Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Indfangning af kromosomkonformation på tværs af længdeskalaer

Published: January 20, 2023 doi: 10.3791/64001
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1
1Department of Systems Biology, University of Massachusetts Medical School, 2Howard Hughes Medical Institute

Summary

Hi-C 3.0 er en forbedret Hi-C-protokol, der kombinerer formaldehyd og disuccinimidylglutarat tværbindinger med en cocktail af DpnII- og DdeI-restriktionsenzymer for at øge signal-støj-forholdet og opløsningen af kromatininteraktionsdetektion.

Abstract

Kromosomkonformationsindfangning (3C) bruges til at detektere tredimensionelle kromatininteraktioner. Typisk bruges kemisk tværbinding med formaldehyd (FA) til at fiksere kromatininteraktioner. Derefter omdanner kromatinfordøjelse med et restriktionsenzym og efterfølgende religation af fragmentender tredimensionel (3D) nærhed til unikke ligeringsprodukter. Endelig, efter vending af tværbindinger, proteinfjernelse og DNA-isolering, skæres DNA og forberedes til sekventering med høj kapacitet. Hyppigheden af nærhedsligation af par loci er et mål for hyppigheden af deres colokalisering i tredimensionelt rum i en cellepopulation.

Et sekventeret Hi-C-bibliotek giver genom-dækkende information om interaktionsfrekvenser mellem alle par loci. Opløsningen og præcisionen af Hi-C er afhængig af effektiv tværbinding, der opretholder kromatinkontakter og hyppig og ensartet fragmentering af kromatinen. Dette papir beskriver en forbedret in situ Hi-C-protokol, Hi-C 3.0, der øger effektiviteten af tværbinding ved at kombinere to tværbindinger (formaldehyd [FA] og disuccinimidylglutarat [DSG]), efterfulgt af finere fordøjelse ved hjælp af to restriktionsenzymer (DpnII og DdeI). Hi-C 3.0 er en enkelt protokol til nøjagtig kvantificering af genomfoldningsfunktioner i mindre skalaer såsom sløjfer og topologisk associerende domæner (TAD'er) samt funktioner i større kernebrede skalaer såsom rum.

Introduction

Kromosomkonformationsoptagelse er blevet brugt siden 20021. Grundlæggende er enhver konformationsindfangningsvariant afhængig af fiksering af DNA-protein og protein-protein-interaktioner for at bevare 3D-kromatinorganisation. Dette efterfølges af DNA-fragmentering, normalt ved restriktionsfordøjelse, og endelig slutter religation af nærliggende DNA for at omdanne rumligt proksimale loci til unikke kovalente DNA-sekvenser. Indledende 3C-protokoller brugte PCR til at prøve specifikke, "en-til-en" interaktioner. Efterfølgende 4C-assays tillod påvisning af "en-til-alle" interaktioner2, mens 5C detekterede "mange-til-mange" interaktioner3. Kromosomkonformationsfangst kom til fuld frugt efter implementering af næste generations high-throughput-sekventering (NGS), som tillod påvisning af "alt-til-alle" genomiske interaktioner ved hjælp af genom-dækkende Hi-C4 og sammenlignelige teknikker såsom 3C-seq5, TCC6 og Micro-C 7,8 (se også anmeldelse af Denker og De Laat9).

I Hi-C anvendes biotinylerede nukleotider til at markere 5′ udhæng efter fordøjelsen og før ligering (figur 1). Dette giver mulighed for udvælgelse af korrekt fordøjede og religerede fragmenter ved hjælp af streptavidinbelagte perler, hvilket adskiller det fra GCC10. En vigtig opdatering af Hi-C-protokollen blev implementeret af Rao et al.11, der udførte fordøjelsen og religationen i intakte kerner (dvs. in situ) for at reducere falske ligeringsprodukter. Desuden reducerede udskiftning af HindIII-fordøjelse med MboI (eller DpnII) fordøjelsen fragmentstørrelsen og øgede opløsningspotentialet for Hi-C. Denne stigning tillod påvisning af relativt små strukturer og en mere præcis genomisk lokalisering af kontaktpunkter, såsom DNA-sløjfer mellem små cis-elementer, f.eks. sløjfer mellem CTCF-bundne steder genereret af loopekstrudering11,12. Dette potentiale har dog en pris. For det første kræver en dobbelt stigning i opløsning en firedobling (22) stigning i sekventeringslæsninger13. For det andet øger de små fragmentstørrelser muligheden for at forveksle ufordøjede nabofragmenter med fordøjede og religerede fragmenter14. Som nævnt adskiller fordøjede og religerede fragmenter sig i Hi-C fra ufordøjede fragmenter ved tilstedeværelsen af biotin ved ligeringskrydset. Imidlertid kræves korrekt fjernelse af biotin fra uligerede ender for at sikre, at kun ligeringskryds trækkes ned14,15.

Med de faldende omkostninger ved NGS bliver det muligt at studere kromosomfoldning mere detaljeret. For at mindske størrelsen af DNA-fragmenter og derved øge opløsningen kan Hi-C-protokollen tilpasses til hyppigere skærerestriktionsenzymer16 eller til at anvende kombinationer af restriktionsenzymer17,18,19. Alternativt kan MNase 7,8 i Micro-C og DNase i DNase Hi-C20 titreres for at opnå optimal fordøjelse.

En nylig systematisk evaluering af de grundlæggende elementer i 3C-metoder viste, at detektionen af kromosomfoldningsfunktioner ved hver længdeskala blev stærkt forbedret med sekventiel tværbinding med 1% FA efterfulgt af 3 mM DSG17. Desuden var Hi-C med HindIII-fordøjelse den bedste mulighed for at detektere store foldefunktioner, såsom rum, og at Micro-C var overlegen til at detektere småskala foldefunktioner såsom DNA-sløjfer. Disse resultater førte til udviklingen af en enkelt "Hi-C 3.0"-strategi med høj opløsning, der anvender kombinationen af FA- og DSG-tværbindinger efterfulgt af dobbeltfordøjelse med DpnII- og DdeI-endonukleaser21. Hi-C 3.0 giver en effektiv strategi til generel brug, fordi den nøjagtigt registrerer foldefunktioner på tværs af alle længdeskalaer17. Den eksperimentelle del af Hi-C 3.0-protokollen er detaljeret her, og typiske resultater, der kan forventes efter sekventering, vises.

Figure 1
Figur 1: Hi-C-procedure i seks trin. Celler fastgøres først med FA og derefter DSG (1). Derefter går lysis forud for en dobbelt fordøjelse med DdeI og DpnII (2). Biotin tilsættes ved udhængsudfyldning, og proksimale stumpede ender ligeres (3) før DNA-oprensning (4). Biotin fjernes fra uligerede ender før sonikering og størrelsesvalg (5). Endelig giver pull-down af biotin mulighed for adapterligation og biblioteksforstærkning ved PCR (6). Forkortelser: FA = formaldehyd; DSG = disuccinimidylglutarat; B = Biotin. Klik her for at se en større version af denne figur.

Protocol

1. Fiksering ved tværbinding

  1. Formaldehydfiksering: startende fra celler i monolag
    1. Få celler podet i passende medium til høst af 5 × 106 celler pr. 150 mm plade.
      BEMÆRK: Brugere kan vælge enhver foretrukken beholder, der sikrer optimal vækst af enhver pattedyrcellelinje. Derudover kan celler isoleres fra væv.
    2. Aspirer mediet med en Pasteur-pipette koblet til en vakuumfælde fra 150 mm plade, vask 2x med ~10 ml HBSS.
    3. Umiddelbart før tværbinding fremstilles en 1% FA-tværbindingsopløsning i et 50 ml rør ved at kombinere 22,5 ml HBSS og 625 μL 37% FA til en endelig 1% koncentration. Bland forsigtigt ved at rocke.
      FORSIGTIG: Brug røghætte; formaldehyd er giftigt.
    4. For at krydse cellerne hældes 23.125 ml af 1% FA-opløsningen til hver 15 cm plade.
    5. Inkuber ved stuetemperatur i 10 min og vugg forsigtigt pladerne i hånden hvert 2. minut.
    6. Tilsæt 1,25 ml 2,5 M glycin (128 mM endelig) og hvirvl forsigtigt pladen for at slukke tværbindingsreaktionen.
    7. Inkuberes ved stuetemperatur i 5 minutter og fortsæt inkubationen på is i mindst 15 minutter for at stoppe tværbindingen.
    8. Skrab cellerne fra pladerne med en celleskraber eller gummipolitimand.
    9. Overfør cellesuspensionen til et 50 ml konisk rør med en pipet. Centrifuge ved 1.000 × g i 10 minutter ved stuetemperatur og kassér supernatanten ved aspiration.
    10. Vask cellepelleten en gang med 10 ml Dulbeccos fosfatbufferede saltvand (DPBS) ved hjælp af en pipet til at resuspendere. Derefter centrifugeres ved 1.000 × g i 10 minutter ved stuetemperatur. Fortsæt straks til DSG tværbinding.
      BEMÆRK: Vær forsigtig, når du vasker cellepillen, da cellepiller kan være løse, og celler kan gå tabt.
  2. Formaldehydfiksering: startende fra celler i suspension
    1. Har celler sået i passende medium til høst 5 × 106 celler pr. Beholder.
      BEMÆRK: Brugere kan vælge enhver foretrukken beholder, der sikrer optimal cellevækst af enhver pattedyrcellelinje.
    2. Umiddelbart før høst tælles cellerne og overføres 5 × 106 celler til et 50 ml konisk rør.
    3. Pæl forsigtigt cellerne ved centrifugering ved 300 × g i 10 minutter ved stuetemperatur.
    4. Forbered 1% FA tværbindingsopløsning ved at tilføje 1,25 ml 37% FA til 45 ml HBSS og bland ved at invertere røret flere gange.
      BEMÆRK: Tilføj hele 1,25 ml FA uden at opdele mængden.
      FORSIGTIG: Formaldehyd er meget giftigt.
    5. Resuspender cellepelleten i 46,25 ml 1% FA tværbindingsopløsning fremstillet i det foregående trin ved pipettering op og ned.
    6. Inkuberes ved stuetemperatur i nøjagtigt 10 minutter på rotator, vipper eller ved blid manuel inversion af røret hvert 1-2 minut.
    7. Sluk tværbindingsreaktionen ved at tilsætte 2,5 ml 2,5 M glycin (128 mM endelig) og bland godt ved at invertere røret.
    8. Inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur og derefter på is i mindst 15 minutter for at stoppe tværbindingen helt.
    9. Centrifuge ved stuetemperatur for at pelletere de tværbundne celler ved 1.000 × g i 10 minutter og kassér supernatanten ved aspiration.
    10. Cellerne vaskes én gang med 10 ml DPBS, og centrifugeres derefter ved 1.000 × g i 10 minutter ved stuetemperatur. Kassér supernatanten fuldstændigt ved hjælp af en pipet og fortsæt straks til DSG-tværbinding.
      BEMÆRK: Vær forsigtig, når du vasker cellepillen, da cellepiller kan være løse, og celler kan gå tabt.
  3. Tværbinding med disuccinimidylglutarat
    1. De pelleterede celler resuspenderes i 9,9 ml DPBS, før der tilsættes 100 μL 300 mM DSG (3 mM endelig). Bland ved inversion.
      BEMÆRK: DSG er fugtfølsom. Det er vigtigt at forberede en frisk bestand på 300 mM DSG i DMSO på dagen for tværbinding.
      FORSIGTIG: DSG i DMSO er meget giftig.
    2. Tværbinding af cellerne ved stuetemperatur i 40 minutter på en rotator.
    3. Tilsæt 1.925 ml 2.5 M glycin (400 mM endelig), inverter for at blande og inkuberes ved stuetemperatur i 5 min.
    4. Centrifuger cellerne ved 2.000 × g i 15 minutter ved stuetemperatur.
      BEMÆRK: Vær forsigtig, når du fjerner supernatanten fra løse cellepiller.
    5. Resuspender pelleten i 1 ml 0,05% bovin serumalbumin (BSA)-DPBS og overføres til et 1,7 ml rør.
      BEMÆRK: Tilsætningen af BSA kan bidrage til at reducere celleklumpning.
    6. Cellerne centrifugeres ved 2.000 × g i 15 minutter ved 4 °C, og supernatanten fjernes med pipet.
      BEMÆRK: For at undgå at miste pelleten skal du hurtigt og helt fjerne supernatanten.
    7. Snap-frys pelleten i flydende nitrogen og opbevares ved -80 ° C eller fortsæt straks til næste trin.

2. Indfangning af kromosomkonformation

  1. Cellelyse og kromatinfordøjelse
    1. Resuspenderer (pipet) de tværbundne cellealikvoter (~ 5 × 106 celler) i 1 ml iskold lysisbuffer (opskrift i supplerende tabel S1) indeholdende 10 μL proteasehæmmercocktail og overføres til en douncehomogenisator til en 15 minutters inkubation på is.
      BEMÆRK: Tilsæt proteasehæmmere til lysisbufferen umiddelbart før brug.
    2. Bevæg langsomt støder A op og ned 30 gange for at homogenisere cellerne på is og inkubere på is i 1 minut for at lade cellerne køle ned, før yderligere 30 slag.
    3. Overfør lysatet til et 1,7 ml mikrocentrifugerør.
      BEMÆRK: Hold suspensionen i bevægelse, fordi nogle gange klæber celler i pipettespidsen.
    4. Centrifugering af lysedophænget ved 2.500 × g i 5 minutter ved stuetemperatur.
    5. Kassér supernatanten og svirp eller hvirvl den våde pille for at resuspendere. Fjern så meget af supernatanten som muligt for at opnå et yoghurtlignende stof med minimale klumper.
    6. Pelleten gensuspenderes i 500 μL iskold 1x restriktionsbuffer (fra 10x; se opskrift i supplerende tabel S1) og centrifuge i 5 minutter ved 2.500 × g. Gentag dette trin for en anden vask.
      BEMÆRK: Pellet i 1x Restriction Buffer er mere granulær end den tidligere pellet i lysisbuffer.
    7. Resuspender cellerne i et endeligt volumen på 360 μL 1x Restriction Buffer ved pipettering efter tilsætning af ~ 340 μL til pellets overførselsvolumen, hvilket afhænger af cellestørrelsen.
    8. Afsæt 18 μL af hvert lysat til test af kromatinintegriteten (CI). CI-prøverne opbevares ved 4 °C.
    9. Tilsæt 38 μL 1% natriumdodecylsulfat (SDS) til hvert Hi-C-rør (samlet volumen på 380 μL) og bland forsigtigt ved pipettering uden at indføre bobler.
      FORSIGTIG: SDS er giftigt.
    10. Prøverne inkuberes ved 65 °C uden at ryste i nøjagtigt 10 minutter for at åbne kromatinen.
    11. Anbring straks rørene på is og forbered fordøjelsesblandingen med Triton X-100 for at slukke SDS som beskrevet i tabel 1.
    12. Tilsæt 107 μL fordøjelsesblanding til Hi-C-røret (487 μL i alt) for at fordøje kromatinen natten over (~ 16 timer) ved 37 ° C i en termomixer med intervalrystelse (f.eks. 900 o / min, 30 s tændt, 4 minutter væk).
      BEMÆRK: Tilsætningen af Triton til en endelig koncentration på 1% tjener til at slukke SDS.
  2. Biotinylering af DNA-ender
    1. Efter fordøjelsen natten over overføres prøverne til 65 °C i 20 minutter for at deaktivere den resterende endonukleaseaktivitet.
    2. Under inkubationen fremstilles en udfyldningsmasterblanding som vist i tabel 2.
    3. Efter inkubation placeres prøverne straks på is.
    4. Der afsættes en 10 μL fordøjelseskontrol (DC) til hver prøve, og den opbevares ved 4 °C.
    5. Fjern kondensen fra låget med en pipet eller ved at dreje. Til hver prøve tilsættes 58 μL biotinudfyldningsblanding (samlet prøvevolumen 535 μL) og pipetteres forsigtigt uden at danne bobler.
    6. Prøverne inkuberes ved 23 °C i 4 timer i en termomixer (f.eks. 900 o/min., 30 s tændt, 4 min fra).
  3. Ligering af proksimale DNA-fragmenter
    1. Ligeringsblandingen forberedes som vist i tabel 3 , mens biotinfyldet inkuberes.
    2. Der tilsættes 665 μL af ligeringsblandingen til hver prøve (samlet prøvevolumen 1.200 μL). Bland forsigtigt ved pipettering.
    3. Prøverne inkuberes ved 16 °C i 4 timer i en termomixer med intervalrystelser (f.eks. 900 o / min, 30 s tændt, 4 min væk). Disse prøver indeholdende kovalent bundet kromatin opbevares ved 4 °C i et par dage.
  4. Vending af tværbinding
    1. Bring mængderne af CI- og DC-prøverne til 50 μL med 1x Tris Low EDTA (TLE; se opskriften i supplerende tabel S1).
    2. Der tilsættes 10 μL 10 mg/ml proteinase K til CI- og DC-prøver.
    3. Inkuberes ved 65 °C natten over med intervalrystelser (f.eks. 900 o / min, 30 s tændt, 4 minutter væk). Alternativt kan du udføre en 30 minutters vending af tværbinding for disse kontroller under DNA-oprensning af Hi-C-prøverne.
    4. Til hver Hi-C-prøve tilsættes 50 μL 10 mg/ml proteinase K og inkuberes ved 65 °C i mindst 2 timer med intervalomrystning (f.eks. 900 o/min., 30 s tændt, 4 min fra).
    5. Der tilsættes yderligere 50 μL 10 mg/ml proteinase K til hvert Hi-C-rør (samlet prøvevolumen 1.300 μL) og inkuberes fortsat ved 65 °C natten over. Opbevares ved 4 °C indtil DNA-rensning.
      BEMÆRK: Opdeling af proteinase K-inkubationer sikrer total proteinfordøjelse.
  5. DNA-oprensning
    1. Lad rørene køle af fra 65 °C ned til stuetemperatur.
    2. Hver prøve overføres til et konisk 15 ml rør, og der tilsættes en 2,6 ml (2x volumen) phenol:chloroform:isoamylalkohol til hvert rør.
      FORSIGTIG: Phenol: chloroform: isoamylalkohol er en meget giftig irritation og er potentielt kræftfremkaldende.
    3. Vortex hvert rør i 1 minut og overfør derefter indholdet til et 15 ml faselåsrør.
    4. Prøverne centrifugeres i 5 minutter ved maksimal hastighed (1.500-3.500 × g) i en bordcentrifuge.
    5. Hæld forsigtigt den vandige fase i et 35 ml ultracentrifugerør og tilsæt ultrarent vand til et slutvolumen på 1.250 μL.
      BEMÆRK: Brug rør til at passe til den tilgængelige ultracentrifuge eller opdelt i flere mikrocentrifugerør.
    6. Tilsæt et 1/10volumenvolumen (~ 125 μL) 3 M natriumacetat og bland godt ved inversion.
    7. Tilsæt et 2,5x volumen (~ 3,4 ml) iskold 100% ethanol til hver prøve, balance rørene til ultracentrifugering ved at tilsætte iskold 100% ethanol og bland godt ved inversion.
    8. Inkuber rørene på tøris i ~ 15 min (undgå størkning).
    9. Rør centrifugeres ved 18.000 × g i 30 minutter ved 4 °C.
      BEMÆRK: For vinklede rotorer: Marker rørene for, hvor pelleten vil være.
    10. Brug en pipette til at fjerne og kassere supernatanten helt fra ikke-pelletsiden.
      BEMÆRK: På dette tidspunkt skal pelleten blive synlig og kan mærkes på røret, fordi det muligvis ikke er tydeligt synligt efter tørring i næste trin.
    11. Lufttørre prøverne i ca. 10 minutter, eller indtil de er synligt tørre.
    12. Hver pellet opløses i 450 μL 1x TLE ved pipettering eller hvirvling og overføres til 0,5 ml centrifugalfilterenhed (CFU) med en 3 kDa molekylvægtafskæring.
    13. Centrifuger CFU'en med maksimal hastighed i 10 minutter, og kassér gennemstrømningen. Vask hvert ultracentrifugerør med yderligere 450 μL 1x TLE og overfør til CFU'en til en anden vask.
      BEMÆRK: Vask af CFU på denne måde begrænser DNA-tab, samtidig med at saltkoncentrationen reduceres.
    14. Centrifuger CFU'en med maksimal hastighed i 10 minutter, og kassér gennemstrømningen.
    15. Tilsæt 80 μL 1x TLE til søjlen, og vend søjlen rundt til et nyt opsamlingsrør, før den centrifugeres i 2 minutter ved maksimal hastighed for at opnå et endeligt volumen på ~ 100 μL.
    16. Der tilsættes 1 μL RnaseA (1 mg/ml; 10 gange fortynding af 10 mg/ml stam) til hver prøve, og der inkuberes ved 37 °C på en varmeblok, i et vandbad eller en termomixer i mindst 30 min.
    17. Efter Rnase-behandlingen fjernes prøverne fra 37 °C og opbevares ved 4 °C indtil kvalitetskontroltrinnet.
  6. Kontrol af kromatinkvalitet, enzymfordøjelse og prøveligation
    1. CI- og DC-prøverne afkøles til stuetemperatur efter vending af tværbindingerne i trin 2.4.5. Overfør derefter til et prespun 2 ml faselåsrør.
      BEMÆRK: Sørg for, at faselåsens indhold er centrifugeret til en pellet (maksimal hastighed i 2 min).
    2. Tilsæt 200 μL phenol:chloroform:isoamylalkohol og bland prøverne ved hvirveldannelse i 1 min.
    3. Centrifuge rørene i 5 minutter ved maksimal hastighed.
    4. Den vandige fase overføres fra hver prøve (~ 50 μL) til et nyt 1,7 ml mikrofugerør.
    5. Der tilsættes 1 μL Rnase A (fra 1 mg/ml) og inkuberes ved 37 °C i mindst 30 min.
    6. Prøverne lægges på en 0,8% agarosegel som anbefalet i tabel 4.
      BEMÆRK: De forventede resultater af en kvalitetskontrol er vist i figur 2.
    7. Dna'et måles ved densitometri fra gelen eller ved hjælp af Qubit eller Nanodrop.
      BEMÆRK: Nøjagtig kvantificering sikrer den korrekte inputvolumen i den næste del af protokollen. Brug flere standarder med en kendt mængde til at konstruere en standardkurve.

Tabel 1: Fordøjelsesreagenser. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2: Biotinudfyldningsreagenser. *Bemærk, at ændring af enzymer kan kræve forskellige buffere og biotinylerede dNTP'er. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 3: Reagenser til ligeringsblandinger. Forkortelse: BSA = bovin serumalbumin. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 4: Gelbelastningsparametre til vurdering af kvalitet og størrelse. Klik her for at downloade denne tabel.

Figure 2
Figur 2: Agarosegel, der viser typiske resultater af kvalitetskontrol efter oprensning efter DNA. (A) CI-kontrollen skal angive et bånd af DNA med høj molekylvægt. (B) DC- og Hi-C-prøverne viser en række DNA-størrelser. Hi-C-prøven, der er blevet kombineret til større fragmenter, skal have højere molekylvægt end DC. Koncentrationsområdet for markører giver mulighed for at generere en standardkurve. Bemærk, at CI i dette eksempel blev indlæst på en separat gel, men det tilrådes at indlæse og køre alle prøver og kontroller sammen. Forkortelser: CI = kromatinintegritet; DC = fordøjelseskontrol; Hi-C = nærhed-ligated. Klik her for at se en større version af denne figur.

3. Forberedelse af Hi-C-sekventeringsbibliotek

  1. Fjernelse af biotin fra uligerede ender
    1. Der fremstilles reaktioner på fjernelse af biotin som vist i tabel 5.
      BEMÆRK: Typisk er 10 μg DNA tilstrækkeligt, men op til 30 μg kan bruges.
    2. Fordel 2 x 65 μL alikvoter fra hver 130 μL reaktion i to PCR-rør.
    3. Overfør til en termocyklist eller PCR-maskine, og inkuber som beskrevet i tabel 5.
      BEMÆRK: Prøver kan opbevares her ved 4 ° C (dage til uger), -20 ° C (langsigtet) eller straks overføres til sonikering.
  2. Sonikering
    1. Saml prøveduplikaterne fra biotinfjernelsestrinnet (130 μL samlet prøvevolumen) i et 130 μL sonicatorrør til sonikering.
    2. Soniker prøverne ved hjælp af parametrene i tabel 6 for at opnå en stram smal fordeling under 500 bp.
      BEMÆRK: Forskellige sonikatortyper kan bruges, men for en smal fragmentfordeling (100-500 bp) kan sonicatorindstillinger kræve optimering.
  3. Størrelsesvalg med magnetiske perler
    1. Pipet det sonikerede DNA fra sonikatorrøret (e) ind i et 1,7 ml lavt bindende rør.
    2. Hver prøve bringes til et samlet volumen på 500 μL med 1x TLE. Prøv at få volumenet så tæt som muligt på 500 μL, da forholdet mellem prøve og magnetisk perleblanding er afgørende for størrelsesvalg.
    3. Der tilsættes 400 μL magnetisk perleblanding til hvert rør for at opnå et forhold mellem magnetisk perleblanding og prøvevolumen på 0,8.
      BEMÆRK: Under disse forhold fanger perler DNA-fragmenter >300 bp, som vil være den øvre fraktion. Supernatanten vil indeholde fragmenter <300 bp, som vil være den nedre fraktion.
    4. Bland rørene ved hvirvlning og inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur på en rotator. For dette og andre størrelsesvalgsforhold skal du sørge for, at prøvens fulde volumen blandes godt. Se efter den "uregelmæssige tilstand", som nogle rotorer har, hvilket fungerer godt for mindre mængder.
    5. Inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur på en magnetisk partikelseparator (MPS).
    6. Under inkubation tilsættes 500 μL af den magnetiske perleblanding til et frisk 1,7 μL lavt bindende rør for hver prøve.
      BEMÆRK: Disse rør vil blive brugt til det næste størrelsesvalg af den nederste fraktion ved at generere et magnetisk perleblanding til prøveforhold på 1,1: 1.
    7. Lad rørene stå på MPS i 5 minutter.
    8. Supernatanten fjernes fra perlerne, og der resuspenderes med 150 μL af magnetperleblandingen.
      BEMÆRK: Dette trin undgår mætning af perlerne med DNA ved at øge antallet af perler uden at øge volumenet.
    9. Supernatanten overføres fra trin 3.3.5 til det mærkede rør, der er forberedt til at vælge den nederste fraktion (trin 3.3.8).
      BEMÆRK: 150 μL magnetisk perleblanding + 400 μL af 0,8x magnetisk perleblanding (550 μL i alt) divideret med 500 μL indledende prøve = 1,1x magnetisk perler blanding til prøveforhold.
    10. Bland de nedre fraktionsrør ved hvirvlning og inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur på en rotator.
      BEMÆRK: Perlerne binder DNA-fragmenter >100 bp, hvilket resulterer i en endelig perlebundet fraktion på 100-300 bp.
    11. Sæt de nederste fraktionsrør på MPS i 5 minutter (stuetemperatur).
    12. Fjern supernatanten og centrifuger rørene kort for yderligere at fjerne supernatanten så meget som muligt.
    13. Vask perlerne fra begge fraktioner to gange med 200 μL 70% ethanol og genvind perlerne i 5 minutter på MPS hver gang.
    14. Efter et hurtigt spin i en centrifuge fjernes ethanolen helt, og perlerne tørres yderligere på MPS'en.
      BEMÆRK: Tør, indtil alkoholen er helt fordampet. Pelleten skal ligne mørk chokolade uden revner (kan tage ~ 10 min).
    15. Resuspender begge fraktioner i 50 μL 1x TLE buffer. Inkuberes ved stuetemperatur i 10 minutter, og tryk eller svirp på rørene hvert andet minut for at stimulere blanding og eluering.
    16. Adskil perlerne fra supernatanten på MPS i 5 minutter for begge fraktioner.
    17. Hold supernatanten fra hver prøve. Pipet supernatanten i et 1,7 ml lavt bindende rør.
      BEMÆRK: Prøverne kan opbevares ved 4 °C i nogle få dage eller ved -20 °C på lang sigt.
    18. Kør en 2% agarosegel som i tabel 4 for at bestemme prøvens kvalitet og kvantitet. Se figur 3 for et eksempel på en sådan gel.
      BEMÆRK: Hvis sonikering af erfaring er meget reproducerbar, kan man springe over denne gel og fortsætte med at afslutte reparationen med det samme. Det anbefales, at brugerne holder fast i de øvre fraktioner indtil PCR efter titrering. Suboptimale DNA-mængder, der ville kræve meget PCR-amplifikation, kan reddes fra materiale i den øvre fraktion.
    19. Kvantificer mængden af DNA fra gelen direkte efter generering af en standardkurve fra det kendte DNA-stigeinput eller ved hjælp af en Qubit eller Nanodrop.
  4. Afslut reparation
    1. Forbered slutreparationsblandingen som i tabel 7 (mængde pr. reaktion givet).
    2. Overfør de resterende 46 μL elueret DNA fra den nedre fraktion til PCR-rør, og tilsæt 24 μL af den forberedte slutreparationsblanding. Inkuberes i en PCR-maskine, som foreslået i tabel 7.
    3. Når programmet er afsluttet, skal prøverne opbevares ved 4 °C, indtil de er trukket ned.
  5. Pull-down af biotinylerede ligelagsprodukter med streptavidin-coatede perler
    1. Bestem mængden af streptavidinbelagte perler for hvert bibliotek ud fra det kvantificerede størrelsesvalg (trin 3.3.19).
      BEMÆRK: Disse streptavidinbelagte perler (10 mg / ml opløsning) kan binde 20 μg dobbeltstrenget DNA pr. Mg perler (= 20 μg / 100 μL perler). Brug 2 μL for hver 1 μg Hi-C DNA, men ikke mindre end 10 μL.
    2. Bland de streptavidinbelagte perler og pipet mængden af perler, der er nødvendige for hvert bibliotek (beregnet i det foregående trin) i individuelle 1,7 ml lavbindende rør.
    3. Resuspender perlerne i 400 μL Tween-vaskebuffer (TWB; se opskrift i supplerende tabel S1) og inkuberes i ~3 minutter ved stuetemperatur på en rotator (se instruktionerne i trin 3.3.4).
    4. Adskil perlerne fra supernatanten på MPS i 1 min. og fjern supernatanten.
    5. Perlerne vaskes ved at pipettere yderligere 400 μL TWB.
    6. Adskil perlerne fra supernatanten på MPS i 1 min. og fjern supernatanten.
    7. Tilsæt 400 μL 2x Bindingsbuffer (BB) (opskrift i supplerende tabel S1) til perlerne og resuspender. Derudover tilføjes 330 μL 1x TLE og løsningen fra End-repair (fra trin 3.4.3).
    8. Prøverne inkuberes i 15 minutter ved stuetemperatur, mens de blandes på en rotator.
    9. Adskil perlerne fra supernatanten på MPS i 1 min. og fjern supernatanten.
    10. Tilsæt 400 μL 1x BB til perlerne og resuspender.
    11. Adskil perlerne fra supernatanten på MPS i 1 min. og fjern supernatanten.
    12. Tilsæt 100 μL 1x TLE for at vaske perlerne.
    13. Adskil perlerne fra supernatanten på MPS i 1 min. og fjern supernatanten.
    14. Til sidst tilsættes 41 μL 1x TLE for at suspendere perlerne igen.
  6. A-tailing
    1. Forbered A-tailing-blandingen som i tabel 8.
    2. Reaktionerne ledes i PCR-rør, og der inkuberes som i tabel 8.
    3. Placer PCR-rørene på is umiddelbart efter fjernelse fra termocyklisten og overfør indholdet til 1,7 ml lavbindende rør.
    4. Adskil perlerne fra supernatanten på MPS i 1 min. og kassér supernatanten.
    5. Tilsæt 400 μL 1x ligeringsbuffer, fortyndet fra 5x T4 DNA-ligasebuffer med ultrarent vand.
    6. Adskil perlerne fra supernatanten på MPS i 1 min, og kassér derefter supernatanten.
    7. Der tilsættes 1x ligeringsbuffer til et slutvolumen på 40 μL.
  7. Udglødning adapter oligos
    1. Forbered adapter oligo lagre på 100 μM (tabel 9).
      BEMÆRK: Bestil 250 nmoles af HPLC-rensede oligoer.
    2. Udglød adapterne i PCR-rør som beskrevet i tabel 9.
    3. Brug en PCR-termocyklist til gradvist at øge temperaturen ved 0,5 °C/s til 97,5 °C. Hold ved 97,5 °C i 2,5 min.
    4. Brug en PCR-termocyklist til gradvist at øge temperaturen ved 0,1 °C/s i 775 cyklusser (når 20 °C). Temperaturen holdes ved 4 °C indtil yderligere brug.
    5. Tilsæt 83 μL 1x udglødningsbuffer (opskrift i supplerende tabel S1) for at fortynde adapterne til 15 μM. Opbevar adapterne ved -20 °C.
  8. Sekventering af adapter ligering
    1. Forbered adapterligatblandingen i et 1,7 ml lavt bindende rør (tabel 10).
    2. Læg i 2 timer ved stuetemperatur.
    3. Adskil perlerne fra supernatanten på MPS i 1 min. og kassér supernatanten.
    4. Tilsæt 400 μL TWB og pipet perlerne forsigtigt op og ned inden inkubation på rotatoren i 5 minutter ved stuetemperatur. Adskil perlerne fra supernatanten på MPS og gentag dette trin igen.
    5. Adskil perlerne fra supernatanten på MPS (~ 1 min), kassér supernatanten, og tilføj 200 μL 1x BB.
    6. Adskil perlerne fra supernatanten på MPS (~ 1 min) og kassér supernatanten.
    7. Tilsæt 200 μL 1x pre-PCR Buffer (fra 10x; opskrift i supplerende tabel S1) og overfør til et nyt 1,7 ml lavbindingsrør.
    8. Adskil perlerne fra supernatanten på MPS (~ 1 min) og kassér supernatanten.
    9. Tilsæt 20 μL 1x pre-PCR Buffer og bland ved pipettering.
    10. Rørene opbevares på is, mens de er i brug, eller opbevares ved 4 °C.
  9. Optimering af PCR-cyklusnummeret efter titrering
    1. Der opstilles 30 μL mastermixreaktioner pr. prøve som i tabel 11 (mængde pr. reaktion givet).
    2. Kør det laveste antal cyklusser og tag en 5 μL aliquot. Kør yderligere 2-3 cyklusser på den resterende reaktion, før du tager de næste 5 μL aliquot. Gentag for at indsamle fire alikvoter.
    3. Brug PCR-parametre fra tabel 11 for hver aliquot.
    4. Der tilsættes 5 μL vand og 2 μL 6x farvestof til hver 5 μL prøve. Kør på en 2% agarose TBE gel (opskrift i supplerende tabel S1) med 25-150 ng lav molekylvægt stige. Se figur 4 for forventede resultater.
      BEMÆRK: Et optimalt antal cyklusser til den endelige biblioteks PCR-forstærkning [trin 3.10] er det laveste antal cyklusser for at få synligt produkt på gelen minus en cyklus.
  10. Endelig PCR-forstærkning af biblioteket
    1. Opsæt 12 x 30 μL reaktioner for at forstærke hvert slutbibliotek til sekventering som i tabel 11.
    2. PCR-reaktionerne i cyklus i henhold til tabel 11 efter bestemmelse af antallet af cyklusser efter PCR-titrering (trin 3.9.3).
    3. Når PCR er færdig, skal du samle replikatprøverne i et 1,7 ml mikrofugerør med lav binding.
    4. Placer rørene på MPS'en og overfør supernatanten til et nyt 1,7 ml mikrofugerør med lav binding.
    5. De resterende streptavidinbelagte perler gensuspenderes i 20 μL 1x pre-PCR-buffer.
      BEMÆRK: Denne skabelon kan genbruges, når den opbevares ved 4 °C i dage til uger eller på lang sigt ved -20 °C.
  11. Fjernelse af primere med magnetisk perleblanding
    1. Brug 1x TLE-buffer (opskrift i supplerende tabel S1) til at justere lydstyrken fra trin 3.10.4 til nøjagtigt 360 μL.
    2. Til hver prøve tilsættes 360 μL af magnetperleblandingen og pipetteres op og ned for at blande.
    3. På en rotator blandes prøverne i 10 minutter ved stuetemperatur.
    4. Adskil perlerne fra supernatanten på MPS ved stuetemperatur (3-5 min).
    5. Vask perlerne to gange med 200 μL 70% ethanol og genvind perlerne i 5 minutter på MPS hver gang.
    6. Quick-spin i en centrifuge og pipetter ethanolen helt af. Tør perlerne i luft på MPS'en for yderligere at fordampe ethanolen.
      BEMÆRK: Pelleten skal ligne mørk chokolade uden revner (kan tage ~ 10 min).
    7. Tilsæt 30 μL ultrarent vand og resuspender for at elutere DNA'et i 10 minutter ved stuetemperatur. Svirp rørene hvert 2. minut for at hjælpe med at blande.
    8. Adskil perlerne fra supernatanten på MPS i 5 min.
    9. Supernatanten samles fra hver prøve i et frisk 1,7 ml rør.
    10. Kør 1 μL af biblioteket på en 2% agarose TBE (opskrift i supplerende tabel S1) gel for at opnå en fragmentstørrelsesfordeling og for at kvantificere det endelige bibliotek (figur 5).
      BEMÆRK: ClaI-fordøjelse kan kun forekomme for DpnII-DpnII-kryds og fungerer som en positiv ligeringskontrol, der skal resultere i en lavere fragmentstørrelsesfordeling for det endelige bibliotek. Endelige biblioteker kan opbevares i et par dage ved 4 °C, langtidslagres ved -20 °C eller straks fortyndes og indsendes til sekventering.

Tabel 5: Reagenser og temperaturer til fjernelse af biotin Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 6: Parametre til sonikering. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 7: Slutreparationsreagenser og temperaturer. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 8: A-tailing reagenser og temperaturer. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 9: PCR-primere og paired-end-adapter oligoer med reagenser udglødning til udglødning. Forkortelse: 5PHOS = 5' fosfat. Stjerner indikerer fosforothioerede DNA-baser. # Kombiner en indekseret oligo med Universal oligo til udglødning i en indekseret adapter. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 10: Adapterligationsreagenser. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 11: PCR-reagenser og cykelparametre. Klik her for at downloade denne tabel.

Figure 3
Figur 3: Agarose gel, der viser typiske valgresultater efter størrelse. De øvre og nedre fraktioner for fire prøver (nummereret 1-4) af DpnII-DdeI Hi-C vises. Den første bane for hver prøve indeholder den øvre fraktion, afledt af en 0,8x magnetisk perleblanding, og den anden og tredje bane indeholder en fortynding af den nedre fraktion afledt af en 1,1x magnetisk perleblanding. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Agarosegel med PCR-titreringsresultater. Fra 5 PCR-cyklusser tages prøver efter hver 2 cyklusser (5, 7, 9 og 11 cyklusser) for hvert af fire biblioteker. Baseret på dette tal blev 6 cyklusser valgt som den optimale cyklus for hver prøve. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Endelige PCR-produkter. Efter rengøring og størrelsesvalg blev PCR-produkter (Hi-C) indlæst ved siden af en ClaI-fordøjet brøkdel af det samme bibliotek (ClaI). ClaI-fordøjede fragmenter indikerer tilstedeværelsen af efterspurgte DpnII-DpnII-ligeringer. Bemærk, at ClaI ikke fordøjer DpnII-DdeI-kryds, og derfor vil ikke alle ligeringer bidrage til en størrelsesreduktion fra denne begrænsning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Representative Results

Figurerne i dette manuskript blev genereret fra et separat, replikerende eksperiment af det, der tidligere blev offentliggjort af Lafontaine et al.21. Efter at have opnået sekventeringsdata med høj kapacitet blev Open Chromatin Collective (Open2C: https://github.com/open2c) brugt til at behandle Hi-C-dataene. En lignende pipeline kan findes på dataportalen for 4D Nucleome-projektet (https://data.4dnucleome.org/resources/data-analysis/hi_c-processing-pipeline). Kort fortalt blev Nextflow-rørledningsdestilleriet (https://github.com/open2c/distiller-nf) implementeret for at (1) justere sekvenserne af Hi-C-molekyler til referencegenomet, (2) analysere .sam-justering og danne filer med Hi-C-par, (3) filtrere PCR-duplikater og (4) aggregerede par i binnederede matricer af Hi-C-interaktioner. Disse HDF5-formaterede matricer, kaldet kølere, kan derefter (1) ses på en HiGlass-server (https://higlass.io/) og (2) analyseres ved hjælp af et stort sæt open source-beregningsværktøjer, der findes i "cooltools" -samlingen, der vedligeholdes af Open Chromatin Collective (https://github.com/open2c/cooltools) for at udtrække og kvantificere foldefunktioner såsom rum, TAD'er og sløjfer.

Nogle kvalitetsindikatorer for Hi-C3.0-bibliotekerne kan vurderes umiddelbart efter kortlægning af læsepar til et referencegenom ved hjælp af nogle få enkle målinger / indikatorer. For det første kan typisk ~ 50% af sekventerede læsepar kortlægges entydigt for humane celler. På grund af kromosomernes polymere natur repræsenterer de fleste af disse kortlagte læsninger (~ 60% -90%) interaktioner inden for et kromosom (cis), hvor interaktionsfrekvenser hurtigt henfalder med stigende genomisk afstand (afstandsafhængig henfald). Det afstandsafhængige henfald kan visualiseres bedst i et "skaleringsplot", som viser kontaktsandsynligheden (pr. kromosomarm) som en funktion af genomisk afstand. Vi fandt ud af, at brugen af forskellige tværbindinger og enzymer kan ændre det afstandsafhængige henfald på lange og korte afstande17. Tilsætningen af DSG-tværbinding øger detekterbarheden af interaktioner på korte afstande, når de kombineres med enzymer såsom Mnase og kombinationer af DpnII-DdeI, der producerer mindre fragmenter (figur 6A).

Afstandsafhængigt henfald kan også observeres direkte fra 2D-interaktionsmatricer: interaktioner bliver mere sjældne, når de placeres længere væk fra den centrale diagonal (figur 6B). Derudover kan genomiske foldefunktioner, såsom rum, TAD'er og sløjfer, identificeres fra Hi-C-matricer og skaleringsplotter som afvigelser fra det generelle genom-dækkende gennemsnitlige afstandsafhængige henfald. Det er vigtigt, at tværbinding med DSG ud over FA reducerer tilfældige ligeringer, som er ubegrænsede på grund af kromosomernes polymernatur og derfor mere tilbøjelige til at forekomme mellem kromosomer (i trans) (figur 6C). Reduktion af tilfældig ligering fører til øgede signal-støj-forhold, især for interkromosomale og meget langtrækkende (>10-50 Mb) intrakromosomale interaktioner.

Figure 6
Figur 6: Repræsentative resultater af kortlagte og filtrerede Hi-C-biblioteker. (A) Skalering af plots med kontaktsandsynlighed og dets derivat for forskellige enzymer, ordnet efter fragmentlængde (øverst) og tværbinding med enten FA eller FA + DSG (nederst). Fordøjelse med MNAse (microC) eller DpnII-DdeI (Hi-C 3.0) øger kortdistancekontakter (øverst) betydeligt, ligesom tilføjelse af DSG til FA (nederst). (B) Kolonner viser Hi-C-varmekort over DpnII-fordøjelsen efter blot FA-tværbinding og DpnII- eller DdeI-fordøjelse efter FA+DSG-tværbinding. Hvide pile viser stigende styrke af "prikker" efter DSG-tværbinding og DdeI-fordøjelse, hvilket indebærer bedre påvisning af DNA-sløjfer. Rækker viser forskellige dele af kromosom 3 ved stigende opløsning, justeret med panel C: øverste række: hele kromosom 3 (0-198,295,559 Mb); midterste række: 186-196 Mb; nederste række: 191,0-191,5 Mb. (C) Dækningsgrafer for de regioner, der er afbildet i A. Sorte pile viser den lavere dækning (% cis læser) for tværbinding kun for FA. Forkortelser: FA = formaldehyd; DSG = disuccinimidylglutarat; Chr = kromosom. Klik her for at se en større version af denne figur.

Ikke alle kortlagte læsninger er nyttige. En anden kvalitetsindikator er antallet af PCR-dubletter. Det er meget usandsynligt, at nøjagtige duplikatlæsninger forekommer tilfældigt efter ligering og sonikering. Således skyldes sådanne aflæsninger sandsynligvis PCR-forstærkning og skal filtreres ud. Duplikater opstår ofte, når der kræves for mange PCR-cyklusser for at forstærke biblioteker med lav kompleksitet. Generelt for Hi-C har de fleste biblioteker kun brug for 5-8 cyklusser med endelig PCR-forstærkning, som bestemt ved titrerings-PCR (se trin 3.9; Figur 4). Biblioteker med tilstrækkelig kompleksitet kan dog opnås selv efter 14 cyklusser med PCR-forstærkning.

En anden kategori af duplikatlæsninger, såkaldte optiske dubletter, kan opstå ved forstærkningsprocessen på Illumina-sekventeringsplatforme, der bruger mønstrede flowceller (såsom HiSeq4000). Optiske duplikater findes fra enten overbelastning af flowcellen, hvilket får (store) klynger til at blive kaldt to separate klynger eller fra lokal reclustering af det oprindelige parrede endemolekyle efter en første runde af PCR. Da begge typer optiske dubletter er lokale, kan de identificeres og skelnes fra PCR-dubletter ved deres placering på flowcellen. Mens biblioteker med >15% PCR-duplikater ville have brug for regenerering, kan biblioteker med optiske duplikater genindlæses efter optimering af indlæsningsprocessen.

Supplerende tabel S1: Buffere og opløsninger. Klik her for at downloade denne tabel.

Discussion

Kritiske trin til cellehåndtering
Selvom det er muligt at bruge et lavere antal inputceller, er denne protokol optimeret til ~ 5 × 106 celler pr. sekventeringsbane (~ 400 M læser) for at sikre korrekt kompleksitet efter dyb sekventering. Celler tælles bedst inden fiksering. Til generering af ultradybe biblioteker multiplicerer vi generelt antallet af baner (og celler), indtil den ønskede læsedybde er nået. For at opnå optimal fiksering skal serumholdigt substrat erstattes med PBS før FA-fiksering, og fikseringsopløsninger skal tilsættes straks og uden koncentrationsgradienter15,22. Til cellehøst foretrækkes skrabning frem for trypsinisering, fordi overgangen fra en fladere til en sfærisk form efter trypsinisering kan påvirke den nukleare konformation. Efter tilsætning af DSG går løse og klumpede cellepiller let tabt. Vær forsigtig, når du håndterer celler på dette stadium, og tilføj op til 0,05% BSA for at mindske klumpning.

Ændringer af metoden
Denne protokol blev udviklet ved hjælp af humane celler17. Men baseret på erfaring med indfangning af kromosomkonformation bør denne protokol fungere for de fleste eukaryote celler. For et betydeligt lavere input (~ 1 × 106 celler) anbefaler vi at bruge halvdelen af volumenerne til lysis- og konformationsindfangningsprocedurerne [trin 2.1-2.4]. Dette ville også gøre det muligt at udføre DNA-isolering [trin 2.5] i en bordpladecentrifuge med 1,7 ml rør, hvilket kunne forbedre pelletering for lave DNA-koncentrationer. Kvantificeringen af DNA (trin 2.6.6) angiver, hvordan man skal forholde sig. For lave mængder isoleret DNA (1-5 μg) foreslår vi at springe over størrelsesvalget (trin 3.3) og fortsætte med fjernelse af biotin efter at have reduceret volumenet fra 130 μL til ~ 45 μL med en CFU.

Denne protokol blev udviklet specielt for at sikre data af høj kvalitet efter efterfølgende tværbinding med FA og DSG og fordøjelse med DpnII og DdeI. Imidlertid kan alternative tværbindingsstrategier såsom FA efterfulgt af EGS (ethylenglycolbis (succinimidylsuccinat)), som også anvendes i ChIP-seq23 og ChIA-PET24, fungere lige så godt17. Tilsvarende kan forskellige enzymkombinationer, såsom DpnII og HinfI18 eller MboI, MseI og NlaIII19 , anvendes til fordøjelsen. Når du tilpasser enzymkombinationer, skal du sørge for at bruge biotinylerede nukleotider, der kan udfylde de specifikke 5 'udhæng og bruge de mest optimale buffere til hver cocktail. DpnII leveres med sin egen buffer, og enzymproducenten anbefaler en specifik buffer til DdeI-fordøjelsen. Men for dobbeltfordøjelsen med DpnII og DdeI i denne protokol anbefales Restriction Buffer, fordi den er vurderet til 100% aktivitet for begge enzymer.

Fejlfinding af konformationsregistrering
De tre vigtigste trin i kromosomkonformationsfangst: tværbinding, fordøjelse og religation er alle blevet udført, før resultaterne kan visualiseres på gel. For at bestemme kvaliteten af hvert af disse tre trin og skelne, hvor der kunne være opstået problemer, tages og lægges aliquoter før (CI) og efter fordøjelsen (DC) på gelen sammen med den ligerede Hi-C-prøve (figur 2). Denne gel bruges til at bestemme kvaliteten af Hi-C-prøven, og om det vil være værd at fortsætte protokollen. Uden CI og DC er det vanskeligt at udpege potentielle suboptimale trin. Det er værd at bemærke, at suboptimal ligering kan skyldes et problem i selve ligeringen, udfyldningen eller et problem med tværbinding. Hvis du vil foretage fejlfinding af krydslinkning, skal du sørge for ikke at bruge mere end 1 × 107 celler pr. bibliotek og starte med friske tværbindingsreagenser og rene celler (dvs. skyllet med PBS). For ligering skal du sørge for, at celler og ligeringsblanding opbevares på is. Tilsæt T4 DNA-ligase lige før 4 timers inkubation ved 16 °C og bland godt.

Fejlfinding af biblioteksforberedelse
Hvis der er behov for mere end 10 PCR-cyklusser, eller der ikke kan ses noget PCR-produkt på gel efter PCR-titrering (figur 4), er der et par muligheder for at gemme Hi-C-prøven. Når man arbejder tilbage fra PCR-titreringen, er den første mulighed at prøve PCR igen. Hvis der stadig ikke er nok produkt, er det muligt at forsøge endnu en omgang A-tailing og adapterligering (trin 3.6) efter vask af perlerne to gange med 1x TLE buffer. Efter denne ekstra A-tailing og adapterligering kan man fortsætte til PCR-titreringen som før. Hvis der stadig ikke er noget produkt, er den sidste mulighed at resonere 0,8x fraktionen fra trin 3,3 og fortsætte derfra.

Begrænsninger og fordele ved Hi-C3.0
Det er vigtigt at indse, at Hi-C er en populationsbaseret metode, der fanger den gennemsnitlige hyppighed af interaktioner mellem par loci i cellepopulationen. Nogle beregningsanalyser er designet til at adskille kombinationer af konformationer fra en population25, men i princippet er Hi-C blind for forskelle mellem celler. Selvom det er muligt at udføre enkeltcelle Hi-C26,27, og beregningsmæssige slutninger kan foretages28, er enkeltcelle Hi-C ikke egnet til at opnå 3C-information med ultrahøj opløsning. En yderligere begrænsning af Hi-C er, at den kun registrerer parvise interaktioner. For at opdage multikontaktinteraktioner kan man enten bruge hyppige fræsere kombineret med kortlæst sekventering (Illumina)16 eller udføre multikontakt 3C29 eller 4C30 ved hjælp af langlæst sekventering fra PacBio- eller Oxford Nanopore-platforme. Hi-C-derivater til specifikt at detektere kontakter mellem og langs søsterkromatider er også blevet udviklet31,32.

Selvom Hi-C19 og Micro-C33 kan bruges til at generere kontaktkort ved subkilobaseopløsninger, kræver begge en stor mængde sekventeringslæsninger, og dette kan blive en dyr opgave. For at komme til lignende eller endnu højere opløsning uden omkostningerne kan berigelse for specifikke genomiske regioner (capture-C34) eller specifikke proteininteraktioner (ChiA-PET 35, PLAC-seq 36, Hi-ChIP37) anvendes. Styrken og ulempen ved disse berigelsesapplikationer er, at der kun udtages et begrænset antal interaktioner. Med sådanne berigelser går det globale aspekt af Hi-C (og muligheden for global normalisering) tabt.

Betydning og potentielle anvendelser af Hi-C3.0
Denne protokol blev designet til at muliggøre ultradeep 3C med høj opløsning, samtidig med at den registrerer store foldefunktioner såsom TAD'er og rum17 (figur 6). Denne protokol starter med 5 × 106 celler pr. rør for hvert Hi-C-bibliotek, hvilket skal være mere end nok materiale til at sekvensere en eller to baner på en flowcelle for at opnå op til 1 milliard parrede endelæsninger. Til ultradeep sekventering skal der fremstilles flere rør med 5 × 106 celler afhængigt af antallet af kortlagte læsninger og PCR-duplikater. Ved den højeste opløsning (<1 kb) findes looping-interaktioner for det meste mellem CTCF-websteder, men promotor-forstærkerinteraktioner kan også detekteres. Læsere kan henvise til Akgol Oksuz et al.17 for en detaljeret beskrivelse af dataanalysen.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Denis Lafontaine for protokoludvikling og Sergey Venev for bioinformatisk bistand. Dette arbejde blev støttet af et tilskud fra National Institutes of Health Common Fund 4D Nucleome Program til JD (U54-DK107980, UM1-HG011536). J.D. er en efterforsker af Howard Hughes Medical Institute.

Denne artikel er underlagt HHMI's Open Access to Publications-politik. HHMI-laboratorieledere har tidligere givet en ikke-eksklusiv CC BY 4.0-licens til offentligheden og en underlicenserbar licens til HHMI i deres forskningsartikler. I henhold til disse licenser kan det forfatteraccepterede manuskript til denne artikel gøres frit tilgængeligt under en CC BY 4.0-licens umiddelbart efter offentliggørelsen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 kb Ladder New England Biolabs N3232L
Agarose Invitrogen 16500100
Agencourt AMPure XP magnetic beads , 60 mL Beckman Coulter A63881
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit (CFU) EMD Millipore UFC500396
Annealing Buffer (5x) See recipe in supplemental materials
ATP 10 mM ThermoFisher R0441
Avanti J-25i High Speed Refrigerated ultra-centrifuge Beckman Coulter
beckman ultracentrifuge tube 35 mL Beckman Coulter 357002
Binding Buffer (2x) See recipe in supplemental materials
biotin-14-dATP 0.4 mM Invitrogen 19524-016
BSA 10 mg/mL New England Biolabs B9000S dilute from 20 mg/mL
Cell scraper Falcon 353089
Cell scraper Corning 3008
Conical polypropylene tubes 50 mL Denville C1062-P
Conical tube 15 mL Denville C1017-P
Covaris micro tube AFA fiber with snap-cap 130 µL Covaris 520045/520077
Covaris Sonicator Covaris E220/E220evolution/M220
Culture flask 175 cm2 Falcon 353112
Culture plates 150 mm x 25 mm Corning 430599
dATP 1 mM Invitrogen 56172
dATP 10 mM Invitrogen 56172
dCTP 10 mM Invitrogen 56173
DdeI New England Biolabs R0175L
dGTP 10 mM Invitrogen 56174
DMSO Sigma D2650-5x10ML
dNTP mix 25 mM Invitrogen 10297117
Dounce homogenizer DWK Life Sciences 8853010002/8853030002
DPBS Gibco 14190-144
DpnII New England Biolabs R0543M
DSG ThermoScientific 20593
dTTP 10 mM Invitrogen 56175
Ethanol 70% Fisher A409-4 Diluted from 100%
Ethidium Bromide Fisher BP1302-10
Formaldehyde (37%) Fisher BP531-500
Gel loading dye (6x ) New England Biolabs B7024S
Glycine in ultrapure water 2.5 M Sigma G8898-1KG
HBSS Gibco 14025-092
Igepal CA-630 detergent MP Biomedicals 198596
Klenow DNA polymerase 5 U/µL New England Biolabs M0210L
Klenow Fragment 3-->5’ exo-, 5 U/µL New England Biolabs M0212L
ligation buffer (10x) New England Biolabs B7203S
Liquid nitrogen
LoBind microcentrifuge tube 1.7 mL Eppendorf 22431021
Low Molecular Weight DNA Ladder New England Biolabs N3233L
Lysis buffer See recipe in supplemental materials
Magnetic Particle separator ThermoFisher 12321D
Microfuge tubes 1.7 mL Axygen MCT-175-C
MyOne Streptavidin C1 beads Invitrogen 65001
NEBuffer 2.1 (10x) New England Biolabs B7002S
NEBuffer 3.1 (10x) New England Biolabs B7203S
PBS Gibco 70013-032
PCR (strip) tubes Biorad TBS0201/ TCS0803
PCR thermocycler Biorad T100
Pfu Ultra II Buffer (10x) Agilent Comes with Pfu Ultra
PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase  Agilent 600674
Phase lock tube 15 mL Qiagen 129065
Phase lock tubes 2 mL Qiagen 129056
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol Invitrogen 15593-049
Protease inhibitor cocktail ThermoFisher 78440
Proteinase K in ultrapure water 10 mg/mL Invitrogen 25530-031
Refrigerated Centrifuge Eppendorf 5810R
RNase A, DNase and protease-free 10 mg/mL Thermo Scientific EN0531
Rotator Argos technologies EW-04397-40 or rocking platform
SDS 1% Fisher BP13111
Sodium acetate pH = 5.2, 3 M Sigma
Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System Biorad 1704401
T4 DNA ligase 1 U/µL Invitrogen 100004817
T4 DNA polymerase New England Biolabs M0203L
T4 DNA polymerase New England Biolabs M0203L
T4 DNA polymerase 3 U/µL New England Biolabs M0203L
T4 ligation buffer (5x) Invitrogen Y90001
T4 polynucleotide kinase 10 U/µL New England Biolabs M0201L
Tabletop centrifuge Eppendorf 5425
TBE buffer See recipe in supplemental materials
Tris Low EDTA Buffer (TLE) See recipe in supplemental materials
Triton X-100 (10%) Sigma 93443
Truseq adapter oligos Integrated DNA Technologies (IDT)) https://www.idtdna.com/site/order/oligoentry 250 nmole and HPLC purified
Tween 20 detergent Fisher 9005-64-5
Tween Wash Buffer See recipe in supplemental materials
Vortex Scientific Industries (G560)SI-0236

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. Capturing chromosome conformation. Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).
  2. Simonis, M., et al. Nuclear organization of active and inactive chromatin domains uncovered by chromosome conformation capture-on-chip (4C). Nature Genetics. 38 (11), 1348-1354 (2006).
  3. Dostie, J., et al. Chromosome Conformation Capture Carbon Copy (5C): a massively parallel solution for mapping interactions between genomic elements. Genome Research. 16 (10), 1299-1309 (2006).
  4. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
  5. Stadhouders, R., et al. Multiplexed chromosome conformation capture sequencing for rapid genome-scale high-resolution detection of long-range chromatin interactions. Nature Protocols. 8 (3), 509-524 (2013).
  6. Kalhor, R., Tjong, H., Jayathilaka, N., Alber, F., Chen, L. Genome architectures revealed by tethered chromosome conformation capture and population-based modeling. Nature Biotechnology. 30 (1), 90-98 (2012).
  7. Hsieh, T. H., et al. Mapping nucleosome resolution chromosome folding in yeast by micro-C. Cell. 162 (1), 108-119 (2015).
  8. Hsieh, T. -H. S., Fudenberg, G., Goloborodko, A., Rando, O. J. Micro-C XL: assaying chromosome conformation from the nucleosome to the entire genome. Nature Methods. 13 (12), 1009-1011 (2016).
  9. Denker, A., de Laat, W. The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization. Genes & Development. 30 (12), 1357-1382 (2016).
  10. Rodley, C. D., Bertels, F., Jones, B., O’Sullivan, J. M. Global identification of yeast chromosome interactions using Genome conformation capture. Fungal Genetics and Biology. 46 (11), 879-886 (2009).
  11. Rao, S. S., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
  12. Alipour, E., Marko, J. F. Self-organization of domain structures by DNA-loop-extruding enzymes. Nucleic Acids Research. 40 (22), 11202-11212 (2012).
  13. Lajoie, B. R., Dekker, J., Kaplan, N. The Hitchhiker’s guide to Hi-C analysis: Practical guidelines. Methods. 72, 65-75 (2015).
  14. Belaghzal, H., Dekker, J., Gibcus, J. H. Hi-C 2.0: An optimized Hi-C procedure for high-resolution genome-wide mapping of chromosome conformation. Methods. 123, 56-65 (2017).
  15. Golloshi, R., Sanders, J. T., McCord, R. P. Iteratively improving Hi-C experiments one step at a time. Methods. 142, 47-58 (2018).
  16. Darrow, E. M., et al. Deletion of DXZ4 on the human inactive X chromosome alters higher-order genome architecture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (31), 4504-4512 (2016).
  17. Akgol Oksuz, B., et al. Systematic evaluation of chromosome conformation capture assays. Nature Methods. 18 (9), 1046-1055 (2021).
  18. Ghuryeid, J., et al. Integrating Hi-C links with assembly graphs for chromosome-scale assembly. PLoS Computational Biology. 15 (8), 1007273 (2019).
  19. Gu, H., et al. Fine-mapping of nuclear compartments using ultra-deep Hi-C shows that active promoter and enhancer elements localize in the active A compartment even when adjacent sequences do not. bioRxiv. , (2021).
  20. Ramani, V., et al. Mapping 3D genome architecture through in situ DNase Hi-C. Nature Protocols. 11 (11), 2104-2121 (2016).
  21. Lafontaine, D. L., Yang, L., Dekker, J., Gibcus, J. H. Hi-C 3.0: Improved Protocol for Genome-Wide Chromosome Conformation Capture. Current Protocols. 1 (7), 198 (2021).
  22. Belton, J. -M. M., et al. Hi-C: A comprehensive technique to capture the conformation of genomes. Methods. 58 (3), 268-276 (2012).
  23. Truch, J., Telenius, J., Higgs, D. R., Gibbons, R. J. How to tackle challenging ChIP-Seq, with long-range cross-linking, Using ATRX as an example. Methods in Molecular Biology. 1832, Clifton, N.J. 105-130 (2018).
  24. Wang, P., et al. In situ chromatin interaction analysis using paired-end tag sequencing. Current Protocols. 1 (8), 174 (2021).
  25. Tjong, H., et al. Population-based 3D genome structure analysis reveals driving forces in spatial genome organization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1663-1672 (2016).
  26. Nagano, T., et al. Cell-cycle dynamics of chromosomal organization at single-cell resolution. Nature. 547 (7661), 61-67 (2017).
  27. Ramani, V., et al. Massively multiplex single-cell Hi-C. Nature Methods. 14 (3), 263-266 (2017).
  28. Meng, L., Wang, C., Shi, Y., Luo, Q. Si-C is a method for inferring super-resolution intact genome structure from single-cell Hi-C data. Nature Communications. 12 (1), 4369 (2021).
  29. Tavares-Cadete, F., Norouzi, D., Dekker, B., Liu, Y., Dekker, J. Multi-contact 3C reveals that the human genome during interphase is largely not entangled. Nature Structural & Molecular Biology. 27 (12), 1105-1114 (2020).
  30. Vermeulen, C., et al. Multi-contact 4C: long-molecule sequencing of complex proximity ligation products to uncover local cooperative and competitive chromatin topologies. Nature Protocols. 15 (2), 364-397 (2020).
  31. Oomen, M. E., Hedger, A. K., Watts, J. K., Dekker, J. Detecting chromatin interactions between and along sister chromatids with SisterC. Nature Methods. 17 (10), 1002-1009 (2020).
  32. Mitter, M., et al. Conformation of sister chromatids in the replicated human genome. Nature. 586 (7827), 139-144 (2020).
  33. Krietenstein, N., et al. Ultrastructural Details of Mammalian Chromosome Architecture. Molecular Cell. 78 (3), 554-565 (2020).
  34. Hughes, J. R., et al. Analysis of hundreds of cis-regulatory landscapes at high resolution in a single, high-throughput experiment. Nature Genetics. 46 (2), 205-212 (2014).
  35. Fullwood, M. J., et al. An oestrogen-receptor-alpha-bound human chromatin interactome. Nature. 462 (7269), 58-64 (2009).
  36. Fang, R., et al. Mapping of long-range chromatin interactions by proximity ligation-assisted ChIP-seq. Cell Research. 26 (12), 1345-1348 (2016).
  37. Mumbach, M. R., et al. HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nature Methods. 13 (11), 919-922 (2016).

Tags

Genetik udgave 191 Kromosomkonformationsfangst tværbinding begrænsningsfordøjelse kromatinsløjfer prikker topologisk associerende domæner opdeling
Indfangning af kromosomkonformation på tværs af længdeskalaer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, L., Akgol Oksuz, B., Dekker,… More

Yang, L., Akgol Oksuz, B., Dekker, J., Gibcus, J. H. Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales. J. Vis. Exp. (191), e64001, doi:10.3791/64001 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter