Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Регенерация эпителия кишечника в ответ на ионизирующее облучение

Published: July 27, 2022 doi: 10.3791/64028
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 1
1Department of Medicine, Renaissance School of Medicine at Stony Brook University, 2Department of Physiology and Biophysics, Renaissance School of Medicine at Stony Brook University

Summary

Желудочно-кишечный тракт является одним из наиболее чувствительных органов к травмам при радиотерапевтическом лечении рака. Это одновременно система органов с одной из самых высоких регенеративных способностей после таких инсультов. Представленный протокол описывает эффективный метод исследования регенеративной способности кишечного эпителия.

Abstract

Кишечный эпителий состоит из одного слоя клеток, но содержит несколько типов терминально дифференцированных клеток, которые образуются в результате активной пролиферации кишечных стволовых клеток, расположенных на дне кишечных крипт. Однако во время острого повреждения кишечника эти активные кишечные стволовые клетки подвергаются клеточной гибели. Гамма-облучение является широко используемым методом лечения колоректального рака, который, хотя и является терапевтически эффективным, имеет побочный эффект истощения активного пула стволовых клеток. Действительно, пациенты часто испытывают желудочно-кишечный лучевой синдром во время лучевой терапии, отчасти из-за активного истощения стволовых клеток. Потеря активных кишечных стволовых клеток в кишечных криптах активирует пул обычно спокойных резервных стволовых клеток кишечника и индуцирует дедифференцировку секреторных и энтероцитарных клеток-предшественников. Если бы не эти клетки, кишечный эпителий не смог бы восстановиться после лучевой терапии и других подобных серьезных повреждений тканей. Новые достижения в технологиях отслеживания линий позволяют отслеживать активацию, дифференцировку и миграцию клеток во время регенерации и успешно используются для изучения этого в кишечнике. Это исследование направлено на то, чтобы изобразить метод анализа клеток кишечного эпителия мыши после лучевого поражения.

Introduction

Кишечный эпителий человека покрывал бы примерно половину площадки для бадминтона, если бы он былполностью плоским1. Вместо этого этот одноклеточный слой, отделяющий людей от содержимого их кишечника, уплотняется в серию пальцевидных выступов, ворсинок и углублений, крипт, которые максимизируют площадь поверхности кишечника. Клетки эпителия дифференцируются по оси крипты-ворсинки. Ворсинки в основном состоят из поглощающих питательные вещества энтероцитов, бокаловидных клеток, секретирующих слизь, и гормонопродуцирующих энтероэндокринных клеток, в то время как крипта в основном состоит из дефензин-продуцирующих клеток Панета, активных и резервных стволовых клеток и клеток-предшественников 2,3,4,5. Кроме того, двунаправленная связь этих клеток со стромальными и иммунными клетками нижележащего мезенхимального компартмента и микробиотой просвета создает сложную сеть взаимодействий, которая поддерживает гомеостаз кишечника и имеет решающее значение для восстановления после травмы 6,7,8.

Кишечный эпителий является наиболее быстро самообновляющейся тканью в организме человека, со скоростью обновления 2-6 дней 9,10,11. Во время гомеостаза активные стволовые клетки у основания кишечных крипт (столбчатые клетки крипты), отмеченные экспрессией богатого лейцином повторного рецептора, связанного с G-белком (LGR5), быстро делятся и обеспечивают клетки-предшественники, которые дифференцируются во все другие линии кишечного эпителия. Однако из-за высокой митотической скорости активные стволовые клетки и их непосредственные предшественники особенно чувствительны к поражению гамма-излучением и подвергаются апоптозу после облучения 5,12,13,14. При их потере резервные стволовые клетки и нестволовые клетки (субпопуляция предшественников и некоторых терминально дифференцированных клеток) в кишечных криптах подвергаются активации и пополняют базальный компартмент крипты, который затем может восстанавливать клеточные популяции ворсинок и, таким образом, регенерировать кишечный эпителий15. Используя методы отслеживания происхождения, несколько исследовательских групп продемонстрировали, что резервные (покоящиеся) стволовые клетки способны поддерживать регенерацию при потере активных стволовых клеток 13,16,17,18,19,20,21,22. Эти клетки характеризуются наличием онкогена 1-го белка поликомбного комплекса (Bmi1), гена обратной транскриптазы теломеразы мыши (mTert), гомеобокса хмеля (Hopx) и богатого лейцином гена повторного белка 1 (Lrig1). Кроме того, было показано, что нестволовые клетки способны пополнять кишечные крипты при повреждении 23,24,25,26,27,28,29,30,31. В частности, было показано, что предшественники секреторных клеток и энтероцитов подвергаются дедифференцировке при повреждении, возвращаются к стволовым клеткам и поддерживают регенерацию кишечного эпителия. Недавние исследования выявили клетки, экспрессирующие несколько маркеров, которые обладают способностью приобретать стволовые характеристики при травме (такие как DLL+, ATOH1+, PROX1+, MIST1+, DCLK1+)32,33,34,35,36. Удивительно, но Yu et al. показали, что даже зрелые клетки Панета (LYZ+) могут способствовать регенерации кишечника37. Кроме того, помимо апоптоза эпителиальных клеток кишечника и нарушения функции эпителиального барьера, облучение приводит к дисбиозу кишечной флоры, активации иммунных клеток и инициации провоспалительного ответа, а также активации мезенхимальных и стромальных клеток38,39.

Гамма-излучение является ценным терапевтическим инструментом при лечении рака, особенно при колоректальных опухолях40. Однако облучение значительно влияет на гомеостаз кишечника, вызывая повреждение клеток, что приводит к апоптозу. Радиационное облучение вызывает множественные возмущения, которые замедляют выздоровление пациента и характеризуются повреждением слизистой оболочки и воспалением в острой фазе, а также диареей, недержанием мочи, кровотечением и болями в животе в течение длительного времени. Этот набор проявлений называется желудочно-кишечной радиационной токсичностью. Кроме того, радиационно-индуцированное прогрессирование трансмурального фиброза и/или склероза сосудов может проявиться только спустя годы после лечения38,41. Одновременно с самой травмой радиация вызывает реакцию восстановления в клетках кишечника, которая активирует сигнальные пути, ответственные за инициирование и организацию регенерации42. Радиационно-индуцированное заболевание тонкой кишки может возникать в результате лучевой терапии органов малого таза или брюшной полости, проводимых в других органах (таких как шейка матки, простата, поджелудочная железа, прямая кишка)41,43,44,45,46. Таким образом, поражение кишечника от облучения является серьезной клинической проблемой, и лучшее понимание патофизиологии, вероятно, будет способствовать разработке вмешательств для облегчения желудочно-кишечных осложнений, связанных с лучевой терапией. Существуют и другие методы, которые позволяют исследовать регенеративное назначение кишечного эпителия, помимо облучения. Были разработаны трансгенные и химические мышиные модели для изучения воспаления и последующей регенерации47. Декстран сульфат натрия (DSS) индуцирует воспаление в кишечнике и приводит к развитию характеристик, сходных с характеристиками воспалительного заболевания кишечника48. Комбинация лечения DSS проканцерогенным соединением азоксиметаном (ОСО) может привести к развитию рака, связанного с колитом48,49. Травма, вызванная ишемией, является еще одним методом, используемым для изучения регенеративного потенциала кишечного эпителия. Эта методика требует опыта и хирургических знаний50. Кроме того, вышеупомянутые методы вызывают различные виды повреждений, чем радиация, и могут привести к вовлечению различных механизмов регенерации. Кроме того, эти модели отнимают много времени, в то время как радиационная техника довольно короткая. В последнее время методы in vitro с использованием энтероидов и колоноидов, генерируемых из кишечника и толстой кишки, используются в сочетании с лучевым повреждением для изучения механизмов регенерации кишечника51,52. Однако эти методы не полностью повторяют орган, который они моделируют53,54.

Представленный протокол включает описание мышиной модели поражения гамма-излучением в сочетании с генетической моделью, которая после лечения тамоксифеном позволяет отслеживать линии, происходящие из резервной популяции стволовых клеток (Bmi1-CreER; Rosa26eYFP). Эта модель использует облучение всего тела 12 Гр, которое вызывает достаточно значительное повреждение кишечника для активации резервных стволовых клеток, в то же время позволяя проводить последующее исследование регенеративной способности кишечника в течение 7 дней после травмы55.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все мыши были размещены в Отделе лабораторных ресурсов животных (DLAR) в Университете Стоуни-Брук. Институциональный комитет по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Стоуни-Брук одобрил все исследования и процедуры с участием животных. Эксперименты с участием животных проводились строго в соответствии с утвержденным протоколом обращения с животными (IACUC #245094).

ПРИМЕЧАНИЕ: Штаммы мыши B6;129-Bmi1 tm1(cre/ERT)Mrc/J (Bmi1-Cre ER) и B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J (Rosa26eYFP) были коммерчески получены (см. Таблицу материалов) и скрещены для получения Bmi1-Cre ER; Мыши Rosa26eYFP (Bmi1ctrl), как описано ранее56,57,58.

1. Корпус Bmi1-Cre ER; Мыши Rosa26 eYFP

  1. Держите мышей в помещении для животных при температуре от 68 до 72 ° F и влажности от 30 до 70%, в 12-часовом / 12-часовом светлом/темном цикле, с водой и нормальным кормом ad libitum.
  2. Перед экспериментами подтверждают генотипы мышей с помощью стандартной методики генотипирования ПЦР57,58.

2. Подготовка животных и материалов

  1. Переведите мышей в экспериментальную комнату для содержания не менее чем за 7 дней до любых экспериментов, чтобы дать мышам акклиматизироваться.
  2. Сопоставляйте экспериментальных и контрольных животных по полу и возрасту.
  3. Подвергните контрольных животных индуцированной тамоксифеном Cre-опосредованной рекомбинации, но не облучению (фиктивное лечение, 0 Гр), при этом убедитесь, что экспериментальные животные получают инъекцию тамоксифена и подвергаются гамма-облучению.
  4. Приготовьте раствор тамоксифена. Ресуспендировать порошок тамоксифена в стерильном кукурузном масле в концентрации 30 мг / мл. Обрабатывайте ультразвуком в течение 3 мин циклами 30 с ВКЛ и 30 с ВЫКЛ с амплитудой 60%, а затем вращайте в темноте в течение 1 ч при комнатной температуре (RT). Раствор тамоксифена можно замораживать при температуре −20 °C, но не замораживайте/размораживайте его более одного раза. Желательно каждый раз готовить свежий раствор и не хранить его.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Тамоксифен чувствителен к свету. Оберните его оловянной фольгой во время вращения комнатной температуры.
    ВНИМАНИЕ: Тамоксифен является потенциально опасным веществом: опасностью для здоровья (GHS08) и окружающей среды (GHS09).
  5. Приготовьте исходный раствор 5-этинил-2'-дезоксиуридина (EdU). Ресуспендировать порошок EdU в 1/5 от общего объема стерильного диметилсульфоксида (ДМСО) и медленно добавить оставшиеся 4/5 от общего объема стерильной сверхчистой воды. После полного растворения аликвотировать и хранить при температуре -20 °C.
    ВНИМАНИЕ: 5-этинил-2′-дезоксиуридин (EdU) и диметилсульфоксид (ДМСО) являются потенциально опасными веществами: опасность для здоровья (H340 и H631, а также H227, H315 и H319 соответственно). EdU может вызывать генетические дефекты и подозревается в повреждении фертильности или нерожденных детей, а DMSO может вызывать раздражение кожи и глаз.
  6. Подготовьте реагенты для сбора и фиксации тканей: разбавьте этанол для приготовления 70% водного раствора, охладите DPBS до 4 °C и приготовьте модифицированный фиксирующий буфер Буэна (50% этанол и 5% уксусная кислота в дистиллированном H2O) и 10% буферный формалин.
    ВНИМАНИЕ: Этиловый спирт является потенциально опасным веществом: опасен для здоровья (H225-H319), легко воспламеняется (GHS02) и вызывает острую токсичность (GHS07). Уксусная кислота является потенциально опасным веществом: опасным для здоровья (H226-H314), легковоспламеняющимся (GHS02) и коррозионным (GHS05). Формалин является потенциально опасным веществом: опасным для здоровья (H350, H315, H317, H318, H370) и коррозионным. Формалин может вызвать рак, раздражение кожи и глаз, повреждение органов и аллергические кожные реакции.
  7. Подготовьте оборудование, необходимое для эвтаназии в соответствии с утвержденным методом (например, камера CO2 ), набор для вскрытия мышей (ножницы, щипцы), чашки Петри, иглу для зонда 16 G, прикрепленную к шприцу объемом 10 мл для промывания кишечника, и гистологические кассеты.

3. Гамма-облучение всего тела (ЧМТ) и сбор тканей

  1. За два дня до облучения гамма-облучением вводите экспериментальным животным однократную дозу тамоксифена, чтобы вызвать Cre-опосредованную рекомбинацию и отслеживание клеточной линии BMI1 / EYFP + . Взвесьте каждое животное и рассчитайте дозу 40 мг/кг массы тела тамоксифена, ресуспендированного в кукурузном масле. Продезинфицируйте область брюшной полости 70% этанолом и введите тамоксифен внутрибрюшинно с помощью иглы 27G, прикрепленной к шприцу объемом 1 мл.
  2. Наблюдайте за животными в течение следующих 48 часов, чтобы исключить потенциальную токсичность тамоксифена.
  3. Переведите мышей в комнату облучения в соответствии с указаниями местного учреждения.
  4. Рассчитайте время облучения, высвобождаемого источником 137Cs, в соответствии с текущей мощностью дозы экзитора. Например, если текущая мощность дозы равна 75,9 рад/мин (0,759 Гр мин-1 = 75,9 сГр м-1), время воздействия в минутах рассчитывается как желаемая доза/0,759. Для облучения животных до дозы 12 Гр ЧМТ время воздействия составляет ~15,81 мин (15 мин и 48 с).
  5. Продезинфицируйте камеру отбора проб в гамма-облучателе 70% раствором этанола; Поместите абсорбирующий коврик и животных в камеру для проб.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Животные, подвергшиеся фиктивному лечению, должны быть помещены в комнату для облучения, но не подвергаться гамма-облучению.
  6. Закройте крышку и закройте камеру.
  7. Запрограммируйте гамма-облучатель так, чтобы животные подвергались воздействию 12 Гр ЧМТ.
    1. Включите машину, повернув ключ в положение START.
    2. Введите номер оператора с помощью цифровой клавиатуры и подтвердите нажатием клавиши ENTER.
    3. Введите PIN-код с помощью цифровой клавиатуры и подтвердите нажатием клавиши ENTER.
    4. Нажмите 1 для выбора параметров.
    5. Нажмите 1 для настройки таймера.
    6. Нажмите 1 , чтобы узнать время облучения.
    7. Введите настройку таймера для следующего цикла с помощью цифровой клавиатуры (формат чч:мм:сс) и подтвердите нажатием клавиши ВВОД.
    8. Подтвердите настройки еще раз, нажав ENTER.
    9. Вернитесь в главное меню, нажав CLEAR 2x.
    10. Нажмите START, чтобы начать экспозицию.
  8. Оставьте помещение на время активного воздействия. Машина автоматически остановится по истечении заданного времени и начнет издавать звуковой сигнал.
    ВНИМАНИЕ: Цезий-137 (137Cs) является смертельно опасным веществом (опасность для здоровья: H314). Внешнее воздействие больших количеств 137Cs может вызвать ожоги, острую лучевую болезнь и даже смерть.
  9. Выключите машину, повернув ключ в положение СТОП.
  10. Откройте камеру для образцов, снимите крышку, перенесите животных обратно в клетку и продезинфицируйте камеру для отбора проб 70% раствором этанола.
  11. Переведите животных обратно в обычную комнату содержания и наблюдайте за их состоянием после лечения.
  12. Контролируйте вес животных каждый день и немедленно усыпляйте их (несмотря на запланированный момент времени), если наблюдаются какие-либо симптомы измененного самочувствия, дистресса или потери веса, превышающие 15% от исходной массы тела.
  13. За три часа до планируемой эвтаназии продезинфицируйте область живота и, используя инсулиновый шприц 28 г, введите мышам 100 мкл исходного раствора EdU (вводимого внутрибрюшинно).
  14. Собирают проксимальный отдел кишечника через 0 ч, 3 ч, 6 ч, 24 ч, 48 ч, 72 ч, 96 ч и 168 ч после облучения.
    1. Проведите эвтаназию CO2 в соответствии со стандартами домашнего учреждения.
      ВНИМАНИЕ: Углекислый газ является опасным веществом (H280). Содержит газ под давлением; Может взорваться при нагревании. Может вытеснить кислород и вызвать быстрое удушье.
    2. Затем рассекают проксимальную часть тонкой кишки, удаляют прикрепленные ткани, промывают холодным DPBS с помощью иглы для прямого кормления 16 г, прикрепленной к шприцу объемом 10 мл, фиксируют модифицированным фиксирующим буфером Буэна с помощью иглы для прямого кормления 16 г, прикрепленной к шприцу объемом 10 мл, разрезают в продольном направлении и сворачивают проксимальную кишку с использованием техники швейцарского рулона, как описано ранее59.
  15. Поместите ткани в гистологическую кассету и оставьте на 24-48 ч при комнатной температуре в емкости с 10% буферным формалином. Объем формалина должен быть достаточным, чтобы полностью покрыть гистологические кассеты. Когда время инкубации истечет, с помощью щипцов перенесите гистологические кассеты в емкость, заполненную 70% этанолом. Затем приступайте к заделке тканевого парафина.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Встраивание тканевого парафина было выполнено Исследовательской лабораторией гистологии в Университете Стоуни-Брук. На этом процедуру можно остановить, а парафиновые блоки хранить при комнатной температуре.
    ВНИМАНИЕ: Формалин является потенциально опасным веществом: опасным для здоровья (H350, H315, H317, H318, H370) и коррозионным. Формалин может вызвать рак, раздражение кожи и глаз, повреждение органов и аллергические кожные реакции.

4. Гистологический анализ

  1. Охладите гистологические кассеты, содержащие образцы тканей, залитые парафином, поместив их на лед не менее чем на 1 час. С помощью микротома подготовьте для окрашивания срезы толщиной 5 мкм. Каждая ткань должна быть нарезана горизонтально, чтобы покрыть весь свернутый образец.
    1. После резки парафинового блока переложите срезы тканей на водяную баню, подогретую до 45 °С, и поместите срезы на заряженные предметные стекла. Оставьте предметные стекла на решетке на ночь при комнатной температуре для высыхания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом процедуру можно остановить, а слайды можно хранить при комнатной температуре.
  2. Поместите горки в держатель для слайдов и запекайте в духовке при температуре 65 °C в течение ночи. Горки можно выпекать более короткое время, 1-2 часа. Однако это не рекомендуется в случае свежесрезанных (менее 1 месяца) слайдов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите набор для ручного окрашивания предметного стекла под химический колпак и проведите инкубацию с ксилолом, этанолом и гематоксилином под химическим колпаком.
  3. На следующий день охладите предметные стекла, поместив их в держатель слайда под химическим колпаком на 10 минут.
  4. Депарафинизируйте ткани, поместив держатель предметного стекла в емкость, заполненную 100% ксилолом, на 3 мин. Повторите инкубацию, используя свежий 100% ксилол.
    ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента следите за тем, чтобы образцы всегда оставались влажными.
    ВНИМАНИЕ: Ксилол является потенциально опасным веществом: легковоспламеняющимся (GHS02), вызывающим острую токсичность (GHS07) и опасным для здоровья (H226 - H304 - H312 + H332 - H315 - H319 - H335 - H373 - H412). Потенциальные опасные последствия заключаются в том, что он смертелен при проглатывании или попадании в дыхательные пути и может вызвать раздражение кожи, глаз и дыхательных путей. Кроме того, он может влиять на двигательные функции, вызывая сонливость или головокружение, и вызывать повреждение органов в случае длительного или повторного воздействия.
  5. Регидратируют секции в градиенте этанола, помещая держатель слайда последовательно в емкости, заполненные следующими растворами: 100% этанол, 2 мин; 95% этанол, 2 мин; 70% этанол, 2 мин.
  6. Перенесите держатель слайдера в емкость, наполненную дистиллированной водой, и промойте в проточной дистиллированной воде в течение 2 минут.
  7. Поместите держатель слайда в емкость, наполненную раствором гематоксилина, и оставьте пятно на 5 мин (под химическим колпаком).
  8. Перенесите держатель предметного стекла в емкость, наполненную водопроводной водой, и промойте в проточной водопроводной воде до тех пор, пока окрашивание гематоксилином не станет синеватым, обычно через 2 минуты.
  9. Перенесите держатель слайда в контейнер, заполненный 5% (мас./об.) раствором карбоната лития. Погружение в 10 раз.
    ВНИМАНИЕ: Карбонат лития является потенциально опасным веществом: вызывает острую токсичность (GHS07) и опасность для здоровья (H302 - H319). Он вреден при проглатывании, вреден при контакте с кожей и вызывает серьезное раздражение глаз.
  10. Перенесите держатель слайдера в емкость, наполненную дистиллированной водой, и промойте в проточной дистиллированной воде в течение 2 минут.
  11. Поместите держатель слайда в емкость, наполненную эозином и пятном, на 5 минут.
  12. Перенесите держатель слайда в емкость, заполненную 70% этанолом, и ненадолго промойте (10 с).
  13. Обезвоживают секции, помещая держатель слайда последовательно в емкости, заполненные растворами градиента этанола: 95% этанола, 5 погружений; 100% этанол, 5 погружений.
  14. Очистите слайды, поместив держатель слайда в контейнер, заполненный 100% ксилолом, на 3 минуты. Повторите инкубацию, используя свежий 100% ксилол.
  15. Выньте предметное стекло из стойки, высушите область вокруг тканей бумажным полотенцем и, в зависимости от размера образца, добавьте одну или две капли монтажной среды на основе ксилола на поверхность образца. Установите, аккуратно поместив покровное стекло поверх предметного стекла (будьте осторожны, чтобы не оставить пузырьков воздуха). При необходимости аккуратно нажмите. Вся поверхность стекла должна быть покрыта и герметична.
  16. Высушите предметные стекла, оставив их под химическим колпаком на ночь. Как правило, монтажная среда затвердевает менее чем за 24 часа. Чтобы слайды были сухими, можно сделать образец слайда. Используя пустую направляющую, поместите каплю монтажной среды и оставьте под химическим колпаком на ночь. На следующий день прикоснитесь к капле и проверьте, затвердела ли она.
  17. Когда предметные стекла высохнут, проанализируйте гистологию тканей с помощью светового микроскопа или более совершенного микроскопа с каналом светлого поля.
    1. Поместите предметное стекло микроскопа на предметный столик, перемещайте его, пока образец не окажется в центре поля зрения, отрегулируйте фокусировку с помощью ручки фокусировки и используйте объектив с 10-кратным и/или 20-кратным увеличением для анализа гистологии по сравнению с контрольными тканями (фиктивное облучение).
    2. Если микроскоп оснащен камерой, сделайте также снимки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура может быть остановлена здесь; Предметные стекла можно хранить при комнатной температуре и анализировать позже. Не храните предметные стекла дольше 30 дней, так как пятна медленно исчезают.

5. Иммунофлюоресцентное окрашивание

  1. Охладите гистологические кассеты, содержащие образцы тканей, залитые парафином, поместив их на лед не менее чем на 1 час. С помощью микротома подготовьте для окрашивания срезы толщиной 5 мкм. Каждая ткань должна быть нарезана горизонтально, чтобы покрыть весь свернутый образец.
    1. После резки парафинового блока переложите срезы ткани на водяную баню, подогретую до 45 °С, и поместите срезы на заряженные предметные стекла. Оставьте предметные стекла на решетке на ночь при комнатной температуре для высыхания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом процедуру можно остановить, а слайды можно хранить при комнатной температуре.
  2. Поместите горки в держатель для слайдов и запекайте в духовке при температуре 65 °C в течение ночи. Горки можно выпекать более короткое время, 1-2 часа. Однако это не целесообразно в случае свежесрезанных (менее 1 месяца назад) слайдов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите набор для ручного окрашивания предметного стекла под химический колпак и проведите инкубацию с ксилолом, этанолом и H2 O2 / метанолом под химическим колпаком.
  3. На следующий день охладите предметные стекла, поместив их в держатель слайда под химическим колпаком на 10 минут.
  4. Депарафинизируйте ткани, поместив держатель предметного стекла в емкость, заполненную 100% ксилолом, на 3 мин. Повторите инкубацию, используя свежий 100% ксилол.
    ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента следите за тем, чтобы образцы всегда оставались влажными.
  5. Гасят эндогенную пероксидазу путем инкубации предметных стекол в течение 30 мин в емкости, заполненной 2% раствором перекиси водорода в метаноле под химическим колпаком.
    ВНИМАНИЕ: Метиловый спирт является потенциально опасным веществом: опасен для здоровья (H225-H301, H311, H331-H370), легковоспламеняющийся (GHS02) и вызывает острую токсичность (пероральную, кожную, ингаляционную) (GHS08). Перекись водорода является потенциально опасным веществом: вызывает коррозию (GHS05) и вызывает острую токсичность (GHS07).
  6. Регидратируйте секции в градиенте этанола, поместив держатель слайда последовательно в контейнеры, заполненные следующими растворами: 100% этанол, 3 мин; 95% этанол, 3 мин; 70% этанол, 3 мин.
  7. Перенесите держатель слайда в емкость, наполненную дистиллированной водой, и промойте в проточной дистиллированной воде в течение 2 мин.
  8. Чтобы извлечь антигены, перенесите держатель предметного стекла в контейнер с 250 мл цитратного буферного раствора (10 мМ цитрата натрия, 0,05% Tween-20, pH 6,0) и готовьте при 110 ° C в течение 10 минут с помощью камеры для снятия маскировки.
  9. Перенесите весь контейнер в холодильную камеру и дайте ему постепенно остыть в течение 30 минут.
  10. Через 30 мин замените цитратный буферный раствор дистиллированной водой и промойте в проточной дистиллированной воде до тех пор, пока не будут удалены все плавающие кусочки парафина.
  11. Выньте предметные стекла из держателя (по одному), постучите по бумажному полотенцу и тщательно высушите область вокруг образца бумажным полотенцем. Нарисуйте замкнутую форму вокруг образца с помощью ручки, обеспечивающей гидрофобный барьер (ПАП-ручка). Поместите в увлажненную камеру.
  12. Блок с 5% бычьим сывороточным альбумином (BSA) в TBS-Tween путем добавления 200 мкл раствора на поверхность образца. Убедитесь в отсутствии утечек. Инкубировать при 37 °C в увлажненной камере в течение 30 мин.
  13. Удалите блокирующий раствор, постучав предметным стеклом по бумажному полотенцу. Поместите обратно в увлажненную камеру. Добавьте 100 мкл соответствующей концентрации первичных антител, ресуспендированных в блокирующем буфере, и инкубируйте при 4 ° C с легким покачиванием в течение ночи. Для BMI1 / EYFP используйте куриный анти-GFP (разведение 1:500); для Ki-67 используйте кроличий анти-Ki-67 (разбавление 1:200).
  14. Удалите раствор антител, постучав предметным стеклом по бумажному полотенцу; поместите слайды в держатель слайда и переложите в контейнер, заполненный TBS-Tween. Промойте предметные стекла встряхиванием в течение 5 мин. Повторите 3 раза. Каждый раз используйте свежую порцию буфера TBS-Tween.
  15. Выньте предметные стекла из держателя (по одному), удалите излишки моющего раствора, постучав предметным стеклом по бумажному полотенцу, и поместите в увлажненную камеру. Добавьте 100 мкл соответствующей концентрации вторичных антител, ресуспендированных в блокирующем буфере, и инкубируйте при 37 ° C в течение 30 мин. Вторичные антитела должны быть конъюгированы с флуорофором. Для BMI1 / EYFP используйте ослиный антикуриный Alexa Fluor 647 (разбавление 1:500); для Ki-67 используйте козий антикроличий Alexa Fluor 488 (разведение 1:500).
  16. Удалите раствор антител, постучав предметным стеклом по бумажному полотенцу; поместите слайды в держатель слайда и переложите в контейнер, заполненный TBS-Tween. Промойте предметные стекла встряхиванием в течение 5 мин. Повторите 3 раза. Каждый раз используйте свежую порцию буфера TBS-Tween.
  17. Выньте предметные стекла из держателя (по одному), удалите излишки моющего раствора, постучав предметным стеклом по бумажному полотенцу, и поместите в увлажненную камеру. Добавьте 100 мкл раствора для окрашивания EdU, приготовленного в соответствии с инструкциями производителя и с использованием флуорофора Alexa Fluor 555.
  18. Удалите раствор EdU, постучав предметным стеклом по бумажному полотенцу; поместите слайды в держатель слайда и переложите в контейнер, заполненный TBS-Tween. Промойте предметные стекла встряхиванием в течение 5 мин. Повторите 2 раза. Каждый раз используйте свежую порцию буфера TBS-Tween.
  19. Вынимайте слайды из держателя (по одному); Удалите излишки моющего раствора, постучав предметным стеклом по бумажному полотенцу, и поместите в увлажненную камеру. Выполните контрокрашивание по Хёхсту 33258 путем добавления 100 мкл раствора Хёхста 33258 (разведение 1:1000 в TBS-Tween) на поверхность образца. Инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение 5 мин.
  20. Удалите раствор Hoechst 33258, постучав предметным стеклом по бумажному полотенцу; поместите слайды в держатель слайда и переложите в контейнер, наполненный TBS-Tween. Промойте предметные стекла встряхиванием в течение 5 минут.
  21. Выньте предметное стекло из держателя предметного стекла, высушите область вокруг салфеток бумажным полотенцем и, в зависимости от размера образца, добавьте одну или две капли монтажного носителя на основе морской среды на поверхность образца. Установите, аккуратно поместив покровное стекло поверх предметного стекла (будьте осторожны, чтобы не оставить пузырьков воздуха). При необходимости аккуратно нажмите. Вся поверхность стекла должна быть покрыта и герметична.
  22. Высушите предметные стекла, оставив их в темноте при комнатной температуре на ночь. Как правило, монтажная среда затвердевает менее чем за 24 часа. Чтобы слайды были сухими, можно сделать образец слайда. Используйте пустой слайд; Капните установочную среду и оставьте под химическим колпаком на ночь. На следующий день прикоснитесь к капле и проверьте, затвердела ли она.
  23. Когда предметные стекла высыхают, окрашенные ткани могут быть проанализированы с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного эмиссионными фильтрами длин волн, позволяющими визуализировать окрашивание Ki-67, EdU и BMI1 / EYFP (535 нм, 646 нм и 700 нм соответственно).
  24. Поместите предметное стекло микроскопа на предметный столик, перемещайте его, пока образец не окажется в центре поля зрения, отрегулируйте фокусировку с помощью ручки фокусировки и используйте объектив с 10-кратным и/или 20-кратным увеличением для анализа окрашивания по сравнению с контрольными тканями (фиктивное облучение). Если микроскоп оснащен камерой, можно делать снимки. Снимайте изображения для каждого канала отдельно и объединяйте позже.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура может быть остановлена здесь; предметные стекла можно хранить при температуре 4 °C и анализировать в дальнейшем. Не храните предметные стекла дольше 14 дней, так как пятно медленно исчезает.

6. Окрашивание TUNEL

  1. Охладите гистологические кассеты, содержащие образцы тканей, залитые парафином, поместив их на лед не менее чем на 1 час. С помощью микротома подготовьте для окрашивания срезы толщиной 5 мкм. Каждая ткань должна быть нарезана горизонтально, чтобы покрыть весь свернутый образец.
    1. После резки парафинового блока переложите срезы тканей на водяную баню, подогретую до 45 °С, и поместите срезы на заряженные предметные стекла. Оставьте предметные стекла на решетке на ночь при комнатной температуре для высыхания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом процедуру можно остановить, а слайды можно хранить при комнатной температуре.
  2. Поместите горки в держатель для слайдов и запекайте в духовке при температуре 65 °C в течение ночи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Слайды можно запекать в течение более короткого времени, 1-2 часа. Однако это не рекомендуется в случае свежесрезанных (менее 1 месяца назад) слайдов. Поместите набор для ручного окрашивания предметного стекла под химический колпак и проведите инкубацию с ксилолом и этанолом под химическим колпаком.
  3. На следующий день охладите предметные стекла, поместив их в держатель слайда под химическим колпаком на 10 минут.
  4. Депарафинизируйте ткани, поместив держатель предметных стекол в емкость, заполненную 100% ксилолом, на 3 мин. Повторите инкубацию, используя свежий 100% ксилол.
    ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента следите за тем, чтобы образцы всегда оставались влажными.
  5. Регидратируйте срезы в градиенте этанола, последовательно помещая держатель предметных стекол в емкости, заполненные следующими растворами: 100% этанол, 3 мин; 95% этанол, 3 мин; 90% этанол, 3 мин; 80% этанол, 3 мин; 70% этанол, 3 мин.
  6. Перенесите держатель слайда в емкость, наполненную дистиллированной водой, и промойте в проточной дистиллированной воде в течение 1 мин.
  7. Выньте предметные стекла из держателя (по одному), постучите по бумажному полотенцу и тщательно высушите область вокруг образца бумажным полотенцем. Нарисуйте замкнутую форму вокруг образца с помощью ручки, обеспечивающей гидрофобный барьер (ПАП-ручка). Поместите в увлажненную камеру.
  8. Инкубируют со свободной ДНКазой протеиназы К. Добавляют 100 мкл раствора ДНКазной протеиназы К (разбавление 1:25 в DPBS) на поверхность образца в гидрофобном барьере. Инкубировать при комнатной температуре в увлажненной камере в течение 15 мин.
    ВНИМАНИЕ: Протеиназа К является потенциально опасным веществом: опасность для здоровья (H315 - H319 - H334).
  9. Удалите раствор протеиназы К, постучав предметным стеклом по бумажному полотенцу; поместите слайды в держатель для слайдов и перенесите в контейнер, наполненный DPBS. Промойте предметные стекла встряхиванием в течение 5 мин. Повторите 2 раза. Каждый раз используйте свежую порцию DPBS.
  10. Приготовьте реакционную смесь TUNEL: смешайте раствор метки (1x) с раствором фермента (10x). Хорошо пипетка.
  11. Вынимайте слайды из держателя (по одному); Удалите излишки моющего раствора, постучав предметным стеклом по бумажному полотенцу, и поместите в увлажненную камеру. Добавьте 50 мкл реакционной смеси TUNEL на поверхность образца и инкубируйте в темноте при 37 °C в увлажненной камере в течение 60 мин. Для отрицательного контроля используйте только раствор метки (без TdT).
  12. Удалите раствор TUNEL, постучав предметным стеклом по бумажному полотенцу; поместите слайды в держатель слайда и переложите в контейнер, наполненный DPBS. Промойте предметные стекла встряхиванием в течение 5 мин. Повторите 2 раза. Каждый раз используйте свежую порцию DPBS.
  13. Вынимайте слайды из держателя (по одному); Удалите излишки моющего раствора, постучав предметным стеклом по бумажному полотенцу, и поместите в увлажненную камеру. Выполните контрокрашивание по Хёхсту 33258 путем добавления 100 мкл раствора Хёхста 33258 (разведение 1:1000 в TBS-Tween) на поверхность образца. Инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение 5 мин.
  14. Удалите раствор Hoechst 33258, постучав предметным стеклом по бумажному полотенцу; поместите слайды в держатель для слайдов и перенесите в контейнер, наполненный DPBS. Промойте предметные стекла встряхиванием в течение 5 минут.
  15. Выньте слайд из держателя слайда; Высушите область вокруг тканей с помощью бумажного полотенца и, в зависимости от размера образца, добавьте одну или две капли монтажной среды на основе воды на поверхность образца. Установите, аккуратно поместив покровное стекло поверх предметного стекла (будьте осторожны, чтобы не оставить пузырьков воздуха). При необходимости аккуратно нажмите. Вся поверхность стекла должна быть покрыта и герметична.
  16. Высушите предметные стекла, оставив их в темноте при комнатной температуре на ночь. Как правило, монтажная среда затвердевает менее чем за 24 часа. Чтобы слайды были сухими, можно сделать образец слайда. Поместите каплю монтажной среды и оставьте в темноте при комнатной температуре на ночь. На следующий день прикоснитесь к капле и проверьте, затвердела ли она.
  17. Когда предметные стекла высыхают, окрашенные ткани могут быть проанализированы с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного эмиссионными фильтрами длины волны, позволяющими визуализировать окрашивание TUNEL (535 нм).
  18. Поместите предметное стекло микроскопа на предметный столик, перемещайте его, пока образец не окажется в центре поля зрения, отрегулируйте фокусировку с помощью ручки фокусировки и используйте объектив с 10-кратным и/или 20-кратным увеличением для анализа окрашивания по сравнению с контрольными тканями (фиктивное облучение). Если микроскоп оснащен камерой, можно делать снимки. Снимайте изображения для каждого канала отдельно и объединяйте позже.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура может быть остановлена здесь; предметные стекла можно хранить при температуре 4 °C и анализировать в дальнейшем. Не храните предметные стекла дольше 14 дней, так как пятно медленно исчезает.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Использование облучения всего тела (ЧМТ) 12 Гр в сочетании с отслеживанием генетического происхождения мышей позволяет провести тщательный анализ последствий лучевого поражения кишечника. Для начала, Bmi1-CreER; Мыши Rosa26eYFP получили однократную инъекцию тамоксифена, которая индуцирует повышенную экспрессию желтого флуоресцентного белка (EYFP) в резервной популяции стволовых клеток Bmi1+ . Через два дня после инъекции тамоксифена мыши подверглись облучению или фиктивному облучению. За три часа до эвтаназии мышам вводили EdU. После эвтаназии образцы тонкой кишки были собраны для анализа через 0 ч, 3 ч, 6 ч, 24 ч, 48 ч, 72 ч, 96 ч и 7 дней после облучения. Репрезентативные изображения гематоксилина и эозина (H & E) (рис. 1) из вышеупомянутого временного курса иллюстрируют реакцию кишечного эпителия на травму. Временная точка 0 ч иллюстрирует гомеостатический эпителий кишечника (рис. 1); за этим следует апоптотическая фаза, характеризующаяся потерей клеток в компартментах крипты между 3 и 48 часами (рис. 1). Затем следует регенеративная фаза, когда можно обнаружить высокопролиферативные клетки, заселяющие крипты между 72 и 96 часами (рис. 1). Наконец, это приводит к фазе нормализации, представленной здесь 7-дневным моментом времени (рис. 1).

На рисунке 2 показаны изменения в пролиферативном статусе клеток крипт кишечника, оцениваемые иммунофлуоресцентным окрашиванием EdU (маркер клеток в S-фазе) и Ki-67 (маркер клеток в фазах G1, S и G2/M), в то время как отслеживание линии (клетки EYFP+) отмечает клетки, происходящие из резервных стволовых клеток Bmi1+. Во время гомеостаза (рис. 2, 0 ч фикции) Bmi1+-положительные клетки, отмеченные экспрессией EYFP, ограничены положением +4-+6 в криптах. Во время апоптотической фазы (24 ч и 48 ч) количество EYFP-положительных клеток уменьшается (рис. 2). Регенеративная фаза (72 ч и 96 ч) характеризуется быстрой пролиферацией Bmi1+-положительных клеток и их предшественников (рис. 2); через 7 дней после облучения дальнейшая пролиферация и миграция пополнили клетки кишечной крипты и восстановили целостность кишечного эпителия (рис. 2).

У фиктивно облученных мышей (контроль) EdU и Ki-67 окрашивают EYFP отрицательные пролиферативные клетки кишечных крипт, типичные для нормального кишечного гомеостаза, распространяющиеся от активных стволовых клеток через транзитно-амплифицирующую зону (рис. 2). Радиационное повреждение вызывает потерю высокопролиферативных клеток во время апоптотической фазы, о чем свидетельствует уменьшение окрашивания EdU и Ki-67 (рис. 2). Активация резервных стволовых клеток (в данном примере EYFP маркированные Bmi1+ положительные клетки) и их пролиферация приводят к увеличению положительных клеток EdU и Ki-67, отчетливо видимых через 72 ч и 96 ч после повреждения, где крипты состоят почти исключительно из клеток, окрашенных совместно с EYFP, EdU и Ki-67. Наблюдаемые уровни пролиферации нормализуются через 7 дней после травмы (рис. 2).

Чтобы проиллюстрировать апоптоз, вызванный радиационным повреждением, было выполнено окрашивание TUNEL, и репрезентативные изображения включены на рисунок 3. Во время гомеостаза (рис. 3) немногие клетки подвергаются апоптозу, типичному для обычно быстрого обновления эпителия кишечника. Явное увеличение окрашивания TUNEL можно наблюдать в конце апоптотической фазы (24 ч и 48 ч) после облучения (рис. 3). Во время регенеративной фазы окрашивание TUNEL неуклонно уменьшается в регенерирующих криптах и снова почти отсутствует, когда крипты нормализуются (рис. 3). Представленный протокол описывает простой и доступный метод иммунофлуоресцентного окрашивания с использованием простой и широко используемой комбинации методов маркировки (TUNEL, EdU, Ki-67, EYFP), который способен дать представление о поведении клеток кишечника после повреждения (в данном случае облучения). Этот подход может быть использован для изучения механизмов, регулирующих регенеративные процессы в эпителии кишечника в конкретных условиях. Использование этого и подобных подходов прольет свет на альтернативные регенеративные процессы после различных кишечных инсультов и, кроме того, позволит исследовать терапевтические стратегии для предотвращения потери барьерной функции.

Figure 1
Рисунок 1: Репрезентативные изображения окрашенных гематоксилином и эозином (H & E) участков тканей тонкой кишки после временного курса после облучения всего тела. bmi1-creER; Мыши Rosa26eYFP получили одну дозу тамоксифена за 2 дня до облучения всего тела 12 Гр или фиктивного облучения. Мышей приносили в жертву, а ткани тонкой кишки собирали в моменты времени, указанные на рисунке. Все снимки были сделаны с 10-кратным увеличением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Репрезентативные изображения иммунофлюоресцентного окрашивания участков тонкой кишки после облучения. БМИ1-Кре ЭР; Мыши Rosa26eYFP получили одну дозу тамоксифена за 2 дня до облучения всего тела 12 Гр или фиктивного облучения. Мышей приносили в жертву, а ткани тонкой кишки собирали в моменты времени, указанные на рисунке. Срезы тканей окрашивали EdU для маркировки клеток в S-фазе (розовый) и Ki-67 для маркировки клеток в фазах G0, S и G2/M (желтый). EYFP (зеленый) отмечает клетки Bmi1+ и их предшественников и демонстрирует отслеживание линии. Срезы были дополнительно окрашены DAPI (синий) для визуализации ядер. Данные показаны в виде объединенных изображений при 10-кратном увеличении и врезок отдельных пятен при 20-кратном увеличении (они получены из 10-кратных изображений). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Репрезентативные изображения иммунофлуоресцентного окрашивания TUNEL участков тонкой кишки при облучении. bmi1-creER; Мыши Rosa26eYFP получили одну дозу тамоксифена за 2 дня до облучения всего тела 12 Гр или фиктивного облучения. Мышей приносили в жертву, а ткани тонкой кишки собирали в моменты времени, указанные на рисунке. TUNEL (красный) окрашивает апоптотические клетки. Эти изображения были окрашены DAPI (синим) для визуализации ядер. Показанные изображения были сделаны с 20-кратным увеличением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот протокол описывает надежную и воспроизводимую модель лучевого поражения. Это позволяет проводить точный анализ изменений в кишечном эпителии в течение 7 дней после травмы. Важно отметить, что выбранные временные точки отражают критические стадии повреждения и характеризуются отчетливыми изменениями в кишечнике (фазы травмы, апоптоза, регенерации и нормализации)60. Эта модель облучения была создана и тщательно оценена, демонстрируя подходящее проявление травмы, имитирующее то, что испытывают пациенты, проходящие лучевую терапию61. Более половины пациентов с колоректальным раком и гинекологическими онкологическими заболеваниями проходят лучевую терапию брюшной полости 40,62,63. Несмотря на передовые методы таргетной лучевой терапии, пациенты испытывают облучение здоровой ткани кишечника, что приводит к патофизиологии, очень похожей на ту, которая наблюдается при представленной здесь модели облучения всего тела. Таким образом, радиационная модель, описанная в настоящем документе, потенциально может учитывать последствия случайного радиационного облучения пациентов и/или медицинского персонала и, таким образом, является жизненно важной для здоровья человека.

Bmi1-CreER; Модель мышей Rosa26eYFP несет индуцируемый тамоксифеном Cre под транскрипционным контролем промотора мыши Bmi1 (онкоген Bmi1 поликомба безымянного пальца). Кроме того, эти мыши несут последовательность R26-stop-EYFP, где кодон STOP окружен сторонами loxP, за которыми следует ген усиленного желтого флуоресцентного белка (EYFP), вставленный в локус Gt (ROSA) 26Sor. Экспрессия EYFP блокируется восходящей последовательностью STOP, окруженной loxP, но может быть активирована индуцированными тамоксифеном, опосредованными Cre целевыми делециями, что позволяет отслеживать происхождение клеток, экспрессирующих Bmi1, резервную субпопуляцию криптовых клеток, специфичную для стволовых клеток. Радиационный протокол в сочетании с Bmi1-CreER; Модель мышей Rosa26eYFP ранее использовалась для изучения роли транскрипционных факторов в регуляции регенерации кишечника18,56. Репрезентативные результаты, представленные на рисунках 1-3, показывают результаты, аналогичные тем, которые представлены в последних публикациях 18,56.

Следует отметить, что Bmi1-CreER; Мыши Rosa26eYFP являются лишь одной из нескольких моделей трансгенных животных, используемых для изучения регенерации кишечника. Другие модели отслеживания линий мышей были объединены с радиацией, чтобы продемонстрировать роль специфических клеток и путей в регенеративной способности кишечного эпителия 18,26,32,33,34,35,36,36,37,56,64,65,66,67 . Эти модели предназначены для изучения роли различных популяций резервированных стволовых клеток, изучения предшественников секреторных и энтероцитарных линий и изучения функции специфических генов в каждой субпопуляции эпителиальных клеток кишечника. Комбинированные результаты этих исследований помогут расширить понимание регенеративной способности кишечного эпителия.

Важно отметить, что с незначительными изменениями этот метод должен позволять исследовать взаимосвязь между микробиотой и различными популяциями эпителиальных, стромальных и иммунных клеток при лучевом повреждении. Внедрение различных моделей животных, отслеживающих родословную, позволит изучать поведение в реальном времени и взаимодействие различных субпопуляций клеток после травмы. В качестве альтернативы окрашивание тканей может быть заменено секвенированием РНК, секвенированием одноклеточной РНК, сортировкой клеток, активируемой флуоресценцией (FACS) или протеомным анализом для получения более глубоких знаний о роли конкретных клеточных линий в регенерации кишечника после травмы68,69. Эта модель травмы может быть использована для тестирования новых методов лечения, предназначенных для минимизации побочных эффектов облучения, сокращения времени восстановления и улучшения качества ухода за пациентами70. Хотя описанная здесь модель облучения может служить полезным инструментом для изучения регенерации кишечного эпителия, она также имеет ряд ограничений. Доза облучения всего тела неизменно приводит к последующему гемопоэтическому синдрому, который препятствует исследованию регенерации кишечника. Этого можно предотвратить с помощью трансплантации костного мозга. Кроме того, модификация протокола травмы только брюшной полости может потенциально улучшить некоторые побочные эффекты облучения71. Однако эта модель требует дополнительных шагов, которые могут повлиять на реакцию кишечника на травму (например, анестезия). Между прочим, абдоминальное облучение вызывает радиационно-индуцированный желудочно-кишечный синдром (RIGS) без гемопоэтического синдрома, отличающийся от облучения всего тела (WBI) тем, что WBI вызывает аналогичную симптоматику желудочно-кишечного тракта, но включает частичную потерю кроветворной функции после травмы71,72.

Следует отметить, что генетически модифицированные модели животных, такие как описанные в этом протоколе, являются сложными и позволяют отслеживать происхождение конкретных клеток. Однако эти модели, хотя и очень выгодны, требуют дополнительных усилий для обслуживания. Трансгенные модели животных, которые допускают условные делеции генов, трудно генерировать, и их своевременное удаление при травме может быть нелегко осуществимо. Более того, большинство трансгенных моделей допускают только условную делецию или инактивацию интересующего гена, но не индуцируются и, таким образом, не способны восстановить функцию гена и могут препятствовать исследованиям. Кроме того, трансгенные модели животных обычно требуют обработки дополнительными химическими веществами (например, тамоксифеном, доксициклином) для достижения инактивации или сверхэкспрессии интересующего гена. Лечение этими веществами может в некоторой степени изменить реакцию кишечного эпителия или увеличить тяжесть травмы 73,74,75,76. Кроме того, индукция отслеживания линии тамоксифеном может быть введена ближе ко времени лучевого поражения для улучшения маркировки клеток, участвующих в регенерации (например, за 6-24 ч до повреждения). Таким образом, возможна замена трансгенной модели мышами дикого типа и комбинацией окрашивания IF (например, Ki-67, PCNA, EdU, TUNEL, Caspase 3). Эта модель позволяет анализировать регенеративную способность кишечника, хотя и не позволяет изучать конкретную субпопуляцию клеток.

Протокол, описанный в этой рукописи, состоит из нескольких важных этапов. Крайне важно обеспечить, чтобы здоровые мыши использовались для экспериментов, так как они будут подвергаться облучению и обработке химическими веществами. Если эксперименты с разными группами мышей проводятся с интервалом в дни, недели или месяцы, рекомендуется придерживаться одного и того же графика, например, инъекции тамоксифена в одно и то же время суток. Процесс облучения должен быть выполнен быстро, и мыши должны быть немедленно возвращены в свои первоначальные клетки. Кроме того, предоставление размягченной пищи и большого количества воды может помочь смягчить некоторые неблагоприятные последствия радиации. Предложена методика швейцарского ролла, позволяющая проводить всесторонний анализ кишечной ткани59. Этот метод не является тривиальным, и необходимо провести предварительные пробы, чтобы убедиться, что достигается безупречное качество ткани для окрашивания. Все растворы для экспериментов на мышах и окрашивания должны быть приготовлены в свежем виде и храниться в соответствующих условиях. При работе с антителами важно тестировать предметные стекла с использованием положительного и отрицательного контроля и, по возможности, использовать антитела с одинаковым каталожным номером и номером партии. Иммунофлуоресцентные стекла следует хранить при температуре 4 °C и визуализировать в течение 1 недели после приготовления. Длительное хранение даже при −20 °C может привести к потере сигнала. Предметные стекла H&E можно хранить при комнатной температуре, так как нет опасений по поводу потери стабильности флуорофора.

Таким образом, представленная здесь модель лучевого поражения, отслеживающая происхождение, является воспроизводимой и актуальной моделью для отслеживания судьбы кишечных клеток после инсульта и может сочетаться с различными мышиными моделями и молекулярными методами для улучшения понимания патофизиологии кишечного эпителия. Понимание молекулярных и клеточных механизмов, управляющих регенерацией эпителия кишечника, может привести к разработке новых методов лечения и полезных терапевтических вмешательств.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Конфликт интересов у авторов отсутствует.

Acknowledgments

Авторы выражают благодарность Центру исследований гистологии Онкологического центра Стоуни-Брук за экспертную помощь в подготовке образцов тканей и Отделу ресурсов лабораторных животных Университета Стоуни-Брук за помощь в уходе за животными и обращении с ними. Эта работа была поддержана грантами Национального института здравоохранения DK124342, присужденными Агнешке Б. Бялковской, и DK052230 доктору Винсенту В. Янгу.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe BD 309659 -
16G Reusable Small Animal Feeding Needles: Straight VWR 20068-630 -
27G x 1/2" needle BD 305109 -
28G x 1/2" Monoject 1mL insulin syringe Covidien 1188128012 -
5-Ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) Santa Cruz Biotechnology sc284628A 10 mg/mL in sterile DMSO:water (1:4 v/v), aliquot and store in -20°C
Azer Scientific 10% Neutral Buffered Formalin Fisher Scientific 22-026-213 -
B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J The Jackson Laboratory Strain #:006148
B6;129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/J The Jackson Laboratory Strain #:010531
Bovine Serum Albumin Fraction V, heat shock Millipore-Sigma 3116956001
Chicken anti-GFP Aves GFP-1020
Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 imaging kit, Invitrogen Thermo Fisher Scientific C10638 -
Corn oil Millipore-Sigma C8267 -
Decloaking Chamber Biocare Medical DC2012 -
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher BioReagents BP231-100 light sensitive
DNase-free proteinase K Invitrogen C10618H diluted 25x in DPBS
Donkey anti-chicken AF647 Jackson ImmunoResearch 703-605-155
DPBS Fisher Scientific 21-031-CV -
Eosin Fisher Scientific S176
Fluorescence Microscope Nikon Eclipse 90i Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20X Nikon
Fluoromount Aqueous Mounting Medium Millipore-Sigma F4680-25ML
Gamma Cell 40 Exactor Best Theratronics Ltd. - 0.759 Gy min-1
Goat anti-rabbit AF488 Jackson ImmunoResearch 111-545-144
Hematoxylin Solution, Gill No. 3 Millipore-Sigma GHS332
HM 325 Rotary Microtome from Thermo Scientific Fisher Scientific 23-900-668
Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) Thermo Fisher Scientific H3569 dilution 1:1000
Hydrogen Peroxide Solution, ACS, 29-32%, Spectrum Chemical Fisher Scientific 18-603-252 -
In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche) Millipore-Sigma 11684795910
Liquid Blocker Super PAP PEN, Mini Fisher Scientific DAI-PAP-S-M
Lithium Carbonate (Powder/Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific L119-500 0.5g/1L dH2O
Luer-Lok Syringe sterile, single use, 10 mL VWR 89215-218 -
Methanol VWR BDH1135-4LP
Pharmco Products Ethyl alcohol, 200 PROOF Fisher Scientific NC1675398 -
Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Acetic Acid ACS Grade Capitol Scientific AAP-281000ACSCSLT -
Rabbit anti-Ki67 BioCare Medical CRM325
Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Mounting Medium Fisher Scientific 22-050-262
Scientific Industries Incubator-Genie for baking slides at 65 degree Fisher Scientific 50-728-103
Sodium Citrate Dihydrate Fisher Scientific S279-500
Stainless Steel Dissecting Kit VWR 25640-002
Superfrost Plus micro slides [size: 25 x 75 x 1 mm] VWR  48311-703
Tamoxifen Millipore-Sigma T5648 30 mg/mL in sterile corn oil, preferably fresh or short-sterm storage in -20°C, light sensitive
Tissue-Tek 24-Slide Holders with Detachable Handle Sakura 4465
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Blades Sakura 4689
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set Sakura 4451
Tissue-Tek Staining Dish, Green with Lid Sakura 4456
Tissue-Tek Staining Dish, White with Lid Sakura 4457
Tween 20 Millipore-Sigma P7949
Unisette Processing Cassettes VWR 87002-292 -
VWR Micro Cover Glasses VWR 48393-081
Xylene Fisher Scientific X5P-1GAL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Helander, H. F., Fandriks, L. Surface area of the digestive tract - Revisited. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 49 (6), 681-689 (2014).
  2. vander Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annual Review of Physiology. 71, 241-260 (2009).
  3. Clevers, H. The intestinal crypt, a prototype stem cell compartment. Cell. 154 (2), 274-284 (2013).
  4. Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
  5. Yan, K. S., et al. The intestinal stem cell markers Bmi1 and Lgr5 identify two functionally distinct populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (2), 466-471 (2012).
  6. Liao, Z., Hu, C., Gao, Y. Mechanisms modulating the activities of intestinal stem cells upon radiation or chemical agent exposure. Journal of Radiation Research. 63 (2), 149-157 (2022).
  7. Meyer, A. R., Brown, M. E., McGrath, P. S., Dempsey, P. J. Injury-Induced Cellular Plasticity Drives Intestinal Regeneration. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 13 (3), 843-856 (2022).
  8. Owens, B. M., Simmons, A. Intestinal stromal cells in mucosal immunity and homeostasis. Mucosal Immunology. 6 (2), 224-234 (2013).
  9. Barker, N. Adult intestinal stem cells: Critical drivers of epithelial homeostasis and regeneration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 19-33 (2014).
  10. Cheng, H., Origin Leblond, C. P. differentiation and renewal of the four main epithelial cell types in the mouse small intestine. V. Unitarian Theory of the origin of the four epithelial cell types. The American Journal of Anatomy. 141 (4), 537-561 (1974).
  11. Sender, R., Milo, R. The distribution of cellular turnover in the human body. Nature Medicine. 27 (1), 45-48 (2021).
  12. Metcalfe, C., Kljavin, N. M., Ybarra, R., de Sauvage, F. J. Lgr5+ stem cells are indispensable for radiation-induced intestinal regeneration. Cell Stem Cell. 14 (2), 149-159 (2014).
  13. Tian, H., et al. A reserve stem cell population in small intestine renders Lgr5-positive cells dispensable. Nature. 478 (7368), 255-259 (2011).
  14. Tirado, F. R., et al. Radiation-induced toxicity in rectal epithelial stem cell contributes to acute radiation injury in rectum. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 63 (2021).
  15. Tetteh, P. W., Farin, H. F., Clevers, H. Plasticity within stem cell hierarchies in mammalian epithelia. Trends in Cell Biology. 25 (2), 100-108 (2015).
  16. Breault, D. T., et al. Generation of mTert-GFP mice as a model to identify and study tissue progenitor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (30), 10420-10425 (2008).
  17. Montgomery, R. K., et al. Mouse telomerase reverse transcriptase (mTert) expression marks slowly cycling intestinal stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (1), 179-184 (2011).
  18. Orzechowska, E. J., Katano, T., Bialkowska, A. B., Yang, V. W. Interplay among p21(Waf1/Cip1), MUSASHI-1 and Kruppel-like factor 4 in activation of Bmi1-Cre(ER) reserve intestinal stem cells after gamma radiation-induced injury. Scientific Reports. 10 (1), 18300 (2020).
  19. Takeda, N., et al. Interconversion between intestinal stem cell populations in distinct niches. Science. 334 (6061), 1420-1424 (2011).
  20. Wong, V. W., et al. Lrig1 controls intestinal stem-cell homeostasis by negative regulation of ErbB signalling. Nature Cell Biology. 14 (4), 401-408 (2012).
  21. Powell, A. E., et al. The pan-ErbB negative regulator Lrig1 is an intestinal stem cell marker that functions as a tumor suppressor. Cell. 149 (1), 146-158 (2012).
  22. Ayyaz, A., et al. Single-cell transcriptomes of the regenerating intestine reveal a revival stem cell. Nature. 569 (7754), 121-125 (2019).
  23. Tomic, G., et al. Phospho-regulation of ATOH1 is required for plasticity of secretory progenitors and tissue regeneration. Cell Stem Cell. 23 (3), 436-443 (2018).
  24. Castillo-Azofeifa, D., et al. Atoh1(+) secretory progenitors possess renewal capacity independent of Lgr5(+) cells during colonic regeneration. The EMBO Journal. 38 (4), 99984 (2019).
  25. Van Landeghem, L., et al. Activation of two distinct Sox9-EGFP-expressing intestinal stem cell populations during crypt regeneration after irradiation. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 302 (10), 1111-1132 (2012).
  26. Roche, K. C., et al. SOX9 maintains reserve stem cells and preserves radioresistance in mouse small intestine. Gastroenterology. 149 (6), 1553-1563 (2015).
  27. Barriga, F. M., et al. Mex3a marks a slowly dividing subpopulation of Lgr5+ intestinal stem cells. Cell Stem Cell. 20 (6), 801-816 (2017).
  28. May, R., et al. Brief report: Dclk1 deletion in tuft cells results in impaired epithelial repair after radiation injury. Stem Cells. 32 (3), 822-827 (2014).
  29. Tetteh, P. W., et al. Replacement of lost Lgr5-positive stem cells through plasticity of their enterocyte-lineage daughters. Cell Stem Cell. 18 (2), 203-213 (2016).
  30. Bohin, N., et al. Rapid crypt cell remodeling regenerates the intestinal stem cell niche after Notch inhibition. Stem Cell Reports. 15 (1), 156-170 (2020).
  31. Li, N., et al. Single-cell analysis of proxy reporter allele-marked epithelial cells establishes intestinal stem cell hierarchy. Stem Cell Reports. 3 (5), 876-891 (2014).
  32. van Es, J. H., et al. Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage. Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).
  33. Durand, A., et al. Functional intestinal stem cells after Paneth cell ablation induced by the loss of transcription factor Math1 (Atoh1). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (23), 8965-8970 (2012).
  34. Hayakawa, Y., et al. BHLHA15-positive secretory precursor cells can give rise to tumors in intestine and colon in mice. Gastroenterology. 156 (4), 1066-1081 (2019).
  35. Yan, K. S., et al. Intestinal enteroendocrine lineage cells possess homeostatic and injury-inducible stem cell activity. Cell Stem Cell. 21 (1), 78-90 (2017).
  36. Chandrakesan, P., et al. Intestinal tuft cells regulate the ATM mediated DNA damage response via Dclk1 dependent mechanism for crypt restitution following radiation injury. Scientific Reports. 6, 37667 (2016).
  37. Yu, S., et al. Paneth cell multipotency induced by Notch activation following Injury. Cell Stem Cell. 23 (1), 46-59 (2018).
  38. Moussa, L., et al. Bowel radiation injury: Complexity of the pathophysiology and promises of cell and tissue engineering. Cell Transplantation. 25 (10), 1723-1746 (2016).
  39. Gong, W., et al. Mesenchymal stem cells stimulate intestinal stem cells to repair radiation-induced intestinal injury. Cell Death & Disease. 7 (9), 2387 (2016).
  40. Tam, S. Y., Wu, V. W. C. A review on the special radiotherapy techniques of colorectal cancer. Frontiers in Oncology. 9, 208 (2019).
  41. Shadad, A. K., Sullivan, F. J., Martin, J. D., Egan, L. J. Gastrointestinal radiation injury: Symptoms, risk factors and mechanisms. World Journal of Gastroenterology. 19 (2), 185-198 (2013).
  42. Serrano Martinez, P., Giuranno, L., Vooijs, M., Coppes, R. P. The radiation-induced regenerative response of adult tissue-specific stem cells: Models and signaling pathways. Cancers. 13 (4), 855 (2021).
  43. Stacey, R., Green, J. T. Radiation-induced small bowel disease: Latest developments and clinical guidance. Therapeutic Advances in Chronic Disease. 5 (1), 15-29 (2014).
  44. Pan, Y. B., Maeda, Y., Wilson, A., Glynne-Jones, R., Vaizey, C. J. Late gastrointestinal toxicity after radiotherapy for anal cancer: A systematic literature review. Acta Oncologica. 57 (11), 1427-1437 (2018).
  45. Elhammali, A., et al. Late gastrointestinal tissue effects after hypofractionated radiation therapy of the pancreas. Radiation Oncology. 10, 186 (2015).
  46. You, S. H., Cho, M. Y., Sohn, J. H., Lee, C. G. Pancreatic radiation effect in apoptosis-related rectal radiation toxicity. Journal of Radiation Research. 59 (5), 529-540 (2018).
  47. Jiminez, J. A., Uwiera, T. C., Douglas Inglis, G., Uwiera, R. R. Animal models to study acute and chronic intestinal inflammation in mammals. Gut Pathogens. 7, 29 (2015).
  48. Snider, A. J., et al. Murine model for colitis-associated cancer of the colon. Methods in Molecular Biology. 1438, 245-254 (2016).
  49. Clapper, M. L., Cooper, H. S., Chang, W. C. Dextran sulfate sodium-induced colitis-associated neoplasia: A promising model for the development of chemopreventive interventions. Acta Pharmacologica Sinica. 28 (9), 1450-1459 (2007).
  50. Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. Animal models of ischemia-reperfusion-induced intestinal injury: Progress and promise for translational research. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 308 (2), 63-75 (2015).
  51. Fujimichi, Y., Otsuka, K., Tomita, M., Iwasaki, T. Ionizing radiation alters organoid forming potential and replenishment rate in a dose/dose-rate dependent manner. Journal of Radiation Research. 63 (2), 166-173 (2022).
  52. Montenegro-Miranda, P. S., et al. A novel organoid model of damage and repair identifies HNF4alpha as a critical regulator of intestinal epithelial regeneration. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (2), 209-223 (2020).
  53. Nagle, P. W., Coppes, R. P. Current and future perspectives of the use of organoids in radiobiology. Cells. 9 (12), 2649 (2020).
  54. Taelman, J., Diaz, M., Guiu, J. Human Intestinal Organoids: Promise and Challenge. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 854740 (2022).
  55. Kim, C. K., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. The role of intestinal stem cells in epithelial regeneration following radiation-induced gut injury. Current Stem Cell Reports. 3 (4), 320-332 (2017).
  56. Kuruvilla, J. G., et al. Kruppel-like factor 4 modulates development of BMI1(+) intestinal stem cell-derived lineage following gamma-radiation-induced gut injury in mice. Stem Cell Reports. 6 (6), 815-824 (2016).
  57. Sangiorgi, E., Capecchi, M. R. Bmi1 is expressed in vivo in intestinal stem cells. Nature Genetics. 40 (7), 915-920 (2008).
  58. Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Developmental Biology. 1, 4 (2001).
  59. Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. Journal of Visualized Experiments. (113), e54161 (2016).
  60. Booth, C., Tudor, G., Tudor, J., Katz, B. P., MacVittie, T. J. Acute gastrointestinal syndrome in high-dose irradiated mice. Health Physics. 103 (4), 383-399 (2012).
  61. Lu, L., Jiang, M., Zhu, C., He, J., Fan, S. Amelioration of whole abdominal irradiation-induced intestinal injury in mice with 3,3'-Diindolylmethane (DIM). Free Radical Biology & Medicine. 130, 244-255 (2019).
  62. Karlsson, J. A., Andersen, B. L. Radiation therapy and psychological distress in gynecologic oncology patients: Outcomes and recommendations for enhancing adjustment. Journal of Psychosomatic Obstetrics & Gynecology. 5 (4), 283-294 (1986).
  63. Yang, J., Cai, H., Xiao, Z. X., Wang, H., Yang, P. Effect of radiotherapy on the survival of cervical cancer patients: An analysis based on SEER database. Medicine. 98 (30), 16421 (2019).
  64. Giroux, V., et al. Mouse intestinal Krt15+ crypt cells are radio-resistant and tumor initiating. Stem Cell Reports. 10 (6), 1947-1958 (2018).
  65. Kim, C. K., et al. Kruppel-like factor 5 regulates stemness, lineage specification, and regeneration of intestinal epithelial stem cells. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (4), 587-609 (2020).
  66. Sheng, X., et al. Cycling stem cells are radioresistant and regenerate the intestine. Cell Reports. 32 (4), 107952 (2020).
  67. Gross, S., et al. Nkx2.2 is expressed in a subset of enteroendocrine cells with expanded lineage potential. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309 (12), 975-987 (2015).
  68. Sato, T., et al. Characterization of radioresistant epithelial stem cell heterogeneity in the damaged mouse intestine. Scientific Reports. 10 (1), 8308 (2020).
  69. Roth, S., et al. Paneth cells in intestinal homeostasis and tissue injury. PLoS One. 7 (6), 38965 (2012).
  70. Bohin, N., et al. Insulin-like growth factor-1 and mTORC1 signaling promote the intestinal regenerative response after irradiation injury. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (4), 797-810 (2020).
  71. Romesser, P. B., et al. Preclinical murine platform to evaluate therapeutic countermeasures against radiation-induced gastrointestinal syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (41), 20672-20678 (2019).
  72. Gu, J., et al. At what dose can total body and whole abdominal irradiation cause lethal intestinal injury among C57BL/6J mice. Dose Response. 18 (3), 1559325820956783 (2020).
  73. Huh, W. J., et al. Tamoxifen induces rapid, reversible atrophy, and metaplasia in mouse stomach. Gastroenterology. 142 (1), 21-24 (2012).
  74. Keeley, T. M., Horita, N., Samuelson, L. C. Tamoxifen-induced gastric injury: Effects of dose and method of administration. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 8 (3), 365-367 (2019).
  75. Bohin, N., Carlson, E. A., Samuelson, L. C. Genome toxicity and impaired stem cell function after conditional activation of CreER(T2) in the intestine. Stem Cell Reports. 11 (6), 1337-1346 (2018).
  76. Boynton, F. D. D., Ericsson, A. C., Uchihashi, M., Dunbar, M. L., Wilkinson, J. E. Doxycycline induces dysbiosis in female C57BL/6NCrl mice. BMC Research Notes. 10 (1), 644 (2017).

Tags

Биология выпуск 185
Регенерация эпителия кишечника в ответ на ионизирующее облучение
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Orzechowska-Licari, E. J., LaComb,… More

Orzechowska-Licari, E. J., LaComb, J. F., Giarrizzo, M., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation. J. Vis. Exp. (185), e64028, doi:10.3791/64028 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter