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Biology

電離放射線照射による腸管上皮再生

Published: July 27, 2022 doi: 10.3791/64028
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 1
1Department of Medicine, Renaissance School of Medicine at Stony Brook University, 2Department of Physiology and Biophysics, Renaissance School of Medicine at Stony Brook University

Summary

消化管は、放射線治療によるがん治療の損傷に対して最も敏感な臓器の1つです。それは同時に、そのような侮辱に続く最高の再生能力の1つを持つ臓器系です。提示されたプロトコルは、腸上皮の再生能力を研究するための効率的な方法を記載している。

Abstract

腸上皮は単層の細胞で構成されていますが、腸管陰窩の底にある腸幹細胞の活発な増殖によって生成される複数の種類の最終分化細胞が含まれています。しかし、急性腸損傷のイベント中に、これらの活性腸幹細胞は細胞死を受けます。ガンマ線照射は広く使用されている結腸直腸癌治療であり、治療的には有効であるが、活性幹細胞プールを枯渇させる副作用がある。実際、患者は放射線療法を受けている間に胃腸放射線症候群を頻繁に経験しますが、これは一部には活発な幹細胞の枯渇によるものです。腸陰窩における活性腸幹細胞の喪失は、典型的には静止している予備腸幹細胞のプールを活性化し、分泌細胞および腸細胞前駆細胞の脱分化を誘導する。これらの細胞がなければ、腸上皮は放射線療法や他のそのような主要な組織傷害から回復する能力を欠いているでしょう。系統追跡技術の新たな進歩により、再生中の細胞の活性化、分化、および移動の追跡が可能になり、腸内でのこれを研究するために首尾よく採用されています。本研究は、放射線障害後のマウス腸管上皮内の細胞を解析する方法を示すことを目的とする。

Introduction

ヒトの腸管上皮は、完全に平らに配置すると、バドミントンコートの表面のほぼ半分を覆います1。代わりに、人間を腸の内容物から分離するこの単一細胞層は、一連の指のような突起、絨毛、およびくぼみ、腸の表面積を最大化する陰窩に圧縮されます。上皮の細胞は陰窩 - 絨毛軸に沿って分化する。絨毛は主に栄養吸収腸細胞、粘液分泌杯細胞、およびホルモン産生腸内分泌細胞で構成され、陰窩は主にディフェンシン産生パネス細胞、活性および予備幹細胞、および前駆細胞2,3,4,5で構成されています。さらに、これらの細胞が下にある間葉系コンパートメントの間質細胞および免疫細胞および内腔の微生物叢との双方向の通信は、腸の恒常性を維持する相互作用の複雑なネットワークを生成し、損傷後の回復に不可欠です6,7,8。

腸上皮は人体で最も急速に自己再生する組織であり、代謝回転率は2〜6日です9,10,11。恒常性の間、ロイシンリッチリピート含有Gタンパク質共役受容体5(LGR5)の発現によって特徴付けられる腸陰窩の基部(陰窩基底柱状細胞)の活性幹細胞は急速に分裂し、他のすべての腸上皮系譜に分化する前駆細胞を提供する。しかし、有糸分裂率が高いため、活性幹細胞とその直接の前駆細胞はガンマ線損傷に特に敏感であり、照射後にアポトーシスを起こします5,12,13,14。それらが失われると、腸陰窩内の予備幹細胞および非幹細胞(前駆細胞の亜集団およびいくつかの最終分化細胞)が活性化され、基底陰窩コンパートメントを補充し、絨毛の細胞集団を再構成し、したがって腸上皮を再生することができる15。系統追跡技術を用いて、複数の研究グループは、予備(静止)幹細胞が活性幹細胞の喪失時の再生をサポートできることを実証している13、16、17、18、19、20、21、22。これらの細胞は、ポリコーム複合体タンパク質1癌遺伝子(Bmi1)、マウステロメラーゼ逆転写酵素遺伝子(mTert)、ホップホメオボックス(Hopx)、およびロイシンリッチリピートタンパク質1遺伝子(Lrig1)の存在によって特徴付けられる。さらに、非幹細胞は、損傷時に腸陰窩を補充することができることが示されている23、24、25、26、27、28、29、30、31。特に、分泌細胞や腸細胞の前駆細胞は、傷害時に脱分化を起こし、幹細胞様細胞に戻り、腸上皮の再生をサポートすることが示されています。最近の研究では、損傷時にステムのような特徴を獲得する能力を持つ複数のマーカー(DLL+、ATOH1+、PROX1+、MIST1+、DCLK1+など)32,33,34,35,36を発現する細胞が同定されています。驚くべきことに、Yuらは、成熟したPaneth細胞(LYZ+)でさえ腸の再生に寄与し得ることを示した37。さらに、腸上皮細胞のアポトーシスを引き起こし、上皮バリア機能を破壊することに加えて、照射は腸内細菌叢の嚥下障害、免疫細胞の活性化および炎症誘発性応答の開始、ならびに間葉系および間質細胞の活性化をもたらす38,39。

ガンマ線は、特に結腸直腸腫瘍の場合、癌治療における貴重な治療ツールです40。しかし、照射は細胞にダメージを与えることで腸の恒常性に大きく影響し、アポトーシスにつながります。放射線被曝は、患者の回復を遅らせる複数の摂動を引き起こし、急性期の粘膜損傷と炎症、および長期的に下痢、失禁、出血、腹痛を特徴としています。この症状の広がりは、胃腸放射線毒性と呼ばれます。さらに、経壁線維症および/または血管硬化症の放射線誘発性の進行は、治療後数年でのみ現れる可能性があります38,41。損傷自体と同時に、放射線は腸細胞の修復応答を誘導し、再生の開始と調整に関与するシグナル伝達経路を活性化します42。放射線誘発性小腸疾患は、他の臓器(子宮頸部、前立腺、膵臓、直腸など)に提供される骨盤または腹部の放射線療法に起因する可能性があります41、43、44、45、46。したがって、腸管照射損傷は重要な臨床的問題であり、結果として生じる病態生理学のより良い理解は、放射線療法に関連する胃腸合併症を軽減するための介入の開発を進める可能性があります。放射線とは別に、腸上皮の再生目的を調査することを可能にする他の技術があります。炎症およびその後の再生を研究するためのトランスジェニックおよびケミカルマウスモデルが開発されている47。デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)は腸に炎症を誘発し、炎症性腸疾患と同様の特徴を発達させます48。発がん性化合物アゾキシメタン(AOM)とDSS治療の組み合わせは、大腸炎関連癌の発症をもたらす可能性があります48,49。虚血再灌流誘発傷害は、腸上皮の再生能力を研究するために採用される別の方法である。この技術には経験と外科的知識が必要です50。さらに、前述の技術は放射線とは異なるタイプの傷害を引き起こし、再生の異なるメカニズムの関与につながる可能性があります。さらに、これらのモデルは時間がかかりますが、放射線技術はかなり短いです。最近、腸および結腸から生成されたエンテロイドおよびコロノイドを利用するin vitro法が、腸管再生のメカニズムを研究するために放射線障害と組み合わせて使用 されている51,52。ただし、これらの手法は、モデル53,54の臓器を完全には再現していません。

提示されたプロトコルには、タモキシフェン治療後に予備幹細胞集団に由来する系統の追跡を可能にする遺伝子モデルと組み合わせたガンマ線損傷のマウスモデルの説明が含まれています(Bmi1-CreER;Rosa26eYFP)。このモデルは、12Gy全身照射を利用しており、予備の幹細胞を活性化するのに十分な有意な腸損傷を誘発すると同時に、損傷から7日以内に腸の再生能力のその後の調査を可能にします55。

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Protocol

すべてのマウスは、ストーニーブルック大学の実験動物資源部門(DLAR)に収容されました。ストーニーブルック大学施設動物管理および使用委員会(IACUC)は、動物を対象としたすべての研究と手順を承認しました。動物被験者を対象とした実験は、承認された動物取り扱いプロトコル(IACUC #245094)に厳密に従って実施されました。

注:マウス系統B6;129-Bmi1 tm1(cre/ERT)Mrc/J(Bmi1-Cre ER)およびB6.129X1-Gt(ROSA)26Sor tm1(EYFP)Cos/J(Rosa26eYFP)を商業的に入手し(材料の表を参照)、交配してBmi1-CreERを得た。Rosa26eYFP(Bmi1ctrl)マウスは、前述のように56、57、58である。

1. Bmi1-Cre ERのハウジング;ローザ26 eYFPマウス

  1. マウスを動物施設で、68〜72°Fの範囲の温度と30〜70%の範囲の湿度で、水と通常の固形飼料を 自由に使用して、12時間/ 12時間の明暗サイクルで飼育します。.
  2. 実験に先立って、標準的なPCRジェノタイピング技術を用いてマウス遺伝子型を確認する57、58。

2.動物と材料の準備

  1. 実験の少なくとも7日前にマウスを実験収容室に移し、マウスを順応させます。
  2. 性別と年齢に応じて実験動物と対照動物を一致させます。
  3. 実験動物がタモキシフェン注射を受け、ガンマ線照射にさらされるようにしながら、対照動物をタモキシフェン誘発性Cre媒介組換えにさらしますが、照射(偽治療、0Gy)は受けません。
  4. タモキシフェン溶液を調製する。タモキシフェン粉末を30 mg / mLの濃度の滅菌コーン油に再懸濁します。.30%の振幅で30秒オンと30秒オフのサイクルで60分間超音波処理し、室温(RT)で1時間暗闇の中で回転します。タモキシフェン溶液は-20°Cで凍結できますが、複数回凍結/解凍しないでください。好ましくは、毎回新鮮な溶液を調製し、それを保存しないでください。
    注:タモキシフェンは光に敏感です。室温回転中に錫箔で包みます。
    注意: タモキシフェンは潜在的に危険な物質です:健康被害(GHS08)および環境危険(GHS09)。
  5. 5-エチニル-2′-デオキシウリジン(EdU)ストック溶液を調製します。滅菌ジメチルスルホキシド(DMSO)の総容量の1/5にEdU粉末を再懸濁し、残りの4/5を滅菌超純水の総容量の4/5をゆっくりと加えます。完全に溶解したら、分注し、-20°Cで保存します。
    注意: 5-エチニル-2′-デオキシウリジン(EdU)とジメチルスルホキシド(DMSO)は潜在的に危険な物質です:健康被害(それぞれH340とH631、H227、H315、H319)。EdUは遺伝的欠陥を引き起こす可能性があり、生殖能力や胎児に損害を与える疑いがあり、DMSOは皮膚や目の炎症を引き起こす可能性があります。
  6. 組織収集および固定用の試薬を調製する:エタノールを希釈して70%水溶液を調製し、DPBSを4°Cに冷却し、修飾ブアン固定緩衝液(蒸留H2O中の50%エタノールおよび5%酢酸)および10%緩衝ホルマリンを調製する。
    注意: エチルアルコールは潜在的に危険な物質です:健康被害(H225-H319)、可燃性(GHS02)、および急性毒性(GHS07)を引き起こします。酢酸は潜在的に危険な物質です:健康被害(H226-H314)、可燃性(GHS02)、および腐食性(GHS05)。ホルマリンは潜在的に危険な物質です:健康被害(H350、H315、H317、H318、H370)、および腐食性。ホルマリンは、癌、皮膚および眼の炎症、臓器の損傷、およびアレルギー性皮膚反応を引き起こす可能性があります。
  7. 承認された方法(CO2 チャンバーなど)、マウス解剖キット(はさみ、鉗子)、ペトリ皿、腸を洗い流すための10 mLシリンジに取り付けられた16 Gの経管栄養針、および組織学的カセットに従って、安楽死に必要な機器を準備します。

3.全身ガンマ線照射(TBI)と組織採取

  1. ガンマ線照射の2日前に、実験動物にタモキシフェンの単回投与を注射して、Creを介した組換えとBMI1 / EYFP + 細胞系統追跡を誘発します。各動物の体重を量り、コーン油に再懸濁したタモキシフェンの体重40 mg / kgの用量を計算します。.腹部を70%エタノールで消毒し、1mLシリンジに取り付けられた27G針を使用してタモキシフェンを腹腔内投与します。.
  2. 潜在的なタモキシフェン毒性を排除するために、次の48時間動物を観察します。.
  3. 地元の機関が指定した照射室にマウスを移します。
  4. 現在のエクサクター線量率に応じて 、137Cs線源から放出される照射被ばく時間を計算します。例えば、現在の線量率が75.9 rad/min( 0.759 Gymin−1 = 75.9 cGy m−1)に等しい場合、分単位の被ばく時間は所望の線量/0.759として計算される。動物に12GyTBIの線量を照射する場合、曝露時間は~15.81分(15分48秒)である。
  5. ガンマ線照射器のサンプルチャンバーを70%エタノール溶液で消毒します。吸収マットと動物をサンプルチャンバー内に置きます。
    注:偽処理された動物は照射室に置く必要がありますが、ガンマ線照射にはさらさないでください。
  6. 蓋をしてチャンバーを閉じます。
  7. 動物を12GyTBIにさらすようにガンマ線照射器をプログラムします。
    1. キーをSTART位置に回して、マシンの電源を入れます。
    2. 数字キーボードを使用してオペレーター番号を入力し、Enter キーを押して確認します。
    3. 数字キーボードを使用してPIN番号を入力し、Enterキーを押して確認します。
    4. オプションを表示するには 、1 を押します。
    5. タイマー設定のために 1 を押します。
    6. 照射時間は 1 を押します。
    7. テンキー(hh:mm:ss形式)を使用して次のサイクルのタイマー設定を入力し、Enterキーを押して確認します。
    8. Enter キーを押して、もう一度設定を確認します。
    9. CLEAR 2xを押してホームメニューに戻ります。
    10. STARTを押して露出を開始します。
  8. アクティブな露出の時間のために部屋を出てください。プリセット時間が経過すると、マシンは自動的に停止し、ビープ音が鳴り始めます。
    注意: セシウム137(137Cs)は致命的な危険物質です(健康被害:H314)。大量の137Csへの外部被ばくは、火傷、急性放射線障害、さらには死に至る可能性があります。
  9. キーをSTOP位置に回して、マシンの電源を切ります。
  10. サンプルチャンバーを開き、蓋を外し、動物をケージに戻し、サンプルチャンバーを70%エタノール溶液で消毒します。
  11. 動物を従来の飼育室に戻し、治療後の状態を観察します。
  12. 動物の体重を毎日監視し、開始時の体重の15%を超える幸福の変化、苦痛、または体重減少の症状が観察された場合は、すぐに(計画された時点にもかかわらず)安楽死させます。
  13. 計画された安楽死の3時間前に腹部を消毒し、28Gインスリン注射器を使用して、マウスに100μLのEdUストック溶液(腹腔内投与)を注射する。
  14. 照射後0時間、3時間、6時間、24時間、48時間、72時間、96時間、168時間で近位腸を採取します。
    1. 在宅機関の基準に従ってCO2 安楽死を行う。
      注意: 二酸化炭素は有害物質(H280)です。圧力下のガスが含まれています。加熱すると爆発する可能性があります。酸素を置換し、急速な窒息を引き起こす可能性があります。
    2. 次に、小腸の近位部分を解剖し、付着した組織を取り除き、10 mLシリンジに取り付けられた16 Gのストレート栄養針を使用して冷たいDPBSでフラッシュし、10 mLシリンジに取り付けられた16 Gのストレート栄養針を使用して修正ブアンの固定液バッファーで固定し、縦方向に切断し、前述のようにスイスロール技術を使用して近位腸をロールします59。
  15. 組織を組織学的カセットに入れ、10%緩衝ホルマリンを含む容器に室温で24〜48時間放置する。ホルマリンの体積は、組織学的カセットを完全に覆うのに十分でなければならない。インキュベーション時間が経過したら、鉗子を使用して、組織学的カセットを70%エタノールで満たされた容器に移す。その後、組織パラフィン包埋を進める。
    注:組織パラフィン包埋は、ストーニーブルック大学の研究組織学コアラボによって実施されました。この手順はここで停止でき、パラフィンブロックは室温で保存できます。
    注意: ホルマリンは潜在的に危険な物質です:健康被害(H350、H315、H317、H318、H370)、および腐食性。ホルマリンは、癌、皮膚および眼の炎症、臓器の損傷、およびアレルギー性皮膚反応を引き起こす可能性があります。

4. 組織学的解析

  1. パラフィン包埋組織標本を含む組織学的カセットを氷上に少なくとも1時間置き、冷却します。ミクロトームを使用して、染色のために厚さ5 μmの切片を準備します。すべての組織は、圧延された標本全体を覆うように水平にスライスする必要があります。
    1. パラフィンブロックを切断した後、組織切片を45°Cに温めた水浴に移し、切片を帯電したスライドに置きます。スライドを室温で一晩ラックに置いて乾かします。
      注:この手順はここで停止でき、スライドは室温で保存できます。
  2. スライドをスライドホルダーに入れ、65°Cのオーブンで一晩焼きます。スライドは1〜2時間という短い時間焼くことができます。ただし、これは、切りたて(生後1か月未満)のカットスライドの場合はお勧めできません。
    注意: 手動スライド染色セットを化学フードの下に置き、キシレン、エタノール、およびヘマトキシリンとのインキュベーションを化学フードの下で実行します。
  3. 翌日、スライドを化学薬品フードの下のスライドホルダーに10分間入れて冷却します。
  4. スライドホルダーを100%キシレンで満たされた容器に3分間入れて、組織を脱パラフィンします。新鮮な100%キシレンを使用してインキュベーションを繰り返します。
    注意: その瞬間から、標本が常に濡れていることを確認してください。
    注意:キシレンは潜在的に危険な物質です:可燃性(GHS02)、急性毒性(GHS07)、および健康被害(H226-H304-H312 + H332-H315-H319-H335-H373-H412)。潜在的な危険な影響は、飲み込んだり気道に入ったりすると致命的であり、皮膚、目、呼吸器の炎症を引き起こす可能性があることです。さらに、眠気やめまいを引き起こすことによって運動機能に影響を及ぼし、長期または反復曝露の場合に臓器損傷を引き起こす可能性があります。.
  5. 以下の溶液で満たされた容器にスライドホルダーを順次配置することにより、エタノール勾配で切片を再水和する:100%エタノール、2分;95%エタノール、2分;70%エタノール、2分
  6. スライドホルダーを蒸留水で満たされた容器に移し、流蒸留水で2分間すすぎます。
  7. スライドホルダーをヘマトキシリン溶液で満たされた容器に入れ、5分間(化学フードの下)染色します。
  8. スライドホルダーを水道水で満たされた容器に移し、ヘマトキシリン染色が青みがかった色になるまで、通常は2分後に流水ですすいでください。
  9. スライドホルダーを5%(w / v)炭酸リチウム溶液で満たされた容器に移します。10倍浸します。
    注意: 炭酸リチウムは潜在的に危険な物質であり、急性毒性(GHS07)および健康被害(H302-H319)を引き起こします。飲み込むと有害であり、皮膚に触れると有害であり、深刻な眼の刺激を引き起こします。
  10. スライドホルダーを蒸留水で満たされた容器に移し、流蒸留水で2分間すすぎます。
  11. スライドホルダーをエオシンで満たされた容器に入れ、5分間染色します。
  12. スライドホルダーを70%エタノールで満たされた容器に移し、短時間(10秒)すすいでください。
  13. エタノール勾配溶液で満たされた容器にスライドホルダーを順次配置することにより、切片を脱水します:95%エタノール、5ディップ;100%エタノール、5ディップ。
  14. スライドホルダーを100%キシレンで満たされた容器に3分間置き、スライドをクリアします。新鮮な100%キシレンを使用してインキュベーションを繰り返します。
  15. スライドをラックから取り出し、ペーパータオルでティッシュの周囲を乾かし、検体の大きさに応じて、キシレン系封入剤を検体の表面に1滴または2滴加えます。スライドガラスの上にカバーガラスをそっと置き、取り付けます(気泡を残さないように注意してください)。必要に応じて軽く押します。ガラスの表面全体を覆い、密封する必要があります。
  16. スライドを化学薬品フードの下に一晩置いて乾かします。通常、封入剤は24時間以内に固化します。スライドが乾燥していることを確認するために、サンプルスライドを作成できます。空のスライドを使用して、封入剤を一滴置き、化学薬品フードの下に一晩置きます。翌日、ドロップをタッチして固まっているかどうかを確認します。
  17. スライドが乾いたら、光学顕微鏡または明視野チャンネルを備えたより高度な顕微鏡を使用して組織の組織像を分析します。
    1. 顕微鏡スライドをステージに置き、サンプルが視野の中心になるまで移動し、フォーカスノブを使用して焦点を調整し、10倍および/または20倍の倍率の対物レンズを使用して、対照組織と比較して組織像を分析します(偽照射)。
    2. 顕微鏡にカメラが装備されている場合は、画像も撮影してください。
      注:この手順はここで停止できます。スライドは室温で保存し、後で分析することができます。汚れがゆっくりと消えていくため、スライドを30日以上保管しないでください。

5. 免疫蛍光染色

  1. パラフィン包埋組織標本を含む組織学的カセットを氷上に少なくとも1時間置き、冷却します。ミクロトームを使用して、染色のために厚さ5 μmの切片を準備します。すべての組織は、圧延された標本全体を覆うように水平にスライスする必要があります。
    1. パラフィンブロックを切断した後、組織切片を45°Cに温めた水浴に移し、切片を帯電したスライドに置きます。スライドを室温で一晩ラックに置いて乾かします。
      注:この手順はここで停止でき、スライドは室温で保存できます。
  2. スライドをスライドホルダーに入れ、65°Cのオーブンで一晩焼きます。スライドは1〜2時間という短い時間焼くことができます。ただし、これは、新しく(1か月以内に)カットされたスライドの場合はお勧めできません。
    注意: 手動スライド染色セットを化学フードの下に置き、キシレン、エタノール、およびH 2 O2/メタノールを使用して化学フードの下でインキュベーションを実行します。
  3. 翌日、スライドを化学薬品フードの下のスライドホルダーに10分間入れて冷却します。
  4. スライドホルダーを100%キシレンで満たされた容器に3分間入れて、組織を脱パラフィンします。新鮮な100%キシレンを使用してインキュベーションを繰り返します。
    注意: その瞬間から、標本が常に濡れていることを確認してください。
  5. 化学フード下のメタノール中の2%過酸化水素水で満たされた容器中でスライドを30分間インキュベートすることにより、内因性ペルオキシダーゼをクエンチします。
    注意: メチルアルコールは潜在的に危険な物質です:健康被害(H225-H301、H311、H331-H370)、可燃性(GHS02)、および急性毒性(経口、皮膚、吸入)を引き起こします(GHS08)。過酸化水素は潜在的に危険な物質です:腐食性(GHS05)および急性毒性(GHS07)を引き起こします。
  6. 以下の溶液で満たされた容器にスライドホルダーを順次配置することにより、エタノール勾配で切片を再水和します:100%エタノール、3分;95%エタノール、3分;70%エタノール、3分
  7. スライドホルダーを蒸留水で満たされた容器に移し、流蒸留水で2分間すすぎます。
  8. 抗原を取得するには、スライドホルダーを250 mLのクエン酸緩衝液(10 mMクエン酸ナトリウム、0.05%Tween-20、pH 6.0)の入った容器に移し、デクローキングチャンバーを使用して110°Cで10分間調理します。
  9. 容器全体を冷蔵室に移し、30分間かけて徐々に冷却します。
  10. 30分後、クエン酸緩衝液を蒸留水と交換し、浮遊パラフィン片がすべて除去されるまで流蒸留水ですすいでください。
  11. スライドをホルダーから(一度に1つずつ)取り出し、ペーパータオルを軽くたたき、ペーパータオルで標本の周囲を慎重に乾かします。疎水性バリアを提供するペン(PAPペン)を使用して、標本の周りに閉じた形状を描きます。加湿チャンバーに入れます。
  12. TBS-Tween中の5%ウシ血清アルブミン(BSA)で、200 μLの溶液を検体の表面に添加してブロックします。漏れがないことを確認してください。加湿チャンバー内で37°Cで30分間インキュベートします。
  13. ペーパータオルでスライドガラスをタップして、ブロッキング溶液を取り除きます。加湿チャンバーに戻します。ブロッキングバッファーに再懸濁した一次抗体を適切な濃度の100 μL加え、4°Cで一晩穏やかに揺動しながらインキュベートします。BMI1 / EYFPの場合は、鶏肉抗GFP(希釈1:500)を使用します。Ki-67の場合は、ウサギの抗Ki-67(希釈1:200)を使用してください。
  14. ペーパータオルでスライドガラスをタップして抗体溶液を除去します。スライドをスライドホルダーに入れ、TBSトゥイーンで満たされた容器に移します。5分間振とうしながらスライドを洗い、3回繰り返します。毎回、TBSトゥイーンバッファーの新しい部分を使用してください。
  15. スライドをホルダーから取り出し(一度に1つずつ)、ペーパータオルでスライドガラスを軽くたたいて余分な洗浄液を取り除き、加湿チャンバーに入れます。ブロッキングバッファーに再懸濁した二次抗体の適切な濃度100 μLを追加し、37°Cで30分間インキュベートします。二次抗体は蛍光色素と結合させる必要があります。BMI1 / EYFPの場合は、ロバアンチチキンAlexa Fluor 647(希釈1:500)を使用してください。Ki-67の場合は、ヤギ抗ウサギAlexa Fluor 488(希釈1:500)を使用してください。
  16. ペーパータオルでスライドガラスをタップして抗体溶液を除去します。スライドをスライドホルダーに入れ、TBSトゥイーンで満たされた容器に移します。5分間振とうしながらスライドを洗い、3回繰り返します。毎回、TBSトゥイーンバッファーの新しい部分を使用してください。
  17. スライドをホルダーから取り出し(一度に1つずつ)、ペーパータオルでスライドガラスを軽くたたいて余分な洗浄液を取り除き、加湿チャンバーに入れます。製造元の指示に従ってAlexa Fluor 555蛍光色素を使用して調製したEdU染色液を100 μL加えます。
  18. ペーパータオルでスライドガラスをタップして、EdUソリューションを取り外します。スライドをスライドホルダーに入れ、TBSトゥイーンで満たされた容器に移します。5分間振とうしながらスライドを洗い、2回繰り返します。毎回、TBSトゥイーンバッファーの新しい部分を使用してください。
  19. スライドをホルダーから取り出します(一度に1つずつ)。ペーパータオルでスライドガラスを軽くたたいて余分な洗浄液を取り除き、加湿チャンバーに入れます。試料の表面に100 μLのHoechst 33258溶液(TBS-Tweenで1:1000に希釈)を加えて、Hoechst 33258対比染色を行います。暗所で室温で5分間インキュベートします。
  20. ペーパータオルでスライドガラスをタップして、Hoechst 33258ソリューションを取り外します。スライドをスライドホルダーに入れ、TBSトゥイーンで満たされた容器に移します。5分間振とうしながらスライドを洗います。
  21. スライドホルダーからスライドを取り出し、ペーパータオルでティッシュの周囲を乾かし、標本の大きさに応じて、水系封入剤を標本の表面に1滴または2滴加えます。スライドガラスの上にカバーガラスをそっと置き、取り付けます(気泡を残さないように注意してください)。必要に応じて軽く押します。ガラスの表面全体を覆い、密封する必要があります。
  22. スライドを室温で一晩暗所に置いて乾燥させます。通常、封入剤は24時間以内に固化します。スライドが乾燥していることを確認するために、サンプルスライドを作成できます。空のスライドを使用します。封入剤を一滴置き、化学薬品フードの下に一晩置きます。翌日、ドロップをタッチして固まっているかどうかを確認します。
  23. スライドが乾いたら、発光波長フィルターを備えた蛍光顕微鏡を使用して染色組織を分析し、Ki-67、EdU、およびBMI1/EYFP染色(それぞれ535 nm、646 nm、および700 nm)を視覚化できます。
  24. 顕微鏡スライドをステージに置き、サンプルが視野の中央にくるまで移動し、フォーカスノブを使用してフォーカスを調整し、10倍および/または20倍の倍率の対物レンズを使用して、対照組織(偽照射)と比較して染色を分析します。顕微鏡にカメラが装備されていれば、画像も撮ることができます。チャンネルごとに個別に画像を撮り、後でマージします。
    注:この手順はここで停止できます。スライドは4°Cで保存し、後で分析することができます。汚れがゆっくりと消えていくため、スライドを14日以上保管しないでください。

6.チュネル染色

  1. パラフィン包埋組織標本を含む組織学的カセットを氷上に少なくとも1時間置き、冷却します。ミクロトームを使用して、染色のために厚さ5 μmの切片を準備します。すべての組織は、圧延された標本全体を覆うように水平にスライスする必要があります。
    1. パラフィンブロックを切断した後、組織切片を45°Cに温めた水浴に移し、切片を帯電したスライドに置きます。スライドを室温で一晩ラックに置いて乾かします。
      注:この手順はここで停止でき、スライドは室温で保存できます。
  2. スライドをスライドホルダーに入れ、65°Cのオーブンで一晩焼きます。
    注意: スライドは1〜2時間という短い時間焼くことができます。ただし、新しく(1か月以内に)カットされたスライドの場合はお勧めできません。手動スライド染色セットをケミカルフードの下に置き、キシレンとエタノールとのインキュベーションをケミカルフードの下に実行します。
  3. 翌日、スライドを化学薬品フードの下のスライドホルダーに10分間入れて冷却します。
  4. スライドホルダーを100%キシレンで満たされた容器に3分間入れて、組織を脱パラフィンします。新鮮な100%キシレンを使用してインキュベーションを繰り返します。
    注意: この時点から、試験片が常に濡れていることを確認してください。
  5. 以下の溶液で満たされた容器にスライドホルダーを順次配置することにより、エタノール勾配で切片を再水和します:100%エタノール、3分;95%エタノール、3分;90%エタノール、3分;80%エタノール、3分;70%エタノール、3分
  6. スライドホルダーを蒸留水で満たされた容器に移し、流蒸留水で1分間すすぎます。
  7. スライドをホルダーから(一度に1つずつ)取り出し、ペーパータオルを軽くたたき、ペーパータオルで標本の周囲を慎重に乾かします。疎水性バリアを提供するペン(PAPペン)を使用して、標本の周りに閉じた形状を描きます。加湿チャンバーに入れます。
  8. DNaseフリープロテイナーゼKでインキュベートし、100 μLのDNaseフリープロテイナーゼK溶液(DPBSで1:25に希釈)を疎水性バリア内の検体の表面に加えます。加湿チャンバー内で室温で15分間インキュベートします。
    注意:プロテイナーゼKは潜在的に危険な物質です:健康被害(H315-H319-H334)。
  9. ペーパータオルでスライドガラスをタップしてプロテイナーゼK溶液を取り除きます。スライドをスライドホルダーに入れ、DPBSで満たされた容器に移します。5分間振とうしながらスライドを洗い、2回繰り返します。毎回、DPBSの新しい部分を使用してください。
  10. TUNEL反応混合物を調製する:標識溶液(1x)と酵素溶液(10x)を混合する。よくピペットで。
  11. スライドをホルダーから取り出します(一度に1つずつ)。ペーパータオルでスライドガラスを軽くたたいて余分な洗浄液を取り除き、加湿チャンバーに入れます。50 μLのTUNEL反応混合物を検体の表面に添加し、加湿チャンバー内で37°Cの暗所で60分間インキュベートします。ネガティブコントロールの場合は、ラベル溶液のみを使用してください(TdTなし)。
  12. ペーパータオルでスライドガラスをタップして、TUNELソリューションを取り外します。スライドをスライドホルダーに入れ、DPBSで満たされた容器に移します。5分間振とうしながらスライドを洗い、2回繰り返します。毎回、DPBSの新しい部分を使用してください。
  13. スライドをホルダーから取り出します(一度に1つずつ)。ペーパータオルでスライドガラスを軽くたたいて余分な洗浄液を取り除き、加湿チャンバーに入れます。試料の表面に100 μLのHoechst 33258溶液(TBS-Tweenで1:1000に希釈)を加えて、Hoechst 33258対比染色を行います。暗所で室温で5分間インキュベートします。
  14. ペーパータオルでスライドガラスをタップして、Hoechst 33258溶液を取り除きます。スライドをスライドホルダーに入れ、DPBSで満たされた容器に移します。5分間振とうしながらスライドを洗います。
  15. スライドホルダーからスライドを取り出します。ペーパータオルでティッシュの周囲を乾かし、標本の大きさに応じて、水系封入剤を1滴または2滴検体の表面に添加します。スライドガラスの上にカバーガラスをそっと置き、取り付けます(気泡を残さないように注意してください)。必要に応じて軽く押します。ガラスの表面全体を覆い、密封する必要があります。
  16. スライドを室温で一晩暗所に置いて乾燥させます。通常、封入剤は24時間以内に固化します。スライドが乾燥していることを確認するために、サンプルスライドを作成できます。封入剤を一滴置き、室温で暗所に一晩放置します。翌日、ドロップをタッチして固まっているかどうかを確認します。
  17. スライドが乾いたら、発光波長フィルターを備えた蛍光顕微鏡を使用して染色組織を分析し、TUNEL染色(535 nm)を視覚化できます。
  18. 顕微鏡スライドをステージに置き、サンプルが視野の中央にくるまで移動し、フォーカスノブを使用してフォーカスを調整し、10倍および/または20倍の倍率の対物レンズを使用して、対照組織(偽照射)と比較して染色を分析します。顕微鏡にカメラが装備されていれば、画像も撮ることができます。チャンネルごとに個別に画像を撮り、後でマージします。
    注:この手順はここで停止できます。スライドは4°Cで保存し、後で分析することができます。汚れがゆっくりと消えていくため、スライドを14日以上保管しないでください。

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Representative Results

12 Gy全身照射(TBI)をマウスの遺伝的系統追跡と組み合わせて使用 することで、腸内の放射線損傷の結果を完全に分析することができます。まず、 Bmi1-CreER;Rosa26eYFPマウスは、Bmi1+ 予備幹細胞集団内で黄色蛍光タンパク質(EYFP)発現の増強を誘導するタモキシフェン注射を単回受けた。タモキシフェン注射の2日後に、マウスは照射または偽照射を受けた。安楽死の3時間前に、マウスにEdUを注射した。安楽死後、照射後0時間、3時間、6時間、24時間、48時間、72時間、96時間、および7日目に小腸検体を採取して分析しました。前述の経時変化からの代表的なヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)画像(図1)は、損傷に対する腸上皮応答を示しています。0時間の時点は、恒常性腸上皮の実例です(図1)。これに続いて、3時間から48時間の間に陰窩コンパートメント内の細胞が失われることを特徴とするアポトーシス相が続きます(図1)。その後、再生段階が続き、72時間から96時間の間に高増殖性細胞が陰窩に生息していることがわかります(図1)。最後に、これは正規化フェーズにつながり、ここでは7日目の時点(図1)で表されます。

図2は、EdU(S期の細胞のマーカー)およびKi-67(G1、S、およびG2/M期の細胞のマーカー)の免疫蛍光染色によって評価された腸陰窩細胞の増殖状態の変化を示し、系統追跡(EYFP+細胞)はBmi1+予備幹細胞に由来する細胞をマークします。恒常性維持中(図2、0時間偽)、EYFPの発現によってマークされたBmi1+陽性細胞は、陰窩内の+4-+6位置に制限されます。アポトーシス期(24時間および48時間)の間、EYFP陽性細胞の数が減少します(図2)。再生期(72時間および96時間)は、急速に増殖するBmi1+陽性細胞とその前駆細胞によって特徴付けられます(図2)。照射後7日までに、さらなる増殖と遊走により腸陰窩細胞が補充され、腸上皮の完全性が回復しました(図2)。

偽照射マウス(対照)では、EdUおよびKi-67は、正常な腸恒常性に典型的な腸陰窩のEYFP陰性増殖細胞を染色し、活性幹細胞からトランジット増幅ゾーンを介して伸びます(図2)。放射線損傷は、EdUおよびKi-67染色の減少によって示されるように、アポトーシス期に高増殖細胞の損失を引き起こします(図2)。予備幹細胞(この例では、EYFPは Bmi1+ 陽性細胞とマークされています)の活性化とそれらの増殖は、損傷後72時間および96時間ではっきりと見えるEdUおよびKi-67陽性細胞の増加をもたらし、陰窩はほぼEYFP、EdU、およびKi-67と共染色された細胞のみで構成されます。観察された増殖レベルは、損傷後7日で正常化します(図2)。

放射線損傷によるアポトーシスを説明するために、TUNEL染色を行い、代表的な画像を 図3に含めます。恒常性維持中(図3)、通常は急速な腸上皮代謝回転に典型的なアポトーシスを起こしている細胞はほとんどありません。TUNEL染色の明らかな増加は、照射後のアポトーシス期の後半(24時間および48時間)に観察できます(図3)。再生段階では、TUNEL染色は再生陰窩内で着実に減少し、陰窩が正常化すると再びほとんどなくなります(図3)。提示されたプロトコルは、損傷後の腸細胞の挙動に関する洞察を提供できる標識技術(TUNEL、EdU、Ki-67、EYFP)の簡単で広く採用されている組み合わせを利用したシンプルで親しみやすい免疫蛍光染色法について説明しています(ここでは照射)。このアプローチは、特定の状況における腸上皮の再生過程を調節するメカニズムを研究するために採用することができる。このアプローチおよび同様のアプローチを採用することで、さまざまな腸の損傷に続く代替再生プロセスを明らかにし、さらに、バリア機能の喪失を防ぐための治療戦略の調査が可能になります。

Figure 1
図1:全身照射後の経時変化後の小腸組織のヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)染色切片の代表的な画像。 Bmi1-CreER;Rosa26eYFPマウスは、12Gy全身照射または偽照射の2日前にタモキシフェンを1回投与した。マウスを屠殺し、図に示す時点で小腸組織を採取した。すべての画像は10倍の倍率で撮影されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:照射後の小腸切片の免疫蛍光染色の代表的な画像。 Bmi1-クレER;Rosa26eYFPマウスは、12Gy全身照射または偽照射の2日前にタモキシフェンを1回投与した。マウスを屠殺し、図に示す時点で小腸組織を採取した。組織切片をEdUで染色してS期(ピンク色)の細胞をマークし、Ki-67で染色してG0、S、およびG2/M期(黄色)の細胞をマークしました。EYFP(緑色)は、 Bmi1+ 細胞とその前駆細胞をマークし、系統追跡を示します。切片をさらにDAPI(青色)で対比染色して核を可視化した。データは、10倍の倍率でマージされた画像として表示され、20倍の倍率で個々の汚れの挿入図として表示されます(これらは10倍の画像から取得されます)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:照射時の小腸切片の免疫蛍光TUNEL染色の代表的な画像。 Bmi1-CreER;Rosa26eYFPマウスは、12Gy全身照射または偽照射の2日前にタモキシフェンを1回投与した。マウスを屠殺し、図に示す時点で小腸組織を採取した。TUNEL(赤)はアポトーシス細胞を染色します。これらの画像をDAPI(青)で対比染色して核を可視化した。表示画像は20倍の倍率で撮影したものです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

このプロトコルは、堅牢で再現性のある放射線障害モデルを記述します。これにより、損傷後7日間の腸上皮の変化を正確に分析することができます。重要なことに、選択された時点は損傷の重要な段階を反映しており、腸への明確な変化(損傷、アポトーシス、再生、および正常化段階)によって特徴付けられます60。この照射モデルは確立され、注意深く評価されており、放射線療法を受けている患者が経験する損傷の適切な症状を模倣していることを示している61。結腸直腸癌および婦人科癌の患者の半数以上が腹部放射線療法を受けています40,62,63。放射線治療を標的とする高度な方法にもかかわらず、患者は健康な腸組織の照射を経験し、ここで提示された全身照射モデルで観察されたものと非常によく似た病態生理を生み出します。したがって、本明細書に記載される放射線モデルは、患者および/または医療従事者の偶発的な放射線被曝の影響に潜在的に対処することができ、したがって、ヒトの健康にとって不可欠である。

Bmi1-クレER;Rosa26eYFPマウスモデルは、マウスBmi1(Bmi1ポリコーム薬指癌遺伝子)プロモーターの転写制御下でタモキシフェン誘導性Creを担持している。さらに、これらのマウスはR26-stop-EYFP配列を持っており、STOPコドンはloxP側に隣接しており、続いてGt(ROSA)26Sor遺伝子座に挿入された増強黄色蛍光タンパク質遺伝子(EYFP)が続きます。EYFPの発現は、上流のloxPに隣接するSTOP配列によってブロックされますが、タモキシフェン誘導性のCreを介した標的欠失によって活性化することができ、陰窩細胞の予備幹細胞特異的亜集団であるBmi1発現細胞の系統追跡を可能にします。Bmi1-CreERと組み合わせた放射線プロトコル。Rosa26eYFPマウスモデルは、腸管再生の調節における転写因子の役割を研究するために以前に採用されている18、56。図1〜図3に提示された代表的な結果は、最近の刊行物18、56に提示されたものと同様の結果を示す。

注目すべきは、Bmi1-CreERです。Rosa26eYFPマウスは、腸管再生の研究に採用された複数のトランスジェニック動物モデルの1つにすぎません。他のマウス系統追跡モデルは、腸上皮の再生能力における特定の細胞および経路の役割を実証するために放射線と組み合わされています18,26,32,33,34,35,36,37,56,64,65,66,67.これらのモデルは、予約幹細胞のさまざまな集団の役割を調査し、分泌細胞系統と腸細胞系統の前駆体を探索し、腸上皮細胞の各亜集団内の特定の遺伝子の機能を研究するように設計されています。これらの研究の結果を組み合わせることで、腸上皮の再生能力の理解が深まることが期待されます。

重要なことに、わずかな変更で、この技術は、放射線損傷時の微生物叢と異なる上皮、間質、および免疫細胞集団との関係の調査を可能にするはずです。異なる系統追跡動物モデルを導入することで、損傷後の細胞のさまざまな亜集団のリアルタイムの行動と相互作用の研究が可能になります。あるいは、組織の染色をRNAシーケンシング、シングルセルRNAシーケンシング、蛍光活性化セルソーティング(FACS)、またはプロテオミクス分析に置き換えることで、損傷後の腸管再生中の特定の細胞系譜の役割に関するより深い知識を収集することもできます68,69。この傷害モデルは、照射の副作用を最小限に抑え、回復時間を短縮し、患者ケアの質を向上させることを目的とした新しい治療法をテストするために利用することができます70。ここで説明する放射線モデルは、腸上皮の再生を研究するための有用なツールとして役立ちますが、いくつかの制限もあります。全身の放射線量は必ずその後の造血症候群を引き起こし、腸管再生の調査を妨げます。これは骨髄移植によって回避することができます。さらに、腹部のみの損傷プロトコルへの変更は、照射71の副作用のいくつかを潜在的に改善し得る。ただし、このモデルでは、損傷に対する腸の反応に影響を与える可能性のある追加の手順が必要です(麻酔など)。ちなみに、腹部放射線は、全身照射(WBI)とは異なり、造血症候群を伴わない放射線誘発胃腸症候群(RIGS)を引き起こし、WBIは同様のGI症状を引き起こしますが、損傷後の造血機能の部分的な喪失が含まれます71,72。

注目すべきことに、このプロトコルに記載されているような遺伝子操作された動物モデルは洗練されており、特定の細胞の系統追跡を可能にします。ただし、これらのモデルは非常に有益ですが、維持するには追加の作業が必要です。条件付き遺伝子欠失を可能にするトランスジェニック動物モデルは、生成が困難であり、損傷時のタイムリーな欠失は容易に達成されない可能性がある。さらに、ほとんどのトランスジェニックモデルは、目的の遺伝子の条件付き欠失または不活性化のみを可能にしますが、誘導性ではないため、遺伝子機能を回復することができず、研究を妨げる可能性があります。さらに、トランスジェニック動物モデルは、通常、目的の遺伝子の不活性化または過剰発現を達成するために、追加の化学物質(例えば、タモキシフェン、ドキシサイクリン)による処理を必要とする。これらの物質による治療は、ある程度、腸上皮の反応を変化させるか、または傷害の重症度を増す可能性がある73,74,75,76。加えて、タモキシフェンによる系統追跡の誘導は、再生に関与する細胞の標識を改善するために放射線傷害の時により近いところに導入することができる(例えば、傷害の6〜24時間前)。したがって、トランスジェニックモデルを野生型マウスとIF染色の組み合わせ(例えば、Ki−67、PCNA、EdU、TUNEL、カスパーゼ3)で代用することができる。このモデルは腸の再生能力の分析を可能にするが、細胞の特定の亜集団の研究は許さない。

この原稿で説明されているプロトコルには、いくつかの重要なステップがあります。健康なマウスは放射線にさらされ、化学物質による治療を受けるため、実験に使用することが最も重要です。異なるマウスグループでの実験が数日、数週間、または数か月間隔で行われる場合は、同じタイムライン、たとえば、同じ時間にタモキシフェン注射を行うことをお勧めします。照射プロセスは迅速に行われ、マウスはすぐに元のケージに戻されるべきです。さらに、軟化した食品と大量の水を提供することで、放射線の悪影響の一部を改善することができます。スイスロール技術は、腸組織59の包括的な分析を可能にすることが示唆される。この技術は些細なことではなく、染色のための組織の非の打ちどころのない品質が達成されることを保証するために、事前のトライアウトを行う必要があります。マウスの実験および染色のためのすべての溶液は、新たに調製し、適切な条件下で保存する必要があります。抗体を扱う場合、ポジティブコントロールとネガティブコントロールを使用してスライドをテストし、可能であれば、同じカタログ番号とロット番号の抗体を使用することが重要です。免疫蛍光スライドは4°Cで保存し、調製後1週間以内に画像化する必要があります。-20°Cでも長期間保管すると、信号が失われる可能性があります。H&Eスライドは、蛍光色素の安定性が失われる心配がないため、室温で保存できます。

要約すると、ここで紹介する系統追跡放射線傷害モデルは、侮辱後の腸細胞の運命を追跡するための再現性のある関連性のあるモデルであり、多様なマウスモデルや分子技術と組み合わせて、腸上皮の病態生理学の理解を深めることができます。腸管上皮再生を支配する分子および細胞メカニズムへの洞察は、新しい治療法と有益な治療介入の開発につながる可能性があります。

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Disclosures

著者には利益相反はありません。

Acknowledgments

著者らは、組織標本の準備に関する専門家の支援についてはストーニーブルックがんセンター組織学研究コア、動物の世話と取り扱いを支援するストーニーブルック大学の実験動物資源部門に感謝したいと思います。この研究は、国立衛生研究所からの助成金によって支援されました DK124342 Agnieszka B. Bialkowskaに授与され、DK052230からVincent W. Yang博士に授与されました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe BD 309659 -
16G Reusable Small Animal Feeding Needles: Straight VWR 20068-630 -
27G x 1/2" needle BD 305109 -
28G x 1/2" Monoject 1mL insulin syringe Covidien 1188128012 -
5-Ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) Santa Cruz Biotechnology sc284628A 10 mg/mL in sterile DMSO:water (1:4 v/v), aliquot and store in -20°C
Azer Scientific 10% Neutral Buffered Formalin Fisher Scientific 22-026-213 -
B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J The Jackson Laboratory Strain #:006148
B6;129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/J The Jackson Laboratory Strain #:010531
Bovine Serum Albumin Fraction V, heat shock Millipore-Sigma 3116956001
Chicken anti-GFP Aves GFP-1020
Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 imaging kit, Invitrogen Thermo Fisher Scientific C10638 -
Corn oil Millipore-Sigma C8267 -
Decloaking Chamber Biocare Medical DC2012 -
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher BioReagents BP231-100 light sensitive
DNase-free proteinase K Invitrogen C10618H diluted 25x in DPBS
Donkey anti-chicken AF647 Jackson ImmunoResearch 703-605-155
DPBS Fisher Scientific 21-031-CV -
Eosin Fisher Scientific S176
Fluorescence Microscope Nikon Eclipse 90i Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20X Nikon
Fluoromount Aqueous Mounting Medium Millipore-Sigma F4680-25ML
Gamma Cell 40 Exactor Best Theratronics Ltd. - 0.759 Gy min-1
Goat anti-rabbit AF488 Jackson ImmunoResearch 111-545-144
Hematoxylin Solution, Gill No. 3 Millipore-Sigma GHS332
HM 325 Rotary Microtome from Thermo Scientific Fisher Scientific 23-900-668
Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) Thermo Fisher Scientific H3569 dilution 1:1000
Hydrogen Peroxide Solution, ACS, 29-32%, Spectrum Chemical Fisher Scientific 18-603-252 -
In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche) Millipore-Sigma 11684795910
Liquid Blocker Super PAP PEN, Mini Fisher Scientific DAI-PAP-S-M
Lithium Carbonate (Powder/Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific L119-500 0.5g/1L dH2O
Luer-Lok Syringe sterile, single use, 10 mL VWR 89215-218 -
Methanol VWR BDH1135-4LP
Pharmco Products Ethyl alcohol, 200 PROOF Fisher Scientific NC1675398 -
Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Acetic Acid ACS Grade Capitol Scientific AAP-281000ACSCSLT -
Rabbit anti-Ki67 BioCare Medical CRM325
Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Mounting Medium Fisher Scientific 22-050-262
Scientific Industries Incubator-Genie for baking slides at 65 degree Fisher Scientific 50-728-103
Sodium Citrate Dihydrate Fisher Scientific S279-500
Stainless Steel Dissecting Kit VWR 25640-002
Superfrost Plus micro slides [size: 25 x 75 x 1 mm] VWR  48311-703
Tamoxifen Millipore-Sigma T5648 30 mg/mL in sterile corn oil, preferably fresh or short-sterm storage in -20°C, light sensitive
Tissue-Tek 24-Slide Holders with Detachable Handle Sakura 4465
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Blades Sakura 4689
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set Sakura 4451
Tissue-Tek Staining Dish, Green with Lid Sakura 4456
Tissue-Tek Staining Dish, White with Lid Sakura 4457
Tween 20 Millipore-Sigma P7949
Unisette Processing Cassettes VWR 87002-292 -
VWR Micro Cover Glasses VWR 48393-081
Xylene Fisher Scientific X5P-1GAL

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生物学、第185号、
電離放射線照射による腸管上皮再生
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Orzechowska-Licari, E. J., LaComb, J. F., Giarrizzo, M., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation. J. Vis. Exp. (185), e64028, doi:10.3791/64028 (2022).

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