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Medicine

इन विट्रो में नेक्रोटाइजिंग एंटरोकोलाइटिस का एपिकल-आउट एंटरॉइड मॉडल

Published: June 8, 2022 doi: 10.3791/64003
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Pediatrics, Division of Neonatal-Perinatal Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center and Center for Pregnancy and Newborn Health

Summary

यह प्रोटोकॉल एक एपिकल-आउट नेक्रोटाइजिंग एंटरोकोलाइटिस (एनईसी) -इन-ए-डिश मॉडल का वर्णन करता है जो उलट ध्रुवीयता के साथ छोटे आंतों के एंटरॉइड का उपयोग करता है, जिससे एपिकल सतह तक पहुंच की अनुमति मिलती है। हम एनईसी से संबंधित उपकला व्यवधान का पता लगाने के लिए एक इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं और एनईसी-इन-ए-डिश प्रोटोकॉल के अधीन एपिकल-आउट एंटरॉइड्स की व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए एक विधि प्रदान करते हैं।

Abstract

नेक्रोटाइजिंग एंटरोकोलाइटिस (एनईसी) अपरिपक्व शिशुओं को प्रभावित करने वाली एक विनाशकारी बीमारी है, जो आंतों की सूजन और परिगलन की विशेषता है। एंटरॉइड्स हाल ही में गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल विकृतियों को मॉडल करने के लिए एक आशाजनक प्रणाली के रूप में उभरे हैं। हालांकि, वर्तमान में एंटरॉइड हेरफेर के लिए उपयोग किए जाने वाले तरीकों में या तो उपकला (त्रि-आयामी [3 डी]) की एपिकल सतह तक पहुंच की कमी है या समय लेने वाली और संसाधन-गहन (दो-आयामी [2 डी] मोनोलेयर) हैं। इन विधियों को अक्सर अतिरिक्त चरणों की आवश्यकता होती है, जैसे कि माइक्रोइंजेक्शन, मॉडल को शारीरिक रूप से अनुवाद योग्य बनने के लिए। यहां, हम एंटरॉइड ध्रुवीयता को उलटकर इन विट्रो में एनईसी का अध्ययन करने के लिए एक शारीरिक रूप से प्रासंगिक और सस्ती प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप एपिकल सतह बाहर की ओर (एपिकल-आउट) का सामना करना पड़ता है। नॉरमोक्सिक या हाइपोक्सिक स्थितियों के तहत ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-अल्फा (टीएनएफ-α) या लिपोपॉलीसेकेराइड (एलपीएस) के संपर्क में आने के बाद एंटरॉइड बाधा अखंडता और जंक्शनल प्रोटीन अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए एक इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला प्रोटोकॉल भी प्रदान किया जाता है। 24 घंटे के लिए नॉर्मोक्सिक या हाइपोक्सिक एलपीएस या टीएनएफ-α के संपर्क में आने वाले 3 डी एपिकल-आउट एंटरॉइड की व्यवहार्यता का भी मूल्यांकन किया जाता है। हाइपोक्सिया के साथ संयोजन में एलपीएस या टीएनएफ-α के संपर्क में आने वाले एंटरोइड्स ने उपकला वास्तुकला के विघटन, जंक्शन प्रोटीन अभिव्यक्ति का नुकसान और सेल व्यवहार्यता में कमी का प्रदर्शन किया। यह प्रोटोकॉल एक नए एपिकल-आउट एनईसी-इन-ए-डिश मॉडल का वर्णन करता है जो एनईसी उपचारों के लिए संभावित उपकला लक्ष्यों की पहचान करने और चिकित्सीय के लिए अपरिपक्व आंतों की प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए शारीरिक रूप से प्रासंगिक और लागत प्रभावी मंच प्रस्तुत करता है।

Introduction

नेक्रोटाइजिंग एंटरोकोलाइटिस (एनईसी), छोटी आंत की एक गंभीर भड़काऊ बीमारी जो 10% अपरिपक्व शिशुओं में होती है, आमतौर पर उच्च रुग्णता और मृत्यु दर 1,2 से जुड़ी होती है। बहुत कम जन्म के वजन (<1500 ग्राम) शिशुओं में 50% तक पहुंचने वाली मृत्यु दर, सर्जिकल हस्तक्षेप की आवश्यकता होती है, असामान्य नहीं हैं3. जबकि एनईसी के सटीक एटियलजि को वर्तमान में समझा नहीं गया है, जोखिम कारक, जैसे कि फॉर्मूला फीडिंग, को शारीरिक विसंगतियों के साथ यौगिक माना जाता है, जैसे कि डिस्बिओसिस, एक अपरिपक्व आंतों का उपकला, और एक बेकार आंतों की बाधा, रोग 2,4 के विकास में। महत्वपूर्ण प्रयास के बावजूद, पिछले दशक में एनईसी की रोकथाम या उपचार में बहुत कम प्रगति हुई है5. एनईसी और संबद्ध आंतों के उपकला बाधा शिथिलता का अध्ययन करने के लिए एक उपन्यास इन विट्रो विधि रोग के रोगजनन की समझ को आगे बढ़ाने के लिए आवश्यक है, क्योंकि पशु मॉडल के निष्कर्षों ने अब तक बेडसाइड6 में खराब अनुवाद किया है।

एनईसी के दौरान खेलने वाले तंत्र की जांच करने के लिए कई इन विट्रो मॉडल का उपयोग किया गया है। मानव आंतों की उपकला कोशिका रेखा, कैको -2, एनईसी 7,8 के इन विट्रो मॉडल में सबसे अधिक उपयोग की जाने वाली है। कैको -2 कोशिकाएं छोटी आंत की ब्रश सीमा रूपात्मक विशेषताओं का अनुकरण करती हैं, लेकिन, एक सेल लाइन के रूप में, विवो सेल प्रकारों की विस्तृत विविधता में अंतर नहीं करती हैं, जिसमें बलगम-उत्पादक गोबलेट कोशिकाएं शामिल हैं, जो अत्यधिक अनुवाद योग्य मॉडल के लिए आवश्यक हैं। एचटी -29-एमटीएक्स, मानव बृहदान्त्र एडेनोकार्सिनोमा कोशिकाओं में एक मिश्रित एंटरोसाइट और गोबलेट सेल फेनोटाइप शामिल हैं, लेकिन अभी भी आंतों के उपकला 9 के क्रिप्ट-आधारित सेलप्रकारों की कमी है। आईईसी -6 और आईईसी -18 एक अपरिपक्व इलियल क्रिप्ट जैसी आकृति विज्ञान के साथ गैर-रूपांतरित सेल लाइनें हैं, लेकिन मानव ऊतक से प्राप्त नहीं होती हैं, जो उनकी अनुवाद क्षमता को सीमित करती हैं। एफएच 74-इंट और एच 4 आंतों की कोशिका रेखाएं मानव भ्रूण के ऊतकों से प्राप्त होती हैं और तंग जंक्शन या ध्रुवीकृत मोनोलेयर10,11 नहीं बनाती हैं, और इस प्रकार एनईसी के लिए अतिसंवेदनशील सबसे समय से पहले शिशुओं की तुलना में अपरिपक्व हैं। आमतौर पर, एनईसी इन विट्रो मॉडल टोल-जैसे रिसेप्टर 4 (टीएलआर 4) को प्रेरित करने के लिए लिपोपॉलीसेकेराइड (एलपीएस) उपचार का उपयोग करते हैं, एनईसी12 में आंतों की सूजन शुरू करने वाला एक प्रमुख रिसेप्टर। प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) उपचार के माध्यम से मध्यस्थता की गई क्षति, आमतौर पर हाइड्रोजन पेरोक्साइड के माध्यम से, अक्सर एनईसी जैसी ऑक्सीडेटिव क्षति और एपोप्टोसिस13,14 को प्रेरित करने के लिए उपयोग की जाती है। आंतों की सूजन के मुख्य चालक के रूप में, ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-अल्फा (टीएनएफ-α), भड़काऊ टीएलआर 4 सिग्नलिंग का एक डाउनस्ट्रीम घटक, आमतौर पर इन इन विट्रो मॉडल में विवो रोगजनन15 में नकल करने के लिए भी उपयोग किया जाता है।

इंड्यूसिबल प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) से उत्पन्न ऑर्गेनोइड, विवो आर्किटेक्चर में कॉम्प्लेक्स को पुन: पेश करने की उनकी क्षमता और ऊतक की सेल-प्रकार की संरचना के कारण आंत के इन विट्रो मॉडल के रूप में लोकप्रियता में वृद्धि हुई है, जिससे वे16,17 प्राप्त होते हैं। एक संबंधित इन विट्रो सिस्टम, एंटरॉइड्स, विच्छेदित आंतों के क्रिप्ट से प्राप्त ऑर्गेनोइड हैं जो आईपीएससी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड की तुलना में अधिक आसानी से स्थापित और बनाए रखे जाते हैं। एंटरॉइड आमतौर पर एक त्रि-आयामी (3 डी) बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) में उगाए जाते हैं, जिसमें प्रयोगात्मक पहुंच बेसोलेटरल सेल सतह तक सीमित होती है। माइक्रोइंजेक्शन18,19 जैसे तरीके एपिकल सतह पर इस बाधा को दूर करने के लिए विकसित किए गए हैं, लेकिन लुमेन के भीतर सेलुलर मलबे और बलगम का निर्माण तकनीकी रूप से कठिन और असंगत दोनों माइक्रोइंजेक्शन प्रदान करता है। चूंकि कस्टम रोबोट माइक्रोइंजेक्शन प्लेटफ़ॉर्म व्यापक रूपसे सुलभ नहीं हैं, तकनीकी क्षमता और सामान्य तकनीक में प्रयोगशाला-से-प्रयोगशाला परिवर्तनशीलता माइक्रोइंजेक्शन प्रोटोकॉल के साथ दूर करने के लिए महत्वपूर्ण चर बन जाती है। दो आयामी (2 डी) मोनोलेयर पृथक 3 डी एंटरॉइड्स से प्राप्त होते हैं, जिसमें अभी भी आंतों के उपकला के सभी प्रमुख सेल प्रकार शामिल हैं, एपिकल सतह तक पहुंच की अनुमति देते हैं लेकिन पारंपरिक रूप से मेसेनकाइमल मायोफिब्रोब्लास्ट्स21 की फीडर परत के बिना बनाए रखना मुश्किल है। जबकि सेल संस्कृति पारगम्य समर्थन का उपयोग अंतर्निहित मायोफिब्रोब्लास्ट्स के उपयोग के बिना एंटरॉइड मोनोलेयर्स के एपिकल और बेसोलेटरल दोनों पक्षों तक पहुंचने के लिए किया जा सकता है, इन आवेषणों को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी जैसे तौर-तरीकों के साथ उपयोग करने से पहले झिल्ली के छांटना और बढ़ते की आवश्यकता होती है, जिसके परिणामस्वरूप पारंपरिक माइक्रोस्कोपी विधियों का उपयोग करते समय अधिक तकनीकी रूप से मांग और कठिन प्रक्रियाहोती है 22. एनईसी को पारंपरिक 3 डी एंटरॉइड्स23,24,25 और पारगम्य समर्थन 26,27 का उपयोग करके कृत्रिम परिवेशीय में मॉडलिंग की गई है, और आंतों की सूजन को हाल ही में आंत-ऑन-ए-चिप मॉडल 28,29 के साथ दोहराया गया है। जबकि माइक्रोफ्लुइडिक्स को शामिल करने वाले आंत-ऑन-ए-चिप मॉडल अब तक के सबसे उन्नत और अनुवाद योग्य मॉडल हैं, यह तकनीक महंगी, जटिल और अधिकांश जांचकर्ताओंके लिए दुर्गम है।

एपिकल-आउट एंटरॉइड तकनीकों में हालिया प्रगति ने इन विट्रो उपकला 31,32,33 की संरचनात्मक अखंडता को नुकसान पहुंचाए बिना3 डी एंटरॉइड की एपिकल सतह तक आसान पहुंच की अनुमति दी है। एपिकल-आउट एंटरॉइड विवो आंतों के उपकला में सेल प्रकार की संरचना और बाधा समारोह को साझा करते हैं, लेकिन, विशिष्ट 3 डी एंटरॉइड्स के विपरीत, इन कोशिकाओं की एपिकल सतहें संस्कृति माध्यम का सामना करती हैं, जिससे पोषक तत्व अवशोषण, माइक्रोबियल संक्रमण और ल्यूमिनल स्राव31 पर अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक अध्ययन की अनुमति मिलती है। एपिकल-आउट एंटरॉइड्स का एक अतिरिक्त लाभ एंटरॉइड्स को प्रयोगात्मक एजेंटों को समरूप रूप से वितरित करने की क्षमता है। एंटरॉइड आकार के आधार पर अलग-अलग उपचार की मात्रा की आवश्यकता नहीं है, क्योंकि यह माइक्रोइंजेक्शन के साथ है, और निलंबन संस्कृति में इन एंटरोइड्स को बनाए रखने की क्षमता प्रयोगात्मक एजेंट प्रसार32 पर किसी भी ईसीएम हस्तक्षेप को नकारती है।

नेक्रोटाइजिंग एंटरोकोलाइटिस एक बहुआयामी बीमारी है जिसमें कई आंतों के उपकला कोशिका प्रकार और विभिन्न प्रकार के पर्यावरणीय और पैथोफिजियोलॉजिकल कारक शामिलहैं। आंतों के एंटरॉइड्स की विविध कोशिका संरचना एनईसी जैसी जटिल बीमारी के मॉडलिंग में मोनोकल्चर पर एक स्पष्ट सुधार है। दिलचस्प बात यह है कि, जबकि एक एकल भड़काऊ जोखिम अक्सर इन विट्रो मोनोकल्चर में क्षति को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त होता है, एंटरोइड्स, माउस मॉडल23 के साथ, एनईसी जैसी क्षति को प्रेरित करने के लिए न्यूनतम दो भड़काऊ घटकों की आवश्यकता होती है6. यहां, हम हाइपोक्सिया (एनईसी6 की एक महत्वपूर्ण नैदानिक विशेषता) और या तो एलपीएस या टीएनएफ-α के संयोजन में एपिकल-आउट एंटरॉइड्स का उपयोग करके एक एपिकल-आउट एनईसी-इन-ए-डिश मॉडल प्रस्तुत करते हैं, एनईसी जैसी सूजन के लिए उपकला प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो मॉडल में एक बेहतर और अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक के रूप में और संभावित रूप से, चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करें। हम उपकला बाधा व्यवधान और जंक्शनल प्रोटीन अभिव्यक्ति परिवर्तन की पहचान करने के लिए छोटे आंतों के 3 डी एंटरोइड्स की ध्रुवीयता को उलटने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, साथ ही एक इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला प्रोटोकॉल भी। अंत में, हम आगे हमारे दोहरे हिट, एपिकल-आउट एनईसी-इन-ए-डिश मॉडल के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए एक सरल एंटरॉइड व्यवहार्यता परख का प्रदर्शन करते हैं।

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Protocol

इस अध्ययन में सभी पशु प्रक्रियाओं को ओक्लाहोमा स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था। एक अलग अध्ययन (प्रोटोकॉल # 101523-16-039-आई) के लिए इच्छामृत्यु के बाद एक अपरिपक्व गैर-मानव प्राइमेट (एनएचपी, 90% गर्भावस्था, जैतून बबून, पापियो अनुबिस) से छोटी आंत सुविधा के नमूने प्राप्त किए गए थे।

1. एपिकल-आउट एंटरॉइड एनईसी-इन-ए-डिश मॉडल की स्थापना

  1. मीडिया और एंटरॉइड उपचार की तैयारी
    नोट: एक बार मानक सड़न रोकनेवाला तकनीक के बाद तैयार किया जाता है, मीडिया को 1 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    1. ऑर्गेनोइड पूरक के 50 मिलीलीटर के साथ मानव ऑर्गेनोइड विकास मीडिया के 50 मिलीलीटर मिश्रण द्वारा एंटीबायोटिक मुक्त मीडिया (एएफएम) तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें)। पीबीएस के 9,900 μL के लिए 0.5 एम ईडीटीए के 100 μL जोड़कर 5 एमएम एथिलीनडियामाइनटेट्राएसेटिक एसिड /
    2. पोषक तत्व हैम के मिश्रण एफ 12 + 15 एमएम एचईपीईएस बफर (डीएमईएम / एफ 12) को 2-8 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा करें।
    3. 1x पीबीएस के 1 एमएल में टीएनएफ-α पाउडर के 100 μg को निलंबित करके टीएनएफ-α स्टॉक समाधान तैयार करें। विलायक के रूप में एएफएम का उपयोग करके टीएनएफ-α स्टॉक को 20 एनजी / एमएल और 50 एनजी / एमएल सांद्रता तक पतला करें। 1एक्स पीबीएस के 1 एमएल में 2 मिलीग्राम एलपीएस को निलंबित करके एलपीएस स्टॉक समाधान तैयार करें। विलायक के रूप में एएफएम का उपयोग करके 100 μg/एमएल और 200 μg/एमएल के लिए स्टॉक एलपीएस को और पतला करें।
  2. 3 डी एंटरॉइड्स की ध्रुवीयता को उलटना
    नोट: निम्नलिखित प्रक्रिया दो 24-अच्छी तरह से अल्ट्रा-लो अटैचमेंट टिशू कल्चर प्लेटों में एक एकल 24-अच्छी तरह से फ्लैट-बॉटम टिशू कल्चर प्लेट के उत्क्रमण के लिए अभिप्रेत है। टिशू कल्चर प्लेटों को उपयोग करने से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया जाना चाहिए। बेसोलेटरल-आउट 3 डी एंटरॉइड्स की व्युत्पत्ति को मीडिया के लिए मामूली संशोधनों के साथ कई समूहों35,36 द्वारा पहले वर्णित किया गया था (ऊपर विस्तृत)। सामान्य एंटरॉइड व्युत्पत्ति प्रक्रिया मनुष्यों से भिन्न नहीं होती है। संक्षेप में, उत्पादित ऊतक धोया जाता है, छोटे टुकड़ों में कटौती की जाती है, और सेल व्यवधान बफर में ऊष्मायन किया जाता है। सेल समाधान तब 70 μM सेल छलनी के माध्यम से चलाया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप क्रिप्ट्स होते हैं जो उच्च घनत्व पर चढ़ाया जाता है।
    1. स्थापित 3 डी बेसोलेटरल-आउट एंटरॉइड्स की 24-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं से एस्पिरेट मीडिया।
    2. पीबीएस के 500 μL 24 अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं के लिए जोड़ें और धीरे यांत्रिक रूप से एक पी 200 पिपेट के साथ ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा तहखाने झिल्ली निकालने /
    3. चार कुओं की सामग्री को 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें और शंक्वाकार ट्यूब में 8 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा ईडीटीए / शेष 20 कुओं को इसी तरह से स्थानांतरित करें।
    4. एक घूर्णन मंच या 330 आरपीएम पर प्रकार के बरतन पर 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों सेते हैं। 1 घंटे इनक्यूबेशन के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 300 एक्स जी पर शंक्वाकार ट्यूबों अपकेंद्रित्र। निकालें और प्रत्येक ट्यूब से सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    5. एफ 12 के 5 एमएल के साथ सेल छर्रों को मिलाएं और धोएं और सेल निलंबन को दो 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में वितरित करें।
    6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 300 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूजिंग द्वारा कोशिकाओं गोली। सतह पर तैरनेवाला निकालें और प्रत्येक ट्यूब में एएफएम के 12 मिलीलीटर जोड़ें, यह सुनिश्चित करना कि सेल छर्रों को फिर से निलंबित कर दिया गया है।
    7. दो 24 अच्छी तरह से अल्ट्रा-कम लगाव प्लेटों के प्रत्येक कुएं में एंटरॉइड निलंबन के पिपेट 500 μL।
    8. 2-5 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर प्लेटों सेते हैं या जब तक एंटरोइड ध्रुवीयता को उलट नहीं देते हैं।
    9. एंटरॉइड रिवर्सल की जांच करने के लिए, पहले पुष्टिकरण इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला और रिवर्सल (~ 3 दिन) के लिए औसत समय स्थापित करें, फिर एक बुनियादी प्रकाश माइक्रोस्कोप विज़ुअलाइज़ेशन का उपयोग करके ध्रुवीयता उत्क्रमण की पुष्टि करें। एपिकल-आउट एंटरॉइड दिखने में बहुत सेलुलर होते हैं, जबकि बेसोलेटरल-आउट एंटरॉइड्स अक्सर एक बड़े केंद्रीय लुमेन या नवोदित ( पूरक चित्रा 1 देखें) की उपस्थिति पर हावी होते हैं।
      नोट: एक बार प्रक्रिया मानकीकृत हो जाने के बाद, एपिकल-आउट में रूपांतरण दर आमतौर पर 95% से अधिक हो जाती है। एपिकल-आउट एंटरॉइड्स का उपयोग टर्मिनल प्रयोग के रूप में अभिप्रेत है, हालांकि सैद्धांतिक रूप से एपिकल-आउट एंटरॉइड्स को बेसोलेटरल-आउट एंटरॉइड्स की एक छोटी संख्या में पारित करना संभव है।
  3. एपिकल-आउट एनईसी-इन-ए-डिश
    नोट: एक बार एंटरोइड्स ने ध्रुवीयता को उलट दिया है, तो बाद के प्रयोगों में संस्कृतियों का उपयोग जल्दी से करें, क्योंकि एपिकल-आउट विरूपण में उनकी दीर्घायु 3-4 दिनों से परे पुष्टि नहीं की गई है। निम्नलिखित एनईसी-इन-ए-डिश मॉडल के लिए, एंटरॉइड्स को 24 घंटे के लिए इलाज किया गया था, फिर तुरंत बाद में एकत्र किया गया और डाउनस्ट्रीम प्रयोगों के लिए संरक्षित किया गया।
    1. एक बार जब एंटरॉइड कम से कम 95% दक्षता के साथ ध्रुवीयता को नेत्रहीन रूप से उलट देते हैं, तो इनक्यूबेटर से प्लेटों को हटा दें और 24-अच्छी तरह से प्लेट के आठ कुओं को 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में इकट्ठा करें। चूंकि एपिकल-आउट एंटरॉइड निलंबन में हैं, बस एंटरॉइड / मीडिया समाधान को पिपेट करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 एक्स जी पर 15 एमएल ट्यूब अपकेंद्रित्र।
    2. एक बार कोशिकाओं को गोली मार दी जाती है, सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और 1x पीबीएस (नियंत्रण) के वांछित मात्रा (यहां 10 μL जोड़ा गया) के साथ मिश्रित एएफएम के 4 मिलीलीटर में सेल गोली को फिर से निलंबित कर दें।
    3. एएफएम निलंबन के पिपेट 500 μL एक 24 अच्छी तरह से अल्ट्रा-लो अटैचमेंट प्लेट के आठ कुओं में और 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर प्लेट सेते हैं।
    4. चरण 1.3.1.-1.3.3 दोहराएँ। नॉर्मोक्सिया में टीएनएफ -α (20 एनजी / एमएल और 50 एनजी / एमएल) और एलपीएस (100 μg / एमएल और 200 μg / एमएल) उपचार के लिए। सभी हाइपोक्सिया उपचार के लिए, चरण 1.3.1.-1.3.3., लेकिन प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2, और24 घंटे के लिए 1% ओ2 पर एक अलग इनक्यूबेटर में रखें।
      नोट: चरण 1.3.4. चरण 1.3.1.-1.3.3 के साथ एक साथ किया जा सकता है, लेकिन, स्पष्टता के लिए, जटिलता को कम करने के लिए उपरोक्त प्रक्रिया को उपचार द्वारा अलग किया गया था।

2. इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी

  1. धुंधला समाधान की तैयारी
    1. 7 एमएल की अंतिम मात्रा में 1 एक्स पीबीएस में ट्राइटन एक्स -100 के 7 μL मिश्रण करके 0.1% ट्राइटन एक्स -100 तैयार करें। 30 एमएल की अंतिम मात्रा में ट्वीन -20 से 1 एक्स पीबीएस के 30 μL जोड़कर पीबीएसटी (पीबीएस-ट्वीन) तैयार करें।
    2. पीबीएसटी के 6.3 एमएल में एनडीएस के 700 μL जोड़कर 10% सामान्य गधा सीरम (एनडीएस)/ 7 एमएल की अंतिम मात्रा में पीबीएसटी में एनडीएस के 70 μL जोड़कर 1% एनडीएस /
      नोट: माध्यमिक एंटीबॉडी मेजबान के साथ सहसंबंधित करने के लिए गधा सीरम का उपयोग यहां किया गया था। हालांकि, अवरुद्ध सीरम प्रजातियों को गैर-विशिष्ट बाध्यकारी को ठीक से अवरुद्ध करने के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी प्रजातियों से मेल खाना चाहिए।
  2. धुंधला (दिन 1)
    1. एक 24 अच्छी तरह से प्लेट के चार कुओं की सामग्री को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। एक अलग ट्यूब में प्रत्येक उपचार के साथ, सभी वांछित कुओं / उपचारों के लिए दोहराएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 मिनट के लिए 300 एक्स जी पर ट्यूबों अपकेंद्रित्र। एक बार एंटरॉइड्स को गोली लगने के बाद, सतह पर तैरनेवाला को हटा दें।
    2. कमरे के तापमान (आरटी) पर 30 मिनट के लिए 4% फॉर्मलाडेहाइड फिक्सेटिव के 300 μL में सेल छर्रों को फिर से निलंबित करें। 30 मिनट के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 मिनट के लिए 300 एक्स जी पर ट्यूबों अपकेंद्रित्र, सतह पर तैरनेवाला को हटा दें, और बाँझ, आरटी 1 एक्स पीबीएस के 500 μL के साथ गोली धो लें।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 मिनट के लिए 300 एक्स जी पर ट्यूबों अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला निकालें और 0.1% ट्राइटन एक्स -100 के 500 μL जोड़ें, और आरटी पर 1 घंटे के लिए बैठने दें।
    4. 1 घंटे के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 मिनट के लिए 300 एक्स जी पर ट्यूबों अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला हटा दें। 1x पीबीएस के 500 μL के साथ धो लें और 2-8 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 200 आरपीएम पर एक रोटेटर या प्रकार के बरतन पर ट्यूबों जगह। इसे कुल 4x दोहराएं।
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 मिनट के लिए 300 एक्स जी पर ट्यूबों अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला हटा दें। पीबीएसटी के 500 μL जोड़ें और 45 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं। इनक्यूबेशन के दौरान, पुनः संयोजक एंटी-विलिन एंटीबॉडी के 20 μL, ई-कैडरिन एंटीबॉडी के 10 μL, और 24-अच्छी तरह से प्लेट के आठ कुओं के लिए 1% एनडीएस / पीबीएसटी के 1970 μL के संयोजन से प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें।
    6. 45 मिनट इनक्यूबेशन के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 मिनट के लिए 300 एक्स जी पर ट्यूबों अपकेंद्रित्र। ट्यूबों को बर्फ पर रखें। सतह पर तैरनेवाला निकालें और प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 250 μL के साथ प्रतिस्थापित करें। 2-8 डिग्री सेल्सियस पर रात भर ट्यूबों सेते हैं।
  3. धुंधला (दिन 2)
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 मिनट के लिए 300 एक्स जी पर ट्यूबों अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला हटा दें। गोली के आकार के आधार पर, प्रत्येक ट्यूब में पीबीएसटी के 250-500 μL जोड़ें, और 2-8 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 200 आरपीएम पर रोटेटर या शेकर पर रखें। पीबीएसटी धोने 4x दोहराएँ।
    2. पीबीएसटी के 5142.8 μL के लिए 50% ग्लिसरॉल और गधा विरोधी माउस फ्लोरोसेंट ग्रीन 488 माध्यमिक एंटीबॉडी के 5.2 μL करने के लिए Cy3 गधा विरोधी खरगोश आईजीजी (एच + एल) के 52 μL जोड़कर माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें।
    3. अंतिम पीबीएसटी धोने और सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, ट्यूबों से सतह पर तैरनेवाला हटा दें। प्रत्येक ट्यूब के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के 200 μL वितरण और 2-8 डिग्री सेल्सियस पर रात भर अंधेरे में सेते हैं।
  4. बढ़ते दाग वाले एपिकल-आउट एंटरॉइड्स (दिन 1)
    1. 1 घंटे से अधिक आरटी के लिए नीले परमाणु डाई युक्त ग्लिसरॉल-आधारित माउंटेंट लाएं।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 मिनट के लिए 300 एक्स जी पर ट्यूबों अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला के 100 μL निकालें और सतह पर तैरनेवाला के शेष ~ 100 μL में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। 0.5 एमएल ट्यूबों के लिए सेल निलंबन स्थानांतरण।
    3. कोशिकाओं गोली करने के लिए 20 एस के लिए एक मिनी अपकेंद्रित्र में ट्यूबों अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला निकालें और दूर-लाल न्यूक्लिक एसिड दाग के 100 μL में सेल छर्रों को फिर से निलंबित करें। 10 मिनट के लिए आरटी पर ट्यूबों सेते हैं।
    4. कोशिकाओं गोली करने के लिए 20 एस के लिए एक मिनी अपकेंद्रित्र में ट्यूबों अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला निकालें और 1x पीबीएस के 100 μL में सेल छर्रों को फिर से निलंबित करें। एक दूसरे धोने के लिए दोहराएं।
    5. कोशिकाओं गोली और सतह पर तैरनेवाला के 70 μL को हटाने के लिए 20 एस के लिए एक मिनी अपकेंद्रित्र में ट्यूबों अपकेंद्रित्र। पीबीएस की शेष मात्रा में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और सामग्री को एक लेबल कवरस्लिप (24 मिमी x 60 मिमी) में स्थानांतरित करें।
    6. सीधे नमूने पर माउंटेंट के 75 μL लागू करें और एक विंदुक टिप के साथ किसी भी बुलबुले को हटा दें। कवरलिप्स को अंधेरे में आरटी पर रात भर (18-24 घंटे) ठीक करने की अनुमति दें।
  5. बढ़ते दाग वाले एपिकल-आउट एंटरॉइड्स (दिन 2)
    1. रात भर इलाज के बाद, कवरलिप्स पर ग्लिसरॉल की एक पतली परत (~ 15 μL) लागू करें। कवरस्लिप को ग्लास स्लाइड पर माउंट करें और धीरे-धीरे जगह में दबाएं। कवरस्लिप और स्लाइड के बीच किसी भी बुलबुले को हटाने के लिए टैप करें।
    2. कवरस्लिप को कम से कम 2 घंटे के लिए अंधेरे में आरटी पर सेट करने की अनुमति दें, एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ 20x आवर्धन पर इमेजिंग से पहले। विभिन्न कन्फोकल अधिग्रहण विधियों का उपयोग करके एंटरॉइड्स के सूक्ष्म दृश्य के लिए, लालेमेंट एट अल 37 देखें।
  6. इम्यूनोफ्लोरोसेंट मात्रा का ठहराव
    नोट: यह विधि ImageJ सॉफ़्टवेयर (https://imagej.nih.gov/ij/) का उपयोग करपृष्ठभूमि संकेत को हटाकर सही कुल प्रतिदीप्ति निर्धारित करता है।
    1. इमेजजे में कॉन्फोकल छवियों को खोलें और ब्याज के क्षेत्र (आरओआई) टूल के साथ वांछित क्षेत्र को रेखांकित करें।
    2. माप सेट करें विश्लेषण करने के लिए नेविगेट करके उपयोगकर्ता-परिभाषित पैरामीटर सेट >। सेटिंग्स टैब > तहत एकीकृत घनत्व > मतलब ग्रे मान क्षेत्र का चयन करें।
    3. विश्लेषण > उपाय करने के लिए नेविगेट करें। एक पॉप-अप विंडो दिखाई देगी जिसमें माप शामिल हैं। इन मापों को स्प्रेडशीट में कॉपी और पेस्ट करें।
    4. पृष्ठभूमि संकेत को घटाने के लिए, छवि के एक छोटे गैर-फ्लोरोसेंट क्षेत्र का चयन करें। उस क्षेत्र के लिए विश्लेषण > उपाय पर नेविगेट करें। एक पॉप-अप विंडो दिखाई देगी जिसमें माप शामिल हैं। आउटपुट को स्प्रेडशीट में कॉपी और पेस्ट करें।
    5. पृष्ठभूमि रीडिंग के औसत प्रतिदीप्ति से चयनित सेल के क्षेत्र को गुणा करें, और सही कुल सेल प्रतिदीप्ति (सीटीसीएफ) की गणना करने के लिए एकीकृत घनत्व से योग घटाएं। स्प्रेडशीट या सांख्यिकीय सॉफ़्टवेयर पैकेज में रिकॉर्ड बनाए रखते हुए ब्याज की सभी छवियों के लिए ऊपर दिए गए चरणों को दोहराएं ( सामग्री की तालिका देखें)।

3. एपिकल-आउट एनईसी-इन-ए-डिश सेल व्यवहार्यता

  1. एंटरॉइड उपचार
    1. चरण 1 के रूप में 24 घंटे के लिए एपिकल-आउट एनईसी-इन-ए-डिश मॉडल स्थापित करें।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेल व्यवहार्यता परख अभिकर्मक पिघलना। परख के दिन, उपयोग करने से पहले अभिकर्मक को आरटी 30 मिनट में लाएं। मिश्रण करने के लिए अभिकर्मक को उल्टा करें।
    3. परख करने से पहले, प्रत्येक कुएं से मीडिया के 100 μL को हटा दें, शेष 400 μL छोड़कर प्रत्येक अच्छी तरह से सेल व्यवहार्यता परख अभिकर्मक के 400 μL जोड़ें।
    4. सख्ती सेल लसीका प्रेरित करने के लिए 200 आरपीएम पर 5 मिनट के लिए आरटी पर एक प्लेट शेकर पर सामग्री अच्छी तरह से मिश्रण। मिलाते हुए बाद, एक अतिरिक्त 25 मिनट के लिए आरटी पर प्लेट सेते हैं।
    5. 25 मिनट इनक्यूबेशन के बाद, पाइपिंग के माध्यम से एक अच्छी तरह से एक की सामग्री मिश्रण और एक 96 अच्छी तरह से, अपारदर्शी, पॉलीस्टाइनिन, स्पष्ट तल प्लेट के एक ही कुएं के लिए 800 μL के 200 μL हस्तांतरण। शेष 600 μL के लिए दोहराएं, प्रति अच्छी तरह से चार तकनीकी प्रतिकृतियां बनाएं। 24-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं की शेष सामग्री को इस तरह से 96-अच्छी तरह से प्लेट में स्थानांतरित करें।
    6. ल्यूमिनेसेंस में सक्षम प्लेट रीडर का उपयोग करके, 0.25 एमएस एकीकरण पर मूल्यों को रिकॉर्ड करें और उपचार के बीच सापेक्ष मूल्यों की तुलना करें। वैकल्पिक रूप से, एक एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) मानक के लिए उपचार ल्यूमिनेसेंस की तुलना करें।

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Representative Results

आंत्र सूजन को मॉडल करने के लिए एंटरॉइड का उपयोग, यहां तक कि नेक्रोटाइजिंग एंटरोकोलाइटिस के संदर्भ में भी, अब आम है। हालांकि, वर्तमान में उपयोग की जाने वाली अधिकांश विधियों में या तो एंटरोइड्स की एपिकल सतह तक पहुंच की कमी होती है, जो मौखिक चिकित्सीय के रूप में अंतिम उपयोग के लिए अभिप्रेत यौगिकों की शारीरिक प्रासंगिकता को नकारती है, या तकनीकी रूप से कठिन और समय लेने वाली होती है, जैसा कि एंटरॉइड-व्युत्पन्न मोनोलेयर के साथ होता है। एनईसी के इन विट्रो एंटरॉइड मॉडल में वर्तमान की उपयोगिता को बढ़ाने के लिए, हमने एंटरोइड्स की ध्रुवीयता को उलट दिया, और 24 घंटे हाइपोक्सिया और एलपीएस या टीएनएफ-α के साथ संयोजन में, एक एपिकल-आउट एनईसी-इन-ए-डिश मॉडल उत्पन्न किया। इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला लुमेन की ओर नाभिक (नीला) के एपिकल-आउट स्थानीयकरण की पुष्टि करता है और उपकला (चित्रा 1 ए) के बाहरी किनारे पर विलिन32 (लाल, एपिकल मार्कर) का पता लगाता है। एमएल टीएनएफ-α, या हाइपोक्सिया अकेले सकल सेल आकृति विज्ञान, ई-कैडरिन38 (हरा), या विलिन स्थानीयकरण या फ्लोरोसेंट तीव्रता में नियंत्रण की तुलना में परिवर्तन को प्रेरित नहीं करता है (चित्रा 1 ए-डी; चित्र 2)। हाइपोक्सिया के साथ संयोजन में एलपीएस या टीएनएफ-α के साथ उपचार, उपकला वास्तुकला को बाधित करता है और अनुयायियों जंक्शन और ब्रश बॉर्डर प्रोटीन अभिव्यक्ति का एक महत्वपूर्ण नुकसान होता है, जो ई-कैडरिन और विलिन धुंधला (चित्रा 1 ई-एफ) के नुकसान से संकेत मिलता है; चित्र 2)। एंटरोसाइट ब्रश सीमा और जंक्शन प्रोटीन अभिव्यक्तियों में ये कटौती संभवतः उपकला बाधा अखंडता में कमी का संकेत देती है और मानव सर्जिकल एनईसी और रोग के इन विट्रो मॉडलिंग दोनों की एक सामान्य विशेषता है23.

3 डी एपिकल-आउट एंटरॉइड्स की व्यवहार्यता पर एनईसी-इन-ए-डिश घटकों के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए, सेल व्यवहार्यता का मूल्यांकन 3 डी संस्कृतियों के लिए डिज़ाइन किए गए सेल व्यवहार्यता परख का उपयोग करके किया गया था, जो सेल लिसिस के बाद एटीपी मात्रा का ठहराव पर केंद्रित था। एंटरोइड्स को नॉर्मोक्सिक या हाइपोक्सिक स्थितियों के तहत 24 घंटे के लिए एलपीएस (200 μg / एमएल) या टीएनएफ -α (50 एनजी / एमएल) के साथ इलाज किया गया था। अकेले एलपीएस या टीएनएफ-α ने नियंत्रण (चित्रा 3 ए) की तुलना में सेल व्यवहार्यता को काफी प्रभावित नहीं किया। हालांकि, व्यवहार्यता में महत्वपूर्ण कमी तब हुई जब एपिकल-आउट एंटरॉइड्स को हाइपोक्सिया (* पी < 0.0001) के संयोजन में 200 μg / एमएल एलपीएस या 50 एनजी / एमएल टीएनएफ-α के साथ इलाज किया गया था अकेले हाइपोक्सिया (चित्रा 3 बी)। ये प्रयोग लागत प्रभावी और सरल एनईसी-इन-ए-डिश मॉडल में एपिकल-आउट एंटरॉइड का उपयोग करने की बहुमुखी प्रतिभा और शारीरिक प्रासंगिकता को प्रदर्शित करते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: एपिकल-आउट फेनोटाइप और लिपोपॉलीसेकेराइड (एलपीएस), ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर अल्फा (टीएनएफ-α), और हाइपोक्सिया के रूपात्मक प्रभावों की पुष्टि। एंटरोसाइट ब्रश सीमा के लिए 3 डी एपिकल-आउट एंटरॉइड्स के प्रतिनिधि इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला हो जाना और 24 घंटे के बाद जंक्शन प्रोटीन का पालन करता है (ए) नियंत्रण, (बी) हाइपोक्सिया, (सी) एलपीएस (200 μg / एमएल), (डी) टीएनएफ-α (50 एनजी / एमएल), (ई) एलपीएस (200 μg / एमएल) + हाइपोक्सिया, (एफ) टीएनएफ-α प्रत्येक छवि के लिए स्केल बार = 50 μm। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: ब्रश सीमा के लिए धुंधला तीव्रता का ठहराव और 24 घंटे लिपोपॉलीसेकेराइड (एलपीएस), ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर अल्फा (टीएनएफ-α), और हाइपोक्सिया उपचार के बाद जंक्शन प्रोटीन का पालन करता है। नियंत्रण की तुलना में ए = पी 0.0001 <; नियंत्रण की तुलना में बी = पी 0.05 <; सी = पी हाइपोक्सिया की तुलना में 0.0001 <; हाइपोक्सिया की तुलना में डी = पी 0.05 <; ई = पी टीएनएफ-α की तुलना में 0.001 <; एफ = पी एलपीएस + हाइपोक्सिया की तुलना में 0.01 <; एलपीएस की तुलना में जी = पी 0.0001 <; और (बी) उपचार के बीच तुलना में ई-कैडरिन (हरा) स्तर; नियंत्रण की तुलना में ए = पी < 0.0001; हाइपोक्सिया की तुलना में बी = पी < 0.0001; एलपीएस की तुलना में सी = पी 0.01 <; डी = पी टीएनएफ-α की तुलना में 0.01 <; एलपीएस + हाइपोक्सिया की तुलना में ई = पी 0.05 <। पोस्ट-हॉक विश्लेषण के लिए तुकी के परीक्षण के साथ विचरण (एनोवा) के एक तरफा विश्लेषण का उपयोग करके महत्व का मूल्यांकन किया गया था, जिसे माध्य (एसईएम) (एन ± ≥ 7/ नियंत्रण वाहन नियंत्रण के रूप में पीबीएस के साथ नॉर्मोक्सिया का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: एपिकल-आउट सेल व्यवहार्यता पर लिपोपॉलीसेकेराइड (एलपीएस), ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर अल्फा (टीएनएफ-α), और हाइपोक्सिया का प्रभाव। एमएल) या टीएनएफ-α (50 एनजी / एमएल) के साथ इलाज किए गए 3 डी एपिकल-आउट एंटरोइड्स की व्यवहार्यता (ए) नॉर्मोक्सिक या (बी) हाइपोक्सिक स्थितियों के तहत 24 घंटे के लिए ल्यूमिनेसेंस के माध्यम से मापा गया था। सांख्यिकीय महत्व की गणना पोस्ट-हॉक विश्लेषण के लिए तुकी के परीक्षण के साथ विचरण (एनोवा) के एक तरफा विश्लेषण का उपयोग करके की गई थी। एमएल) और टीएनएफ-α (50 एनजी / एमएल) के साथ इलाज किए गए एंटरोइड्स, हाइपोक्सिया के साथ संयोजन में, अकेले हाइपोक्सिया की तुलना में काफी कम व्यवहार्य थे, यहां ल्यूमिनेसेंस में वृद्धि के साथ देखा गया था। एलपीएस (200 μg /mL) या टीएनएफ-α (50 एनजी / एमएल), नॉर्मोक्सिक स्थितियों के तहत, नियंत्रण से अलग नहीं थे। डेटा को माध्य (एसईएम), एन = 8/समूह, ** पी < 0.0001 की माध्य ± मानक त्रुटि के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। नियंत्रण वाहन नियंत्रण के रूप में पीबीएस के साथ नॉर्मोक्सिया का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा 1: त्रि-आयामी एंटरॉइड की आकृति विज्ञान। (ए) जबकि बेसोलेटरल-आउट एंटरॉइड्स में एक बड़े और खुले केंद्रीय लुमेन की उपस्थिति का प्रभुत्व होता है, नवोदित के साथ या बिना, (बी) एपिकल-आउट एंटरोइड्स को घने, सेलुलर उपस्थिति की विशेषता होती है। प्रत्येक छवि के लिए स्केल बार = 100 μm। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

आंतों के उपकला क्रिप्ट से प्राप्त एंटरॉइड मॉडल का हालिया विकास इन विट्रो ऊतक में अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक की अनुमति देता है जिसमें नेक्रोटाइजिंग एंटरोकोलाइटिस रोगजनन का अध्ययन करना है। आंतों के उपकला के सभी प्रमुख विभेदित सेल प्रकारों को शामिल करने के बावजूद, 3 डी एंटरोइड अभी भी कई महत्वपूर्ण सीमाओं के अधीन हैं। पारंपरिक, बेसोलेटरल-आउट एंटरॉइड्स को 3 डी ईसीएम हाइड्रोगेल गुंबदों में निलंबित कर दिया जाता है, जिनमें से संरचना और घनत्व ऊतक संस्कृति पर्यावरण39 के भीतर सामान्य प्रसार को सीमित कर सकते हैं। महत्वपूर्ण रूप से, ये एंटरॉइड कोशिकाओं की एपिकल सतह तक सीमित पहुंच प्रदान करते हैं, जो सतह है जो विवो में, ल्यूमिनल बैक्टीरिया और एंटीजन के साथ बातचीत करेगी, जैसे कि एलपीएस के एंटरोसाइट टीएलआर 4-बाइंडिंग।

जबकि एनईसी का पैथोफिजियोलॉजी अस्पष्ट रहता है, अपरिपक्व आंतों के उपकला में एपिकल टीएलआर 4 की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति और सक्रियण को एक प्रमुख भूमिका निभाने के लिए माना जाता है40. टीएलआर 4 सक्रियण के डाउनस्ट्रीम, आंतों की पारगम्यता में वृद्धि, उपकला की मरम्मत में कमी, और जीवाणु अनुवाद के परिणामस्वरूप एक बेकार आंतों की बाधा होती है, जिससे आंत का परिगलनहोता है 2. समय से पहले शिशुओं की डिस्टल आंत में यह भड़काऊ चक्र आंतों के लुमेन में उत्पन्न होता है, जो एंटरोसाइट्स की एपिकल सतह पर शुरू होता है। इस प्रकार, आंतों के उपकला के जीवाणु अनुवाद से जुड़े यंत्रवत अध्ययनों में बेसोलेटरल-आउट 3 डी एंटरॉइड्स का उपयोग करने वाले मॉडल विवो रोगजनन में पुनरावृत्ति नहीं करते हैं जैसा कि वर्तमान में समझा जाता है और उप-इष्टतम जानकारी प्राप्त करने की संभावना है।

यहां, हम एपिकल-आउट एनईसी-इन-ए-डिश मॉडल की स्थापना का वर्णन करते हैं, जिससे एंटरॉइड कोशिकाओं की एपिकल सतह तक आसान पहुंच की अनुमति मिलती है और संभवतः, पारंपरिक 3 डी बेसोलेटरल-आउट एंटरॉइड्स की तुलना में अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक मॉडल होता है। इन एंटरॉइड्स में ध्रुवीयता उत्क्रमण संभावित मौखिक रूप से प्रशासित चिकित्सीय को केवल मीडिया में जोड़ने और एंटरोसाइट्स द्वारा स्वाभाविक रूप से लेने की अनुमति देता है, जैसा कि विवो में होगा। इस दृष्टिकोण को महंगी और तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण तकनीकों की आवश्यकता नहीं है, जैसे कि माइक्रोइंजेक्शन, और 2 डी मोनोलेयर या गट-ऑन-ए-चिप मॉडल की स्थापना की तुलना में अधिक संसाधन-अनुकूल है।

हमारे प्रतिनिधि परिणाम हाइपोक्सिया के साथ संयोजन में एलपीएस या टीएनएफ-α के अधीन एपिकल-आउट एंटरोइड्स को इंगित करते हैं, कम व्यवहार्यता, बाधित उपकला वास्तुकला, और नियंत्रण की तुलना में अनुयायी जंक्शन प्रोटीन अभिव्यक्ति में कमी, या अकेले हाइपोक्सिया या भड़काऊ मध्यस्थ उपचार की तुलना में, विवो एनईसी की ज्ञात विशेषताओं की नकल करते हुए। आंतों के उपकला बाधा समारोह41 के लिए महत्वपूर्ण अनुयायी जंक्शनों का विघटन, एनईसी42,43 में बताया गया है। तंग जंक्शन वास्तुशिल्प व्यवधान, जो एनईसी44 में भी महत्वपूर्ण है, संभवतः भी हुआ, हालांकि इन परिवर्तनों का मूल्यांकन भविष्य के अध्ययनों में किया जाएगा। शारीरिक रूप से अनुवाद योग्य ऊतक में, यह दोहरी हिट मॉडल एनईसी में निहित कारकों के लिए अपरिपक्व आंतों की प्रतिक्रियाओं के अध्ययन की अनुमति देता है, जबकि एक मंच प्रदान करता है जिसके माध्यम से संभावित उपन्यास चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान की जा सकती है। भविष्य के अध्ययन परजीवी, जीवाणु, या वायरल संक्रमण31,32, मेजबान-माइक्रोबायोम इंटरैक्शन 45, और गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल अवशोषण समारोह46 पर केंद्रित अध्ययनों के लिए एनईसी से परे एपिकल-आउट एंटरॉइड्स के आवेदन का विस्तार कर सकते हैं, लेकिन अपरिपक्व शिशु के शारीरिक संदर्भ में।

एपिकल-आउट एनईसी-इन-ए-डिश के लिए इस प्रोटोकॉल में जोर देने वाले कई महत्वपूर्ण कदम शामिल हैं। सेल संस्कृति मीडिया की संरचना और ताजगी प्रयोगों में अत्यधिक अनुदैर्ध्य परिवर्तनशीलता से बचने और प्रयोगात्मक उपचार से पहले एंटरोइड स्वस्थ सुनिश्चित करने में महत्वपूर्ण हैं। इसी तरह, टीएनएफ-α और एलपीएस के स्टॉक समाधानों को अत्यधिक फ्रीज / पिघलना चक्रों से बचने और इष्टतम गतिविधि को संरक्षित करने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत और संग्रहीत किया जाना चाहिए। अंत में, यह सुनिश्चित करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए कि ईडीटीए / पीबीएस इनक्यूबेशन के दौरान सभी ईसीएम घुलनशील हैं। ईसीएम के अधूरे हटाने के परिणामस्वरूप एंटरॉइड ध्रुवीयता को उलटने में विफल हो सकते हैं। यदि आवश्यक हो, तो मैट्रिक्स को पूरी तरह से हटाने के लिए इनक्यूबेशन अवधि को 1.5 घंटे तक बढ़ाया जा सकता है।

जबकि यह एपिकल-आउट एनईसी-इन-ए-डिश मॉडल लागत प्रभावी और सीधा है, विधि कई सीमाओं के अधीन है। एपिकल-आउट एनईसी-इन-ए-डिश आंत-ऑन-ए-चिप मॉडल28,29 के रूप में शारीरिक रूप से प्रासंगिक नहीं है, लेकिन एक मध्यवर्ती विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है जहां और जब चिप विकल्प सुलभ नहीं होते हैं। इसके अलावा, एक निलंबन संस्कृति के रूप में, एंटरॉइड्स को मीडिया परिवर्तनों के लिए एकत्र, गोली मार दी जानी चाहिए और फिर से निलंबित किया जाना चाहिए, अन्यथा सरल प्रक्रिया में एक सेंट्रीफ्यूजेशन चरण जोड़ना चाहिए। एक और सीमा एपिकल-आउट एंटरॉइड्स की दीर्घायु है, क्योंकि उन्हें आमतौर पर केवल अंत-बिंदु विश्लेषण के लिए उपयुक्त माना जाता है। चूंकि बेसोलेटरल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर्स अब मीडिया विकास कारकों के साथ निरंतर संपर्क में नहीं हैं, एपिकल-आउट एंटरॉइड्स को बेसोलेटरल-आउट एंटरॉइड्स की तुलना में कम प्रसार की विशेषता है, जिसके परिणामस्वरूप एपिकल-आउट संस्कृतियोंको पारित करने में सापेक्ष असमर्थता 31,32 है। इसके अतिरिक्त, विवो ऊतक की तुलना में एंटरॉइड में सेल प्रकारों के सापेक्ष अनुपात सहित सटीक संरचना का प्रतिनिधित्व किया जाता है या नहीं, यह ज्ञात नहीं है, लेकिन अध्ययन आम तौर पर मामूली अंतर31,32 का सुझाव देते हैं। अंत में, इस एपिकल-आउट एनईसी-इन-ए-डिश मॉडल का 24 घंटे का विकास, जबकि सुविधाजनक है, विवो फॉर्मूला-आधारित एनईसी मॉडल47 की तुलना में अपेक्षाकृत संक्षिप्त हो सकता है, संभावित रूप से हस्तक्षेप की लंबी अवधि वांछित होने पर अतिरिक्त मानकीकरण की आवश्यकता होती है।

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Disclosures

लेखकों के पास प्रकट करने के लिए कुछ भी नहीं है और हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

यह सामग्री पूरी तरह से लेखकों की ज़िम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करती है। एचसी को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ से अनुदान पी 20 जीएम 134973 द्वारा समर्थित किया गया है। केबी को चिल्ड्रन हॉस्पिटल फाउंडेशन (सीएचएफ) और प्रेस्बिटेरियन हेल्थ फाउंडेशन (पीएचएफ) अनुदान द्वारा समर्थित किया जाता है। हम कोर सुविधा के उपयोग के लिए ओयूएचएससी में आणविक जीवविज्ञान और साइटोमेट्री रिसर्च के लिए प्रयोगशाला का धन्यवाद करते हैं, जिसने कॉन्फोकल इमेजिंग प्रदान की।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA, pH 8.0 Fisher Scientific 15575-020
1.5 mL microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-129
15 mL Conical tube VWR 89039-666
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay Promega G9681
Corning Costar Ultra-Low Attachment 24-Well Microplates Fisher Scientific 07-200-602
Cover Glass 24 mm x 60 mm Thermo Scientific 102460
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Scientific A-21202
Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody, Cy3 conjugate Sigma-Aldrich AP182C
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer STEMCELL Technologies 36254
E-cadherin antibody (7H12) Novus Biologicals NBP2-19051
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 Millipore Sigma 1004960700
Glycerol Sigma-Aldrich 56-81-5
ImageJ Fiji N/A
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) STEMCELL Technologies 06010
Leica SP8 Confocal Microscope Leica Biosystems
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography Millipore Sigma L3012-10MG
Microscope Slides Fisher Scientific 12-544-7
Normal Donkey Serum Sigma-Aldrich 566460
Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate Thermo Scientific 136101
PBS (Phosphate Buffered Saline), 1x [-] calcium, magnesium, pH 7.4 Corning 21-040-CM
Prolong Glass Antifade Mountant with NucBlue Fisher Scientific P36983
Recombinant Anti-Villin antibody [SP145] Abcam ab130751
Recombinant Human TNF-α protein 100 µg Bio-Techne 210-TA-100/CF
SpectraMax iD3 Multi-Mode Microplate Reader Molecular Devices
Thermo Forma Series II Water-Jacketed Tri-Gas Incubator, 184L Fisher Scientific 3140
TO-PRO-3 Iodide (642/661) Thermo Scientific T3605
Triton X-100 Sigma-Aldrich 9002-93-1
Tubes, 0.5 mL, flat cap Thermo Scientific AB0350
Tween-20 Sigma-Aldrich 9005-64-5

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References

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चिकित्सा अंक 184
<em>इन विट्रो में </em> नेक्रोटाइजिंग एंटरोकोलाइटिस का एपिकल-आउट एंटरॉइड मॉडल
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Burge, K., Wilson, A., Chaaban, H.… More

Burge, K., Wilson, A., Chaaban, H. In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis. J. Vis. Exp. (184), e64003, doi:10.3791/64003 (2022).

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