Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Intestinale epitheelregeneratie als reactie op ioniserende bestraling

Published: July 27, 2022 doi: 10.3791/64028
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 1
1Department of Medicine, Renaissance School of Medicine at Stony Brook University, 2Department of Physiology and Biophysics, Renaissance School of Medicine at Stony Brook University

Summary

Het maagdarmkanaal is een van de meest gevoelige organen voor letsel bij radiotherapeutische kankerbehandelingen. Het is tegelijkertijd een orgaansysteem met een van de hoogste regeneratieve capaciteiten na dergelijke beledigingen. Het gepresenteerde protocol beschrijft een efficiënte methode om het regeneratieve vermogen van het darmepitheel te bestuderen.

Abstract

Het darmepitheel bestaat uit een enkele laag cellen, maar bevat meerdere soorten terminaal gedifferentieerde cellen, die worden gegenereerd door de actieve proliferatie van darmstamcellen op de bodem van darmcrypten. Tijdens gebeurtenissen van acuut darmletsel ondergaan deze actieve darmstamcellen echter celdood. Gammabestraling is een veel gebruikte colorectale kankerbehandeling, die, hoewel therapeutisch effectief, de bijwerking heeft van het uitputten van de actieve stamcelpool. Inderdaad, patiënten ervaren vaak gastro-intestinaal stralingssyndroom tijdens het ondergaan van radiotherapie, deels als gevolg van actieve stamceluitputting. Het verlies van actieve intestinale stamcellen in darmcrypten activeert een pool van typisch rustige reserve darmstamcellen en induceert dedifferentiatie van secretoire en enterocytvoorlopercellen. Zonder deze cellen zou het darmepitheel niet in staat zijn om te herstellen van radiotherapie en andere dergelijke belangrijke weefselbeledigingen. Nieuwe ontwikkelingen in lineage-tracing-technologieën maken het mogelijk om de activering, differentiatie en migratie van cellen tijdens regeneratie te volgen en zijn met succes gebruikt om dit in de darm te bestuderen. Deze studie heeft tot doel een methode weer te geven voor de analyse van cellen in het darmepitheel van de muis na stralingsletsel.

Introduction

Het menselijke darmepitheel zou ongeveer het oppervlak van een half badmintonveld bedekken als hetvolledig vlak 1 zou worden geplaatst. In plaats daarvan wordt deze enkele cellaag die mensen scheidt van de inhoud van hun darmen samengeperst in een reeks vingerachtige projecties, villi en inkepingen, crypten die het oppervlak van de darmen maximaliseren. De cellen van het epitheel differentiëren langs een crypte-villusas. De villus bestaat voornamelijk uit voedingsabsorberende enterocyten, slijmafscheidende bokaalcellen en de hormoonproducerende entero-endocriene cellen, terwijl de crypten voornamelijk bestaan uit defensine-producerende Paneth-cellen, actieve en reservestamcellen en voorlopercellen 2,3,4,5. Bovendien genereert de bidirectionele communicatie die deze cellen hebben met de stromale en immuuncellen van het onderliggende mesenchymale compartiment en de microbiota van het lumen een complex netwerk van interacties dat de darmhomeostase handhaaft en van cruciaal belang is voor herstel na letsel 6,7,8.

Het darmepitheel is het snelst zelfvernieuwende weefsel in het menselijk lichaam, met een omloopsnelheid van 2-6 dagen 9,10,11. Tijdens homeostase delen actieve stamcellen aan de basis van darmcrypten (crypt base columnar cells), gekenmerkt door de expressie van leucine-rijke repeat-bevattende G-eiwit gekoppelde receptor 5 (LGR5), zich snel en leveren voorlopercellen die differentiëren in alle andere intestinale epitheellijnen. Vanwege hun hoge mitotische snelheid zijn actieve stamcellen en hun directe voorlopers echter bijzonder gevoelig voor gammastralingsschade en ondergaan ze apoptose na bestraling 5,12,13,14. Na hun verlies ondergaan reservestamcellen en niet-stamcellen (subpopulatie van voorlopers en sommige terminaal gedifferentieerde cellen) in darmcrypten activering en vullen ze het basale cryptecompartiment aan, dat vervolgens celpopulaties van de villi kan reconstitueren en zo het darmepitheel kan regenereren15. Met behulp van afstammingstechnieken hebben meerdere onderzoeksgroepen aangetoond dat reserve (rustige) stamcellen in staat zijn om regeneratie te ondersteunen bij het verlies van actieve stamcellen 13,16,17,18,19,20,21,22. Deze cellen worden gekenmerkt door de aanwezigheid van polycomb complex protein 1 oncogen (Bmi1), muis telomerase reverse transcriptase gen (mTert), Hop homeobox (Hopx), en leucine-rijke repeat protein 1 gen (Lrig1). Bovendien is aangetoond dat niet-stamcellen in staat zijn om darmcrypten aan te vullen bij letsel 23,24,25,26,27,28,29,30,31. In het bijzonder is aangetoond dat voorlopers van secretoire cellen en enterocyten dedifferentiatie ondergaan bij letsel, terugkeren naar stamachtige cellen en de regeneratie van het darmepitheel ondersteunen. Recente studies hebben cellen geïdentificeerd die meerdere markers tot expressie brengen die de capaciteit bezitten om stamachtige kenmerken te verwerven bij letsel (zoals DLL +, ATOH1 +, PROX1 +, MIST1 +, DCLK1 +) 32,33,34,35,36. Verrassend genoeg toonden Yu et al. aan dat zelfs volwassen Paneth-cellen (LYZ +) kunnen bijdragen aan darmregeneratie37. Bovendien, naast het veroorzaken van apoptose van intestinale epitheelcellen en het verstoren van de epitheelbarrièrefunctie, resulteert bestraling in dysbiose van de darmflora, immuuncelactivering en het initiëren van een pro-inflammatoire reactie, en de activering van mesenchymale en stromale cellen38,39.

Gammastraling is een waardevol therapeutisch hulpmiddel bij de behandeling van kanker, vooral voor colorectale tumoren40. Bestraling beïnvloedt echter de intestinale homeostase aanzienlijk door schade aan de cellen te veroorzaken, wat leidt tot apoptose. Blootstelling aan straling veroorzaakt meerdere verstoringen die het herstel van een patiënt vertragen en wordt gekenmerkt door slijmvliesletsel en ontsteking in de acute fase en diarree, incontinentie, bloedingen en buikpijn op lange termijn. Dit arsenaal aan manifestaties wordt gastro-intestinale stralingstoxiciteit genoemd. Bovendien kan door straling geïnduceerde progressie van transmurale fibrose en/of vasculaire sclerose zich pas jaren na de behandeling manifesteren38,41. Gelijktijdig met het letsel zelf induceert straling een herstelreactie in darmcellen die signaalroutes activeert die verantwoordelijk zijn voor het initiëren en orkestreren van regeneratie42. Door straling geïnduceerde dunne darmziekte kan afkomstig zijn van bekken- of abdominale radiotherapie die wordt toegediend aan andere organen (zoals baarmoederhals, prostaat, pancreas, rectum)41,43,44,45,46. Intestinale bestralingsschade is dus een belangrijk klinisch probleem en een beter begrip van de resulterende pathofysiologie zal waarschijnlijk de ontwikkeling van interventies bevorderen om de gastro-intestinale complicaties geassocieerd met radiotherapie te verlichten. Er zijn andere technieken die het mogelijk maken om het regeneratieve doel van het darmepitheel te onderzoeken, afgezien van straling. Transgene en chemische muizenmodellen om ontstekingen en de regeneratie daarna te bestuderen zijnontwikkeld 47. Dextran natriumsulfaat (DSS) induceert ontsteking in de darm en leidt tot de ontwikkeling van kenmerken die vergelijkbaar zijn met die van inflammatoire darmziekte48. Een combinatie van DSS-behandeling met de pro-carcinogene verbinding azoxymethaan (AOM) kan leiden tot de ontwikkeling van colitis-geassocieerde kanker48,49. Ischemie reperfusie-geïnduceerde schade is een andere methode die wordt gebruikt om het regeneratieve potentieel van het darmepitheel te bestuderen. Deze techniek vereist ervaring en chirurgische kennis50. Bovendien veroorzaken de bovengenoemde technieken andere soorten letsel dan straling en kunnen ze leiden tot de betrokkenheid van verschillende regeneratiemechanismen. Bovendien zijn deze modellen tijdrovend, terwijl de stralingstechniek vrij kort is. Onlangs zijn in vitro methoden met behulp van enteroïden en colonoïden gegenereerd uit de darm en dikke darm gebruikt in combinatie met stralingsletsel om de mechanismen van darmregeneratie te bestuderen51,52. Deze technieken geven echter niet volledig de balans weer van het orgel dat ze modelleren53,54.

Het gepresenteerde protocol omvat de beschrijving van een muizenmodel van gammastralingsschade in combinatie met een genetisch model dat, na behandeling met tamoxifen, het traceren van afstammingslijnen afkomstig van de reservestamcelpopulatie (Bmi1-CreER; Rosa26eYFP). Dit model maakt gebruik van een 12 Gy totale lichaamsbestraling, die voldoende darmletsel veroorzaakt om reservestamcellen te activeren, terwijl het daaropvolgende onderzoek naar het regeneratieve vermogen van de darm binnen 7 dagen na letsel mogelijk is55.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle muizen werden ondergebracht in de Division of Laboratory Animal Resources (DLAR) aan de Stony Brook University. De Stony Brook University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) keurde alle studies en procedures met dieren goed. Experimenten met proefdieren werden strikt uitgevoerd in overeenstemming met het goedgekeurde protocol voor het hanteren van dieren (IACUC #245094).

OPMERKING: Muisstammen B6;129-Bmi1 tm1(cre/ERT)Mrc/J (Bmi1-Cre ER) en B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J (Rosa26eYFP) werden commercieel verkregen (zie materiaaltabel) en gekruist om Bmi1-Cre ER te verkrijgen; Rosa26eYFP (Bmi1ctrl) muizen, zoals eerder beschreven56,57,58.

1. Huisvesting van Bmi1-Cre ER; Rosa26 eYFP muizen

  1. Houd de muizen in een dierenfaciliteit op een temperatuur variërend van 68-72 ° F en een luchtvochtigheid variërend van 30-70%, in een 12 h / 12 h licht / donker cyclus, met water en normale chow ad libitum.
  2. Bevestig voorafgaand aan de experimenten de genotypen van muizen met behulp van een standaard PCR-genotyperingstechniek57,58.

2. Voorbereiding van dieren en materialen

  1. Breng muizen ten minste 7 dagen voor elk experiment over naar de experimentele huisvestingsruimte om de muizen te laten acclimatiseren.
  2. Match experimentele en controledieren op basis van geslacht en leeftijd.
  3. De controledieren onderwerpen aan tamoxifen-geïnduceerde Cre-gemedieerde recombinatie, maar niet aan bestraling (schijnbehandeling, 0 Gy), waarbij ervoor wordt gezorgd dat de proefdieren de tamoxifeninjectie krijgen en worden blootgesteld aan gammastraling.
  4. Bereid de tamoxifenoplossing. Resuspendeerde tamoxifen poeder in steriele maïsolie in een concentratie van 30 mg / ml. Soniceer gedurende 3 minuten in cycli van 30 s AAN en 30 s UIT met 60% amplitude en draai vervolgens in het donker gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (RT). Tamoxifenoplossing kan worden ingevroren bij −20 °C, maar vries/ontdooi het niet meer dan één keer. Bereid bij voorkeur elke keer een verse oplossing en bewaar deze niet.
    OPMERKING: Tamoxifen is lichtgevoelig. Wikkel het met tinfolie tijdens kamertemperatuurrotatie.
    LET OP: Tamoxifen is een potentieel gevaarlijke stof: Gezondheidsgevaar (GHS08) en Milieugevaar (GHS09).
  5. Bereid 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) stockoplossing. Resuspendeer EdU-poeder in 1/5 van het totale volume steriel dimethylsulfoxide (DMSO) en voeg langzaam de resterende 4/5 van het totale volume steriel ultrapuur water toe. Wanneer volledig opgelost, aliquot en bewaren bij −20 °C.
    LET OP: 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) en dimethylsulfoxide (DMSO) zijn potentieel gevaarlijke stoffen: Gezondheidsrisico's (respectievelijk H340 en H631 en H227, H315 en H319). EdU kan genetische defecten veroorzaken en wordt verdacht van het beschadigen van de vruchtbaarheid of ongeboren kinderen, en DMSO kan huid- en oogirritatie veroorzaken.
  6. Reagentia bereiden voor weefselverzameling en -fixatie: verdun ethanol om een 70% wateroplossing te bereiden, koel DPBS af tot 4 °C en bereid gemodificeerde Bouin's fixatieve buffer (50% ethanol en 5% azijnzuur in gedestilleerd H2O) en 10% gebufferde formaline.
    LET OP: Ethylalcohol is een potentieel gevaarlijke stof: gevaar voor de gezondheid (H225-H319), ontvlambaar (GHS02) en veroorzaakt acute toxiciteit (GHS07). Azijnzuur is een potentieel gevaarlijke stof: gevaar voor de gezondheid (H226-H314), ontvlambaar (GHS02) en bijtend (GHS05). Formaline is een potentieel gevaarlijke stof: gevaar voor de gezondheid (H350, H315, H317, H318, H370) en corrosief. Formaline kan kanker, huid- en oogirritatie, schade aan organen en allergische huidreacties veroorzaken.
  7. Bereid de apparatuur voor euthanasie voor volgens een goedgekeurde methode (CO2-kamer , bijvoorbeeld), een muizendissectiekit (schaar, tang), petrischalen, een 16 G maagnaald bevestigd aan een 10 ml spuit om de darmen te spoelen en histologische cassettes.

3. Gammastraling van het totale lichaam (TBI) en weefselverzameling

  1. Injecteer de proefdieren twee dagen voorafgaand aan blootstelling aan gammastraling met een enkele dosis tamoxifen om cre-gemedieerde recombinatie en BMI1/EYFP+ cellinage tracing te induceren. Weeg elk dier en bereken een dosis van 40 mg/kg lichaamsgewicht tamoxifen geresuspendeerd in maïsolie. Desinfecteer de buikstreek met 70% ethanol en dien tamoxifen intraperitoneaal toe met een naald van 27 G die is bevestigd aan een spuit van 1 ml.
  2. Observeer dieren gedurende de volgende 48 uur om mogelijke tamoxifentoxiciteit uit te sluiten.
  3. Breng de muizen over naar de bestralingsruimte zoals gespecificeerd door de lokale instelling.
  4. Bereken de blootstellingstijd aan bestraling die vrijkomt door de 137Cs-bron volgens het huidige exactordosistempo. Als het huidige dosistempo bijvoorbeeld gelijk is aan 75,9 rad/min (0,759 Gy min−1 = 75,9 cGy m−1), wordt de blootstellingstijd in minuten berekend als de gewenste dosis/0,759. Om de dieren te bestralen tot een dosis van 12 Gy TBI, is de blootstellingstijd ~ 15,81 min (15 min en 48 s).
  5. Desinfecteer de monsterkamer in de gammabestralingsinstallatie met 70% ethanoloplossing; Plaats de absorberende mat en de dieren in de monsterkamer.
    OPMERKING: Met schijn behandelde dieren moeten in de doorstralingsruimte worden geplaatst, maar niet aan gammastraling worden blootgesteld.
  6. Plaats het deksel en sluit de kamer.
  7. Programmeer de gammabestraling om dieren bloot te stellen aan 12 Gy TBI.
    1. Schakel het apparaat in door de sleutel in de START-positie te draaien.
    2. Voer het operatornummer in met behulp van een numeriek toetsenbord en bevestig door op ENTER te drukken.
    3. Voer de pincode in met een numeriek toetsenbord en bevestig door op ENTER te drukken.
    4. Druk op 1 voor opties.
    5. Druk op 1 voor de timerinstellingen.
    6. Druk op 1 voor de bestralingstijd.
    7. Voer de timerinstelling voor de volgende cyclus in met behulp van een numeriek toetsenbord (uu:mm:ss-indeling) en bevestig door op ENTER te drukken.
    8. Bevestig de instellingen nogmaals door op ENTER te drukken.
    9. Ga terug naar het startmenu door 2x op CLEAR te drukken.
    10. Druk op START om de belichting te starten.
  8. Verlaat de kamer voor de tijd van actieve blootstelling. Het apparaat stopt automatisch nadat de vooraf ingestelde tijd is verstreken en begint te piepen.
    LET OP: Cesium-137 (137Cs) is een dodelijk gevaarlijke stof (Gezondheidsrisico: H314). Externe blootstelling aan grote hoeveelheden van 137C's kan brandwonden, acute stralingsziekte en zelfs de dood veroorzaken.
  9. Schakel het apparaat uit door de sleutel in de STOP-positie te draaien.
  10. Open de monsterkamer, verwijder het deksel, breng de dieren terug naar de kooi en desinfecteer de monsterkamer met 70% ethanoloplossing.
  11. Breng de dieren terug naar de conventionele huisvestingsruimte en observeer hun toestand na de behandeling.
  12. Controleer het gewicht van de dieren elke dag en euthanaseer ze onmiddellijk (ondanks het geplande tijdstip) als symptomen van veranderd welzijn, angst of gewichtsverlies van meer dan 15% van het startlichaamsgewicht worden waargenomen.
  13. Drie uur voor de geplande euthanasie desinfecteert u de buikstreek en injecteert u de muizen met behulp van een 28G-insulinespuit met 100 μL EdU-stamoplossing (intraperitoneaal toegediend).
  14. Verzamel proximale darmen op 0 h, 3 h, 6 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h en 168 h na de bestraling.
    1. Voer CO 2-euthanasie uit volgens de normen van de thuisinstelling.
      LET OP: Koolstofdioxide is een gevaarlijke stof (H280). Bevat gas onder druk; kan ontploffen bij verhitting. Kan zuurstof verdringen en snelle verstikking veroorzaken.
    2. Ontleed vervolgens het proximale deel van de dunne darm, verwijder aangehechte weefsels, spoel met koude DPBS met behulp van een 16 G rechte voedingsnaald bevestigd aan een spuit van 10 ml, fixeer met gemodificeerde Bouin's fixatieve buffer met behulp van een 16 G rechte voedingsnaald bevestigd aan een 10 ml spuit, snijd in de lengterichting open en rol de proximale darmen met behulp van de zwitserse roltechniek zoals eerder beschreven59.
  15. Plaats de weefsels in een histologische cassette en laat 24-48 uur bij kamertemperatuur in een container met 10% gebufferde formaline. Het volume van de formaline moet voldoende zijn om de histologische cassettes volledig te bedekken. Wanneer de incubatietijd is verstreken, brengt u met behulp van een tang de histologische cassettes over naar de container gevuld met 70% ethanol. Ga vervolgens verder met het insluiten van weefselparaffine.
    OPMERKING: Weefselparaffine-inbedding werd uitgevoerd door het Research Histology Core Laboratory aan de Stony Brook University. De procedure kan hier worden gestopt en paraffineblokken kunnen bij kamertemperatuur worden bewaard.
    LET OP: Formaline is een potentieel gevaarlijke stof: gevaar voor de gezondheid (H350, H315, H317, H318, H370) en corrosief. Formaline kan kanker, huid- en oogirritatie, schade aan organen en allergische huidreacties veroorzaken.

4. Histologische analyse

  1. Koel de histologische cassettes met de in paraffine ingebedde weefselmonsters af door ze gedurende ten minste 1 uur op ijs te plaatsen. Bereid met behulp van een microtoom 5 μm dikke secties voor kleuring. Elk weefsel moet horizontaal worden gesneden om het hele gewalste monster te bedekken.
    1. Na het snijden van het paraffineblok, breng de weefselsecties over in een waterbad opgewarmd tot 45 °C en plaats de secties op geladen dia's. Laat de dia's een nacht op kamertemperatuur op een rek liggen om te drogen.
      OPMERKING: De procedure kan hier worden gestopt en de dia's kunnen bij kamertemperatuur worden opgeslagen.
  2. Plaats de dia's in een diahouder en bak ze een nacht in een oven van 65 °C. De dia's kunnen korter worden gebakken, 1-2 uur. Dit is echter niet aan te raden in het geval van vers (minder dan 1 maand oude) gesneden dia's.
    OPMERKING: Plaats de handmatige diakleuringsset onder de chemische kap en voer de incubaties uit met xyleen, ethanol en hematoxyline onder de chemische kap.
  3. Koel de dia's de volgende dag af door ze 10 minuten in een schuifhouder onder de chemische kap te plaatsen.
  4. Deparaffineer de weefsels door de schuifhouder gedurende 3 minuten in een container gevuld met 100% xyleen te plaatsen. Herhaal de incubatie met vers 100% xyleen.
    OPMERKING: Zorg er vanaf dat moment voor dat de exemplaren te allen tijde nat worden gehouden.
    LET OP: Xyleen is een potentieel gevaarlijke stof: ontvlambaar (GHS02), veroorzaakt acute toxiciteit (GHS07) en vormt een gevaar voor de gezondheid (H226 - H304 - H312 + H332 - H315 - H319 - H335 - H373 - H412). De potentieel gevaarlijke effecten zijn dat het dodelijk is als het wordt ingeslikt of in de luchtwegen terechtkomt en huid-, oog- en ademhalingsirritatie kan veroorzaken. Bovendien kan het de motorische functies beïnvloeden door slaperigheid of duizeligheid te veroorzaken en orgaanschade veroorzaken in geval van langdurige of herhaalde blootstelling.
  5. Rehydrateer secties in een ethanolgradiënt door de schuifhouder achtereenvolgens in containers gevuld met de volgende oplossingen te plaatsen: 100% ethanol, 2 min; 95% ethanol, 2 min; 70% ethanol, 2 min.
  6. Breng de schuifhouder over in de container gevuld met gedestilleerd water en spoel gedurende 2 minuten af in stromend gedestilleerd water.
  7. Plaats de schuifhouder in een container gevuld met hematoxyline-oplossing en beits gedurende 5 minuten (onder de chemische kap).
  8. Breng de schuifhouder over in de container gevuld met leidingwater en spoel af in stromend leidingwater totdat de hematoxylinekleuring blauwachtig wordt, meestal na 2 minuten.
  9. Breng de schuifhouder over in de container gevuld met 5% (m/v) lithiumcarbonaatoplossing. Dip 10x.
    LET OP: Lithiumcarbonaat is een potentieel gevaarlijke stof: die acute toxiciteit (GHS07) en een gevaar voor de gezondheid veroorzaakt (H302 - H319). Het is schadelijk als het wordt ingeslikt, schadelijk bij contact met de huid en veroorzaakt ernstige oogirritatie.
  10. Breng de schuifhouder over in de container gevuld met gedestilleerd water en spoel gedurende 2 minuten af in stromend gedestilleerd water.
  11. Plaats de diahouder in een container gevuld met eosine en beits gedurende 5 minuten.
  12. Breng de schuifhouder over in de container gevuld met 70% ethanol en spoel kort (10 s).
  13. Droog de secties uit door de schuifhouder achtereenvolgens in de containers gevuld met ethanolgradiëntoplossingen te plaatsen: 95% ethanol, 5 dips; 100% ethanol, 5 dips.
  14. Wis de dia's door de schuifhouder gedurende 3 minuten in de container gevuld met 100% xyleen te plaatsen. Herhaal de incubatie met vers 100% xyleen.
  15. Haal de dia uit het rek, droog het gebied rond de tissues met een papieren handdoek en voeg, afhankelijk van de grootte van het monster, een druppel of twee op xyleen gebaseerd montagemedium toe aan het oppervlak van het monster. Monteer door voorzichtig een coverslip op de glazen plaat te plaatsen (pas op dat er geen luchtbellen achterblijven). Druk indien nodig zachtjes aan. Het hele oppervlak van het glas moet worden bedekt en verzegeld.
  16. Droog de dia's door ze een nacht onder de chemische kap te laten liggen. Meestal stolt het montagemedium in minder dan 24 uur. Om ervoor te zorgen dat de dia's droog zijn, kan een voorbeeldplaat worden gemaakt. Plaats met behulp van een lege dia een druppel van het montagemedium en laat het een nacht onder de chemische kap staan. Raak de volgende dag de druppel aan en controleer of deze is gestold.
  17. Wanneer de dia's uitdrogen, analyseert u de histologie van de weefsels met behulp van een lichtmicroscoop of een meer geavanceerde microscoop met een helder veldkanaal.
    1. Plaats een microscoopglaasje op het werkgebied, beweeg totdat het monster zich in het midden van het gezichtsveld bevindt, pas de focus aan met behulp van de scherpstelknop en gebruik een 10x en/of 20x vergrotingsobjectief om de histologie te analyseren in vergelijking met controleweefsels (schijnbestraling).
    2. Als de microscoop is uitgerust met een camera, maak dan ook foto's.
      OPMERKING: De procedure kan hier worden gestopt; De dia's kunnen bij kamertemperatuur worden bewaard en later worden geanalyseerd. Bewaar de dia's niet langer dan 30 dagen, omdat de vlekken langzaam vervagen.

5. Immunofluorescentiekleuring

  1. Koel de histologische cassettes met in paraffine ingebedde weefselmonsters af door ze gedurende ten minste 1 uur op ijs te plaatsen. Bereid met behulp van een microtoom 5 μm dikke secties voor kleuring. Elk weefsel moet horizontaal worden gesneden om het hele gewalste monster te bedekken.
    1. Nadat u het paraffineblok hebt gesneden, brengt u de weefselsecties over in een waterbad dat is opgewarmd tot 45 °C en plaatst u de secties op geladen dia's. Laat de dia's een nacht op kamertemperatuur op een rek liggen om te drogen.
      OPMERKING: De procedure kan hier worden gestopt en de dia's kunnen bij kamertemperatuur worden opgeslagen.
  2. Plaats de dia's in een diahouder en bak ze een nacht in een oven van 65 °C. De dia's kunnen korter worden gebakken, 1-2 uur. Dit is echter niet aan te raden in het geval van vers (minder dan 1 maand geleden) gesneden dia's.
    OPMERKING: Plaats de handmatige diakleuringsset onder de chemische kap en voer de incubaties uit met xyleen, ethanol en H2 O2/methanol onder de chemische kap.
  3. Koel de dia's de volgende dag af door ze 10 minuten in een schuifhouder onder de chemische kap te plaatsen.
  4. Deparaffineer de weefsels door de schuifhouder gedurende 3 minuten in een container gevuld met 100% xyleen te plaatsen. Herhaal de incubatie met vers 100% xyleen.
    OPMERKING: Zorg er vanaf dat moment voor dat de exemplaren te allen tijde nat worden gehouden.
  5. Blus endogene peroxidase door de dia's gedurende 30 minuten te incuberen in een container gevuld met 2% waterstofperoxide-oplossing in methanol onder de chemische kap.
    LET OP: Methylalcohol is een potentieel gevaarlijke stof: gevaar voor de gezondheid (H225-H301, H311, H331-H370), ontvlambaar (GHS02) en veroorzaakt acute toxiciteit (oraal, dermaal, inademing) (GHS08). Waterstofperoxide is een potentieel gevaarlijke stof: corrosief (GHS05) en veroorzaakt acute toxiciteit (GHS07).
  6. Rehydrateer de secties in een ethanolgradiënt door de schuifhouder achtereenvolgens in containers te plaatsen die zijn gevuld met de volgende oplossingen: 100% ethanol, 3 min; 95% ethanol, 3 min; 70% ethanol, 3 min.
  7. Breng de diahouder over in een container gevuld met gedestilleerd water en spoel gedurende 2 minuten af in stromend gedestilleerd water.
  8. Om de antigenen op te halen, brengt u de schuifhouder over in een container met 250 ml citraatbufferoplossing (10 mM natriumcitraat, 0,05% Tween-20, pH 6,0) en kookt u gedurende 10 minuten op 110 °C met behulp van een ontcloakingskamer.
  9. Breng de hele container over naar de koelruimte en laat geleidelijk afkoelen in de loop van 30 minuten.
  10. Vervang na 30 minuten de citraatbufferoplossing door gedestilleerd water en spoel af in stromend gedestilleerd water totdat alle drijvende paraffinestukken zijn verwijderd.
  11. Haal de dia's uit de houder (één voor één), tik op een papieren handdoek en droog het gebied rond het monster voorzichtig af met een papieren handdoek. Teken een gesloten vorm rond het monster met behulp van een pen die een hydrofobe barrière (PAP-pen) biedt. Plaats in een bevochtigde kamer.
  12. Blokkeer met 5% runderserumalbumine (BSA) in TBS-Tween door 200 μL van de oplossing toe te voegen aan het oppervlak van een monster. Zorg ervoor dat er geen lekkage is. Incubeer bij 37 °C in een bevochtigde kamer gedurende 30 minuten.
  13. Verwijder de blokkerende oplossing door op de glazen plaat op een papieren handdoek te tikken. Plaats terug in een bevochtigde kamer. Voeg 100 μL van de juiste concentratie van de primaire antilichamen geresuspendeerd toe in een blokkerende buffer en incubeer bij 4 °C met zacht schommelen gedurende een nacht. Gebruik voor BMI1/EYFP kip anti-GFP (verdunning 1:500); gebruik voor Ki-67 konijn anti-Ki-67 (verdunning 1:200).
  14. Verwijder de antilichaamoplossing door op de glazen plaat op een papieren handdoek te tikken; plaats de dia's in een diahouder en breng ze over naar de container gevuld met TBS-Tween. Was de dia's met schudden gedurende 5 min. Herhaal 3x. Gebruik elke keer een nieuw deel van de TBS-Tween-buffer.
  15. Haal de dia's uit de houder (één voor één), verwijder overtollige wasoplossing door op de glazen plaat op een papieren handdoek te tikken en plaats ze in een bevochtigde kamer. Voeg 100 μl van de juiste concentratie secundaire antilichamen geresuspendeerd in een blokkerende buffer toe en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C. Secundaire antilichamen moeten worden geconjugeerd met een fluorofoor. Gebruik voor BMI1/EJFPP ezel anti-kip Alexa Fluor 647 (verdunning 1:500); gebruik voor Ki-67 geiten anti-konijn Alexa Fluor 488 (verdunning 1:500).
  16. Verwijder de antilichaamoplossing door op de glazen plaat op een papieren handdoek te tikken; plaats de dia's in een diahouder en breng ze over naar de container gevuld met TBS-Tween. Was de dia's met schudden gedurende 5 min. Herhaal 3x. Gebruik elke keer een nieuw deel van de TBS-Tween-buffer.
  17. Haal de dia's uit de houder (één voor één), verwijder overtollige wasoplossing door op de glazen plaat op een papieren handdoek te tikken en plaats ze in een bevochtigde kamer. Voeg 100 μL van de EdU-kleuringsoplossing toe, bereid volgens de instructies van de fabrikant en met Alexa Fluor 555 fluorofoor.
  18. Verwijder de EdU-oplossing door op de glazen plaat op een papieren handdoek te tikken; plaats de dia's in een diahouder en breng ze over naar de container gevuld met TBS-Tween. Was de dia's met schudden gedurende 5 min. Herhaal 2x. Gebruik elke keer een nieuw deel van de TBS-Tween-buffer.
  19. Haal de dia's uit de houder (één voor één); Verwijder overtollige wasoplossing door op de glazen plaat op een papieren handdoek te tikken en in een bevochtigde kamer te plaatsen. Voer Hoechst 33258 counterstaining uit door 100 μL van de Hoechst 33258-oplossing (verdunning 1:1000 in TBS-Tween) toe te voegen aan het oppervlak van het monster. Incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
  20. Verwijder de Hoechst 33258-oplossing door op de glasplaat op een papieren handdoek te tikken; plaats de dia's in een diahouder en breng ze over naar een container gevuld met TBS-Tween. Was de dia's met schudden gedurende 5 minuten.
  21. Haal de dia uit de diahouder, droog het gebied rond de tissues met een papieren handdoek en voeg, afhankelijk van de grootte van het monster, een druppel of twee aquagebaseerd montagemedium toe aan het oppervlak van het monster. Monteer door voorzichtig een coverslip op de glazen plaat te plaatsen (pas op dat er geen luchtbellen achterblijven). Druk indien nodig zachtjes aan. Het hele oppervlak van het glas moet worden bedekt en verzegeld.
  22. Droog de dia's door ze een nacht in het donker op kamertemperatuur te laten staan. Doorgaans stolt het montagemedium in minder dan 24 uur. Om ervoor te zorgen dat de dia's droog zijn, kan een voorbeeldplaat worden gemaakt. Gebruik een lege dia; Plaats een druppel van het montagemedium en laat een nacht onder de chemische kap staan. Raak de volgende dag de druppel aan en controleer of deze is gestold.
  23. Wanneer de dia's uitdrogen, kunnen gekleurde weefsels worden geanalyseerd met behulp van een fluorescentiemicroscoop uitgerust met emissiegolflengtefilters die de visualisatie van Ki-67, EdU en BMI1 / EYFP-kleuring mogelijk maken (respectievelijk 535 nm, 646 nm en 700 nm).
  24. Plaats een microscoopglaasje op het werkgebied, beweeg totdat het monster zich in het midden van het gezichtsveld bevindt, pas de scherpstelling aan met de scherpstelknop en gebruik de 10x en/of 20x vergrotingsobjectieflens om de kleuring te analyseren in vergelijking met controleweefsels (schijnbestraling). Als de microscoop is uitgerust met een camera, kunnen er ook foto's worden gemaakt. Maak afbeeldingen voor elk kanaal afzonderlijk en voeg later samen.
    OPMERKING: De procedure kan hier worden gestopt; de dia's kunnen bij 4 °C worden bewaard en later worden geanalyseerd. Bewaar de dia's niet langer dan 14 dagen, omdat de vlekken langzaam vervagen.

6. TUNEL vlekken

  1. Koel de histologische cassettes met in paraffine ingebedde weefselmonsters af door ze gedurende ten minste 1 uur op ijs te plaatsen. Bereid met behulp van een microtoom 5 μm dikke secties voor kleuring. Elk weefsel moet horizontaal worden gesneden om het hele gewalste monster te bedekken.
    1. Na het snijden van het paraffineblok, breng de weefselsecties over in een waterbad opgewarmd tot 45 °C en plaats de secties op geladen dia's. Laat de dia's een nacht op kamertemperatuur op een rek liggen om te drogen.
      OPMERKING: De procedure kan hier worden gestopt en de dia's kunnen bij kamertemperatuur worden opgeslagen.
  2. Plaats de dia's in een diahouder en bak ze een nacht in een oven van 65 °C.
    OPMERKING: De dia's kunnen worden gebakken voor een kortere tijd, 1-2 uur. Het is echter niet aan te raden in het geval van vers (minder dan 1 maand geleden) gesneden dia's. Plaats de handmatige schuifkleuringsset onder de chemische kap en voer de incubaties uit met xyleen en ethanol onder de chemische kap.
  3. Koel de dia's de volgende dag af door ze 10 minuten in een schuifhouder onder de chemische kap te plaatsen.
  4. Deparaffineer de weefsels door de diahouder gedurende 3 minuten in een container gevuld met 100% xyleen te plaatsen. Herhaal de incubatie met vers 100% xyleen.
    OPMERKING: Zorg er vanaf dit punt voor dat de monsters te allen tijde nat worden gehouden.
  5. Rehydrateer de secties in een ethanolgradiënt door de diahouder achtereenvolgens in containers gevuld met de volgende oplossingen te plaatsen: 100% ethanol, 3 min; 95% ethanol, 3 min; 90% ethanol, 3 min; 80% ethanol, 3 min; 70% ethanol, 3 min.
  6. Breng de schuifhouder over in een container gevuld met gedestilleerd water en spoel gedurende 1 minuut af in stromend gedestilleerd water.
  7. Haal de dia's uit de houder (één voor één), tik op een papieren handdoek en droog het gebied rond het monster voorzichtig af met een papieren handdoek. Teken een gesloten vorm rond het monster met behulp van een pen die een hydrofobe barrière (PAP-pen) biedt. Plaats in een bevochtigde kamer.
  8. Incubeer met DNase-vrije proteinase K. Voeg 100 μL van de DNase-vrije proteinase K-oplossing (verdunning 1:25 in DPBS) toe aan het oppervlak van het monster binnen de hydrofobe barrière. Incubeer bij kamertemperatuur in een bevochtigde kamer gedurende 15 minuten.
    LET OP: Proteïnase K is een potentieel gevaarlijke stof: Gevaar voor de gezondheid (H315 - H319 - H334).
  9. Verwijder de proteïnase K-oplossing door op de glazen plaat op een papieren handdoek te tikken; plaats de dia's in een diahouder en breng ze over naar de container gevuld met DPBS. Was de dia's met schudden gedurende 5 min. Herhaal 2x. Gebruik elke keer een verse portie DPBS.
  10. Bereid het TUNEL-reactiemengsel: Meng de etiketoplossing (1x) met de enzymoplossing (10x). Pipetteer goed.
  11. Haal de dia's uit de houder (één voor één); Verwijder overtollige wasoplossing door op de glazen plaat op een papieren handdoek te tikken en in een bevochtigde kamer te plaatsen. Voeg 50 μL TUNEL-reactiemengsel toe aan het oppervlak van het monster en incubeer in het donker bij 37 °C in een bevochtigde kamer gedurende 60 minuten. Gebruik voor een negatieve controle alleen de labeloplossing (zonder TdT).
  12. Verwijder de TUNEL-oplossing door op de glazen plaat op een papieren handdoek te tikken; plaats de dia's in een diahouder en breng ze over naar een container gevuld met DPBS. Was de dia's met schudden gedurende 5 min. Herhaal 2x. Gebruik elke keer een verse portie DPBS.
  13. Haal de dia's uit de houder (één voor één); Verwijder overtollige wasoplossing door op de glazen plaat op een papieren handdoek te tikken en in een bevochtigde kamer te plaatsen. Voer Hoechst 33258 counterstaining uit door 100 μL van de Hoechst 33258-oplossing (verdunning 1:1000 in TBS-Tween) toe te voegen aan het oppervlak van het monster. Incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
  14. Verwijder de Hoechst 33258-oplossing door op de glazen plaat op een papieren handdoek te tikken; plaats de dia's in een diahouder en breng ze over naar de container gevuld met DPBS. Was de dia's met schudden gedurende 5 minuten.
  15. Haal de dia uit de schuifhouder; Droog het gebied rond de tissues met een papieren handdoek en voeg, afhankelijk van de grootte van het monster, een druppel of twee aquagebaseerd montagemedium toe aan het oppervlak van het monster. Monteer door voorzichtig een coverslip op de glazen plaat te plaatsen (pas op dat er geen luchtbellen achterblijven). Druk indien nodig zachtjes aan. Het hele oppervlak van het glas moet worden bedekt en verzegeld.
  16. Droog de dia's door ze een nacht in het donker op kamertemperatuur te laten staan. Meestal stolt het montagemedium in minder dan 24 uur. Om ervoor te zorgen dat de dia's droog zijn, kan een voorbeeldplaat worden gemaakt. Plaats een druppel van het bevestigingsmedium en laat het een nacht in het donker op kamertemperatuur staan. Raak de volgende dag de druppel aan en controleer of deze is gestold.
  17. Wanneer de dia's uitdrogen, kunnen gekleurde weefsels worden geanalyseerd met behulp van een fluorescentiemicroscoop uitgerust met emissiegolflengtefilters die de visualisatie van TUNEL-kleuring (535 nm) mogelijk maken.
  18. Plaats een microscoopglaasje op het werkgebied, beweeg totdat het monster zich in het midden van het gezichtsveld bevindt, pas de scherpstelling aan met de scherpstelknop en gebruik een 10x en/of 20x vergrotingsobjectief om de kleuring te analyseren in vergelijking met controleweefsels (schijnbestraling). Als de microscoop is uitgerust met een camera, kunnen er ook foto's worden gemaakt. Maak afbeeldingen voor elk kanaal afzonderlijk en voeg later samen.
    OPMERKING: De procedure kan hier worden gestopt; dia's kunnen bij 4 °C worden bewaard en later worden geanalyseerd. Bewaar de dia's niet langer dan 14 dagen, omdat de vlekken langzaam vervagen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het gebruik van 12 Gy total-body bestraling (TBI) in combinatie met murine genetische afstamming tracing maakt een grondige analyse van de gevolgen van stralingsletsel in de darm mogelijk. Om te beginnen, Bmi1-CreER; Rosa26eYFP-muizen kregen een enkele tamoxifeninjectie, die een verbeterde gele fluorescerende eiwit (EYFP) expressie induceert binnen een Bmi1 + reservestamcelpopulatie. Twee dagen na de tamoxifeninjectie ondergingen de muizen bestraling of schijnbestraling. Drie uur voor euthanasie werden de muizen geïnjecteerd met EdU. Na euthanasie werden dunne darmmonsters verzameld voor analyse op 0 h, 3 h, 6 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h en 7 dagen na bestraling. Representatieve hematoxyline- en eosinebeelden (H&E) (figuur 1) uit het bovengenoemde tijdsverloop illustreren de intestinale epitheelrespons op letsel. Het tijdstip van 0 uur is illustratief voor homeostatisch darmepitheel (figuur 1); dit wordt gevolgd door de apoptotische fase - gekenmerkt door een verlies van cellen in crypte compartimenten tussen 3 h en 48 h (figuur 1). Daarna volgt de regeneratieve fase, waarbij zeer proliferatieve cellen te vinden zijn die de crypten bevolken tussen 72 h en 96 h (figuur 1). Ten slotte leidt dit tot de normalisatiefase, hier weergegeven door het 7-daagse tijdspunt (figuur 1).

Figuur 2 illustreert veranderingen in de proliferatieve status van intestinale cryptcellen beoordeeld door immunofluorescente kleuring van EdU (marker van cellen in S-fase) en Ki-67 (marker van cellen in G1-, S- en G2 / M-fasen), terwijl lineage tracing (EYFP + -cellen) cellen markeert die afkomstig zijn van Bmi1 + reservestamcellen. Tijdens homeostase (figuur 2, 0 h sham) zijn de Bmi1+-positieve cellen gemarkeerd door de expressie van EYFP beperkt tot de +4-+6 positie in crypten. Tijdens de apoptotische fase (24 uur en 48 uur) nemen EYFP-positieve cellen in aantal af (figuur 2). De regeneratieve fase (72 uur en 96 uur) wordt gekenmerkt door snel prolifererende Bmi1+-positieve cellen en hun voorlopers (figuur 2); 7 dagen na bestraling hebben verdere proliferatie en migratie de darmcryptecellen aangevuld en de integriteit van het darmepitheel hersteld (figuur 2).

Bij schijnbestraalde muizen (controle) kleuren EdU- en Ki-67-kleuren EYFP-negatieve proliferatieve cellen van de darmcrypten, typisch voor normale darmhomeostase, die zich uitstrekken van actieve stamcellen tot de transitversterkende zone (figuur 2). Stralingsschade veroorzaakt een verlies van zeer proliferatieve cellen tijdens de apoptotische fase, zoals blijkt uit de vermindering van EdU- en Ki-67-kleuring (figuur 2). De activering van reservestamcellen (in dit voorbeeld markeerde EYFP Bmi1 + positieve cellen) en hun proliferatie resulteren in een toename van EdU- en Ki-67-positieve cellen die duidelijk zichtbaar zijn op 72 h en 96 h na letsel, waar crypten bijna uitsluitend bestaan uit cellen die samen met EYFP, EdU en Ki-67 zijn gekleurd. De waargenomen proliferatieniveaus normaliseren 7 dagen na het letsel (figuur 2).

Om apoptose veroorzaakt door stralingsschade te illustreren, werd TUNEL-kleuring uitgevoerd en representatieve afbeeldingen zijn opgenomen in figuur 3. Tijdens homeostase (figuur 3) ondergaan weinig cellen apoptose, typerend voor de normaal gesproken snelle intestinale epitheelomzet. Een duidelijke toename van TUNEL-kleuring kan worden waargenomen laat in de apoptotische fase (24 uur en 48 uur) na bestraling (figuur 3). Tijdens de regeneratieve fase neemt de TUNEL-kleuring gestaag af in de regenererende crypten en is opnieuw bijna afwezig wanneer de crypten zijn genormaliseerd (figuur 3). Het gepresenteerde protocol beschrijft een eenvoudige en toegankelijke immunofluorescente kleuringsmethode met behulp van een eenvoudige en veel gebruikte combinatie van etiketteringstechnieken (TUNEL, EdU, Ki-67, EYFP) die inzicht kan geven in het gedrag van darmcellen na letsel (hier bestraling). Deze benadering kan worden gebruikt om de mechanismen te bestuderen die regeneratieve processen in het darmepitheel in specifieke omstandigheden reguleren. Het gebruik van deze en soortgelijke benaderingen zal alternatieve regeneratieve processen na verschillende intestinale beledigingen verlichten en verder het onderzoek van therapeutische strategieën voor het voorkomen van verlies van barrièrefunctie mogelijk maken.

Figure 1
Figuur 1: Representatieve beelden van hematoxyline en eosine (H&E)-gekleurde delen van dunne darmweefsels na een tijdsverloop na totale lichaamsbestraling. Bmi1-CreER; Rosa26eYFP-muizen kregen één dosis tamoxifen 2 dagen vóór 12 Gy totale lichaamsbestraling of schijnbestraling. Muizen werden geofferd en dunne darmweefsels werden verzameld op tijdstippen die in de figuur worden aangegeven. Alle foto's zijn gemaakt met een vergroting van 10x. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Representatieve beelden van immunofluorescente kleuring van dunne darmsecties na bestraling. Bmi1-CreER; Rosa26eYFP-muizen kregen één dosis tamoxifen 2 dagen vóór 12 Gy totale lichaamsbestraling of schijnbestraling. Muizen werden geofferd en dunne darmweefsels werden verzameld op tijdstippen die in de figuur worden aangegeven. Weefselsecties werden gekleurd met EdU om cellen in S-fase (roze) te markeren en met Ki-67 om cellen in G0-, S- en G2 / M-fasen (geel) te markeren. EYFP (groen) markeert Bmi1+ cellen en hun voorlopers en demonstreert afstammingstracering. De secties werden verder gecounterd met DAPI (blauw) om kernen te visualiseren. De gegevens worden weergegeven als samengevoegde afbeeldingen bij 10x vergroting en inzetstukken van individuele vlekken bij 20x vergroting (deze zijn afkomstig van 10x afbeeldingen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Representatieve beelden van immunofluorescente TUNEL-kleuring van dunne darmsecties bij bestraling. Bmi1-CreER; Rosa26eYFP-muizen kregen één dosis tamoxifen 2 dagen vóór 12 Gy totale lichaamsbestraling of schijnbestraling. Muizen werden geofferd en dunne darmweefsels werden verzameld op tijdstippen die in de figuur worden aangegeven. TUNEL (rood) kleurt apoptotische cellen. Deze beelden werden gecounterd met DAPI (blauw) om kernen te visualiseren. De getoonde beelden zijn gemaakt met een vergroting van 20x. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit protocol beschrijft een robuust en reproduceerbaar stralingsschademodel. Het maakt de nauwkeurige analyse mogelijk van de veranderingen in het darmepitheel in de loop van 7 dagen na het letsel. Belangrijk is dat de geselecteerde tijdstippen cruciale stadia van letsel weerspiegelen en worden gekenmerkt door duidelijke veranderingen in de darm (letsel, apoptose, regeneratie en normalisatiefasen)60. Dit bestralingsmodel is vastgesteld en zorgvuldig beoordeeld, wat een geschikte manifestatie van letsel aantoont om die te bootsen die wordt ervaren door patiënten die radiotherapie ondergaan61. Meer dan de helft van de patiënten met colorectale kanker en gynaecologische kankers ondergaat abdominale radiotherapie 40,62,63. Ondanks geavanceerde methoden voor gerichte radiotherapie, ervaren patiënten bestraling van gezond darmweefsel, wat pathofysiologie produceert die sterk lijkt op die waargenomen met het hier gepresenteerde bestralingsmodel voor het totale lichaam. Daarom kan het hierin beschreven stralingsmodel mogelijk de gevolgen van accidentele blootstelling aan straling van patiënten en/of medisch personeel aanpakken en is het dus van vitaal belang voor de menselijke gezondheid.

De Bmi1-CreER; Rosa26eYFP muizenmodel draagt tamoxifen-induceerbare Cre onder de transcriptionele controle van de muis Bmi1 (Bmi1 polycomb ringvinger oncogen) promotor. Bovendien dragen deze muizen een R26-stop-EYFP-sequentie, waarbij het STOP-codon wordt geflankeerd door loxP-zijden gevolgd door het Enhanced Yellow Fluorescent Protein-gen (EYFP) dat is ingebracht in de Gt (ROSA) 26Sor-locus. De expressie van EYFP wordt geblokkeerd door een stroomopwaartse loxP-geflankeerde STOP-sequentie, maar kan worden geactiveerd door tamoxifen-geïnduceerde, Cre-gemedieerde gerichte deleties, waardoor afstammingstracering van Bmi1-tot expressie brengende cellen mogelijk is, een reservestamcelspecifieke subpopulatie van cryptcellen. Het stralingsprotocol in combinatie met de Bmi1-CreER; Rosa26eYFP-muizenmodel is eerder gebruikt om de rol van transcriptiefactoren bij het reguleren van darmregeneratiete bestuderen 18,56. De representatieve resultaten in figuur 1 tot en met figuur 3 laten resultaten zien die vergelijkbaar zijn met die in recente publicaties18,56.

Van belang, Bmi1-CreER; Rosa26eYFP-muizen zijn slechts een van de vele transgene diermodellen die worden gebruikt om darmregeneratie te bestuderen. Andere murine lineage tracing modellen zijn gecombineerd met straling om de rol van specifieke cellen en routes in de regeneratieve capaciteit van het darmepitheel aan te tonen18,26,32,33,34,35,36,37,56,64,65,66,66,67 . Deze modellen zijn ontworpen om de rol van verschillende populaties van gereserveerde stamcellen te onderzoeken, de voorlopers van secretoire en enterocytenlijnen te onderzoeken en de functie van specifieke genen binnen elke subpopulatie van de darmepitheelcellen te bestuderen. Gecombineerde resultaten van deze onderzoeken zullen helpen om het begrip van het regeneratieve vermogen van het darmepitheel uit te breiden.

Belangrijk is dat deze techniek, met kleine aanpassingen, het mogelijk moet maken om de relaties tussen microbiota en verschillende epitheel-, stromale en immuuncelpopulaties bij stralingsletsel te onderzoeken. De introductie van verschillende afstammingstracerende diermodellen zal de studie van real-time gedrag en de interactie van verschillende subpopulaties van cellen na letsel mogelijk maken. Als alternatief kan de kleuring van weefsels worden vervangen door RNA-sequencing, single-cell RNA-sequencing, fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) of proteomische analyse om meer diepgaande kennis te vergaren over de rol van specifieke cellijnen tijdens intestinale regeneratie na letsel68,69. Dit letselmodel kan worden gebruikt om nieuwe behandelingsmodaliteiten te testen die bedoeld zijn om de bijwerkingen van bestraling te minimaliseren, de hersteltijd te verkorten en de kwaliteit van de patiëntenzorg te verbeteren70. Hoewel het hier beschreven stralingsmodel kan dienen als een nuttig hulpmiddel om de regeneratie van het darmepitheel te bestuderen, heeft het ook verschillende beperkingen. De totale lichaamsstralingsdosis resulteert steevast in het daaropvolgende hematopoietische syndroom, wat het onderzoek naar darmregeneratie belemmert. Dit kan worden voorkomen door beenmergtransplantatie. Verder kan de wijziging van een abdominaal letselprotocol mogelijk enkele van de bijwerkingen van de bestraling verbeteren71. Dit model vereist echter aanvullende stappen die de darmrespons op het letsel kunnen beïnvloeden (bijv. Anesthesie). Overigens produceert abdominale straling stralingsgeïnduceerd gastro-intestinaal syndroom (RIGS) zonder hematopoietisch syndroom, verschillend van bestraling van het hele lichaam (WBI), in die zin dat WBI vergelijkbare GI-symptomen produceert, maar gedeeltelijk verlies van hematopoietische functie omvat na letsel71,72.

Van belang is dat genetisch gemanipuleerde diermodellen zoals die in dit protocol worden beschreven, geavanceerd zijn en de afstamming van specifieke cellen mogelijk maken. Deze modellen, hoewel zeer voordelig, vereisen echter extra inspanning om te onderhouden. Transgene diermodellen die voorwaardelijke gendeleties mogelijk maken, zijn moeilijk te genereren en hun tijdige deletie bij letsel kan niet gemakkelijk worden bereikt. Bovendien laten de meeste transgene modellen alleen een voorwaardelijke deletie of inactivatie van een interessant gen toe, maar zijn ze niet induceerbaar en zijn ze dus niet in staat om de genfunctie te herstellen en kunnen ze de studies belemmeren. Bovendien vereisen transgene diermodellen meestal behandeling met extra chemicaliën (bijv. Tamoxifen, doxycycline) om inactivatie of overexpressie van het gen van belang te bereiken. Behandelingen met deze stoffen kunnen tot op zekere hoogte de reactie van het darmepitheel veranderen of de ernst van het letsel vergroten 73,74,75,76. Bovendien kan de inductie van afstammingstracering door tamoxifen dichter bij het tijdstip van stralingsletsel worden geïntroduceerd om de etikettering van de cellen die betrokken zijn bij regeneratie te verbeteren (bijv. 6-24 uur vóór het letsel). Het is dus mogelijk om een transgeen model te vervangen door wild-type muizen en een combinatie van IF-kleuring (bijv. Ki-67, PCNA, EdU, TUNEL, Caspase 3). Dit model maakt de analyse van de regeneratieve capaciteit van de darm mogelijk, hoewel het de studie van een specifieke subpopulatie van de cellen niet toestaat.

Het protocol dat in dit manuscript wordt beschreven, heeft verschillende cruciale stappen. Het is van het grootste belang om ervoor te zorgen dat gezonde muizen worden gebruikt voor experimenten, omdat ze worden blootgesteld aan straling en behandeling met chemicaliën. Als experimenten met verschillende muizengroepen dagen, weken of maanden na elkaar worden uitgevoerd, is het een goede gewoonte om dezelfde tijdlijn aan te houden, bijvoorbeeld tamoxifeninjecties op hetzelfde tijdstip van de dag. Het bestralingsproces moet snel worden uitgevoerd en muizen moeten onmiddellijk worden teruggebracht naar hun oorspronkelijke kooien. Bovendien kan het verstrekken van onthard voedsel en veel water helpen om enkele van de nadelige effecten van straling te verbeteren. De swiss-roll-techniek wordt voorgesteld om een uitgebreide analyse van het darmweefsel mogelijk te maken59. Deze techniek is niet triviaal en eerdere try-outs moeten worden gedaan om ervoor te zorgen dat een onberispelijke kwaliteit van het weefsel voor kleuring wordt bereikt. Alle oplossingen voor muizenexperimenten en kleuring moeten vers worden bereid en onder de juiste omstandigheden worden bewaard. Bij het werken met antilichamen is het belangrijk om dia's te testen met behulp van positieve en negatieve controles en, indien mogelijk, antilichamen te gebruiken met hetzelfde catalogusnummer en lotnummer. Immunofluorescentieglaasjes moeten bij 4 °C worden bewaard en binnen 1 week na bereiding in beeld worden gebracht. Langdurige opslag, zelfs bij −20 °C, kan leiden tot signaalverlies. H&E-dia's kunnen bij kamertemperatuur worden bewaard, omdat er geen zorgen zijn over verlies van fluorofoorstabiliteit.

Samenvattend is het hier gepresenteerde lineage-tracing radiation injury model een reproduceerbaar en relevant model om het lot van darmcellen na belediging te volgen en kan het worden gecombineerd met diverse muizenmodellen en moleculaire technieken om het begrip van de pathofysiologie van het darmepitheel te verbeteren. Inzicht in de moleculaire en cellulaire mechanismen die de regeneratie van intestinale epitheel regelen, kan leiden tot de ontwikkeling van nieuwe behandelingen en nuttige therapeutische interventies.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten.

Acknowledgments

De auteurs willen de Stony Brook Cancer Center Histology Research Core erkennen voor deskundige hulp bij de voorbereiding van weefselmonsters en de afdeling Laboratory Animal Resources aan de Stony Brook University voor hulp bij de verzorging en behandeling van dieren. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health DK124342 toegekend aan Agnieszka B. Bialkowska en DK052230 aan Dr. Vincent W. Yang.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe BD 309659 -
16G Reusable Small Animal Feeding Needles: Straight VWR 20068-630 -
27G x 1/2" needle BD 305109 -
28G x 1/2" Monoject 1mL insulin syringe Covidien 1188128012 -
5-Ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) Santa Cruz Biotechnology sc284628A 10 mg/mL in sterile DMSO:water (1:4 v/v), aliquot and store in -20°C
Azer Scientific 10% Neutral Buffered Formalin Fisher Scientific 22-026-213 -
B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J The Jackson Laboratory Strain #:006148
B6;129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/J The Jackson Laboratory Strain #:010531
Bovine Serum Albumin Fraction V, heat shock Millipore-Sigma 3116956001
Chicken anti-GFP Aves GFP-1020
Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 imaging kit, Invitrogen Thermo Fisher Scientific C10638 -
Corn oil Millipore-Sigma C8267 -
Decloaking Chamber Biocare Medical DC2012 -
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher BioReagents BP231-100 light sensitive
DNase-free proteinase K Invitrogen C10618H diluted 25x in DPBS
Donkey anti-chicken AF647 Jackson ImmunoResearch 703-605-155
DPBS Fisher Scientific 21-031-CV -
Eosin Fisher Scientific S176
Fluorescence Microscope Nikon Eclipse 90i Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20X Nikon
Fluoromount Aqueous Mounting Medium Millipore-Sigma F4680-25ML
Gamma Cell 40 Exactor Best Theratronics Ltd. - 0.759 Gy min-1
Goat anti-rabbit AF488 Jackson ImmunoResearch 111-545-144
Hematoxylin Solution, Gill No. 3 Millipore-Sigma GHS332
HM 325 Rotary Microtome from Thermo Scientific Fisher Scientific 23-900-668
Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) Thermo Fisher Scientific H3569 dilution 1:1000
Hydrogen Peroxide Solution, ACS, 29-32%, Spectrum Chemical Fisher Scientific 18-603-252 -
In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche) Millipore-Sigma 11684795910
Liquid Blocker Super PAP PEN, Mini Fisher Scientific DAI-PAP-S-M
Lithium Carbonate (Powder/Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific L119-500 0.5g/1L dH2O
Luer-Lok Syringe sterile, single use, 10 mL VWR 89215-218 -
Methanol VWR BDH1135-4LP
Pharmco Products Ethyl alcohol, 200 PROOF Fisher Scientific NC1675398 -
Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Acetic Acid ACS Grade Capitol Scientific AAP-281000ACSCSLT -
Rabbit anti-Ki67 BioCare Medical CRM325
Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Mounting Medium Fisher Scientific 22-050-262
Scientific Industries Incubator-Genie for baking slides at 65 degree Fisher Scientific 50-728-103
Sodium Citrate Dihydrate Fisher Scientific S279-500
Stainless Steel Dissecting Kit VWR 25640-002
Superfrost Plus micro slides [size: 25 x 75 x 1 mm] VWR  48311-703
Tamoxifen Millipore-Sigma T5648 30 mg/mL in sterile corn oil, preferably fresh or short-sterm storage in -20°C, light sensitive
Tissue-Tek 24-Slide Holders with Detachable Handle Sakura 4465
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Blades Sakura 4689
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set Sakura 4451
Tissue-Tek Staining Dish, Green with Lid Sakura 4456
Tissue-Tek Staining Dish, White with Lid Sakura 4457
Tween 20 Millipore-Sigma P7949
Unisette Processing Cassettes VWR 87002-292 -
VWR Micro Cover Glasses VWR 48393-081
Xylene Fisher Scientific X5P-1GAL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Helander, H. F., Fandriks, L. Surface area of the digestive tract - Revisited. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 49 (6), 681-689 (2014).
  2. vander Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annual Review of Physiology. 71, 241-260 (2009).
  3. Clevers, H. The intestinal crypt, a prototype stem cell compartment. Cell. 154 (2), 274-284 (2013).
  4. Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
  5. Yan, K. S., et al. The intestinal stem cell markers Bmi1 and Lgr5 identify two functionally distinct populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (2), 466-471 (2012).
  6. Liao, Z., Hu, C., Gao, Y. Mechanisms modulating the activities of intestinal stem cells upon radiation or chemical agent exposure. Journal of Radiation Research. 63 (2), 149-157 (2022).
  7. Meyer, A. R., Brown, M. E., McGrath, P. S., Dempsey, P. J. Injury-Induced Cellular Plasticity Drives Intestinal Regeneration. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 13 (3), 843-856 (2022).
  8. Owens, B. M., Simmons, A. Intestinal stromal cells in mucosal immunity and homeostasis. Mucosal Immunology. 6 (2), 224-234 (2013).
  9. Barker, N. Adult intestinal stem cells: Critical drivers of epithelial homeostasis and regeneration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 19-33 (2014).
  10. Cheng, H., Origin Leblond, C. P. differentiation and renewal of the four main epithelial cell types in the mouse small intestine. V. Unitarian Theory of the origin of the four epithelial cell types. The American Journal of Anatomy. 141 (4), 537-561 (1974).
  11. Sender, R., Milo, R. The distribution of cellular turnover in the human body. Nature Medicine. 27 (1), 45-48 (2021).
  12. Metcalfe, C., Kljavin, N. M., Ybarra, R., de Sauvage, F. J. Lgr5+ stem cells are indispensable for radiation-induced intestinal regeneration. Cell Stem Cell. 14 (2), 149-159 (2014).
  13. Tian, H., et al. A reserve stem cell population in small intestine renders Lgr5-positive cells dispensable. Nature. 478 (7368), 255-259 (2011).
  14. Tirado, F. R., et al. Radiation-induced toxicity in rectal epithelial stem cell contributes to acute radiation injury in rectum. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 63 (2021).
  15. Tetteh, P. W., Farin, H. F., Clevers, H. Plasticity within stem cell hierarchies in mammalian epithelia. Trends in Cell Biology. 25 (2), 100-108 (2015).
  16. Breault, D. T., et al. Generation of mTert-GFP mice as a model to identify and study tissue progenitor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (30), 10420-10425 (2008).
  17. Montgomery, R. K., et al. Mouse telomerase reverse transcriptase (mTert) expression marks slowly cycling intestinal stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (1), 179-184 (2011).
  18. Orzechowska, E. J., Katano, T., Bialkowska, A. B., Yang, V. W. Interplay among p21(Waf1/Cip1), MUSASHI-1 and Kruppel-like factor 4 in activation of Bmi1-Cre(ER) reserve intestinal stem cells after gamma radiation-induced injury. Scientific Reports. 10 (1), 18300 (2020).
  19. Takeda, N., et al. Interconversion between intestinal stem cell populations in distinct niches. Science. 334 (6061), 1420-1424 (2011).
  20. Wong, V. W., et al. Lrig1 controls intestinal stem-cell homeostasis by negative regulation of ErbB signalling. Nature Cell Biology. 14 (4), 401-408 (2012).
  21. Powell, A. E., et al. The pan-ErbB negative regulator Lrig1 is an intestinal stem cell marker that functions as a tumor suppressor. Cell. 149 (1), 146-158 (2012).
  22. Ayyaz, A., et al. Single-cell transcriptomes of the regenerating intestine reveal a revival stem cell. Nature. 569 (7754), 121-125 (2019).
  23. Tomic, G., et al. Phospho-regulation of ATOH1 is required for plasticity of secretory progenitors and tissue regeneration. Cell Stem Cell. 23 (3), 436-443 (2018).
  24. Castillo-Azofeifa, D., et al. Atoh1(+) secretory progenitors possess renewal capacity independent of Lgr5(+) cells during colonic regeneration. The EMBO Journal. 38 (4), 99984 (2019).
  25. Van Landeghem, L., et al. Activation of two distinct Sox9-EGFP-expressing intestinal stem cell populations during crypt regeneration after irradiation. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 302 (10), 1111-1132 (2012).
  26. Roche, K. C., et al. SOX9 maintains reserve stem cells and preserves radioresistance in mouse small intestine. Gastroenterology. 149 (6), 1553-1563 (2015).
  27. Barriga, F. M., et al. Mex3a marks a slowly dividing subpopulation of Lgr5+ intestinal stem cells. Cell Stem Cell. 20 (6), 801-816 (2017).
  28. May, R., et al. Brief report: Dclk1 deletion in tuft cells results in impaired epithelial repair after radiation injury. Stem Cells. 32 (3), 822-827 (2014).
  29. Tetteh, P. W., et al. Replacement of lost Lgr5-positive stem cells through plasticity of their enterocyte-lineage daughters. Cell Stem Cell. 18 (2), 203-213 (2016).
  30. Bohin, N., et al. Rapid crypt cell remodeling regenerates the intestinal stem cell niche after Notch inhibition. Stem Cell Reports. 15 (1), 156-170 (2020).
  31. Li, N., et al. Single-cell analysis of proxy reporter allele-marked epithelial cells establishes intestinal stem cell hierarchy. Stem Cell Reports. 3 (5), 876-891 (2014).
  32. van Es, J. H., et al. Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage. Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).
  33. Durand, A., et al. Functional intestinal stem cells after Paneth cell ablation induced by the loss of transcription factor Math1 (Atoh1). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (23), 8965-8970 (2012).
  34. Hayakawa, Y., et al. BHLHA15-positive secretory precursor cells can give rise to tumors in intestine and colon in mice. Gastroenterology. 156 (4), 1066-1081 (2019).
  35. Yan, K. S., et al. Intestinal enteroendocrine lineage cells possess homeostatic and injury-inducible stem cell activity. Cell Stem Cell. 21 (1), 78-90 (2017).
  36. Chandrakesan, P., et al. Intestinal tuft cells regulate the ATM mediated DNA damage response via Dclk1 dependent mechanism for crypt restitution following radiation injury. Scientific Reports. 6, 37667 (2016).
  37. Yu, S., et al. Paneth cell multipotency induced by Notch activation following Injury. Cell Stem Cell. 23 (1), 46-59 (2018).
  38. Moussa, L., et al. Bowel radiation injury: Complexity of the pathophysiology and promises of cell and tissue engineering. Cell Transplantation. 25 (10), 1723-1746 (2016).
  39. Gong, W., et al. Mesenchymal stem cells stimulate intestinal stem cells to repair radiation-induced intestinal injury. Cell Death & Disease. 7 (9), 2387 (2016).
  40. Tam, S. Y., Wu, V. W. C. A review on the special radiotherapy techniques of colorectal cancer. Frontiers in Oncology. 9, 208 (2019).
  41. Shadad, A. K., Sullivan, F. J., Martin, J. D., Egan, L. J. Gastrointestinal radiation injury: Symptoms, risk factors and mechanisms. World Journal of Gastroenterology. 19 (2), 185-198 (2013).
  42. Serrano Martinez, P., Giuranno, L., Vooijs, M., Coppes, R. P. The radiation-induced regenerative response of adult tissue-specific stem cells: Models and signaling pathways. Cancers. 13 (4), 855 (2021).
  43. Stacey, R., Green, J. T. Radiation-induced small bowel disease: Latest developments and clinical guidance. Therapeutic Advances in Chronic Disease. 5 (1), 15-29 (2014).
  44. Pan, Y. B., Maeda, Y., Wilson, A., Glynne-Jones, R., Vaizey, C. J. Late gastrointestinal toxicity after radiotherapy for anal cancer: A systematic literature review. Acta Oncologica. 57 (11), 1427-1437 (2018).
  45. Elhammali, A., et al. Late gastrointestinal tissue effects after hypofractionated radiation therapy of the pancreas. Radiation Oncology. 10, 186 (2015).
  46. You, S. H., Cho, M. Y., Sohn, J. H., Lee, C. G. Pancreatic radiation effect in apoptosis-related rectal radiation toxicity. Journal of Radiation Research. 59 (5), 529-540 (2018).
  47. Jiminez, J. A., Uwiera, T. C., Douglas Inglis, G., Uwiera, R. R. Animal models to study acute and chronic intestinal inflammation in mammals. Gut Pathogens. 7, 29 (2015).
  48. Snider, A. J., et al. Murine model for colitis-associated cancer of the colon. Methods in Molecular Biology. 1438, 245-254 (2016).
  49. Clapper, M. L., Cooper, H. S., Chang, W. C. Dextran sulfate sodium-induced colitis-associated neoplasia: A promising model for the development of chemopreventive interventions. Acta Pharmacologica Sinica. 28 (9), 1450-1459 (2007).
  50. Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. Animal models of ischemia-reperfusion-induced intestinal injury: Progress and promise for translational research. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 308 (2), 63-75 (2015).
  51. Fujimichi, Y., Otsuka, K., Tomita, M., Iwasaki, T. Ionizing radiation alters organoid forming potential and replenishment rate in a dose/dose-rate dependent manner. Journal of Radiation Research. 63 (2), 166-173 (2022).
  52. Montenegro-Miranda, P. S., et al. A novel organoid model of damage and repair identifies HNF4alpha as a critical regulator of intestinal epithelial regeneration. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (2), 209-223 (2020).
  53. Nagle, P. W., Coppes, R. P. Current and future perspectives of the use of organoids in radiobiology. Cells. 9 (12), 2649 (2020).
  54. Taelman, J., Diaz, M., Guiu, J. Human Intestinal Organoids: Promise and Challenge. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 854740 (2022).
  55. Kim, C. K., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. The role of intestinal stem cells in epithelial regeneration following radiation-induced gut injury. Current Stem Cell Reports. 3 (4), 320-332 (2017).
  56. Kuruvilla, J. G., et al. Kruppel-like factor 4 modulates development of BMI1(+) intestinal stem cell-derived lineage following gamma-radiation-induced gut injury in mice. Stem Cell Reports. 6 (6), 815-824 (2016).
  57. Sangiorgi, E., Capecchi, M. R. Bmi1 is expressed in vivo in intestinal stem cells. Nature Genetics. 40 (7), 915-920 (2008).
  58. Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Developmental Biology. 1, 4 (2001).
  59. Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. Journal of Visualized Experiments. (113), e54161 (2016).
  60. Booth, C., Tudor, G., Tudor, J., Katz, B. P., MacVittie, T. J. Acute gastrointestinal syndrome in high-dose irradiated mice. Health Physics. 103 (4), 383-399 (2012).
  61. Lu, L., Jiang, M., Zhu, C., He, J., Fan, S. Amelioration of whole abdominal irradiation-induced intestinal injury in mice with 3,3'-Diindolylmethane (DIM). Free Radical Biology & Medicine. 130, 244-255 (2019).
  62. Karlsson, J. A., Andersen, B. L. Radiation therapy and psychological distress in gynecologic oncology patients: Outcomes and recommendations for enhancing adjustment. Journal of Psychosomatic Obstetrics & Gynecology. 5 (4), 283-294 (1986).
  63. Yang, J., Cai, H., Xiao, Z. X., Wang, H., Yang, P. Effect of radiotherapy on the survival of cervical cancer patients: An analysis based on SEER database. Medicine. 98 (30), 16421 (2019).
  64. Giroux, V., et al. Mouse intestinal Krt15+ crypt cells are radio-resistant and tumor initiating. Stem Cell Reports. 10 (6), 1947-1958 (2018).
  65. Kim, C. K., et al. Kruppel-like factor 5 regulates stemness, lineage specification, and regeneration of intestinal epithelial stem cells. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (4), 587-609 (2020).
  66. Sheng, X., et al. Cycling stem cells are radioresistant and regenerate the intestine. Cell Reports. 32 (4), 107952 (2020).
  67. Gross, S., et al. Nkx2.2 is expressed in a subset of enteroendocrine cells with expanded lineage potential. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309 (12), 975-987 (2015).
  68. Sato, T., et al. Characterization of radioresistant epithelial stem cell heterogeneity in the damaged mouse intestine. Scientific Reports. 10 (1), 8308 (2020).
  69. Roth, S., et al. Paneth cells in intestinal homeostasis and tissue injury. PLoS One. 7 (6), 38965 (2012).
  70. Bohin, N., et al. Insulin-like growth factor-1 and mTORC1 signaling promote the intestinal regenerative response after irradiation injury. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (4), 797-810 (2020).
  71. Romesser, P. B., et al. Preclinical murine platform to evaluate therapeutic countermeasures against radiation-induced gastrointestinal syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (41), 20672-20678 (2019).
  72. Gu, J., et al. At what dose can total body and whole abdominal irradiation cause lethal intestinal injury among C57BL/6J mice. Dose Response. 18 (3), 1559325820956783 (2020).
  73. Huh, W. J., et al. Tamoxifen induces rapid, reversible atrophy, and metaplasia in mouse stomach. Gastroenterology. 142 (1), 21-24 (2012).
  74. Keeley, T. M., Horita, N., Samuelson, L. C. Tamoxifen-induced gastric injury: Effects of dose and method of administration. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 8 (3), 365-367 (2019).
  75. Bohin, N., Carlson, E. A., Samuelson, L. C. Genome toxicity and impaired stem cell function after conditional activation of CreER(T2) in the intestine. Stem Cell Reports. 11 (6), 1337-1346 (2018).
  76. Boynton, F. D. D., Ericsson, A. C., Uchihashi, M., Dunbar, M. L., Wilkinson, J. E. Doxycycline induces dysbiosis in female C57BL/6NCrl mice. BMC Research Notes. 10 (1), 644 (2017).

Tags

Biologie Nummer 185
Intestinale epitheelregeneratie als reactie op ioniserende bestraling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Orzechowska-Licari, E. J., LaComb,… More

Orzechowska-Licari, E. J., LaComb, J. F., Giarrizzo, M., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation. J. Vis. Exp. (185), e64028, doi:10.3791/64028 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter