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Biology

Regeneración epitelial intestinal en respuesta a la irradiación ionizante

Published: July 27, 2022 doi: 10.3791/64028
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 1
1Department of Medicine, Renaissance School of Medicine at Stony Brook University, 2Department of Physiology and Biophysics, Renaissance School of Medicine at Stony Brook University

Summary

El tracto gastrointestinal es uno de los órganos más sensibles a las lesiones en los tratamientos radioterapéuticos contra el cáncer. Es simultáneamente un sistema de órganos con una de las capacidades regenerativas más altas después de tales insultos. El protocolo presentado describe un método eficiente para estudiar la capacidad regenerativa del epitelio intestinal.

Abstract

El epitelio intestinal consiste en una sola capa de células, pero contiene múltiples tipos de células terminalmente diferenciadas, que se generan por la proliferación activa de células madre intestinales ubicadas en la parte inferior de las criptas intestinales. Sin embargo, durante los eventos de lesión intestinal aguda, estas células madre intestinales activas experimentan la muerte celular. La irradiación gamma es un tratamiento contra el cáncer colorrectal ampliamente utilizado que, aunque terapéuticamente eficaz, tiene el efecto secundario de agotar el conjunto activo de células madre. De hecho, los pacientes con frecuencia experimentan síndrome de radiación gastrointestinal mientras se someten a radioterapia, en parte debido al agotamiento activo de las células madre. La pérdida de células madre intestinales activas en criptas intestinales activa un conjunto de células madre intestinales de reserva típicamente quiescentes e induce la desdiferenciación de las células secretoras y precursoras de enterocitos. Si no fuera por estas células, el epitelio intestinal carecería de la capacidad de recuperarse de la radioterapia y otros insultos tisulares importantes. Los nuevos avances en las tecnologías de rastreo de linaje permiten el seguimiento de la activación, diferenciación y migración de las células durante la regeneración y se han empleado con éxito para estudiar esto en el intestino. Este estudio tiene como objetivo representar un método para el análisis de las células dentro del epitelio intestinal del ratón después de una lesión por radiación.

Introduction

El epitelio intestinal humano cubriría aproximadamente la superficie de la mitad de una cancha de bádminton si se colocara completamente plano1. En cambio, esta capa de una sola célula que separa a los humanos del contenido de sus intestinos se compacta en una serie de proyecciones en forma de dedos, vellosidades y hendiduras, criptas que maximizan el área de superficie de los intestinos. Las células del epitelio se diferencian a lo largo de un eje cripta-vellosidad. Las vellosidades consisten principalmente en enterocitos que absorben nutrientes, células caliciformes secretoras de moco y células enteroendocrinas productoras de hormonas, mientras que las criptas consisten principalmente en células de Paneth productoras de defensina, células madre activas y de reserva, y células progenitoras 2,3,4,5. Además, la comunicación bidireccional que estas células tienen con las células estromales e inmunes del compartimiento mesenquimal subyacente y la microbiota de la luz generan una compleja red de interacciones que mantiene la homeostasis intestinal y es crítica para la recuperación después de una lesión 6,7,8.

El epitelio intestinal es el tejido que se auto-renueva más rápidamente en el cuerpo humano, con una tasa de renovación de 2-6 días 9,10,11. Durante la homeostasis, las células madre activas en la base de las criptas intestinales (células columnares de la base de la cripta), marcadas por la expresión del receptor acoplado a proteína G 5 rico en leucina (LGR5), se dividen rápidamente y proporcionan células progenitoras que se diferencian en todos los demás linajes epiteliales intestinales. Sin embargo, debido a su alta tasa mitótica, las células madre activas y sus progenitores inmediatos son particularmente sensibles a la lesión por radiación gamma y sufren apoptosis después de la irradiación 5,12,13,14. Tras su pérdida, las células madre de reserva y las células no madre (subpoblación de progenitores y algunas células terminalmente diferenciadas) dentro de las criptas intestinales se activan y reponen el compartimiento de la cripta basal, que luego puede reconstituir las poblaciones celulares de las vellosidades y, por lo tanto, regenerar el epitelio intestinal15. Utilizando técnicas de rastreo de linaje, múltiples grupos de investigación han demostrado que las células madre de reserva (quiescentes) son capaces de apoyar la regeneración tras la pérdida de células madre activas 13,16,17,18,19,20,21,22. Estas células se caracterizan por la presencia del oncogén de la proteína 1 del complejo polycomb (Bmi1), el gen de la transcriptasa inversa de la telomerasa de ratón (mTert), el homeobox del lúpulo (Hopx) y el gen de la proteína 1 de repetición rica en leucina (Lrig1). Además, se ha demostrado que las células no madre son capaces de reponer las criptas intestinales tras una lesión 23,24,25,26,27,28,29,30,31. En particular, se ha demostrado que los progenitores de células secretoras y enterocitos sufren desdiferenciación tras una lesión, vuelven a células madre y apoyan la regeneración del epitelio intestinal. Estudios recientes han identificado células que expresan múltiples marcadores que poseen la capacidad de adquirir características similares a las de un tallo tras una lesión (como DLL+, ATOH1+, PROX1+, MIST1+, DCLK1+)32,33,34,35,36. Sorprendentemente, Yu et al. demostraron que incluso las células maduras de Paneth (LYZ+) pueden contribuir a la regeneración intestinal37. Además, además de causar apoptosis de las células epiteliales intestinales y alterar la función de barrera epitelial, la irradiación resulta en disbiosis de la flora intestinal, activación de células inmunes y el inicio de una respuesta proinflamatoria, y la activación de células mesenquimales y estromales38,39.

La radiación gamma es una valiosa herramienta terapéutica en el tratamiento del cáncer, especialmente para los tumores colorrectales40. Sin embargo, la irradiación afecta significativamente la homeostasis intestinal al inducir daño a las células, lo que conduce a la apoptosis. La exposición a la radiación causa múltiples perturbaciones que ralentizan la recuperación de un paciente y se caracteriza por lesiones de la mucosa e inflamación en la fase aguda y diarrea, incontinencia, sangrado y dolor abdominal a largo plazo. Esta panoplia de manifestaciones se conoce como toxicidad por radiación gastrointestinal. Además, la progresión inducida por la radiación de la fibrosis transmural y/o la esclerosis vascular sólo puede manifestarse años después del tratamiento38,41. Simultáneamente a la lesión misma, la radiación induce una respuesta de reparación en las células intestinales que activa las vías de señalización responsables de iniciar y orquestar la regeneración42. La enfermedad del intestino delgado inducida por radiación puede originarse a partir de la radioterapia pélvica o abdominal administrada a otros órganos (como cuello uterino, próstata, páncreas, recto)41,43,44,45,46. La lesión por irradiación intestinal es, por lo tanto, un problema clínico importante, y es probable que una mejor comprensión de la fisiopatología resultante avance en el desarrollo de intervenciones para aliviar las complicaciones gastrointestinales asociadas con la radioterapia. Existen otras técnicas que permiten investigar el propósito regenerativo del epitelio intestinal aparte de la radiación. Se han desarrollado modelos murinos transgénicos y químicos para estudiar la inflamación y la regeneración posterior47. El sulfato de sodio de dextrano (DSS) induce inflamación en el intestino y conduce al desarrollo de características similares a las de la enfermedad inflamatoria intestinal48. Una combinación del tratamiento DSS con el compuesto procancerígeno azoximetano (OMA) puede resultar en el desarrollo de cáncer asociado a colitis48,49. La lesión inducida por isquemia por reperfusión es otro método empleado para estudiar el potencial regenerativo del epitelio intestinal. Esta técnica requiere experiencia y conocimientos quirúrgicos50. Además, las técnicas antes mencionadas causan diferentes tipos de lesiones que la radiación y pueden conducir a la participación de diferentes mecanismos de regeneración. Además, estos modelos consumen mucho tiempo, mientras que la técnica de radiación es bastante breve. Recientemente, los métodos in vitro que utilizan enteroides y colonoides generados a partir del intestino y el colon se han utilizado en combinación con lesiones por radiación para estudiar los mecanismos de regeneración intestinal51,52. Sin embargo, estas técnicas no recapitulan completamente el órgano que modelan53,54.

El protocolo presentado incluye la descripción de un modelo murino de lesión por radiación gamma en combinación con un modelo genético que, después del tratamiento con tamoxifeno, permite rastrear linajes originados en la población de células madre de reserva (Bmi1-CreER; Rosa26eYFP). Este modelo utiliza una irradiación corporal total de 12 Gy, que induce una lesión intestinal lo suficientemente significativa como para activar las células madre de reserva, al tiempo que permite la investigación posterior de la capacidad regenerativa intestinal dentro de los 7 días posteriores a la lesión55.

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Protocol

Todos los ratones fueron alojados en la División de Recursos para Animales de Laboratorio (DLAR) de la Universidad de Stony Brook. El Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Stony Brook (IACUC) aprobó todos los estudios y procedimientos que involucran sujetos animales. Los experimentos con sujetos animales se llevaron a cabo estrictamente de acuerdo con el protocolo aprobado de manejo de animales (IACUC # 245094).

NOTA: Las cepas de ratón B6;129-Bmi1 tm1(cre/ERT)Mrc/J (Bmi1-Cre ER) y B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J (Rosa26 eYFP) se obtuvieron comercialmente (ver Tabla de materiales) y se cruzaron para obtener Bmi1-Cre ER; RatonesRosa26 eYFP (Bmi1ctrl), como se describió anteriormente56,57,58.

1. Carcasa de Bmi1-Cre ER; Ratones Rosa26 eYFP

  1. Mantenga a los ratones en una instalación para animales a una temperatura que oscile entre 68-72 ° F y humedad que oscile entre 30-70%, en un ciclo de luz / oscuridad de 12 h / 12 h, con agua y comida ad libitum normal.
  2. Antes de los experimentos, confirmar los genotipos de los ratones utilizando una técnica estándar de genotipado por PCR57,58.

2. Preparación de animales y materiales

  1. Transfiera los ratones a la sala de alojamiento experimental al menos 7 días antes de cualquier experimentación para permitir que los ratones se aclimaten.
  2. Emparejar animales experimentales y de control según el género y la edad.
  3. Someter a los animales de control a una recombinación mediada por Cre inducida por tamoxifeno, pero no a irradiación (tratamiento simulado, 0 Gy) asegurándose de que los animales de experimentación reciban la inyección de tamoxifeno y estén expuestos a la irradiación gamma.
  4. Prepare la solución de tamoxifeno. Resuspenda el tamoxifeno en polvo en aceite de maíz estéril a una concentración de 30 mg / ml. Sonicar durante 3 min en ciclos de 30 s ON y 30 s OFF con 60% de amplitud y luego rotar en la oscuridad durante 1 h a temperatura ambiente (RT). La solución de tamoxifeno se puede congelar a -20 °C, pero no la congele/descongele más de una vez. Preferiblemente, prepare una solución fresca cada vez y no la almacene.
    NOTA: El tamoxifeno es sensible a la luz. Envuélvalo con papel de aluminio durante la rotación a temperatura ambiente.
    PRECAUCIÓN: El tamoxifeno es una sustancia potencialmente peligrosa: peligro para la salud (GHS08) y peligro para el medio ambiente (GHS09).
  5. Prepare la solución madre de 5-etinil-2′-desoxiuridina (EdU). Resuspenda el polvo de EdU en 1/5 del volumen total de dimetilsulfóxido estéril (DMSO) y agregue lentamente los 4/5 restantes del volumen total de agua ultrapura estéril. Cuando esté completamente disuelto, alícuota y conservar a -20 °C.
    PRECAUCIÓN: La 5-etinil-2′-desoxiuridina (EdU) y el dimetilsulfóxido (DMSO) son sustancias potencialmente peligrosas: peligro para la salud (H340 y H631, y H227, H315 y H319, respectivamente). EdU puede causar defectos genéticos y se sospecha que daña la fertilidad o los niños por nacer, y DMSO puede causar irritación de la piel y los ojos.
  6. Preparar reactivos para la recolección y fijación de tejidos: diluir etanol para preparar una solución de agua al 70%, enfriar DPBS a 4 °C y preparar tampón fijador de Bouin modificado (50% etanol y 5% de ácido acético en H2O destilado) y formalina tamponada al 10%.
    PRECAUCIÓN: El alcohol etílico es una sustancia potencialmente peligrosa: peligro para la salud (H225-H319), inflamable (GHS02) y causa toxicidad aguda (GHS07). El ácido acético es una sustancia potencialmente peligrosa: peligro para la salud (H226-H314), inflamable (GHS02) y corrosiva (GHS05). La formalina es una sustancia potencialmente peligrosa: peligrosa para la salud (H350, H315, H317, H318, H370) y corrosiva. La formalina puede causar cáncer, irritación de la piel y los ojos, daño a los órganos y reacciones alérgicas en la piel.
  7. Prepare el equipo necesario para la eutanasia de acuerdo con un método aprobado (cámara de CO2 , por ejemplo), un kit de disección de ratones (tijeras, fórceps), placas de Petri, una aguja de sonda de 16 G conectada a una jeringa de 10 ml para enjuagar los intestinos y casetes histológicos.

3. Irradiación gamma corporal total (LCT) y recolección de tejido

  1. Dos días antes de la exposición a la irradiación gamma, inyecte a los animales de experimentación una dosis única de tamoxifeno para inducir la recombinación mediada por Cre y el rastreo del linaje celular BMI1 / EYFP + . Pesar cada animal y calcular una dosis de 40 mg/kg de peso corporal de tamoxifeno resuspendido en aceite de maíz. Desinfecte el área abdominal con etanol al 70% y administre tamoxifeno por vía intraperitoneal usando una aguja de 27G conectada a una jeringa de 1 ml.
  2. Observar a los animales durante las siguientes 48 h para excluir la posible toxicidad del tamoxifeno.
  3. Transfiera los ratones a la sala de irradiación según lo especificado por la institución local.
  4. Calcule el tiempo de exposición a la irradiación liberado por la fuente de 137Cs de acuerdo con la tasa de dosis actual del exactor. Por ejemplo, si la tasa de dosis actual es igual a 75,9 rad/min (0,759 Gy min−1 = 75,9 cGy m−1), el tiempo de exposición en minutos se calcula como la dosis deseada/0,759. Para irradiar a los animales a una dosis de 12 Gy TBI, el tiempo de exposición es ~15.81 min (15 min y 48 s).
  5. Desinfecte la cámara de muestras en el irradiador gamma con solución de etanol al 70%; Coloque la estera absorbente y los animales dentro de la cámara de muestras.
    NOTA: Los animales tratados con simulacro deben colocarse en la sala de irradiación, pero no exponerse a la irradiación gamma.
  6. Coloque la tapa y cierre la cámara.
  7. Programe el irradiador gamma para exponer a los animales a 12 Gy TBI.
    1. Encienda la máquina girando la llave en la posición START.
    2. Introduzca el número de operador con un teclado numérico y confirme pulsando INTRO.
    3. Introduzca el número PIN con un teclado numérico y confirme pulsando INTRO.
    4. Presione 1 para ver las opciones.
    5. Pulse 1 para ver los ajustes del temporizador.
    6. Pulse 1 para ver el tiempo de irradiación.
    7. Introduzca la configuración del temporizador para el siguiente ciclo mediante un teclado numérico (formato hh:mm:ss) y confirme pulsando ENTRAR.
    8. Confirme la configuración una vez más presionando ENTRAR.
    9. Vuelva al menú de inicio presionando BORRAR 2x.
    10. Pulse START para iniciar la exposición.
  8. Salga de la habitación durante el tiempo de exposición activa. La máquina se detendrá automáticamente después de que transcurra el tiempo preestablecido y comenzará a emitir pitidos.
    PRECAUCIÓN: El cesio-137 (137Cs) es una sustancia peligrosa mortal (Peligro para la salud: H314). La exposición externa a grandes cantidades de 137C puede causar quemaduras, enfermedad aguda por radiación e incluso la muerte.
  9. Apague la máquina girando la llave en la posición STOP.
  10. Abra la cámara de muestras, retire la tapa, transfiera los animales de nuevo a la jaula y desinfecte la cámara de muestras con una solución de etanol al 70%.
  11. Transfiera a los animales de vuelta a la sala de alojamiento convencional y observe su condición después del tratamiento.
  12. Controle el peso de los animales todos los días y eutanasiéelos inmediatamente (a pesar del punto de tiempo planificado) si se observa algún síntoma de alteración del bienestar, angustia o pérdida de peso superior al 15% del peso corporal inicial.
  13. Tres horas antes de la eutanasia planificada, desinfectar el área abdominal y, utilizando una jeringa de insulina de 28 G, inyectar a los ratones 100 μL de solución madre de EdU (administrada por vía intraperitoneal).
  14. Recoger los intestinos proximales a las 0 h, 3 h, 6 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h y 168 h después de la irradiación.
    1. Realizar la eutanasia deCO2 de acuerdo con los estándares de la institución de origen.
      PRECAUCIÓN: El dióxido de carbono es una sustancia peligrosa (H280). Contiene gas a presión; puede explotar si se calienta. Puede desplazar el oxígeno y causar asfixia rápida.
    2. Luego, diseccionar la parte proximal del intestino delgado, quitar los tejidos adheridos, enjuagar con DPBS frío usando una aguja de alimentación recta de 16 G conectada a una jeringa de 10 ml, fijar con tampón fijador de Bouin modificado usando una aguja de alimentación recta de 16 G conectada a una jeringa de 10 ml, cortar longitudinalmente y enrollar los intestinos proximales usando la técnica swiss-roll como se describió anteriormente59.
  15. Colocar los tejidos en un casete histológico y dejar actuar durante 24-48 h a temperatura ambiente en un recipiente con formalina tamponada al 10%. El volumen de formalina debe ser suficiente para cubrir completamente los casetes histológicos. Cuando transcurra el tiempo de incubación, utilizando fórceps, transfiera los casetes histológicos al recipiente lleno de etanol al 70%. Luego, proceda con la incrustación de parafina tisular.
    NOTA: La incrustación de parafina tisular fue realizada por el Laboratorio Central de Investigación de Histología de la Universidad de Stony Brook. El procedimiento se puede detener aquí, y los bloques de parafina se pueden almacenar a temperatura ambiente.
    PRECAUCIÓN: La formalina es una sustancia potencialmente peligrosa: peligro para la salud (H350, H315, H317, H318, H370) y corrosiva. La formalina puede causar cáncer, irritación de la piel y los ojos, daño a los órganos y reacciones alérgicas en la piel.

4. Análisis histológico

  1. Enfriar los casetes histológicos que contienen las muestras de tejido incrustadas en parafina colocándolas en hielo durante al menos 1 h. Usando un micrótomo, prepare secciones de 5 μm de espesor para la tinción. Cada tejido debe cortarse horizontalmente para cubrir toda la muestra enrollada.
    1. Después de cortar el bloque de parafina, transfiera las secciones de tejido a un baño de agua calentado hasta 45 ° C y coloque las secciones en portaobjetos cargados. Deje que los portaobjetos se sequen en una rejilla durante la noche a temperatura ambiente.
      NOTA: El procedimiento se puede detener aquí y los portaobjetos se pueden almacenar a temperatura ambiente.
  2. Coloque las guías en un portaportaobjetos y hornee en un horno a 65 °C durante la noche. Los toboganes se pueden hornear por un tiempo más corto, 1-2 h. Sin embargo, esto no es aconsejable en el caso de portaobjetos recién cortados (menos de 1 mes de edad).
    NOTA: Coloque el juego de tinción manual de portaobjetos debajo de la campana química y realice las incubaciones con xileno, etanol y hematoxilina debajo de la campana química.
  3. Al día siguiente, enfríe los portaobjetos colocándolos en un portaportaobjetos debajo de la campana química durante 10 minutos.
  4. Desparafinar los tejidos colocando el portaportaobjetos en un recipiente lleno de 100% xileno durante 3 min. Repita la incubación utilizando 100% xileno fresco.
    NOTA: A partir de ese momento, asegúrese de que las muestras se mantengan húmedas en todo momento.
    PRECAUCIÓN: El xileno es una sustancia potencialmente peligrosa: inflamable (GHS02), que causa toxicidad aguda (GHS07) y un peligro para la salud (H226 - H304 - H312 + H332 - H315 - H319 - H335 - H373 - H412). Los posibles efectos peligrosos son que es fatal si se ingiere o ingresa a las vías respiratorias y puede causar irritación de la piel, los ojos y las vías respiratorias. Además, puede afectar las funciones motoras al causar somnolencia o mareos y causar daño a los órganos en caso de exposición prolongada o repetida.
  5. Rehidrate las secciones en un gradiente de etanol colocando el portaportaobjetos secuencialmente en recipientes llenos de las siguientes soluciones: 100% etanol, 2 min; 95% etanol, 2 min; 70% etanol, 2 min.
  6. Transfiera el portaportaobjetos al recipiente lleno de agua destilada y enjuague con agua destilada corriente durante 2 minutos.
  7. Coloque el portaportaobjetos en un recipiente lleno de solución de hematoxilina y manténgalo durante 5 minutos (debajo de la campana química).
  8. Transfiera el portaportaobjetos al recipiente lleno de agua del grifo y enjuague con agua corriente del grifo hasta que la tinción de hematoxilina se vuelva azulada, generalmente después de 2 minutos.
  9. Transfiera el portaportaobjetos al recipiente lleno de una solución de carbonato de litio al 5% (p/v). Inmersión 10x.
    PRECAUCIÓN: El carbonato de litio es una sustancia potencialmente peligrosa: causa toxicidad aguda (GHS07) y es un peligro para la salud (H302 - H319). Es perjudicial si se ingiere, es perjudicial en contacto con la piel y causa irritación ocular grave.
  10. Transfiera el portaportaobjetos al recipiente lleno de agua destilada y enjuague con agua destilada corriente durante 2 minutos.
  11. Coloque el portaportaobjetos en un recipiente lleno de eosina y manche durante 5 minutos.
  12. Transfiera el portaportaobjetos al recipiente lleno de etanol al 70% y enjuague brevemente (10 s).
  13. Deshidratar las secciones colocando el portaportaobjetos secuencialmente en los recipientes llenos de soluciones de gradiente de etanol: etanol al 95%, 5 inmersiones; 100% etanol, 5 inmersiones.
  14. Limpie los portaobjetos colocando el portaportaobjetos en el recipiente lleno de 100% xileno durante 3 minutos. Repita la incubación utilizando 100% xileno fresco.
  15. Saque el portaobjetos de la rejilla, seque el área alrededor de los pañuelos con una toalla de papel y, dependiendo del tamaño de la muestra, agregue una o dos gotas de medio de montaje a base de xileno en la superficie de la muestra. Monte colocando suavemente un cubreobjetos en la parte superior de la corredera de vidrio (tenga cuidado de no dejar burbujas de aire). Presione suavemente si es necesario. Toda la superficie del vidrio debe estar cubierta y sellada.
  16. Seque los portaobjetos dejándolos debajo de la campana química durante la noche. Normalmente, el medio de montaje se solidifica en menos de 24 h. Para asegurarse de que los portaobjetos estén secos, se puede hacer un portaobjetos de muestra. Con una corredera vacía, coloque una gota del medio de montaje y déjela debajo de la campana química durante la noche. Al día siguiente, toque la gota y verifique si está solidificada.
  17. Cuando los portaobjetos se sequen, analice la histología de los tejidos con un microscopio óptico o un microscopio más avanzado con un canal de campo brillante.
    1. Coloque un portaobjetos de microscopio en el escenario, muévase hasta que la muestra esté en el centro del campo de visión, ajuste el enfoque con la perilla de enfoque y use una lente objetiva de aumento de 10x y/o 20x para analizar la histología en comparación con los tejidos de control (irradiados simulados).
    2. Si el microscopio está equipado con una cámara, tome imágenes también.
      NOTA: El procedimiento se puede detener aquí; Los portaobjetos pueden almacenarse a temperatura ambiente y analizarse posteriormente. No mantenga los portaobjetos por más de 30 días ya que la mancha se desvanece lentamente.

5. Tinción por inmunofluorescencia

  1. Enfriar los casetes histológicos que contengan muestras de tejido incrustadas en parafina colocándolos en hielo durante al menos 1 h. Usando un micrótomo, prepare secciones de 5 μm de espesor para la tinción. Cada tejido debe cortarse horizontalmente para cubrir toda la muestra enrollada.
    1. Después de cortar el bloque de parafina, transfiera las secciones de tejido a un baño maría calentado a 45 °C y coloque las secciones en portaobjetos cargados. Deje que los portaobjetos se sequen en una rejilla durante la noche a temperatura ambiente.
      NOTA: El procedimiento se puede detener aquí y los portaobjetos se pueden almacenar a temperatura ambiente.
  2. Coloque las guías en un portaportaobjetos y hornee en un horno a 65 °C durante la noche. Los toboganes se pueden hornear por un tiempo más corto, 1-2 h. Sin embargo, esto no es aconsejable en el caso de portaobjetos recién cortados (hace menos de 1 mes).
    NOTA: Coloque el juego de tinción manual de diapositivas debajo de la campana química y realice las incubaciones con xileno, etanol yH2O2/metanol debajo de la campana química.
  3. Al día siguiente, enfríe los portaobjetos colocándolos en un portaportaobjetos debajo de la campana química durante 10 minutos.
  4. Desparafinar los tejidos colocando el portaportaobjetos en un recipiente lleno de 100% xileno durante 3 min. Repita la incubación utilizando 100% xileno fresco.
    NOTA: A partir de ese momento, asegúrese de que las muestras se mantengan húmedas en todo momento.
  5. Apague la peroxidasa endógena incubando los portaobjetos durante 30 minutos en un recipiente lleno con solución de peróxido de hidrógeno al 2% en metanol debajo de la campana química.
    PRECAUCIÓN: El alcohol metílico es una sustancia potencialmente peligrosa: peligro para la salud (H225-H301, H311, H331-H370), inflamable (GHS02) y causa toxicidad aguda (oral, dérmica, inhalación) (GHS08). El peróxido de hidrógeno es una sustancia potencialmente peligrosa: corrosiva (GHS05) y causa toxicidad aguda (GHS07).
  6. Rehidratar las secciones en un gradiente de etanol colocando el portaportaobjetos secuencialmente en recipientes llenos de las siguientes soluciones: 100% etanol, 3 min; 95% etanol, 3 min; 70% etanol, 3 min.
  7. Transfiera el portaportaobjetos a un recipiente lleno de agua destilada y enjuague con agua destilada corriente durante 2 minutos.
  8. Para recuperar los antígenos, transfiera el portaportaobjetos a un recipiente con 250 ml de solución tampón de citrato (10 mM de citrato de sodio, 0,05% Tween-20, pH 6,0) y cocine a 110 °C durante 10 min utilizando una cámara de descubierta.
  9. Transfiera todo el recipiente a la cámara frigorífica y permita un enfriamiento gradual en el transcurso de 30 minutos.
  10. Después de 30 minutos, reemplace la solución tampón de citrato con agua destilada y enjuague con agua destilada corriente hasta que se retiren todas las piezas flotantes de parafina.
  11. Saque las diapositivas del soporte (una a la vez), golpee una toalla de papel y seque cuidadosamente el área alrededor de la muestra con una toalla de papel. Dibuje una forma cerrada alrededor de la muestra usando una pluma que proporcione una barrera hidrofóbica (pluma PAP). Colocar en una cámara humidificada.
  12. Bloquear con albúmina sérica bovina (BSA) al 5% en TBS-Tween añadiendo 200 μL de la solución sobre la superficie de una muestra. Asegúrese de que no haya fugas. Incubar a 37 °C en una cámara humidificada durante 30 min.
  13. Retire la solución de bloqueo golpeando el portaobjetos de vidrio con una toalla de papel. Vuelva a colocar en una cámara humidificada. Añadir 100 μL de la concentración adecuada de los anticuerpos primarios resuspendidos en un tampón de bloqueo e incubar a 4 °C con un suave balanceo durante la noche. Para IMC1/EYFP, use pollo anti-GFP (dilución 1:500); para Ki-67, use conejo anti-Ki-67 (dilución 1:200).
  14. Retire la solución de anticuerpos golpeando el portaobjetos de vidrio con una toalla de papel; coloque las diapositivas en un portaportaobjetos y transfiéralas al recipiente lleno de TBS-Tween. Lave los portaobjetos agitando durante 5 min. Repita 3x. Cada vez, use una porción nueva de búfer TBS-Tween.
  15. Saque los portaobjetos del soporte (uno a la vez), retire el exceso de solución de lavado golpeando el portaobjetos de vidrio con una toalla de papel y colóquelos en una cámara humidificada. Añadir 100 μL de la concentración apropiada de anticuerpos secundarios resuspendidos en un tampón de bloqueo e incubar a 37 °C durante 30 min. Los anticuerpos secundarios deben conjugarse con un fluoróforo. Para IMC1/EYFP, use burro anti-pollo Alexa Fluor 647 (dilución 1:500); para Ki-67, use cabra anti-conejo Alexa Fluor 488 (dilución 1:500).
  16. Retire la solución de anticuerpos golpeando el portaobjetos de vidrio con una toalla de papel; coloque las diapositivas en un portaportaobjetos y transfiéralas al recipiente lleno de TBS-Tween. Lave los portaobjetos agitando durante 5 min. Repita 3x. Cada vez, use una porción nueva de búfer TBS-Tween.
  17. Saque los portaobjetos del soporte (uno a la vez), retire el exceso de solución de lavado golpeando el portaobjetos de vidrio con una toalla de papel y colóquelos en una cámara humidificada. Añadir 100 μL de la solución de tinción EdU preparada según las instrucciones del fabricante y utilizando el fluoróforo Alexa Fluor 555.
  18. Retire la solución de EdU golpeando el portaobjetos de vidrio con una toalla de papel; coloque las diapositivas en un portaportaobjetos y transfiéralas al recipiente lleno de TBS-Tween. Lave los portaobjetos agitando durante 5 min. Repita 2x. Cada vez, use una porción nueva de búfer TBS-Tween.
  19. Saque las diapositivas del soporte (una a la vez); Retire el exceso de solución de lavado golpeando el portaobjetos de vidrio sobre una toalla de papel y colóquelo en una cámara humidificada. Realizar la contratinción Hoechst 33258 añadiendo 100 μL de la solución Hoechst 33258 (dilución 1:1000 en TBS-Tween) sobre la superficie de la muestra. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 5 min.
  20. Retire la solución Hoechst 33258 golpeando el portaobjetos de vidrio con una toalla de papel; coloque las diapositivas en un portadiapositivas y transfiéralas a un recipiente lleno de TBS-Tween. Lave los toboganes agitando durante 5 min.
  21. Saque el portaobjetos del portaobjetos, seque el área alrededor de los pañuelos con una toalla de papel y, dependiendo del tamaño de la muestra, agregue una o dos gotas de medio de montaje a base de agua en la superficie de la muestra. Monte colocando suavemente un cubreobjetos en la parte superior de la corredera de vidrio (tenga cuidado de no dejar burbujas de aire). Presione suavemente si es necesario. Toda la superficie del vidrio debe estar cubierta y sellada.
  22. Seque los portaobjetos dejándolos en la oscuridad a temperatura ambiente durante la noche. Normalmente, el medio de montaje se solidifica en menos de 24 h. Para asegurarse de que los portaobjetos estén secos, se puede hacer un portaobjetos de muestra. Utilice una diapositiva vacía; Coloque una gota del medio de montaje y déjela debajo de la campana química durante la noche. Al día siguiente, toque la gota y verifique si está solidificada.
  23. Cuando los portaobjetos se secan, los tejidos teñidos se pueden analizar utilizando un microscopio de fluorescencia equipado con filtros de longitud de onda de emisión que permiten la visualización de la tinción Ki-67, EdU y BMI1 / EYFP (535 nm, 646 nm y 700 nm, respectivamente).
  24. Coloque un portaobjetos de microscopio en el escenario, muévase hasta que la muestra esté en el centro del campo de visión, ajuste el enfoque con la perilla de enfoque y use la lente objetiva de aumento de 10x y / o 20x para analizar la tinción en comparación con los tejidos de control (irradiado simulado). Si el microscopio está equipado con una cámara, también se pueden tomar imágenes. Tome imágenes para cada canal por separado y combínelas más tarde.
    NOTA: El procedimiento se puede detener aquí; los portaobjetos pueden almacenarse a 4 °C y analizarse posteriormente. No mantenga los portaobjetos por más de 14 días ya que la mancha se desvanece lentamente.

6. Tinción TUNEL

  1. Enfriar los casetes histológicos que contengan muestras de tejido incrustadas en parafina colocándolos en hielo durante al menos 1 h. Usando un micrótomo, prepare secciones de 5 μm de espesor para la tinción. Cada tejido debe cortarse horizontalmente para cubrir toda la muestra enrollada.
    1. Después de cortar el bloque de parafina, transfiera las secciones de tejido a un baño de agua calentado hasta 45 ° C y coloque las secciones en portaobjetos cargados. Deje que los portaobjetos se sequen en una rejilla durante la noche a temperatura ambiente.
      NOTA: El procedimiento se puede detener aquí y los portaobjetos se pueden almacenar a temperatura ambiente.
  2. Coloque las guías en un portaportaobjetos y hornee en un horno a 65 °C durante la noche.
    NOTA: Los toboganes se pueden hornear por un tiempo más corto, 1-2 horas. Sin embargo, no es aconsejable en el caso de diapositivas recién cortadas (hace menos de 1 mes). Coloque el juego de tinción manual de diapositivas debajo de la campana química y realice las incubaciones con xileno y etanol debajo de la campana química.
  3. Al día siguiente, enfríe los portaobjetos colocándolos en un portaportaobjetos debajo de la campana química durante 10 minutos.
  4. Desparafinar los tejidos colocando el portaportaportaobjetos en un recipiente lleno de 100% xileno durante 3 min. Repita la incubación utilizando 100% xileno fresco.
    NOTA: A partir de este punto, asegúrese de que las muestras se mantengan húmedas en todo momento.
  5. Rehidratar las secciones en un gradiente de etanol colocando el portaportaobjetos secuencialmente en recipientes llenos de las siguientes soluciones: 100% etanol, 3 min; 95% etanol, 3 min; 90% etanol, 3 min; 80% etanol, 3 min; 70% etanol, 3 min.
  6. Transfiera el portaportaobjetos a un recipiente lleno de agua destilada y enjuague con agua destilada corriente durante 1 minuto.
  7. Saque las diapositivas del soporte (una a la vez), golpee una toalla de papel y seque cuidadosamente el área alrededor de la muestra con una toalla de papel. Dibuje una forma cerrada alrededor de la muestra usando una pluma que proporcione una barrera hidrofóbica (pluma PAP). Colocar en una cámara humidificada.
  8. Incubar con proteinasa K libre de DNasa. Añadir 100 μL de la solución de proteinasa K libre de DNasa (dilución 1:25 en DPBS) sobre la superficie de la muestra dentro de la barrera hidrofóbica. Incubar a temperatura ambiente en una cámara humidificada durante 15 min.
    PRECAUCIÓN: La proteinasa K es una sustancia potencialmente peligrosa: peligro para la salud (H315 - H319 - H334).
  9. Retire la solución de proteinasa K golpeando el portaobjetos de vidrio sobre una toalla de papel; coloque las diapositivas en un portaportaobjetos y transfiéralas al contenedor lleno de DPBS. Lave los portaobjetos agitando durante 5 min. Repita 2x. Cada vez, use una porción nueva de DPBS.
  10. Preparar la mezcla de reacción TUNEL: Mezclar la solución de la etiqueta (1x) con la solución enzimática (10x). Pipeta bien.
  11. Saque las diapositivas del soporte (una a la vez); Retire el exceso de solución de lavado golpeando el portaobjetos de vidrio sobre una toalla de papel y colóquelo en una cámara humidificada. Añadir 50 μL de mezcla de reacción TUNEL sobre la superficie de la muestra e incubar en la oscuridad a 37 °C en una cámara humidificada durante 60 min. Para un control negativo, use solo la solución de la etiqueta (sin TdT).
  12. Retire la solución TUNEL golpeando el portaobjetos de vidrio sobre una toalla de papel; coloque las diapositivas en un portadiapositivas y transfiéralas a un contenedor lleno de DPBS. Lave los portaobjetos agitando durante 5 min. Repita 2x. Cada vez, use una porción nueva de DPBS.
  13. Saque las diapositivas del soporte (una a la vez); Retire el exceso de solución de lavado golpeando el portaobjetos de vidrio sobre una toalla de papel y colóquelo en una cámara humidificada. Realizar la contratinción Hoechst 33258 añadiendo 100 μL de la solución Hoechst 33258 (dilución 1:1000 en TBS-Tween) sobre la superficie de la muestra. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 5 min.
  14. Retire la solución Hoechst 33258 golpeando el portaobjetos de vidrio sobre una toalla de papel; coloque las diapositivas en un portaportaobjetos y transfiéralas al contenedor lleno de DPBS. Lave los toboganes agitando durante 5 min.
  15. Saque la diapositiva del portaobjetos; Seque el área alrededor de los tejidos con una toalla de papel y, dependiendo del tamaño de la muestra, agregue una o dos gotas de medio de montaje a base de agua en la superficie de la muestra. Monte colocando suavemente un cubreobjetos en la parte superior de la corredera de vidrio (tenga cuidado de no dejar burbujas de aire). Presione suavemente si es necesario. Toda la superficie del vidrio debe estar cubierta y sellada.
  16. Seque los portaobjetos dejándolos en la oscuridad a temperatura ambiente durante la noche. Normalmente, el medio de montaje se solidifica en menos de 24 h. Para asegurarse de que los portaobjetos estén secos, se puede hacer un portaobjetos de muestra. Coloque una gota del medio de montaje y déjela en la oscuridad a temperatura ambiente durante la noche. Al día siguiente, toque la gota y verifique si está solidificada.
  17. Cuando los portaobjetos se secan, los tejidos teñidos se pueden analizar utilizando un microscopio de fluorescencia equipado con filtros de longitud de onda de emisión que permiten la visualización de la tinción TUNEL (535 nm).
  18. Coloque un portaobjetos de microscopio en el escenario, muévase hasta que la muestra esté en el centro del campo de visión, ajuste el enfoque con la perilla de enfoque y use una lente objetiva de aumento de 10x y / o 20x para analizar la tinción en comparación con los tejidos de control (irradiado simulado). Si el microscopio está equipado con una cámara, también se pueden tomar imágenes. Tome imágenes para cada canal por separado y combínelas más tarde.
    NOTA: El procedimiento se puede detener aquí; los portaobjetos pueden almacenarse a 4 °C y analizarse posteriormente. No mantenga los portaobjetos por más de 14 días ya que la mancha se desvanece lentamente.

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Representative Results

El uso de irradiación corporal total (LCT) de 12 Gy en combinación con el rastreo del linaje genético murino permite un análisis exhaustivo de las consecuencias de la lesión por radiación en el intestino. Para empezar, Bmi1-CreER; Los ratonesRosa26 eYFP recibieron una sola inyección de tamoxifeno, que induce la expresión mejorada de proteína fluorescente amarilla (EYFP) dentro de una población de células madre de reserva Bmi1 + . Dos días después de la inyección de tamoxifeno, los ratones se sometieron a irradiación o irradiación simulada. Tres horas antes de la eutanasia, los ratones fueron inyectados con EdU. Después de la eutanasia, se recogieron muestras de intestino delgado para su análisis a las 0 h, 3 h, 6 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h y 7 días después de la irradiación. Las imágenes representativas de hematoxilina y eosina (H&E) (Figura 1) del curso de tiempo antes mencionado ilustran la respuesta del epitelio intestinal a la lesión. El punto de tiempo 0 h es ilustrativo del epitelio intestinal homeostático (Figura 1); esto es seguido por la fase apoptótica, caracterizada por una pérdida de células dentro de los compartimentos de la cripta entre 3 h y 48 h (Figura 1). Luego sigue la fase regenerativa, donde se pueden encontrar células altamente proliferativas poblando las criptas entre 72 h y 96 h (Figura 1). Finalmente, esto conduce a la fase de normalización, aquí representada por el punto de tiempo de 7 días (Figura 1).

La Figura 2 ilustra los cambios en el estado proliferativo de las células de la cripta intestinal evaluados mediante tinción inmunofluorescente de EdU (marcador de células en fase S) y Ki-67 (marcador de células en las fases G1, S y G2/M), mientras que el rastreo de linaje (células EYFP+) marca las células originarias de las células madre de reserva Bmi1+. Durante la homeostasis (Figura 2, 0 h simulada), las células positivas para IMC1+ marcadas por la expresión de EYFP están restringidas a la posición +4-+6 dentro de las criptas. Durante la fase apoptótica (24 h y 48 h), el número de células positivas para EYFP disminuye (Figura 2). La fase regenerativa (72 h y 96 h) se caracteriza por la rápida proliferación de células positivas para el IMC1+ y sus progenitores (Figura 2); a los 7 días después de la irradiación, una mayor proliferación y migración han repuesto las células de la cripta intestinal y restaurado la integridad del epitelio intestinal (Figura 2).

En ratones irradiados simuladamente (control), EdU y Ki-67 tiñen las células proliferativas negativas de EYFP de las criptas intestinales, típicas de la homeostasis intestinal normal, que se extienden desde las células madre activas a través de la zona de amplificación de tránsito (Figura 2). El daño por radiación causa una pérdida de células altamente proliferativas durante la fase apoptótica, como lo demuestra la reducción de la tinción de EdU y Ki-67 (Figura 2). La activación de células madre de reserva (en este ejemplo, EYFP marcado con células positivas para Bmi1+ ) y su proliferación dan como resultado un aumento de células positivas para EdU y Ki-67 claramente visibles a las 72 h y 96 h después de la lesión, donde las criptas están compuestas casi exclusivamente por células co-teñidas con EYFP, EdU y Ki-67. Los niveles observados de proliferación se normalizan 7 días después de la lesión (Figura 2).

Para ilustrar la apoptosis causada por el daño por radiación, se realizó tinción TUNEL y se incluyen imágenes representativas en la Figura 3. Durante la homeostasis (Figura 3), pocas células están experimentando apoptosis, típica del recambio epitelial intestinal normalmente rápido. Se observa un claro aumento de la tinción TUNEL al final de la fase apoptótica (24 h y 48 h) después de la irradiación (Figura 3). Durante la fase regenerativa, la tinción TUNEL disminuye constantemente dentro de las criptas regeneradoras y nuevamente está casi ausente cuando las criptas se han normalizado (Figura 3). El protocolo presentado describe un método de tinción inmunofluorescente simple y accesible que utiliza una combinación directa y ampliamente empleada de técnicas de etiquetado (TUNEL, EdU, Ki-67, EYFP) que puede proporcionar información sobre el comportamiento de las células intestinales después de una lesión (aquí, irradiación). Este enfoque se puede emplear para estudiar los mecanismos que regulan los procesos regenerativos en el epitelio intestinal en circunstancias específicas. El empleo de este y otros enfoques similares iluminará procesos regenerativos alternativos después de diferentes insultos intestinales y, además, permitirá la investigación de estrategias terapéuticas para la prevención de la pérdida de la función de barrera.

Figure 1
Figura 1: Imágenes representativas de secciones teñidas con hematoxilina y eosina (H&E) de tejidos del intestino delgado después de un curso de tiempo después de la irradiación corporal total. Bmi1-CreER; Los ratones Rosa26eYFP recibieron una dosis de tamoxifeno 2 días antes de la irradiación corporal total de 12 Gy o la irradiación simulada. Se sacrificaron ratones y se recolectaron tejidos del intestino delgado en los puntos de tiempo indicados en la figura. Todas las imágenes fueron tomadas con un aumento de 10x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Imágenes representativas de la tinción inmunofluorescente de secciones del intestino delgado después de la irradiación. Bmi1-CreER; Los ratones Rosa26eYFP recibieron una dosis de tamoxifeno 2 días antes de la irradiación corporal total de 12 Gy o la irradiación simulada. Se sacrificaron ratones y se recolectaron tejidos del intestino delgado en los puntos de tiempo indicados en la figura. Las secciones de tejido se tiñeron con EdU para marcar las células en fase S (rosa) y con Ki-67 para marcar células en las fases G0, S y G2/M (amarillo). EYFP (verde) marca las células Bmi1+ y sus progenitoras y demuestra el trazado del linaje. Las secciones se contrastaron aún más con DAPI (azul) para visualizar los núcleos. Los datos se muestran como imágenes combinadas con un aumento de 10x y recuadros de manchas individuales con un aumento de 20x (estos se originaron a partir de imágenes de 10x). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Imágenes representativas de la tinción inmunofluorescente TUNEL de secciones del intestino delgado tras la irradiación. Bmi1-CreER; Los ratones Rosa26eYFP recibieron una dosis de tamoxifeno 2 días antes de la irradiación corporal total de 12 Gy o la irradiación simulada. Se sacrificaron ratones y se recolectaron tejidos del intestino delgado en los puntos de tiempo indicados en la figura. TUNEL (rojo) tiñe las células apoptóticas. Estas imágenes fueron contrastadas con DAPI (azul) para visualizar núcleos. Las imágenes mostradas fueron tomadas con un aumento de 20x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Este protocolo describe un modelo de lesión por radiación robusto y reproducible. Permite el análisis preciso de los cambios en el epitelio intestinal en el transcurso de 7 días después de la lesión. Es importante destacar que los puntos de tiempo seleccionados reflejan etapas cruciales de la lesión y se caracterizan por distintas alteraciones en el intestino (fases de lesión, apoptosis, regeneración y normalización)60. Este modelo de irradiación ha sido establecido y evaluado cuidadosamente, demostrando una manifestación adecuada de lesión para imitar la experimentada por los pacientes sometidos a radioterapia61. Más de la mitad de las pacientes con cáncer colorrectal y cánceres ginecológicos se someten a radioterapia abdominal 40,62,63. A pesar de los métodos avanzados para dirigir la radioterapia, los pacientes experimentan irradiación de tejido intestinal sano, lo que produce una fisiopatología muy similar a la observada con el modelo de irradiación corporal total presentado aquí. Por lo tanto, el modelo de radiación descrito en este documento puede abordar potencialmente las repercusiones de la exposición accidental a la radiación de pacientes y / o personal médico y, por lo tanto, es vital para la salud humana.

El Bmi1-CreER; El modelo de ratonesRosa26 eYFP lleva Cre inducible por tamoxifeno bajo el control transcripcional del promotor Bmi1 (Bmi1 polycomb ring finger oncogene) de ratón. Además, estos ratones llevan una secuencia R26-stop-EYFP, donde el codón STOP está flanqueado por lados loxP seguidos por el gen de la proteína fluorescente amarilla mejorada (EYFP) insertado en el locus Gt (ROSA) 26Sor. La expresión de EYFP está bloqueada por una secuencia STOP flanqueada por loxP aguas arriba, pero puede activarse mediante deleciones dirigidas inducidas por tamoxifeno y mediadas por Cre, lo que permite el rastreo del linaje de las células que expresan Bmi1, una subpoblación específica de células madre de reserva de células cripta. El protocolo de radiación en combinación con el Bmi1-CreER; El modelo de ratonesRosa26 eYFP se ha empleado previamente para estudiar el papel de los factores de transcripción en la regulación de la regeneración intestinal18,56. Los resultados representativos presentados en la Figura 1 a la Figura 3 muestran resultados similares a los presentados en publicaciones recientes18,56.

Cabe destacar Bmi1-CreER; Los ratonesRosa26 eYFP son solo uno de los múltiples modelos animales transgénicos empleados para estudiar la regeneración intestinal. Otros modelos de rastreo de linaje murino se han combinado con radiación para demostrar el papel de células y vías específicas en la capacidad regenerativa del epitelio intestinal 18,26,32,33,34,35,36,37,56,64,65,66,67 . Estos modelos están diseñados para investigar el papel de diferentes poblaciones de células madre reservadas, explorar los precursores de los linajes secretores y de enterocitos, y estudiar la función de genes específicos dentro de cada subpoblación de las células epiteliales intestinales. Los resultados combinados de estas investigaciones ayudarán a ampliar la comprensión de la capacidad regenerativa del epitelio intestinal.

Es importante destacar que, con modificaciones menores, esta técnica debería permitir la investigación de las relaciones entre la microbiota y diferentes poblaciones epiteliales, estromales e inmunes tras la lesión por radiación. La introducción de distintos modelos animales de rastreo de linaje permitirá el estudio del comportamiento en tiempo real y la interacción de varias subpoblaciones de células después de la lesión. Alternativamente, la tinción de tejidos podría ser reemplazada por secuenciación de ARN, secuenciación de ARN unicelular, clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) o análisis proteómico para obtener un conocimiento más profundo sobre el papel de linajes celulares específicos durante la regeneración intestinal después de una lesión68,69. Este modelo de lesión podría ser utilizado para probar nuevas modalidades de tratamiento destinadas a minimizar los efectos secundarios de la irradiación, acortar el tiempo de recuperación y mejorar la calidad de la atención al paciente70. Aunque el modelo de radiación descrito aquí puede servir como una herramienta útil para estudiar la regeneración del epitelio intestinal, también tiene varias limitaciones. La dosis de radiación corporal total invariablemente resulta en un síndrome hematopoyético posterior, lo que dificulta la investigación de la regeneración intestinal. Esto se puede evitar mediante un trasplante de médula ósea. Además, la modificación de un protocolo de lesión solo abdominal puede mejorar potencialmente algunos de los efectos secundarios de la irradiación71. Sin embargo, este modelo requiere pasos adicionales que pueden afectar la respuesta intestinal a la lesión (por ejemplo, anestesia). Por cierto, la radiación abdominal produce síndrome gastrointestinal inducido por radiación (RIGS) sin síndrome hematopoyético, que difiere de la irradiación de cuerpo entero (WBI), en que WBI produce una sintomatología GI similar pero incluye pérdida parcial de la función hematopoyética después de la lesión71,72.

Cabe destacar que los modelos animales genéticamente modificados como los descritos en este protocolo son sofisticados y permiten el rastreo del linaje de células específicas. Sin embargo, estos modelos, aunque muy beneficiosos, requieren un esfuerzo adicional para mantenerse. Los modelos animales transgénicos que permiten deleciones genéticas condicionales son difíciles de generar, y su eliminación oportuna tras una lesión puede no lograrse fácilmente. Además, la mayoría de los modelos transgénicos solo permiten una eliminación condicional o inactivación de un gen de interés, pero no son inducibles y, por lo tanto, son incapaces de restaurar la función génica y pueden impedir los estudios. Además, los modelos animales transgénicos generalmente requieren tratamiento con productos químicos adicionales (por ejemplo, tamoxifeno, doxiciclina) para lograr la inactivación o sobreexpresión del gen de interés. Los tratamientos con estas sustancias pueden, hasta cierto punto, alterar la respuesta del epitelio intestinal o aumentar la gravedad de la lesión 73,74,75,76. Además, la inducción del trazado del linaje por tamoxifeno puede introducirse más cerca del momento de la lesión por radiación para mejorar el etiquetado de las células involucradas en la regeneración (por ejemplo, 6-24 h antes de la lesión). Por lo tanto, es posible sustituir un modelo transgénico con ratones de tipo salvaje y una combinación de tinción IF (por ejemplo, Ki-67, PCNA, EdU, TUNEL, Caspasa 3). Este modelo permite analizar la capacidad regenerativa del intestino, aunque no permite el estudio de una subpoblación específica de las células.

El protocolo descrito en este manuscrito tiene varios pasos cruciales. Es de suma importancia asegurarse de que los ratones sanos se utilicen para la experimentación, ya que estarán expuestos a la radiación y al tratamiento con productos químicos. Si los experimentos con diferentes grupos de ratones se realizan con días, semanas o meses de diferencia, es una buena práctica cumplir con la misma línea de tiempo, por ejemplo, inyecciones de tamoxifeno a la misma hora del día. El proceso de irradiación debe hacerse con prontitud, y los ratones deben ser devueltos a sus jaulas originales de inmediato. Además, proporcionar alimentos ablandados y mucha agua puede ayudar a mejorar algunos de los efectos adversos de la radiación. Se sugiere la técnica swiss-roll para permitir un análisis exhaustivo del tejido intestinal59. Esta técnica no es trivial, y se deben realizar pruebas previas para garantizar que se logre una calidad impecable del tejido para la tinción. Todas las soluciones para experimentos con ratones y tinción deben prepararse frescamente y almacenarse en condiciones adecuadas. Cuando se trabaja con anticuerpos, es importante probar portaobjetos utilizando controles positivos y negativos y, si es posible, usar anticuerpos con el mismo número de catálogo y número de lote. Los portaobjetos de inmunofluorescencia deben almacenarse a 4 °C y obtener imágenes dentro de 1 semana de preparación. El almacenamiento prolongado, incluso a -20 °C, puede provocar la pérdida de señal. Los portaobjetos H&E se pueden almacenar a temperatura ambiente, ya que no hay preocupación por la pérdida de estabilidad del fluoróforo.

En resumen, el modelo de lesión por radiación de rastreo de linaje presentado aquí es un modelo reproducible y relevante para rastrear el destino de las células intestinales después de un insulto y se puede combinar con diversos modelos murinos y técnicas moleculares para mejorar la comprensión de la fisiopatología del epitelio intestinal. La comprensión de los mecanismos moleculares y celulares que rigen la regeneración del epitelio intestinal podría conducir al desarrollo de nuevos tratamientos e intervenciones terapéuticas beneficiosas.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses.

Acknowledgments

Los autores desean agradecer al Núcleo de Investigación de Histología del Centro de Cáncer de Stony Brook por la asistencia experta con la preparación de muestras de tejido y a la División de Recursos para Animales de Laboratorio de la Universidad de Stony Brook por su asistencia con el cuidado y manejo de animales. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud DK124342 otorgadas a Agnieszka B. Bialkowska y DK052230 al Dr. Vincent W. Yang.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe BD 309659 -
16G Reusable Small Animal Feeding Needles: Straight VWR 20068-630 -
27G x 1/2" needle BD 305109 -
28G x 1/2" Monoject 1mL insulin syringe Covidien 1188128012 -
5-Ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) Santa Cruz Biotechnology sc284628A 10 mg/mL in sterile DMSO:water (1:4 v/v), aliquot and store in -20°C
Azer Scientific 10% Neutral Buffered Formalin Fisher Scientific 22-026-213 -
B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J The Jackson Laboratory Strain #:006148
B6;129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/J The Jackson Laboratory Strain #:010531
Bovine Serum Albumin Fraction V, heat shock Millipore-Sigma 3116956001
Chicken anti-GFP Aves GFP-1020
Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 imaging kit, Invitrogen Thermo Fisher Scientific C10638 -
Corn oil Millipore-Sigma C8267 -
Decloaking Chamber Biocare Medical DC2012 -
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher BioReagents BP231-100 light sensitive
DNase-free proteinase K Invitrogen C10618H diluted 25x in DPBS
Donkey anti-chicken AF647 Jackson ImmunoResearch 703-605-155
DPBS Fisher Scientific 21-031-CV -
Eosin Fisher Scientific S176
Fluorescence Microscope Nikon Eclipse 90i Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20X Nikon
Fluoromount Aqueous Mounting Medium Millipore-Sigma F4680-25ML
Gamma Cell 40 Exactor Best Theratronics Ltd. - 0.759 Gy min-1
Goat anti-rabbit AF488 Jackson ImmunoResearch 111-545-144
Hematoxylin Solution, Gill No. 3 Millipore-Sigma GHS332
HM 325 Rotary Microtome from Thermo Scientific Fisher Scientific 23-900-668
Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) Thermo Fisher Scientific H3569 dilution 1:1000
Hydrogen Peroxide Solution, ACS, 29-32%, Spectrum Chemical Fisher Scientific 18-603-252 -
In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche) Millipore-Sigma 11684795910
Liquid Blocker Super PAP PEN, Mini Fisher Scientific DAI-PAP-S-M
Lithium Carbonate (Powder/Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific L119-500 0.5g/1L dH2O
Luer-Lok Syringe sterile, single use, 10 mL VWR 89215-218 -
Methanol VWR BDH1135-4LP
Pharmco Products Ethyl alcohol, 200 PROOF Fisher Scientific NC1675398 -
Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Acetic Acid ACS Grade Capitol Scientific AAP-281000ACSCSLT -
Rabbit anti-Ki67 BioCare Medical CRM325
Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Mounting Medium Fisher Scientific 22-050-262
Scientific Industries Incubator-Genie for baking slides at 65 degree Fisher Scientific 50-728-103
Sodium Citrate Dihydrate Fisher Scientific S279-500
Stainless Steel Dissecting Kit VWR 25640-002
Superfrost Plus micro slides [size: 25 x 75 x 1 mm] VWR  48311-703
Tamoxifen Millipore-Sigma T5648 30 mg/mL in sterile corn oil, preferably fresh or short-sterm storage in -20°C, light sensitive
Tissue-Tek 24-Slide Holders with Detachable Handle Sakura 4465
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Blades Sakura 4689
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set Sakura 4451
Tissue-Tek Staining Dish, Green with Lid Sakura 4456
Tissue-Tek Staining Dish, White with Lid Sakura 4457
Tween 20 Millipore-Sigma P7949
Unisette Processing Cassettes VWR 87002-292 -
VWR Micro Cover Glasses VWR 48393-081
Xylene Fisher Scientific X5P-1GAL

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References

  1. Helander, H. F., Fandriks, L. Surface area of the digestive tract - Revisited. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 49 (6), 681-689 (2014).
  2. vander Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annual Review of Physiology. 71, 241-260 (2009).
  3. Clevers, H. The intestinal crypt, a prototype stem cell compartment. Cell. 154 (2), 274-284 (2013).
  4. Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
  5. Yan, K. S., et al. The intestinal stem cell markers Bmi1 and Lgr5 identify two functionally distinct populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (2), 466-471 (2012).
  6. Liao, Z., Hu, C., Gao, Y. Mechanisms modulating the activities of intestinal stem cells upon radiation or chemical agent exposure. Journal of Radiation Research. 63 (2), 149-157 (2022).
  7. Meyer, A. R., Brown, M. E., McGrath, P. S., Dempsey, P. J. Injury-Induced Cellular Plasticity Drives Intestinal Regeneration. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 13 (3), 843-856 (2022).
  8. Owens, B. M., Simmons, A. Intestinal stromal cells in mucosal immunity and homeostasis. Mucosal Immunology. 6 (2), 224-234 (2013).
  9. Barker, N. Adult intestinal stem cells: Critical drivers of epithelial homeostasis and regeneration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 19-33 (2014).
  10. Cheng, H., Origin Leblond, C. P. differentiation and renewal of the four main epithelial cell types in the mouse small intestine. V. Unitarian Theory of the origin of the four epithelial cell types. The American Journal of Anatomy. 141 (4), 537-561 (1974).
  11. Sender, R., Milo, R. The distribution of cellular turnover in the human body. Nature Medicine. 27 (1), 45-48 (2021).
  12. Metcalfe, C., Kljavin, N. M., Ybarra, R., de Sauvage, F. J. Lgr5+ stem cells are indispensable for radiation-induced intestinal regeneration. Cell Stem Cell. 14 (2), 149-159 (2014).
  13. Tian, H., et al. A reserve stem cell population in small intestine renders Lgr5-positive cells dispensable. Nature. 478 (7368), 255-259 (2011).
  14. Tirado, F. R., et al. Radiation-induced toxicity in rectal epithelial stem cell contributes to acute radiation injury in rectum. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 63 (2021).
  15. Tetteh, P. W., Farin, H. F., Clevers, H. Plasticity within stem cell hierarchies in mammalian epithelia. Trends in Cell Biology. 25 (2), 100-108 (2015).
  16. Breault, D. T., et al. Generation of mTert-GFP mice as a model to identify and study tissue progenitor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (30), 10420-10425 (2008).
  17. Montgomery, R. K., et al. Mouse telomerase reverse transcriptase (mTert) expression marks slowly cycling intestinal stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (1), 179-184 (2011).
  18. Orzechowska, E. J., Katano, T., Bialkowska, A. B., Yang, V. W. Interplay among p21(Waf1/Cip1), MUSASHI-1 and Kruppel-like factor 4 in activation of Bmi1-Cre(ER) reserve intestinal stem cells after gamma radiation-induced injury. Scientific Reports. 10 (1), 18300 (2020).
  19. Takeda, N., et al. Interconversion between intestinal stem cell populations in distinct niches. Science. 334 (6061), 1420-1424 (2011).
  20. Wong, V. W., et al. Lrig1 controls intestinal stem-cell homeostasis by negative regulation of ErbB signalling. Nature Cell Biology. 14 (4), 401-408 (2012).
  21. Powell, A. E., et al. The pan-ErbB negative regulator Lrig1 is an intestinal stem cell marker that functions as a tumor suppressor. Cell. 149 (1), 146-158 (2012).
  22. Ayyaz, A., et al. Single-cell transcriptomes of the regenerating intestine reveal a revival stem cell. Nature. 569 (7754), 121-125 (2019).
  23. Tomic, G., et al. Phospho-regulation of ATOH1 is required for plasticity of secretory progenitors and tissue regeneration. Cell Stem Cell. 23 (3), 436-443 (2018).
  24. Castillo-Azofeifa, D., et al. Atoh1(+) secretory progenitors possess renewal capacity independent of Lgr5(+) cells during colonic regeneration. The EMBO Journal. 38 (4), 99984 (2019).
  25. Van Landeghem, L., et al. Activation of two distinct Sox9-EGFP-expressing intestinal stem cell populations during crypt regeneration after irradiation. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 302 (10), 1111-1132 (2012).
  26. Roche, K. C., et al. SOX9 maintains reserve stem cells and preserves radioresistance in mouse small intestine. Gastroenterology. 149 (6), 1553-1563 (2015).
  27. Barriga, F. M., et al. Mex3a marks a slowly dividing subpopulation of Lgr5+ intestinal stem cells. Cell Stem Cell. 20 (6), 801-816 (2017).
  28. May, R., et al. Brief report: Dclk1 deletion in tuft cells results in impaired epithelial repair after radiation injury. Stem Cells. 32 (3), 822-827 (2014).
  29. Tetteh, P. W., et al. Replacement of lost Lgr5-positive stem cells through plasticity of their enterocyte-lineage daughters. Cell Stem Cell. 18 (2), 203-213 (2016).
  30. Bohin, N., et al. Rapid crypt cell remodeling regenerates the intestinal stem cell niche after Notch inhibition. Stem Cell Reports. 15 (1), 156-170 (2020).
  31. Li, N., et al. Single-cell analysis of proxy reporter allele-marked epithelial cells establishes intestinal stem cell hierarchy. Stem Cell Reports. 3 (5), 876-891 (2014).
  32. van Es, J. H., et al. Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage. Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).
  33. Durand, A., et al. Functional intestinal stem cells after Paneth cell ablation induced by the loss of transcription factor Math1 (Atoh1). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (23), 8965-8970 (2012).
  34. Hayakawa, Y., et al. BHLHA15-positive secretory precursor cells can give rise to tumors in intestine and colon in mice. Gastroenterology. 156 (4), 1066-1081 (2019).
  35. Yan, K. S., et al. Intestinal enteroendocrine lineage cells possess homeostatic and injury-inducible stem cell activity. Cell Stem Cell. 21 (1), 78-90 (2017).
  36. Chandrakesan, P., et al. Intestinal tuft cells regulate the ATM mediated DNA damage response via Dclk1 dependent mechanism for crypt restitution following radiation injury. Scientific Reports. 6, 37667 (2016).
  37. Yu, S., et al. Paneth cell multipotency induced by Notch activation following Injury. Cell Stem Cell. 23 (1), 46-59 (2018).
  38. Moussa, L., et al. Bowel radiation injury: Complexity of the pathophysiology and promises of cell and tissue engineering. Cell Transplantation. 25 (10), 1723-1746 (2016).
  39. Gong, W., et al. Mesenchymal stem cells stimulate intestinal stem cells to repair radiation-induced intestinal injury. Cell Death & Disease. 7 (9), 2387 (2016).
  40. Tam, S. Y., Wu, V. W. C. A review on the special radiotherapy techniques of colorectal cancer. Frontiers in Oncology. 9, 208 (2019).
  41. Shadad, A. K., Sullivan, F. J., Martin, J. D., Egan, L. J. Gastrointestinal radiation injury: Symptoms, risk factors and mechanisms. World Journal of Gastroenterology. 19 (2), 185-198 (2013).
  42. Serrano Martinez, P., Giuranno, L., Vooijs, M., Coppes, R. P. The radiation-induced regenerative response of adult tissue-specific stem cells: Models and signaling pathways. Cancers. 13 (4), 855 (2021).
  43. Stacey, R., Green, J. T. Radiation-induced small bowel disease: Latest developments and clinical guidance. Therapeutic Advances in Chronic Disease. 5 (1), 15-29 (2014).
  44. Pan, Y. B., Maeda, Y., Wilson, A., Glynne-Jones, R., Vaizey, C. J. Late gastrointestinal toxicity after radiotherapy for anal cancer: A systematic literature review. Acta Oncologica. 57 (11), 1427-1437 (2018).
  45. Elhammali, A., et al. Late gastrointestinal tissue effects after hypofractionated radiation therapy of the pancreas. Radiation Oncology. 10, 186 (2015).
  46. You, S. H., Cho, M. Y., Sohn, J. H., Lee, C. G. Pancreatic radiation effect in apoptosis-related rectal radiation toxicity. Journal of Radiation Research. 59 (5), 529-540 (2018).
  47. Jiminez, J. A., Uwiera, T. C., Douglas Inglis, G., Uwiera, R. R. Animal models to study acute and chronic intestinal inflammation in mammals. Gut Pathogens. 7, 29 (2015).
  48. Snider, A. J., et al. Murine model for colitis-associated cancer of the colon. Methods in Molecular Biology. 1438, 245-254 (2016).
  49. Clapper, M. L., Cooper, H. S., Chang, W. C. Dextran sulfate sodium-induced colitis-associated neoplasia: A promising model for the development of chemopreventive interventions. Acta Pharmacologica Sinica. 28 (9), 1450-1459 (2007).
  50. Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. Animal models of ischemia-reperfusion-induced intestinal injury: Progress and promise for translational research. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 308 (2), 63-75 (2015).
  51. Fujimichi, Y., Otsuka, K., Tomita, M., Iwasaki, T. Ionizing radiation alters organoid forming potential and replenishment rate in a dose/dose-rate dependent manner. Journal of Radiation Research. 63 (2), 166-173 (2022).
  52. Montenegro-Miranda, P. S., et al. A novel organoid model of damage and repair identifies HNF4alpha as a critical regulator of intestinal epithelial regeneration. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (2), 209-223 (2020).
  53. Nagle, P. W., Coppes, R. P. Current and future perspectives of the use of organoids in radiobiology. Cells. 9 (12), 2649 (2020).
  54. Taelman, J., Diaz, M., Guiu, J. Human Intestinal Organoids: Promise and Challenge. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 854740 (2022).
  55. Kim, C. K., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. The role of intestinal stem cells in epithelial regeneration following radiation-induced gut injury. Current Stem Cell Reports. 3 (4), 320-332 (2017).
  56. Kuruvilla, J. G., et al. Kruppel-like factor 4 modulates development of BMI1(+) intestinal stem cell-derived lineage following gamma-radiation-induced gut injury in mice. Stem Cell Reports. 6 (6), 815-824 (2016).
  57. Sangiorgi, E., Capecchi, M. R. Bmi1 is expressed in vivo in intestinal stem cells. Nature Genetics. 40 (7), 915-920 (2008).
  58. Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Developmental Biology. 1, 4 (2001).
  59. Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. Journal of Visualized Experiments. (113), e54161 (2016).
  60. Booth, C., Tudor, G., Tudor, J., Katz, B. P., MacVittie, T. J. Acute gastrointestinal syndrome in high-dose irradiated mice. Health Physics. 103 (4), 383-399 (2012).
  61. Lu, L., Jiang, M., Zhu, C., He, J., Fan, S. Amelioration of whole abdominal irradiation-induced intestinal injury in mice with 3,3'-Diindolylmethane (DIM). Free Radical Biology & Medicine. 130, 244-255 (2019).
  62. Karlsson, J. A., Andersen, B. L. Radiation therapy and psychological distress in gynecologic oncology patients: Outcomes and recommendations for enhancing adjustment. Journal of Psychosomatic Obstetrics & Gynecology. 5 (4), 283-294 (1986).
  63. Yang, J., Cai, H., Xiao, Z. X., Wang, H., Yang, P. Effect of radiotherapy on the survival of cervical cancer patients: An analysis based on SEER database. Medicine. 98 (30), 16421 (2019).
  64. Giroux, V., et al. Mouse intestinal Krt15+ crypt cells are radio-resistant and tumor initiating. Stem Cell Reports. 10 (6), 1947-1958 (2018).
  65. Kim, C. K., et al. Kruppel-like factor 5 regulates stemness, lineage specification, and regeneration of intestinal epithelial stem cells. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (4), 587-609 (2020).
  66. Sheng, X., et al. Cycling stem cells are radioresistant and regenerate the intestine. Cell Reports. 32 (4), 107952 (2020).
  67. Gross, S., et al. Nkx2.2 is expressed in a subset of enteroendocrine cells with expanded lineage potential. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309 (12), 975-987 (2015).
  68. Sato, T., et al. Characterization of radioresistant epithelial stem cell heterogeneity in the damaged mouse intestine. Scientific Reports. 10 (1), 8308 (2020).
  69. Roth, S., et al. Paneth cells in intestinal homeostasis and tissue injury. PLoS One. 7 (6), 38965 (2012).
  70. Bohin, N., et al. Insulin-like growth factor-1 and mTORC1 signaling promote the intestinal regenerative response after irradiation injury. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (4), 797-810 (2020).
  71. Romesser, P. B., et al. Preclinical murine platform to evaluate therapeutic countermeasures against radiation-induced gastrointestinal syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (41), 20672-20678 (2019).
  72. Gu, J., et al. At what dose can total body and whole abdominal irradiation cause lethal intestinal injury among C57BL/6J mice. Dose Response. 18 (3), 1559325820956783 (2020).
  73. Huh, W. J., et al. Tamoxifen induces rapid, reversible atrophy, and metaplasia in mouse stomach. Gastroenterology. 142 (1), 21-24 (2012).
  74. Keeley, T. M., Horita, N., Samuelson, L. C. Tamoxifen-induced gastric injury: Effects of dose and method of administration. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 8 (3), 365-367 (2019).
  75. Bohin, N., Carlson, E. A., Samuelson, L. C. Genome toxicity and impaired stem cell function after conditional activation of CreER(T2) in the intestine. Stem Cell Reports. 11 (6), 1337-1346 (2018).
  76. Boynton, F. D. D., Ericsson, A. C., Uchihashi, M., Dunbar, M. L., Wilkinson, J. E. Doxycycline induces dysbiosis in female C57BL/6NCrl mice. BMC Research Notes. 10 (1), 644 (2017).

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Biología Número 185
Regeneración epitelial intestinal en respuesta a la irradiación ionizante
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Orzechowska-Licari, E. J., LaComb, J. F., Giarrizzo, M., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation. J. Vis. Exp. (185), e64028, doi:10.3791/64028 (2022).

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