさかのぼって、最初のオプションはPCRを再試行することです。それでも十分な製品がない場合は、1x TLEバッファーでビーズを2回洗浄した後、Aテーリングとアダプターライゲーション(ステップ3.6)の別のラウンドを試みることができます。この追加のAテーリングとアダプターライゲーションの後、以前と同様にPCR滴定に進むことができます。それでも製品がない場合、最後のオプションは、ステップ3.3の0.8倍フラクションを再超音波処理し、そこから続行することです。
Hi-C3.0の制限事項と利点
Hi-Cは、細胞集団内の遺伝子座のペア間の相互作用の平均頻度をキャプチャする集団ベースの方法であることを認識することが重要です。いくつかの計算解析は、集団25から立体構造の組み合わせを解きほぐすように設計されていますが、原則として、Hi-Cは細胞間の違いを知らされません。シングルセルHi−C26,27を行うことは可能であり、計算推論28を行うことができるが、シングルセルHi−Cは超高分解能3C情報を得るのには適していない。Hi-Cの追加の制限は、ペアワイズ相互作用のみを検出することです。マルチコンタクト相互作用を検出するには、ショートリードシーケンシング(Illumina)16と組み合わせて頻繁なカッターを使用するか、PacBioまたはOxford Nanoporeプラットフォームのロングリードシーケンシングを使用してマルチコンタクト3C29または4C30を実行することができます。姉妹染色分体間および姉妹染色分体に沿った接触を特異的に検出するためのHi−C誘導体も開発されている31,32。
Hi-C19とMicro-C33は、サブキロベースの解像度でコンタクトマップを生成するために使用できますが、どちらも大量のシーケンシングリードを必要とし、これはコストのかかる作業になる可能性があります。コストをかけずに同等またはさらに高い分解能を得るために、特定のゲノム領域(キャプチャーC 34)または特定のタンパク質相互作用(ChiA-PET 35、PLAC-seq36、Hi-ChIP37)の濃縮を適用できます。これらのエンリッチメント アプリケーションの長所と欠点は、サンプリングされる相互作用の数が限られていることです。このようなエンリッチメントにより、Hi-C のグローバルな側面 (およびグローバル正規化のオプション) が失われます。
Hi-C3.0の重要性と応用の可能性
このプロトコルは、TADやコンパートメント17などの大規模な折り畳み機能を同時に検出しながら、高解像度の超深度3Cを可能にするように設計されています(図6)。このプロトコルは、Hi-Cライブラリごとにチューブあたり5セル×10セルから始まり、フローセルで1レーンまたは2レーンをシーケンスして最大10億のペアエンドリードを取得するのに十分な材料である必要があります。超ディープシーケンシングでは、マッピングされたリードとPCRの重複の数に応じて、5×106細胞の複数のチューブを準備する必要があります。最高分解能(<1 kb)では、CTCF部位間でループ相互作用が主に見られますが、プロモーター-エンハンサー相互作用も検出できます。読者は、データ分析の詳細な説明について、Akgol Oksuz et al.17を参照することができます。
Disclosures
著者は開示する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
プロトコル開発のDenis LafontaineとBioinformaticの支援をしてくれたSergey Venevに感謝します。この研究は、国立衛生研究所共通基金4D Nucleome ProgramからJ.D.への助成金(U54-DK107980、UM1-HG011536)によって支援されました。JDはハワードヒューズ医学研究所の研究者です。
この記事は、HHMIの出版物へのオープンアクセスポリシーの対象となります。HHMIラボの責任者は以前、研究論文で非独占的なCC BY 4.0ライセンスを一般に付与し、HHMIにサブライセンス可能なライセンスを付与しています。これらのライセンスに従い、この記事の著者が承認した原稿は、公開後すぐにCC BY 4.0ライセンスの下で自由に利用することができます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 kb Ladder | New England Biolabs | N3232L | |
| Agarose | Invitrogen | 16500100 | |
| Agencourt AMPure XP magnetic beads , 60 mL | Beckman Coulter | A63881 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit (CFU) | EMD Millipore | UFC500396 | |
| Annealing Buffer (5x) | See recipe in supplemental materials | ||
| ATP 10 mM | ThermoFisher | R0441 | |
| Avanti J-25i High Speed Refrigerated ultra-centrifuge | Beckman Coulter | ||
| beckman ultracentrifuge tube 35 mL | Beckman Coulter | 357002 | |
| Binding Buffer (2x) | See recipe in supplemental materials | ||
| biotin-14-dATP 0.4 mM | Invitrogen | 19524-016 | |
| BSA 10 mg/mL | New England Biolabs | B9000S | dilute from 20 mg/mL |
| Cell scraper | Falcon | 353089 | |
| Cell scraper | Corning | 3008 | |
| Conical polypropylene tubes 50 mL | Denville | C1062-P | |
| Conical tube 15 mL | Denville | C1017-P | |
| Covaris micro tube AFA fiber with snap-cap 130 µL | Covaris | 520045/520077 | |
| Covaris Sonicator | Covaris | E220/E220evolution/M220 | |
| Culture flask 175 cm2 | Falcon | 353112 | |
| Culture plates 150 mm x 25 mm | Corning | 430599 | |
| dATP 1 mM | Invitrogen | 56172 | |
| dATP 10 mM | Invitrogen | 56172 | |
| dCTP 10 mM | Invitrogen | 56173 | |
| DdeI | New England Biolabs | R0175L | |
| dGTP 10 mM | Invitrogen | 56174 | |
| DMSO | Sigma | D2650-5x10ML | |
| dNTP mix 25 mM | Invitrogen | 10297117 | |
| Dounce homogenizer | DWK Life Sciences | 8853010002/8853030002 | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| DpnII | New England Biolabs | R0543M | |
| DSG | ThermoScientific | 20593 | |
| dTTP 10 mM | Invitrogen | 56175 | |
| Ethanol 70% | Fisher | A409-4 | Diluted from 100% |
| Ethidium Bromide | Fisher | BP1302-10 | |
| Formaldehyde (37%) | Fisher | BP531-500 | |
| Gel loading dye (6x ) | New England Biolabs | B7024S | |
| Glycine in ultrapure water 2.5 M | Sigma | G8898-1KG | |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| Igepal CA-630 detergent | MP Biomedicals | 198596 | |
| Klenow DNA polymerase 5 U/µL | New England Biolabs | M0210L | |
| Klenow Fragment 3-->5’ exo-, 5 U/µL | New England Biolabs | M0212L | |
| ligation buffer (10x) | New England Biolabs | B7203S | |
| Liquid nitrogen | |||
| LoBind microcentrifuge tube 1.7 mL | Eppendorf | 22431021 | |
| Low Molecular Weight DNA Ladder | New England Biolabs | N3233L | |
| Lysis buffer | See recipe in supplemental materials | ||
| Magnetic Particle separator | ThermoFisher | 12321D | |
| Microfuge tubes 1.7 mL | Axygen | MCT-175-C | |
| MyOne Streptavidin C1 beads | Invitrogen | 65001 | |
| NEBuffer 2.1 (10x) | New England Biolabs | B7002S | |
| NEBuffer 3.1 (10x) | New England Biolabs | B7203S | |
| PBS | Gibco | 70013-032 | |
| PCR (strip) tubes | Biorad | TBS0201/ TCS0803 | |
| PCR thermocycler | Biorad | T100 | |
| Pfu Ultra II Buffer (10x) | Agilent | Comes with Pfu Ultra | |
| PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase | Agilent | 600674 | |
| Phase lock tube 15 mL | Qiagen | 129065 | |
| Phase lock tubes 2 mL | Qiagen | 129056 | |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | Invitrogen | 15593-049 | |
| Protease inhibitor cocktail | ThermoFisher | 78440 | |
| Proteinase K in ultrapure water 10 mg/mL | Invitrogen | 25530-031 | |
| Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| RNase A, DNase and protease-free 10 mg/mL | Thermo Scientific | EN0531 | |
| Rotator | Argos technologies | EW-04397-40 or rocking platform | |
| SDS 1% | Fisher | BP13111 | |
| Sodium acetate pH = 5.2, 3 M | Sigma | ||
| Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System | Biorad | 1704401 | |
| T4 DNA ligase 1 U/µL | Invitrogen | 100004817 | |
| T4 DNA polymerase | New England Biolabs | M0203L | |
| T4 DNA polymerase | New England Biolabs | M0203L | |
| T4 DNA polymerase 3 U/µL | New England Biolabs | M0203L | |
| T4 ligation buffer (5x) | Invitrogen | Y90001 | |
| T4 polynucleotide kinase 10 U/µL | New England Biolabs | M0201L | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 5425 | |
| TBE buffer | See recipe in supplemental materials | ||
| Tris Low EDTA Buffer (TLE) | See recipe in supplemental materials | ||
| Triton X-100 (10%) | Sigma | 93443 | |
| Truseq adapter oligos | Integrated DNA Technologies (IDT)) | https://www.idtdna.com/site/order/oligoentry | 250 nmole and HPLC purified |
| Tween 20 detergent | Fisher | 9005-64-5 | |
| Tween Wash Buffer | See recipe in supplemental materials | ||
| Vortex | Scientific Industries | (G560)SI-0236 |
References
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