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Medicine

In vitro Modèle entéroïde apical-out de l’entérocolite nécrosante

Published: June 8, 2022 doi: 10.3791/64003
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Pediatrics, Division of Neonatal-Perinatal Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center and Center for Pregnancy and Newborn Health

Summary

Ce protocole décrit un modèle apico-out d’entérocolite nécrosante (ECN) dans une boîte utilisant des entéroïdes intestinaux grêles à polarité inversée, permettant l’accès à la surface apicale. Nous fournissons un protocole de coloration immunofluorescente pour détecter la perturbation épithéliale liée à l’ECN et une méthode pour déterminer la viabilité des entéroïdes à sortie apicale soumis au protocole NEC-in-a-dish.

Abstract

L’entérocolite nécrosante (ECN) est une maladie dévastatrice qui touche les nouveau-nés prématurés, caractérisée par une inflammation intestinale et une nécrose. Les entéroïdes sont récemment apparus comme un système prometteur pour modéliser les pathologies gastro-intestinales. Cependant, les méthodes actuellement utilisées pour la manipulation entéroïde n’ont pas accès à la surface apicale de l’épithélium (tridimensionnel [3D]) ou sont longues et gourmandes en ressources (monocouches bidimensionnelles [2D]). Ces méthodes nécessitent souvent des étapes supplémentaires, telles que la micro-injection, pour que le modèle devienne physiologiquement transposable. Ici, nous décrivons un protocole physiologiquement pertinent et peu coûteux pour étudier l’ECN in vitro en inversant la polarité entéroïde, ce qui donne à la surface apicale tournée vers l’extérieur (apical-out). Un protocole de coloration immunofluorescente pour examiner l’intégrité de la barrière entéroïde et l’expression des protéines jonctionnelles après une exposition au facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) ou au lipopolysaccharide (LPS) dans des conditions normoxiques ou hypoxiques est également fourni. La viabilité des entéroïdes 3D exposés au LPS normoxique ou hypoxique ou au TNF-α pendant 24 heures est également évaluée. Les entéroïdes exposés au LPS ou au TNF-α, en combinaison avec l’hypoxie, présentaient une perturbation de l’architecture épithéliale, une perte de l’expression de la protéine de jonction adhérente et une réduction de la viabilité cellulaire. Ce protocole décrit un nouveau modèle d’ECN dans une boîte qui présente une plate-forme physiologiquement pertinente et rentable pour identifier les cibles épithéliales potentielles pour les thérapies NEC et étudier la réponse intestinale prématurée aux traitements.

Introduction

L’entérocolite nécrosante (ECN), une maladie inflammatoire grave de l’intestin grêle survenant chez jusqu’à 10 % des nouveau-nés prématurés, est généralement associée à une morbidité et une mortalité élevées 1,2. Les taux de mortalité approchant les 50% chez les nourrissons de très faible poids de naissance (<1500 g), nécessitant une intervention chirurgicale, ne sont pas rares3. Bien que l’étiologie exacte de l’ECN ne soit pas actuellement comprise, on pense que les facteurs de risque, tels que l’alimentation au lait maternisé, s’ajoutent à des anomalies physiologiques, telles que la dysbiose, un épithélium intestinal immature et une barrière intestinale dysfonctionnelle, dans le développement de la maladie 2,4. Malgré des efforts importants, peu de progrès ont été réalisés dans la prévention ou le traitement de l’ECN au cours de la dernière décennie5. Une nouvelle méthode in vitro pour étudier l’ECN et le dysfonctionnement de la barrière épithéliale intestinale associée est nécessaire pour faire progresser la compréhension de la pathogenèse de la maladie, car les résultats des modèles animaux ont, jusqu’à présent, mal transposé au chevet du patient6.

Un certain nombre de modèles in vitro ont été utilisés pour étudier les mécanismes en jeu pendant l’ECN. La lignée cellulaire épithéliale intestinale humaine, Caco-2, est parmi les modèles in vitro les plus couramment utilisés de NEC 7,8. Les cellules Caco-2 émulent les caractéristiques morphologiques de l’intestin grêle, mais, en tant que lignée cellulaire, ne se différencient pas dans la grande variété de types de cellules in vivo, y compris les cellules caliciformes productrices de mucus, nécessaires pour un modèle hautement traduisible. HT-29-MTX, cellules d’adénocarcinome du côlon humain, comprennent un phénotype mixte d’entérocyte et de cellules caliciformes, mais manquent encore de types cellulaires à base de cryptes de l’épithélium intestinal9. IEC-6 et IEC-18 sont des lignées cellulaires non transformées avec une morphologie immature semblable à une crypte iléale mais ne sont pas dérivées de tissus humains, ce qui limite leur capacité de traduction. Les lignées cellulaires intestinales FHs 74-Int et H4 sont dérivées de tissus fœtaux humains et ne forment pas de jonctions serrées ou de monocouches polarisées10,11, et sont donc immatures par rapport aux nourrissons les plus prématurés sensibles à l’ECN. En règle générale, les modèles in vitro d’ECN utilisent des traitements lipopolysaccharidiques (LPS) pour induire le récepteur 4 de type Toll (TLR4), un récepteur majeur initiant l’inflammation intestinale dans NEC12. Les dommages induits par le traitement des espèces réactives de l’oxygène (ROS), généralement par le peroxyde d’hydrogène, sont souvent utilisés pour induire des dommages oxydatifs de type NEC et l’apoptose13,14. En tant que principal moteur de l’inflammation intestinale, le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α), un composant en aval de la signalisation inflammatoire TLR4, est également couramment utilisé dans ces modèles in vitro pour imiter la pathogenèse in vivo 15.

Les organoïdes, générés à partir de cellules souches pluripotentes inductibles (CSPi), ont gagné en popularité en tant que modèle in vitro de l’intestin en raison de leur capacité à récapituler l’architecture complexe in vivo et la composition de type cellulaire du tissu dont ils sont dérivés16,17. Un système in vitro apparenté, les entéroïdes, sont des organoïdes dérivés de cryptes intestinales réséquées qui sont plus faciles à établir et à maintenir que les organoïdes dérivés de CSPi. Les entéroïdes sont généralement cultivés dans une matrice extracellulaire (ECM) tridimensionnelle (3D) avec un accès expérimental limité à la surface cellulaire basolatérale. Des méthodes, telles que la microinjection18,19, ont été développées pour surmonter cette barrière à la surface apicale, mais l’accumulation de débris cellulaires et de mucus dans la lumière rend la micro-injection à la fois techniquement difficile et incohérente. Comme les plates-formes de micro-injection robotique personnalisées ne sont pas largement accessibles20, la variabilité de la capacité technique et de la technique générale d’un laboratoire à l’autre devient une variable importante à surmonter avec les protocoles de micro-injection. Les monocouches bidimensionnelles (2D) dérivées d’entéroïdes 3D dissociés, comprenant encore tous les principaux types cellulaires de l’épithélium intestinal, permettent d’accéder à la surface apicale mais ont toujours été difficiles à maintenir sans couche nourricière de myofibroblastes mésenchymateux21. Alors que des supports perméables à la culture cellulaire peuvent être utilisés pour accéder aux côtés apical et basolatéral des monocouches entéroïdes sans utiliser de myofibroblastes sous-jacents, ces inserts nécessitent l’excision et le montage de la membrane avant utilisation avec des modalités telles que la microscopie confocale, ce qui entraîne un processus plus exigeant et plus difficile sur le plan technique lors de l’utilisation de méthodes de microscopie traditionnelles22. NEC a été modélisé in vitro en utilisant des entéroïdes 3D traditionnels 23,24,25 et des supports perméables 26,27, et l’inflammation intestinale a récemment été reproduite avec des modèles intestin-sur-puce 28,29. Bien que les modèles gut-on-a-chip intégrant la microfluidique soient, de loin, les modèles les plus avancés et les plus traduisibles, cette technologie est coûteuse, complexe et inaccessible à la plupart des chercheurs30.

Les progrès récents dans les techniques d’entéroïdes apicals ont permis un accès plus facile à la surface apicale des entéroïdes 3D sans risquer d’endommager l’intégrité structurelle de l’épithélium in vitro 31,32,33. Les entéroïdes à sortie apicale partagent la composition de type cellulaire et la fonction barrière de l’épithélium intestinal in vivo, mais, contrairement aux entéroïdes 3D typiques, les surfaces apicales de ces cellules font face au milieu de culture, ce qui permet des études plus pertinentes sur le plan physiologique sur l’absorption des nutriments, l’infection microbienne et la sécrétion luminale31. Un avantage supplémentaire des entéroïdes à élimination apicale est la capacité de distribuer de manière homogène des agents expérimentaux aux entéroïdes. Il n’est pas nécessaire de faire varier les volumes de traitement en fonction de la taille des entéroïdes, comme c’est le cas avec la micro-injection, et la capacité de maintenir ces entéroïdes en culture en suspension annule toute interférence ECM sur la diffusion expérimentale de l’agent32.

L’entérocolite nécrosante est une maladie multifactorielle impliquant plusieurs types de cellules épithéliales intestinales et divers facteurs environnementaux et physiopathologiques34. La composition cellulaire variée des entéroïdes intestinaux est une nette amélioration par rapport aux monocultures dans la modélisation d’une maladie complexe telle que l’ECN. Il est intéressant de noter que, alors qu’une seule exposition inflammatoire est souvent suffisante pour induire des dommages dans les monocultures in vitro , les entéroïdes, comme avec les modèles murins23, semblent nécessiter au moins deux composants inflammatoires pour induire des dommages de type NEC6. Ici, nous présentons un modèle de NEC-in-a-dish apical-out, utilisant des entéroïdes apical-out en combinaison avec l’hypoxie (une caractéristique clinique importante de NEC6) et le LPS ou le TNF-α, comme un modèle in vitro amélioré et physiologiquement plus pertinent pour étudier les réponses épithéliales à l’inflammation de type NEC et, potentiellement, identifier des cibles thérapeutiques. Nous décrivons un protocole pour inverser la polarité des entéroïdes 3D de l’intestin grêle, ainsi qu’un protocole de coloration immunofluorescente pour identifier la perturbation de la barrière épithéliale et les altérations de l’expression des protéines jonctionnelles. Enfin, nous démontrons en outre un test de viabilité entéroïde simple pour déterminer l’impact de notre modèle NEC-in-a-dish à double coup et à sortie apicale.

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Protocol

Toutes les procédures animales de cette étude ont été approuvées par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux du Centre des sciences de la santé de l’Université de l’Oklahoma. Des échantillons de commodité de l’intestin grêle provenant d’un primate non humain prématuré (PSN, gestation à 90%, babouin olive, Papio anubis) ont été obtenus après euthanasie pour une étude distincte (Protocole #101523-16-039-I).

1. Mise en place d’un modèle d’entéroïde à l’apocale NEC dans une boîte

  1. Préparation des milieux et des traitements entéroïdes
    REMARQUE: Une fois préparé selon la technique aseptique standard, le support peut être conservé à 4 ° C jusqu’à 1 semaine.
    1. Préparer des milieux sans antibiotiques (AFM) en mélangeant 50 mL de milieux de croissance organoïdes humains avec 50 mL de supplément organoïde (voir le tableau des matières). Préparer 5 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique/1x de solution saline tamponnée au phosphate (EDTA/PBS) en ajoutant 100 μL d’EDTA 0,5 M à 9 900 μL de PBS.
    2. Refroidir le mélange de jambon d’aigle modifié de Dulbecco F12 + 15 mM HEPES Buffer (DMEM/F12) à 2-8 °C.
    3. Préparer la solution mère de α TNF en mettant en suspension 100 μg de poudre de α TNF dans 1 mL de 1x PBS. Diluer davantage le stock de TNF-α à des concentrations de 20 ng/mL et 50 ng/mL en utilisant l’AFM comme solvant. Préparer la solution mère de LPS en suspendant 2 mg de LPS dans 1 mL de 1x PBS. Diluer davantage le LPS mère à 100 μg/mL et 200 μg/mL en utilisant l’AFM comme solvant.
  2. Inverser la polarité des entéroïdes 3D
    REMARQUE : La procédure suivante est destinée à l’inversion d’une seule plaque de culture tissulaire à fond plat de 24 puits en deux plaques de culture tissulaire à très faible fixation à 24 puits. Les plaques de culture tissulaire doivent être chauffées à 37 °C pendant au moins 30 minutes avant utilisation. La dérivation d’entéroïdes 3D basolatéraux-out a été réalisée comme décrit précédemment par de nombreux groupes35,36, avec de légères modifications pour les milieux (détaillé ci-dessus). La procédure générale de dérivation entéroïde ne diffère pas de celle des humains. En bref, les tissus excisés sont lavés, coupés en petits fragments et incubés dans un tampon de perturbation cellulaire. La solution cellulaire est ensuite passée à travers une crépine cellulaire de 70 μM, ce qui donne des cryptes qui sont plaquées à une densité élevée.
    1. Aspirer les milieux de chaque puits d’une plaque de 24 puits d’entéroïdes basolatéraux-out 3D établis.
    2. Ajouter 500 μL d’EDTA/PBS glacé de 5 mM à chaque puits de la plaque de 24 puits et perturber mécaniquement doucement l’extrait de membrane basale / dôme ECM en pipetant de haut en bas avec une pipette p200 d’au moins 5x-6x.
    3. Transférer le contenu de quatre puits dans un tube conique de 15 ml et ajouter 8 mL d’EDTA/PBS glacé dans le tube conique. Transférer les 20 puits restants de la même manière.
    4. Incuber des tubes coniques de 15 mL à 4 °C pendant 1 h sur une plate-forme rotative ou un agitateur à 330 tr/min. Après 1 h d’incubation, centrifuger les tubes coniques à 300 x g pendant 3 min à 4 °C. Retirer et jeter le surnageant de chaque tube.
    5. Combiner et laver les granulés de cellule avec 5 ml de DMEM/F12 et répartir la suspension cellulaire dans deux tubes coniques de 15 mL.
    6. Enduire les cellules par centrifugation à 300 x g pendant 3 min à 4 °C. Retirez le surnageant et ajoutez 12 ml d’AFM à chaque tube, en veillant à ce que les pastilles de la cellule soient remises en suspension.
    7. Pipeter 500 μL de la suspension entéroïde dans chaque puits de deux plaques de fixation ultra-basses de 24 puits.
    8. Incuber les plaques à 37 °C et 5% de CO 2 pendant2 à 5 jours ou jusqu’à ce que les entéroïdes aient inversé la polarité.
    9. Pour vérifier l’inversion entéroïde, établissez d’abord la coloration immunofluorescente de confirmation et le délai moyen d’inversion (~ 3 jours), puis confirmez l’inversion de polarité à l’aide d’une visualisation de base au microscope optique. Les entéroïdes de sortie apicole sont très cellulaires en apparence, tandis que les entéroïdes de sortie basolatérale sont souvent dominés par la présence d’une grande lumière centrale ou bourgeonnement (voir la figure supplémentaire 1).
      REMARQUE: Une fois la procédure normalisée, le taux de conversion en apical-out dépasse généralement 95%. L’utilisation d’entéroïdes à sortie apicale est conçue comme une expérience terminale, bien qu’il soit théoriquement possible de faire passer des entéroïdes à sortie apicale dans un petit nombre d’entéroïdes à sortie basolatérale.
  3. Apical-out NEC-in-a-dish
    REMARQUE: Une fois que les entéroïdes ont inversé la polarité, utilisez rapidement les cultures dans des expériences ultérieures, car leur longévité dans la conformation apicale n’a pas été confirmée au-delà de 3-4 jours. Pour le modèle NEC-in-dish suivant, les entéroïdes ont été traités pendant 24 heures, puis collectés immédiatement après et conservés pour des expériences en aval.
    1. Une fois que les entéroïdes ont visuellement inversé la polarité avec une efficacité d’au moins 95%, retirez les plaques de l’incubateur et recueillez huit puits d’une plaque de 24 puits dans un tube conique de 15 mL. Comme les entéroïdes à élimination apicale sont en suspension, il suffit de pipeter la solution entéroïde/média. Centrifuger le tube de 15 mL à 300 x g pendant 5 min à 4 °C.
    2. Une fois les cellules enrobées, retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 4 mL d’AFM mélangé au volume désiré (10 μL ici pour correspondre au volume de traitement le plus élevé ajouté) de 1x PBS (témoin).
    3. Pipeter 500 μL de suspension entéroïde/PBS/AFM dans huit puits d’une plaque de fixation ultra-basse de 24 puits et incuber la plaque à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 24 h.
    4. Répétez les étapes 1.3.1.-1.3.3. pour les traitements au TNF-α (20 ng/mL et 50 ng/mL) et au LPS (100 μg/mL et 200 μg/mL) à la normoxie. Pour tous les traitements contre l’hypoxie, répéter les étapes 1.3.1.-1.3.3., mais placer la plaque dans un incubateur séparé à 37 °C, 5 % de CO2 et 1 % d’O2 pendant 24 h.
      NOTE: Étape 1.3.4. peut être effectuée simultanément avec les étapes 1.3.1.-1.3.3, mais, pour plus de clarté, la procédure ci-dessus a été séparée par traitement afin de réduire la complexité.

2. Coloration par immunofluorescence et microscopie confocale

  1. Préparation de solutions de coloration
    1. Préparer le Triton X-100 à 0,1 % en mélangeant 7 μL de Triton X-100 dans 1 PBS jusqu’à obtenir un volume final de 7 mL. Préparer le PBST (PBS-Tween) en ajoutant 30 μL de Tween-20 à 1x PBS pour obtenir un volume final de 30 mL.
    2. Préparer 10 % de sérum normal d’âne (PDN)/PBST en ajoutant 700 μL de NDS à 6,3 mL de PBST. Préparer 1 % de PDN/PBST en ajoutant 70 μL de NDS au PBST jusqu’à un volume final de 7 mL.
      REMARQUE: Le sérum d’âne a été utilisé ici pour établir une corrélation avec l’hôte anticorps secondaire. Cependant, les espèces de sérum bloquant doivent correspondre aux espèces d’anticorps secondaires afin de bloquer correctement la liaison non spécifique.
  2. Coloration (Jour 1)
    1. Transférer le contenu de quatre puits d’une plaque de 24 puits dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL. Répéter pour tous les puits/traitements souhaités, chaque traitement étant effectué dans un tube séparé. Centrifuger les tubes à 300 x g pendant 4 min à 4 °C. Une fois les entéroïdes enrobés, retirez le surnageant.
    2. Resuspendre les pastilles de la cellule dans 300 μL de fixateur de formaldéhyde à 4% pendant 30 min à température ambiante (RT). Après 30 min, centrifuger les tubes à 300 x g pendant 4 min à 4 °C, retirer le surnageant et laver la pastille avec 500 μL de RT 1x PBS stérile.
    3. Centrifuger les tubes à 300 x g pendant 4 min à 4 °C. Retirer le surnageant et ajouter 500 μL de Triton X-100 à 0,1%, et laisser reposer pendant 1 h à TA.
    4. Après 1 h, centrifuger les tubes à 300 x g pendant 4 min à 4 °C et retirer le surnageant. Laver avec 500 μL de 1x PBS et placer les tubes sur un rotateur ou un agitateur à 200 tr/min pendant 15 min à 2-8 °C. Répétez cette opération un total de 4x.
    5. Centrifuger les tubes à 300 x g pendant 4 min à 4 °C et retirer le surnageant. Ajouter 500 μL de NDS/PBST à 10 % et incuber à TA pendant 45 min. Pendant l’incubation, préparer des solutions d’anticorps primaires en combinant 20 μL d’anticorps anti-villosités recombinants, 10 μL d’anticorps E-cadhérine et 1970 μL de NDS/PBST à 1 % pour huit puits d’une plaque de 24 puits.
    6. Après 45 min d’incubation, centrifuger les tubes à 300 x g pendant 4 min à 4 °C. Placez les tubes sur de la glace. Retirer le surnageant et le remplacer par 250 μL de solution d’anticorps primaires. Incuber les tubes pendant une nuit à 2-8 °C.
  3. Coloration (Jour 2)
    1. Centrifuger les tubes à 300 x g pendant 4 min à 4 °C et retirer le surnageant. Ajouter 250-500 μL de PBST à chaque tube, selon la taille de la pastille, et placer sur le rotateur ou l’agitateur à 200 tr/min pendant 1 h à 2-8 °C. Répétez le lavage PBST 4x.
    2. Préparer la solution d’anticorps secondaires en ajoutant 52 μL d’IgG anti-lapin Cy3 (H + L) à 50% de glycérol et 5,2 μL d’âne anti-souris vert fluorescent 488 anticorps secondaires à 5142,8 μL de NDS/PBST à 1%.
    3. Après le dernier lavage et centrifugation PBST, retirer le surnageant des tubes. Distribuer 200 μL de solution d’anticorps secondaires à chaque tube et incuber dans l’obscurité pendant une nuit à 2-8 °C.
  4. Montage d’entéroïdes apicals tachés (Jour 1)
    1. Apportez à TA un support à base de glycérol contenant un colorant nucléaire bleu pendant 1 h.
    2. Centrifuger les tubes à 300 x g pendant 4 min à 4 °C. Retirer 100 μL du surnageant et remettre en suspension les cellules dans les ~100 μL restants du surnageant. Transférer la suspension cellulaire dans des tubes de 0,5 mL.
    3. Centrifuger les tubes dans une mini-centrifugeuse pendant 20 s pour granuler les cellules. Retirez le surnageant et remettez en suspension les pastilles cellulaires dans 100 μL de coloration d’acide nucléique rouge lointain. Incuber les tubes à TA pendant 10 min.
    4. Centrifuger les tubes dans une mini-centrifugeuse pendant 20 s pour granuler les cellules. Retirer le surnageant et remettre en suspension les pastilles de la cellule dans 100 μL de 1x PBS. Répétez pour un deuxième lavage.
    5. Centrifuger les tubes dans une mini-centrifugeuse pendant 20 s pour granuler les cellules et éliminer 70 μL du surnageant. Remettez en suspension les cellules dans le volume restant du PBS et transférez le contenu sur une feuille de couverture étiquetée (24 mm x 60 mm).
    6. Appliquez 75 μL de support directement sur l’échantillon et retirez les bulles à l’aide d’un embout de pipette. Laisser durcir les lames de couverture pendant la nuit (18-24 h) à RT dans l’obscurité.
  5. Montage d’entéroïdes apicals tachés (Jour 2)
    1. Après séchage pendant la nuit, appliquez une fine couche (~ 15 μL) de glycérol sur les lames de couverture. Montez le couvercle sur la lame de verre et appuyez doucement en place. Appuyez pour supprimer les bulles entre le bordereau de couverture et la glissière.
    2. Laisser la lame-couverture durcir à RT dans l’obscurité pendant au moins 2 heures, avant d’imager à un grossissement de 20x avec un microscope confocal. Pour la visualisation microscopique des entéroïdes à l’aide de diverses méthodes d’acquisition confocale, se reporter à Lallemant et coll.37.
  6. Quantification par immunofluorescence
    REMARQUE: Cette méthode détermine la fluorescence totale corrigée en supprimant le signal de fond à l’aide du logiciel ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/).
    1. Ouvrez les images confocales dans ImageJ et délimitez la zone souhaitée avec l’outil de région d’intérêt (ROI).
    2. Définissez les paramètres définis par l’utilisateur en accédant à Analyser > Définir les mesures. Sélectionnez Zone > Densité intégrée > Valeur moyenne de gris sous l’onglet Paramètres.
    3. Naviguez jusqu’à Analyser > mesurer. Une fenêtre pop-up apparaîtra contenant les mesures. Copiez et collez ces mesures dans une feuille de calcul.
    4. Pour soustraire le signal d’arrière-plan, sélectionnez une petite zone non fluorescente de l’image. Accédez à Analyser > mesure pour cette région. Une fenêtre pop-up apparaîtra contenant les mesures. Copiez et collez la sortie dans une feuille de calcul.
    5. Multipliez la surface de la cellule sélectionnée par la fluorescence moyenne des lectures de fond et soustrayez la somme de la densité intégrée pour calculer la fluorescence totale corrigée des cellules (CTCF). Répétez les étapes ci-dessus pour toutes les images d’intérêt, tout en conservant les enregistrements dans une feuille de calcul ou un logiciel statistique (voir le tableau des matériaux).

3. Viabilité des cellules NEC-in-a-dish

  1. Traitements entéroïdes
    1. Établir un modèle de NEC-in-dish apical-out pendant 24 h, comme à l’étape 1.
    2. Décongeler le réactif de dosage de viabilité cellulaire pendant une nuit à 4 °C. Le jour du dosage, porter le réactif à TA 30 min avant utilisation. Retourner le réactif pour mélanger.
    3. Avant d’effectuer l’essai, retirez 100 μL de milieu de chaque puits, en laissant les 400 μL restants. Ajouter 400 μL de réactif d’essai de viabilité cellulaire à chaque puits.
    4. Bien mélanger vigoureusement le contenu sur un agitateur à plaques à TA pendant 5 min à 200 tr/min pour induire la lyse cellulaire. Après agitation, incuber la plaque à TA pendant 25 minutes supplémentaires.
    5. Après 25 minutes d’incubation, mélanger le contenu d’un puits par pipetage et transférer 200 μL des 800 μL dans un seul puits d’une plaque opaque à fond clair en polystyrène opaque de 96 puits. Répéter pour les 600 μL restants, en créant quatre répétitions techniques par puits. Transférer ainsi le contenu restant de chaque puits de la plaque de 24 puits dans une plaque de 96 puits.
    6. À l’aide d’un lecteur de plaques capable de luminescence, enregistrez les valeurs à 0,25 ms d’intégration et comparez les valeurs relatives entre les traitements. Alternativement, comparez la luminescence de traitement à une norme d’adénosine triphosphate (ATP).

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Representative Results

L’utilisation d’entéroïdes pour modéliser l’inflammation intestinale, même dans le contexte d’une entérocolite nécrosante, est maintenant courante. Cependant, la plupart des méthodes actuellement utilisées soit n’ont pas accès à la surface apicale des entéroïdes, ce qui annule la pertinence physiologique des composés destinés à une utilisation éventuelle comme traitements oraux, soit sont techniquement difficiles et prennent beaucoup de temps, comme dans le cas des monocouches dérivées d’entéroïdes. Pour augmenter l’utilité des modèles entéroïdes in vitro actuels d’ECN, nous avons inversé la polarité des entéroïdes et, en combinaison avec l’hypoxie de 24 h et le LPS ou le TNF-α, généré un modèle NEC-in-a-dish apical-out. La coloration immunofluorescente a confirmé la localisation apicale des noyaux (bleu) vers la lumière et la détection de la villine32 (rouge, marqueur apical) sur le bord externe de l’épithélium (Figure 1A). L’exposition à 200 μg/mL de LPS, à 50 ng/mL de TNF-α ou à l’hypoxie seule n’a pas induit de changements manifestes dans la morphologie des cellules globales, la E-cadhérine38 (vert), la localisation des villosités ou l’intensité fluorescente par rapport au témoin (figure 1A-D; Graphique 2). Le traitement par LPS ou TNF-α, associé à l’hypoxie, a perturbé l’architecture épithéliale et entraîné une perte significative de l’expression de la protéine adhérente de la jonction et de la bordure du pinceau, indiquée par la perte de E-cadhérine et de coloration des villines (Figure 1E-F ; Graphique 2). Ces réductions des expressions de la bordure de la brosse entérocytaire et des protéines de jonction adhérentes indiquent probablement une réduction de l’intégrité de la barrière épithéliale et sont une caractéristique commune de l’ECN chirurgicale humaine et de la modélisation in vitro de la maladie23.

Pour déterminer l’impact des composants NEC-in-a-dish sur la viabilité des entéroïdes 3D apical-out, la viabilité cellulaire a été évaluée à l’aide d’un test de viabilité cellulaire conçu pour les cultures 3D, centré sur la quantification de l’ATP après lyse cellulaire. Les entéroïdes ont été traités avec du LPS (200 μg/mL) ou du TNF-α (50 ng/mL) pendant 24 heures dans des conditions normoxiques ou hypoxiques. Le LPS ou le TNF-α seuls n’ont pas affecté de manière significative la viabilité cellulaire par rapport au groupe témoin (Figure 3A). Cependant, des réductions significatives de la viabilité se sont produites lorsque les entéroïdes à sortie apicale ont été traités avec 200 μg/mL de LPS ou 50 ng/mL de TNF-α en association avec l’hypoxie (****p < 0,0001) par rapport à l’hypoxie seule (Figure 3B). Ces expériences démontrent la polyvalence et la pertinence physiologique de l’utilisation d’entéroïdes apicals dans un modèle NEC dans une boîte simple et rentable.

Figure 1
Figure 1 : Confirmation du phénotype apical-out et des effets morphologiques du lipopolysaccharide (LPS), du facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) et de l’hypoxie. Coloration immunohistochimique représentative des entéroïdes apicals 3D pour la bordure de la brosse entérocytaire et adhère aux protéines de jonction après 24 h. (A) contrôle, (B) hypoxie, (C) LPS (200 μg/mL), (D) TNF-α (50 ng/mL), (E) LPS (200 μg/mL) + hypoxie, (F) TNF-α (50 ng/mL) + hypoxie. Barre d’échelle = 50 μm pour chaque image. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Quantification de l’intensité de coloration pour les protéines de bordure de brosse et de jonction adhérente après des traitements de lipopolysaccharide (LPS), de facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) et d’hypoxie. (A) Niveaux de villine (rouge) comparés entre les traitements; a = p < 0,0001 par rapport au témoin; b = p < 0,05 par rapport au groupe témoin; c = p < 0,0001 par rapport à l’hypoxie; d = p < 0,05 par rapport à l’hypoxie; e = p < 0,001 par rapport au TNF-α; f = p < 0,01 par rapport au LPS + hypoxie ; g = p < 0,0001 par rapport au LPS; et (B) les niveaux d’E-cadhérine (vert) comparés entre les traitements; a = p < 0,0001 par rapport au témoin; b = p < 0,0001 par rapport à l’hypoxie; c = p < 0,01 par rapport au LPS; d = p < 0,01 par rapport au TNF-α; e = p < 0,05 par rapport au LPS + hypoxie. La signification a été évaluée à l’aide d’une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) avec le test de Tukey pour l’analyse post-hoc, présentée comme une moyenne ± une erreur-type de la moyenne (SEM) (n ≥ 7/groupe). Le contrôle représente la normoxie avec le PBS comme contrôle du véhicule. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Effet du lipopolysaccharide (LPS), du facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) et de l’hypoxie sur la viabilité des cellules apicales. La viabilité d’entéroïdes 3D à sortie apicale traités avec du LPS (200 μg/mL) ou du TNF-α (50 ng/mL) pendant 24 h dans des conditions (A) normoxiques ou (B) hypoxiques a été mesurée par luminescence. La signification statistique a été calculée à l’aide de l’analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) avec le test de Tukey pour l’analyse post-hoc. Les entéroïdes traités avec du LPS (200 μg/mL) et du TNF-α (50 ng/mL), en association avec l’hypoxie, étaient significativement moins viables que l’hypoxie seule, observée ici avec une augmentation de la luminescence. Le LPS (200 μg/mL) ou le TNF-α (50 ng/mL), dans des conditions normoxiques, ne différaient pas du témoin. Les données sont présentées sous forme d’erreur moyenne ± type de la moyenne (MEB), n = 8/groupe, ****p < 0,0001. Le contrôle représente la normoxie avec le PBS comme contrôle du véhicule. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Morphologie des entéroïdes tridimensionnels. (A) Alors que les entéroïdes basolatéraux-sortants sont dominés par l’apparition d’une lumière centrale large et ouverte, avec ou sans bourgeonnement, (B) les entéroïdes de sortie apicale sont caractérisés par un aspect cellulaire dense. Barre d’échelle = 100 μm pour chaque image. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Le développement récent de modèles entéroïdes dérivés de cryptes épithéliales intestinales permet d’obtenir un tissu in vitro plus pertinent sur le plan physiologique dans lequel étudier la pathogenèse de l’entérocolite nécrosante. Bien qu’ils incluent tous les principaux types de cellules différenciées de l’épithélium intestinal, les entéroïdes 3D sont toujours soumis à plusieurs limitations importantes. Les entéroïdes conventionnels à sortie basolatérale sont suspendus dans des dômes d’hydrogel ECM 3D, dont la composition et la densité peuvent limiter la diffusion normale dans l’environnement de culture tissulaire39. Il est important de noter que ces entéroïdes fournissent un accès limité à la surface apicale des cellules, qui est la surface qui, in vivo, interagirait avec les bactéries luminales et les antigènes, tels que la liaison TLR4 du LPS aux entérocytes.

Bien que la physiopathologie de l’ECN reste incertaine, on pense que l’augmentation de l’expression et de l’activation de la TLR4 apicale dans l’épithélium intestinal prématuré joue un rôle important40. En aval de l’activation de TLR4, l’augmentation de la perméabilité intestinale, la réduction de la réparation épithéliale et la translocation bactérienne entraînent un dysfonctionnement de la barrière intestinale, entraînant une nécrose de l’intestin2. On pense que ce cycle inflammatoire dans l’intestin distal des prématurés provient de la lumière intestinale, initiant à la surface apicale des entérocytes. Ainsi, les modèles utilisant des entéroïdes 3D basolatéraux-out dans les études mécanistes impliquant la translocation bactérienne de l’épithélium intestinal ne récapitulent pas la pathogenèse in vivo telle qu’elle est actuellement comprise et sont susceptibles de fournir des informations sous-optimales.

Ici, nous décrivons l’établissement d’un modèle NEC-in-dish apical-out, permettant un accès facile à la surface apicale des cellules entéroïdes et, vraisemblablement, résultant en un modèle physiologiquement plus pertinent par rapport aux entéroïdes basolatéraux-out 3D conventionnels. L’inversion de polarité chez ces entéroïdes permet d’ajouter simplement des agents thérapeutiques potentiels administrés par voie orale au milieu et d’être absorbés naturellement par les entérocytes, comme cela se produirait in vivo. Cette approche ne nécessite pas de techniques coûteuses et techniquement difficiles, telles que la micro-injection, et est plus respectueuse des ressources que la mise en place de monocouches 2D ou de modèles gut-on-a-chip.

Nos résultats représentatifs indiquent que les entéroïdes à sortie apicale soumis au LPS ou au TNF-α, en combinaison avec l’hypoxie, souffrent d’une viabilité réduite, d’une architecture épithéliale perturbée et d’une réduction de l’expression de la protéine de jonction adhérente par rapport au contrôle, ou par rapport à l’hypoxie ou au traitement par médiateur inflammatoire seul, imitant les caractéristiques connues de l’ECN in vivo. Une perturbation des jonctions adhérentes, essentielle à la fonction de barrière épithéliale intestinale41, a été rapportée dans NEC42,43. Une perturbation architecturale des jonctions serrées, qui est également importante dans NEC44, s’est probablement également produite, bien que ces changements soient évalués dans de futures études. Dans un tissu physiologiquement transposable, ce modèle à double impact permet d’étudier les réponses intestinales prématurées aux facteurs inhérents à l’ECN, tout en fournissant une plate-forme permettant d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles. Les études futures peuvent étendre l’application des entéroïdes apicals au-delà de l’ECN aux études axées sur les infections parasitaires, bactériennes ou virales31,32, les interactions hôte-microbiome 45 et la fonction d’absorption gastro-intestinale 46, mais dans le contexte physiologique du nouveau-né prématuré.

Ce protocole pour la sortie apicale NEC-in-a-dish comprend plusieurs étapes critiques qui méritent d’être soulignées. La composition et la fraîcheur des milieux de culture cellulaire sont importantes pour éviter une variabilité longitudinale excessive dans les expériences et s’assurer que les entéroïdes sont en bonne santé avant le traitement expérimental. De même, les solutions mères de TNF-α et de LPS doivent être aliquotes et stockées à -80 °C afin d’éviter des cycles excessifs de gel/dégel et de préserver une activité optimale. Enfin, il faut veiller à ce que toute la MCE soit solubilisée pendant l’incubation de l’EDTA/PBS. L’élimination incomplète de l’ECM pourrait empêcher les entéroïdes d’inverser la polarité. Si nécessaire, la période d’incubation peut être prolongée à 1,5 h pour assurer l’élimination complète de la matrice.

Bien que ce modèle NEC-in-a-dish apical-out soit rentable et simple, la méthode est soumise à plusieurs limitations. La NEC-in-a-dish à sortie apicale n’est pas aussi pertinente physiologiquement que les modèles gut-on-a-chip28,29, mais représente une option intermédiaire où et quand les options de puce ne sont pas accessibles. De plus, en tant que culture de suspension, les entéroïdes doivent être collectés, granulés et remis en suspension pour les changements de milieu, ajoutant une étape de centrifugation à un processus autrement simple. Une autre limite est la longévité des entéroïdes à sortie apicale, car ils sont généralement considérés comme ne convenant qu’aux analyses des points finaux. Comme les récepteurs du facteur de croissance basolatéral ne sont plus en contact constant avec les facteurs de croissance des milieux, les entéroïdes de sortie apicale sont caractérisés par une prolifération réduite par rapport aux entéroïdes de sortie basolatérale, ce qui entraîne une incapacité relative à faire passer les cultures de sortie apicole31,32. De plus, on ne sait pas si la composition exacte, y compris les proportions relatives, des types cellulaires sont représentés chez les entéroïdes par rapport aux tissus in vivo, mais les études suggèrent généralement des différences mineures31,32. Enfin, la mise au point sur 24 heures de ce modèle de NEC dans une boîte apicale, bien que pratique, peut être relativement brève par rapport aux modèles NEC in vivo basés sur des formules47, nécessitant potentiellement une normalisation supplémentaire si des périodes d’intervention plus longues sont souhaitées.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer et n’ont aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Ce contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles des National Institutes of Health. SC est soutenu par la subvention P20GM134973 des National Institutes of Health. KB est soutenu par une subvention de la Fondation de l’hôpital pour enfants (CHF) et de la Presbyterian Health Foundation (PHF). Nous remercions le Laboratoire de recherche en biologie moléculaire et cytométrie de l’OUHSC pour l’utilisation de l’installation centrale, qui a fourni l’imagerie confocale.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA, pH 8.0 Fisher Scientific 15575-020
1.5 mL microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-129
15 mL Conical tube VWR 89039-666
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay Promega G9681
Corning Costar Ultra-Low Attachment 24-Well Microplates Fisher Scientific 07-200-602
Cover Glass 24 mm x 60 mm Thermo Scientific 102460
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Scientific A-21202
Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody, Cy3 conjugate Sigma-Aldrich AP182C
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer STEMCELL Technologies 36254
E-cadherin antibody (7H12) Novus Biologicals NBP2-19051
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 Millipore Sigma 1004960700
Glycerol Sigma-Aldrich 56-81-5
ImageJ Fiji N/A
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) STEMCELL Technologies 06010
Leica SP8 Confocal Microscope Leica Biosystems
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography Millipore Sigma L3012-10MG
Microscope Slides Fisher Scientific 12-544-7
Normal Donkey Serum Sigma-Aldrich 566460
Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate Thermo Scientific 136101
PBS (Phosphate Buffered Saline), 1x [-] calcium, magnesium, pH 7.4 Corning 21-040-CM
Prolong Glass Antifade Mountant with NucBlue Fisher Scientific P36983
Recombinant Anti-Villin antibody [SP145] Abcam ab130751
Recombinant Human TNF-α protein 100 µg Bio-Techne 210-TA-100/CF
SpectraMax iD3 Multi-Mode Microplate Reader Molecular Devices
Thermo Forma Series II Water-Jacketed Tri-Gas Incubator, 184L Fisher Scientific 3140
TO-PRO-3 Iodide (642/661) Thermo Scientific T3605
Triton X-100 Sigma-Aldrich 9002-93-1
Tubes, 0.5 mL, flat cap Thermo Scientific AB0350
Tween-20 Sigma-Aldrich 9005-64-5

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Médecine numéro 184
<em>In vitro </em> Modèle entéroïde apical-out de l’entérocolite nécrosante
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Burge, K., Wilson, A., Chaaban, H.… More

Burge, K., Wilson, A., Chaaban, H. In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis. J. Vis. Exp. (184), e64003, doi:10.3791/64003 (2022).

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