Summary
Het protocol presenteert een muismodel van vaginale kolonisatie met anaeroob gekweekte menselijke vaginale bacteriën. We richten ons op Gardnerella vaginalis, terwijl we suggesties opnemen voor Prevotella bivia en Fusobacterium nucleatum. Dit protocol kan ook worden gebruikt als een gids voor vaginale inentingen en levensvatbaar herstel van andere anaeroob gekweekte bacteriën.
Abstract
De vagina van zoogdieren kan worden gekoloniseerd door vele bacteriële taxa. Het menselijke vaginale microbioom wordt vaak gedomineerd door Lactobacillus-soorten , maar een op de vier vrouwen ervaart bacteriële vaginose, waarbij een laag niveau van lactobacillen gepaard gaat met een overgroei van diverse anaerobe bacteriën. Deze aandoening is in verband gebracht met veel gezondheidscomplicaties, waaronder risico's voor de reproductieve en seksuele gezondheid. Hoewel er steeds meer bewijs is dat de complexe aard van microbiële interacties in de menselijke vaginale gezondheid aantoont, zijn de individuele rollen van deze verschillende anaerobe bacteriën niet volledig begrepen. Dit wordt gecompliceerd door het ontbreken van adequate modellen om anaeroob gekweekte vaginale bacteriën te bestuderen. Muismodellen stellen ons in staat om de biologie en virulentie van deze organismen in vivo te onderzoeken. Andere muismodellen van vaginale bacteriële inenting zijn eerder beschreven. Hier beschrijven we methoden voor de inenting van anaeroob gekweekte bacteriën en hun levensvatbare herstel in conventioneel gekweekte C57Bl / 6-muizen. Een nieuwe, minder stressvolle procedurele methode voor vaginale inenting en wassen wordt ook beschreven. Inenting en levensvatbaar herstel van Gardnerella worden in detail geschetst en strategieën voor aanvullende anaëroben zoals Prevotella bivia en Fusobacterium nucleatum worden besproken.
Introduction
Bij zoogdieren is de vagina de thuisbasis van een consortium van bacteriesoorten. Het menselijke vaginale microbioom is uniek onder zoogdieren in zijn overvloed aan leden van het geslacht Lactobacillus en overeenkomstige lage vaginale pH (3.8-4.5) 1,2,3,4. Verstoring van deze Lactobacillus-dominantie wordt geassocieerd met een verscheidenheid aan negatieve gezondheidsresultaten.
Bij bacteriële vaginose (BV) zijn er minder lactobacillen en een verhoogde abundantie van diverse anaerobe bacteriën, zoals Gardnerella vaginalis en Prevotella bivia 5,6. Vrouwen met BV lopen een verhoogd risico op seksueel overdraagbare aandoeningen 7,8,9, onvruchtbaarheid10, zwangerschapsverliezen11, vroeggeboorte 12,13,14, intra-uteriene infecties 15, cervicale infecties16 en kanker 16,17,18 . BV wordt ook geassocieerd met een hogere kans op vaginale kolonisatie door potentieel pathogene bacteriën, zoals Fusobacterium nucleatum 1,19,20, een veel voorkomend isolaat van vruchtwaterinfecties21.
Vanwege het belang van anaerobe bacteriën in de vaginale gezondheid van de mens, is er behoefte aan diermodellen die kunnen worden gebruikt om de biologie en pathogenese van deze organismen te onderzoeken. Hier beschrijven we methoden voor vaginale inenting en levensvatbaar herstel van Gardnerella vaginalis bij oestrogene muizen en suggereren we aanvullende strategieën voor Prevotella bivia en Fusobacterium nucleatum. Andere modellen van murine vaginale kolonisatie zijn eerder beschreven, maar deze hebben zich gericht op de inenting en het herstel van facultatieve anaerobe bacteriën zoals Groep B Streptococcus22 en Neisseria gonorroe23 die aeroob werden gekweekt. Inenting en herstel van obligate anaëroben kan met succes worden bereikt met geschikte experimentele strategieën. We bespreken benaderingen voor het levensvatbare herstel van verschillende bacteriële taxa en suggereren empirische evaluatie van voorwaarden voor de levensvatbaarheid van extra soorten / stammen van belang.
De klassieke methode voor het schatten van kolonisatie door levende bacteriën is het herstel van kolonievormende eenheden (CFU's). Bij conventioneel grootgebrachte muizen met hun eigen endogene microbiota vereist dit herstel op agarmedia die selecteren tegen leden van de endogene vaginale microbiota, terwijl de geënte bacteriestam nog steeds kan groeien. Hier gebruiken we een streptomycine-resistent isolaat van G. vaginalis24 dat selectief kan worden hersteld op een streptomycine-bevattend agarmedium. Om ervoor te zorgen dat het medium voldoende selectief is en, omgekeerd, dat streptomycine-resistente bacteriën niet aanwezig zijn in het endogene microbioom, moeten vaginale lavages die vlak voor inenting worden verzameld, worden geplateerd op selectieve (streptomycine-bevattende) agar.
De beste methode voor entpreparaat kan variëren tussen soorten en bacteriestammen. Voorafgaand aan de start van experimenten bij muizen, moet voorbereidend werk worden uitgevoerd om de voorkeursomstandigheden te bepalen voor het kweekmedium, het groeieindpunt en de bereiding van entmateriaal, evenals de gevoeligheid voor zuurstof en de levensvatbaarheid bij PBS. In het geval van meer zuurstofgevoelige bacteriën kunnen alternatieve preparaten van het entmateriaal worden overwogen (bv. in een anaeroob kweekmedium met een geschikte voertuigcontrolegroep)25,26.
Protocol
Alle dierproeven werden goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met institutionele richtlijnen en de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren van de University of California San Diego (UCSD, protocolnummer: S20057, vanaf 2020) en daarvoor aan de Washington University, St. Louis (Protocol 20110149, tot 2020).
OPMERKING: Het onderstaande protocol maakt gebruik van conventioneel opgevoede vrouwelijke C57Bl / muizen, leeftijd 6-11 weken op het moment van inenting. Let op leveranciersinformatie en specifieke leeftijdscategorieën die eerder in het relevante geciteerde werk zijn gebruikt.
1. Bereiding en toediening van β-oestradiol 17-valeraat
OPMERKING: β-oestradiol 17-valeraat is een carcinogeen en een reproductief toxine dat door de huid kan worden opgenomen27,28. Draag de juiste PBM's tijdens het hanteren van poeder en vloeibare oplossing. Het is ook een aquatisch toxine29; gooi het op de juiste manier weg in een goed afgesloten en geëtiketteerde container.
- Filter steriliseer tot 50 ml sesamolie door een filter van 0,22 μm met behulp van een 50 ml conisch buisvacuümfiltersysteem. Alleen open in een bioveiligheidskast om de steriliteit te behouden.
- Bereken het volume van β-oestradiol valeraatoplossing dat nodig is voor het experiment: 200 μL per muis plus 2-3 ml extra om rekening te houden met monsterverlies tijdens het vullen van de spuit (een experiment met 10 muizen vereist bijvoorbeeld in totaal 4 ml). Bereken de hoeveelheid β-oestradiol valeraat die nodig is om een 5 mg / ml-oplossing te maken en weeg deze direct in een buis met ronde bodem van 14 ml.
- Sluit de buis van 14 ml stevig af en vortex om klonten in het poeder te breken (hierdoor kan het β-oestradiol valeraat sneller oplossen). Voeg steriel gefilterde sesamolie toe aan de buis van 14 ml, zodat de uiteindelijke concentratie van β-oestradiol valeraat 5 mg / ml is.
- Plaats de goed afgedekte buis van 14 ml op een rotator bij 37 °C gedurende 30-40 minuten, totdat het vaste poeder volledig is opgelost. Bevestig visueel de homogeniteit van de oplossing vóór injectie in de muizen. Incubatie bij 37 °C verlaagt de viscositeit van de sesamolie, waardoor het gemakkelijker te injecteren is.
- Breng β-oestradiol valeraatoplossing in een spuit van 1 ml (zonder naald). Om dit te doen zonder bubbels te introduceren, trekt u eerst een beetje van de oplossing op en verwijdert u vervolgens voorzichtig terwijl u de punt van de spuit in de sesamolie houdt. Trek de oplossing langzaam weer op, iets voorbij de grens van 100 μL.
- Plaats een naald van 25 G x 5/8 op de spuit. Prime vervolgens de naald door de sesamolie-oplossing langzaam uit te drijven totdat deze uit de naaldpunt begint te komen. Verwijder de oplossing totdat de spuit op 100 μL is. Bereid één spuit per muis.
- Dien de β-oestradiol 17-valeraat toe via intraperitoneale injectie op 48 uur of 72 uur voorafgaand aan de inenting. Injecteer elke muis met 100 μL van de 5 mg/ml β-oestradiol valeraatoplossing (0,5 mg β-oestradiol valeraat/muis), zoals eerder beschreven22,30. Bewaar de resterende oplossing bij 4 °C gedurende 72 uur tot de volgende injectie.
- Dien de β-oestradiol valeraatoplossing opnieuw toe op de dag van inenting, onmiddellijk voorafgaand aan vaginale inenting van de muizen. Verwijder de oplossing van 4 °C en plaats deze gedurende 30 minuten vóór de injectie op een rotator bij 37 °C om de sesamolie te laten opwarmen en minder stroperig te maken. Ga verder met injecties zoals beschreven in stap 1.7.
2. Bereiding van entmateriaal
OPMERKING: Deze sectie bevat de algemene stappen voor de bereiding van ent enten uit anaeroob gekweekt streptomycine-resistente Gardnerella vaginalis JCP8151B-SmR 24,25,31,32. Alle stappen in deze sectie moeten worden uitgevoerd in een anaerobe kamer.
- Cycle alle reagentia, inclusief bereide NYC III-bouillon, agar en PBS, in een anaerobe kamer om ten minste 24 uur voor gebruik in evenwicht te brengen.
OPMERKING: Hier werd een vinyl anaerobe kamer gebruikt die in evenwicht was met 5% waterstofgasmengsel. De interne zuurstofconcentratie rust meestal op 0 ppm, hoewel er een laag niveau van voorbijgaande verhogingen (10-25 ppm) kan zijn wanneer materialen in de kamer worden gefietst. - Twee dagen voorafgaand aan vaginale inenting, streep Gardnerella uit een bevroren glycerolvoorraad op een NYC III-agarplaat in de anaerobe kamer. Gebruik een kleine container (zoals een lege pipetpuntdoos) gevuld met droogijs om de glycerolvoorraad bevroren te houden tijdens het transport in en uit de kamer.
- Gebruik 1 dag voorafgaand aan vaginale inenting 5-10 individuele Gardnerella-kolonies van de plaat om 10 ml NYC III-bouillon te enten. Laat de vloeistofcultuur een nacht groeien gedurende 16 uur bij 37 °C. Voeg een tweede aliquot van 1 ml toe van het kweekmedium dat niet is ingeinoculeerd en incubeer het naast de geënte cultuur om te bevestigen dat het medium niet verontreinigd is.
- Bereid het entmateriaal uit vloeibare cultuur zoals hieronder beschreven. Voer het entpreparaat zoveel mogelijk uit in de anaerobe kamer.
- Bepaal de cultuur optische dichtheid (OD) door 200 μL cultuur toe te voegen aan 800 μL verse media in een cuvette van 1,5 ml (1:5 verdunning). Gebruik een spectrofotometer om de dichtheid (OD) van de verdunde cultuur te meten bij een golflengte van 600 nm (gebruik een apart cuvet met alleen verse media als blanco). Vermenigvuldig de OD-waarde met 5 om de werkelijke OD600 van de 16 h-cultuur te krijgen.
- Bereken het volume entmateriaal dat nodig is voor het experiment. Om bijvoorbeeld 15 muizen te infecteren met een entmateriaal van 20 μL per muis, is 15 x 20 μL = 300 μL entmateriaal nodig. Bereid ongeveer 25% meer entmateriaal dan nodig is, dus bereid voor 15 muizen 300 μL + (0,25 x 300 μL) = 375 μL entmateriaal.
- Bereken met behulp van de in stap 2.4.1 bepaalde OD600 het volume van de 16 uur cultuur die moet worden afgesponnen en geresuspendeerd om een OD600 = 5,0 entmateriaal te krijgen in het in stap 2.4.2 berekende volume. Als bijvoorbeeld de OD600 van de cultuur 1,5 is en het benodigde entmateriaalvolume 375 μL, dan is het volume van de cultuur dat moet worden afgesponnen (375 μL x 5) / 1,5 = 1250 μL.
- Pipetteer het in stap 2.4.3 berekende cultuurvolume. in een steriele microcentrifugebuis. Pelleteer de bacteriën door centrifugeren bij 16.000 x g gedurende 1-3 minuten.
- Verwijder het supernatant en resuspenseer de pellet in anaerobe PBS op het in stap 2.4.2 berekende volume. Het entmateriaal komt nu op een berekende OD600 van 5,0 te liggen. Bereid indien van toepassing ook een tube PBS voor als voertuigcontrole voor muizen in de niet-geïnfecteerde controlegroep.
- Voordat u de entbuis uit de anaerobe kamer verwijdert, bereidt u een seriële verdunningsreeks voor van 1:10 tot 1:10 x 106 in PBS. Spotplaat 5 repliceert van elke verdunning op een agarplaat met behulp van een meerkanaals pipet om de KVE van het entmateriaal te bepalen. Dit is de pre-inenting CFU.
3. Vaginale pre-lavage en inenting met Gardnerella
- Bereid vaginale lavage/wasbuizen voor in de anaerobe kamer (dit kan tegelijkertijd met de bereiding van het entmateriaal in stap 2.4.). Pipetteer 70 μL steriele, anaerobe PBS in microcentrifugebuizen van 1,5 ml met muisnummers. Bereid één wasslang per muis. Sluit de buizen goed af en fiets ze uit de anaerobe kamer.
- Voer een vaginale lavage uit op elke muis met 50 μL anaerobe PBS uit de afzonderlijke buizen die zijn voorbereid in stap 3.1. Deze vaginale lavages zijn de pre-inenting wasbeurten en kunnen worden gebruikt voor stroomafwaartse metingen en testen.
- Na toediening van de tweede injectie met β-oestradiol valeraat (stap 1.8), plaatst u elke muis op een kooi of een schoon hard oppervlak dat hij met zijn voorpoten kan vasthouden. Pak voorzichtig het middelste deel van de staart vast en til op, zodat de achterhand iets verhoogd is en de vaginale opening wordt blootgelegd.
- Gebruik een pipet en een p-200 filtertip om 50 μL PBS op te nemen uit de wasbuis die overeenkomt met de juiste muis. Steek de pipetpunt voorzichtig in het vaginale lumen ~ 2-3 mm en pipetteer het volume van 50 μL voorzichtig in en uit, 3x-4x.
- Breng het verzamelde wasmateriaal (~ 50 μL) terug in dezelfde wasbuis waar het vandaan kwam, op en neer pipetteer in de wasbuis die nog steeds de resterende 20 μL PBS bevat. Als er overmatig slijm is en de punt verstopt raakt, gebruik dan een schone p-200-tip om het resterende materiaal te verzamelen en in dezelfde wasbuis te plaatsen.
- Dien vaginaal 20 μL van de geconcentreerde bacteriële suspensie of voertuigcontrole toe in de vagina van elke muis. Ent elke muis onmiddellijk na de vaginale lavage voor die muis (d.w.z. voer lavage en inenting achter elkaar uit voor elke muis voordat u doorgaat naar de volgende). Om dit proces te vereenvoudigen, gebruikt u twee p200-pipetten- één ingesteld op 50 μL voor lavages en de andere op 20 μL voor inentingen.
- Houd de muis in bedwang zoals beschreven in stap 3.2.1. Pipetteer met behulp van een p-200-punt 20 μL bacteriële suspensie in de vagina. Gebruik voor co-inentingsexperimenten met twee verschillende bacteriesoorten/stammen 10 μL van elke bacteriële suspensie en vermijd het mengen van de twee stammen voorafgaand aan de inenting.
OPMERKING: Het totale inentingsvolume mag niet hoger zijn dan 20 μL om spillover uit de vagina te voorkomen. - Blijf het achterste uiteinde van elke muis gedurende 10-20 s omhoog houden om te voorkomen dat het toegediende volume zich onmiddellijk verzamelt bij de vaginale introitus. Plaats de muis vervolgens in een nieuwe kooi/houder of bij kooigenoten die al zijn ingeënt.
- Herhaal stap 3.2. en stap 3.3. voor elke muis. Plaats muizen nooit terug in een kooi met dieren die nog niet zijn ingeënt. Dit voorkomt onbedoelde blootstelling van muizen aan streptomycine-resistente bacteriën voorafgaand aan inenting.
- Houd de muis in bedwang zoals beschreven in stap 3.2.1. Pipetteer met behulp van een p-200-punt 20 μL bacteriële suspensie in de vagina. Gebruik voor co-inentingsexperimenten met twee verschillende bacteriesoorten/stammen 10 μL van elke bacteriële suspensie en vermijd het mengen van de twee stammen voorafgaand aan de inenting.
- Nadat alle muizen zijn ingeënt, fietst u de entbuis terug in de anaerobe kamer. Bereid en plaat een andere seriële verdunning zoals beschreven in stap 2.5. Dit is de post-inenting CFU. Vergelijk de CFU's van de post-inentings- en pre-inentingsplaten om te bepalen of de levensvatbaarheid van het entmateriaal afnam terwijl het zich buiten de anaerobe kamer bevond tijdens de inenting van de dieren.
- Plaat de vaginale lavages verzameld in stap 3.2. op selectieve agar (in dit geval 1 mg/ml streptomycine). Incubeer de platen gedurende 1-2 dagen in een anaerobe kamer bij 37 °C en onderzoek op groei.
OPMERKING: Groei geeft aan dat endogene leden van het microbioom resistent zijn tegen de selectiemarker en daarom de CFU-opsomming van het doelorganisme kunnen verdoezelen.
4. Verzameling van vaginale lavages om levensvatbare Gardnerella-kolonisatie te bepalen
- Verzamel de vaginale wasbeurten op geselecteerde tijdstippen om vaginale kolonisatie te analyseren. Verzamelen zoals beschreven in stap 3.2.
- Onmiddellijk na het verzamelen, cyclus de vaginale lavages in een anaerobe kamer. Gebruik 10 μL van elke lavage om seriële verdunning en plating op selectieve agar uit te voeren zoals beschreven in stap 2.5. Gebruik de CFU-tellingen als een maat voor vaginale kolonisatie door Gardnerella (of een andere anaerobe van belang).
5. Opoffering, dissectie en weefselhomogenisatie
- Bereid een buis van 5 ml voor elk orgaan dat van elke muis wordt verzameld (als bijvoorbeeld de vagina, baarmoederhals en baarmoeder allemaal worden verzameld, bereid dan drie buizen per muis voor). Vul elke buis met steriele anaerobe 1x PBS (of andere homogenisatiemedia) in de anaerobe kamer. Gebruik 1 ml PBS voor buizen die worden gebruikt om vagina's en cervices te verzamelen en 750 μL voor buizen die worden gebruikt om baarmoederhoorns te verzamelen.
- Zodra PBS is toegevoegd, weegt u elke afzonderlijke buis (dit is het gewicht vóór de verzameling en wordt gebruikt om het totale gewicht van elk geoogst weefsel te bepalen). Als er geen weegschaal beschikbaar is in de anaerobe kamer, sluit u de buizen stevig af en cyclet u ze uit de kamer om te worden gewogen en fietst u ze vervolgens weer naar binnen.
OPMERKING: Buisvoorbereiding en gewichtsverzameling kunnen 1 dag voor het offer worden gedaan, maar buizen moeten in de anaerobe kamer worden bewaard met doppen goed afgesloten om verdamping te voorkomen. - Bereid een set vaginale lavagebuizen voor zoals beschreven in stap 3.1. om de laatste lavage te verzamelen bij opoffering. Bereid ook een bekerglas van 50 ml gedeïoniseerd (DI) water en een tweede bekerglas van 50 ml 70% -90% ethanol om te gebruiken voor het spoelen en steriliseren van standaard stalen dissectie-instrumenten tijdens het offer.
- Fiets de met PBS gevulde orgelverzamelbuizen uit de anaerobe kamer. Houd de buisjes goed gesloten totdat de tissues klaar zijn om te worden toegevoegd.
- Offer elke muis op met behulp van IACUC-goedgekeurde methoden. Voer de laatste lavage uit zoals beschreven in stap 3.2.2. en 3.2.3. hetzij onmiddellijk voorafgaand aan het offer, hetzij onmiddellijk daarna.
- Begin met dissectie en weefselverzameling. Spuit de buik en rug van elke muis in met 70% ethanol. Steriliseer de schaar in een beker ethanol, laat ze drogen en maak vervolgens een enkele verticale knip de abdominopelvice holte van de muis.
- Gebruik een steriele tang om de huid terug te trekken en duw de darmen voorzichtig uit de lichaamsholte en naar de zijkant van het open veld, waardoor het voortplantingskanaal wordt blootgesteld.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u de darmen niet doorboort of doorboort, omdat ze streptomycine-resistente bacteriën kunnen herbergen die de experimentele resultaten kunnen verstoren. - Om het maximale vaginale weefsel te verzamelen, breekt u het schaambeen tijdens de obductie. Knip met een steriele schaar het midden van het schaambeen (de schaamsymfyse) terwijl u voorzichtig bent om niet in de vagina te snijden. Gebruik twee sets steriele tangen, pak elke kant van het bekken en trek het bekken zijdelings open, waardoor het onderste deel van de vagina eronder wordt blootgesteld.
- Gebruik een tang om de baarmoederhals voorzichtig vast te pakken (een hardere structuur in vergelijking met het omliggende weefsel). Trek voorzichtig aan de baarmoederhals omhoog om de dikke darm bloot te leggen, verborgen achter en nauw verbonden met de vagina.
- Gebruik een kleine schaar om de vagina los te maken van het externe bindweefsel. Scheid de vagina voorzichtig van de dikke darm en vermijd het doorboren van het darmkanaal. Wanneer volledig losgelaten, flankeert u de vagina bij de introitus met een schaar en knipt u om los te komen van het muizenlichaam.
- Houd een zachte grip op de baarmoederhals terwijl u iets omhoog trekt om de baarmoederhoorns beter zichtbaar te maken. Snijd met de andere hand direct onder de eierstokken aan de rechter- en linkerkant om de baarmoederhoorns te bevrijden. Verwijder het nu losgekoppelde voortplantingskanaal uit de lichaamsholte en plaats het in een steriele petriplaat.
- Gebruik een scheermes om de baarmoederhoorns, baarmoederhals en vagina te scheiden. Plaats elk weefsel in de respectievelijke gelabelde verzamelbuis. Als cytokines worden verzameld, plaats de buisjes dan op ijs na toevoeging van weefsel.
- Weeg elke buis opnieuw nadat het weefsel is toegevoegd. Dit is het gewicht na de collectie. Trek het gewicht vóór de verzameling af van het gewicht na de verzameling om het totale gewicht van het weefsel te krijgen.
- Gebruik een handheld homogenisator om de organen in hun verzamelbuizen te homogeniseren. Voer voor Gardnerella JCP8151B deze stap uit in de bioveiligheidskast (aeroob) of de anaerobe kamer.
- Bereid verschillende sets buizen voor voor het wassen en aseptische behandeling van de handheld homogenisator tussen monsters. Zorg ervoor dat elke set drie conische buizen van 50 ml heeft: een gevuld met DI-water, een met 70% ethanol en de derde met 1x PBS. Bereid een aparte set wastubes voor elke muisbehandelingsgroep voor.
- Om de homogenisator schoon te maken, laat u de messen in de vloeistof in elke wasbuis zakken en draait u het instrument op maximale snelheid. Houd de homogenisator ongeveer 3 s in elk van de drie buisjes. De volgorde van wassen is DI-water (om fysiek vuil te verwijderen), vervolgens ethanol (om te ontsmetten) en ten slotte 1x PBS (om te neutraliseren). Schud de sonde op een papieren handdoek of wegwerpbankkussen om overtollig vocht tussen elke spoeling te verwijderen.
- Na het eerste spoelen homogeniseert u de weefsels door de homogenisatorsonde naar de bodem van de verzamelbuis te laten zakken, waardoor het weefsel eronder wordt gevangen. Schakel de homogenisator in om het weefsel te malen en beweeg de sonde ongeveer 5x voorzichtig op en neer terwijl u ondergedompeld blijft. Homogeniseer elk orgaan gedurende ongeveer 15-30 s.
- Nadat u de homogenisator uit de buis hebt uitgeschakeld en verwijderd, inspecteert u de inhoud visueel om volledige weefselverstoring te garanderen. Dit is vooral belangrijk voor de baarmoederhals en vagina, die soms niet door de sonde worden gevangen.
OPMERKING: Het is goed als wat overtollig vet op de baarmoederhoorns niet volledig homogeniseert. - Herhaal stap 5.14.1.-5.14.4. het wassen en steriliseren van de sonde tussen elk monster. Schakel over naar een nieuwe set wasbuizen voor elke experimentele groep.
- Verplaats de buizen met gehomogeniseerde monsters in de anaerobe kamer. Om de bacteriële belasting van elk weefsel te bepalen, voert u een korte zachte vortexing van het monster uit om te mengen, verwijdert u vervolgens 100 μL weefselhomogenaat voor seriële verdunning en plating op selectieve agar voor CFU-bepaling (de eerste verdunning is 1 x 100). Als een ondergrens van detectie vereist is, voer dan spread-plating uit van 200-250 μL onverdund homogenaat.
Representative Results
Een schematische weergave van een voorbeeldexperiment toont enkele manieren waarop men het beschreven protocol zou kunnen uitvoeren (figuur 1).
Sommige dieren dragen endogene microben in hun vaginale microbiomen die zullen groeien op niet-selectieve media. De hier beschreven methoden zijn gebaseerd op streptomycine-resistente isolaten van de bestudeerde bacteriestammen, samen met selectieve media die streptomycine bevatten, om te selecteren tegen endogene bacteriën (figuur 2A, B). Het is mogelijk dat streptomycineresistentie zich spontaan ontwikkelt, dus het controleren van muizen voorafgaand aan infectie (dag 0 wasbeurten) kan helpen vaststellen of dit een probleem kan zijn.
Herstel van levensvatbare bacteriën uit vaginale wasbeurten wordt bereikt door seriële verdunning en plating op agarmedia. Een standaard petrischaaltje kan tot een 6 x 6 array van 5 μL vlekken bevatten, waardoor bacteriële titers van zes replicavlekken over zes ordes van grootte voor elk monster kunnen worden opgesomd als 10-voudige seriële verdunningen worden gebruikt (figuur 3A). Deze methode kan worden gebruikt om titers van bacteriën op te sommen, variërend van Gardnerella tot Prevotella en Fusobacterium (figuur 3B-D).
Samen stellen deze methoden het mogelijk om hypothesen te testen en interpretaties te maken over bacteriële kolonisatie / infectie van het vrouwelijke voortplantingskanaal. Een vergelijking van Gardnerella-titers in vaginale wasbeurten en vaginale weefselhomogenaten toonde bijvoorbeeld concordantie tussen deze methoden (figuur 4A). Evenzo waren in een vaginaal co-inentingsmodel titers van Prevotella in baarmoederweefsel significant hoger (ongeveer 20-voudig) tijdens Gardnerella-co-infectie in vergelijking met Prevotella mono-infectie (figuur 4B). Ten slotte kunnen wild-type versus mutante bacteriestammen in deze modellen worden vergeleken om de rollen vast te stellen die specifieke genen en hun producten spelen in de processen van kolonisatie / infectie van het voortplantingskanaal. Een gemuteerde stam van Fusobacterium die niet in staat was om het koolhydraat siaalzuur te transporteren en te consumeren, leidde bijvoorbeeld tot lagere niveaus van kolonisatie 3 dagen na inenting (figuur 4C).
Figuur 1: Schema van een voorbeeldexperiment33. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Groei van endogene muizen vaginale microben op selectieve versus niet-selectieve agar. Vaginale lavages van vijf vrouwelijke C57Bl/6-muizen (1-5) werden op twee verschillende NYC III-agarplaten gestreept en anaeroob geïncubeerd. (A) De plaat aan de linkerkant bevat geen antibiotica en maakt de groei van endogene anaerobe bacteriën uit het muizene vaginale kanaal mogelijk. (B) De plaat aan de rechterkant bevat 1 mg/ml streptomycine en selecteert tegen de groei van endogene bacteriën. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Herstel van levensvatbare G. vaginalis, P. bivia en F. nucleatum CFU's van vaginale wasbeurten. (A) CFU's van G. vaginalis JCP8151B-SmR inoculum, gerepliceerd als verdunningsreeks op NYC III agar. (B-D) Herstel van levensvatbare (B) G. vaginalis24, (C) P. bivia25 en (D) F. nucleatum26 uit de vaginale lavages van mono-geïnfecteerde dieren. Voor elke grafiek (B-D) worden de gegevens gecombineerd uit twee onafhankelijke experimenten, met 10-15 muizen per experiment 24,25,26. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Verdere analyse van anaerobe bacteriële kolonisatie in een murine vaginaal inentingsmodel. (A) G. vaginalistiters in vaginale wassingen correleren met G. vaginalistiters hersteld van vaginale weefselhomogenaten op 24 uur en 72 uur na inenting (combinatie van twee onafhankelijke experimenten, n = 10 elk. Significantie bepaald door Spearman's rangcorrelatietest)24. (B) Co-infectie met G. vaginalis leidt tot verhoogde P. bivia-titers in baarmoederhoornweefsel in vergelijking met P. bivia mono-geïnfecteerde dieren 48 uur na inenting (combinatie van twee onafhankelijke experimenten, elk met 6-10 muizen per groep. Significantie bepaald door Mann-Whitney U-test, **p = 0,0017)25. (C) F. nucleatummutant met verstoorde siaalzuurtransporter (Ω SiaT) heeft verminderde titers in vaginale lavages van mono-geïnfecteerde muizen in vergelijking met F. nucleatum wild-type 72 uur na inenting (combinatie van twee onafhankelijke experimenten, elk met 10 muizen per groep. Significantie bepaald door Mann-Whitney U-test, **p < 0,01)26. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend dossier 1: Voorbeelden van methoden die worden gebruikt voor verschillende vaginale bacteriën die onder anaërobe omstandigheden worden gekweekt. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
De belangrijkste manier waarop het hier beschreven model verschilt van eerder gepubliceerde vaginale inentingsmodellen is het gebruik van anaëroob gekweekte bacteriën, die speciale overwegingen vereisen voor de bereiding van levensvatbaar entmateriaal en het herstel van bacteriën uit de muizen. Specifieke stappen in het bovenstaande protocol kunnen enigszins variëren, afhankelijk van de gebruikte soort/bacteriestam, zoals voorgesteld in aanvullend dossier 1. Bovendien beschrijft dit manuscript een nieuwe procedurele methode voor het toedienen van bacteriën en vaginale wasbeurten die minder ervaring van de kant van de onderzoeker en minder terughoudendheid voor de muizen vereist. Als de experimentator zich niet op zijn gemak voelt met de vorm van terughoudendheid zoals beschreven in stap 3.2. en stap 3.3., kunnen de muizen in plaats daarvan worden gekrabbeld zoals eerder beschreven34 met of zonder anesthesie volgens het experimentele ontwerp en de institutionele IACUC-richtlijnen.
Een belangrijk voorbehoud bij het gebruik van anaëroob gekweekte bacteriën in muizenmodellen is dat bepaalde stappen (zoals die met levende dieren) buiten de anaerobe kamer moeten worden uitgevoerd. Daarom zijn de meest kritieke stappen in dit protocol die waarin de bacteriën van belang worden blootgesteld aan een aerobe omgeving, zoals tijdens inenting van de muizen. Het gebruik van nieuwe anaërobe in dit model vereist een voorlopig onderzoek naar het vermogen ervan om levensvatbaar te blijven bij blootstelling aan zuurstof (zoals de vergelijking van CFUs vóór en na inenting zoals beschreven in stap 2.5. en stap 3.4. Afhankelijk van de mate van zuurstof en de PBS-gevoeligheid van het organisme, moeten verschillende methoden voor entpreparaat worden overwogen (aanvullend dossier 1, stap 2.4.5.). Voor inentingen met G. vaginalis JCP8151B hebben we ontdekt dat een enkele buis entmateriaal kan worden bereid in PBS en kan worden gebruikt om alle muizen te infecteren. Als een andere anaerobe bacterie wordt gebruikt die gevoeliger is voor zuurstof, kan het entmateriaal in plaats daarvan in afzonderlijke buizen voor elke muis worden bereid, zodat herhaald openen / sluiten van de buis niet nodig is. Evenzo, als de bacteriesoort van belang kieskeuriger / minder in staat is om te overleven in PBS dan G. vaginalis, kan inenting in plaats daarvan worden voorbereid in kweekmedia. Als het gebruikte medium reductiemiddelen bevat, zoals het CDC-anaërobe medium dat wordt gebruikt om Prevotella bivia te kweken (aanvullend bestand 1, stap 2.1. en stap 2.2.), dan zullen de bacteriën ook een verhoogde bescherming hebben tegen blootstelling aan zuurstof.
Alternatieve methoden voor homogenisatie kunnen ook worden overwogen, zoals kraal kloppen22,35, wat wordt gedaan met de buisdop gesloten en daarom minder zuurstof kan introduceren dan de handheld homogenisator. Bovendien kunnen meer zuurstofgevoelige organismen een langere evenwichtstijd voor media nodig hebben. Een zuurstofindicator zoals resazurine kan worden gebruikt om te controleren of anaerobe omstandigheden zijn bereikt (stap 2.1.). Alternatieve methoden zoals anaerobe potten kunnen de resultaten beïnvloeden en moeten vóór gebruik worden doorgelicht op bacteriële levensvatbaarheid.
De zuurstofgevoeligheid en kieskeurigheid van het experimentele organisme kunnen ook een rol spelen bij het succesvol herstel van levensvatbare bacteriën uit de muis tijdens lavages/homogenisatie (aanvullend dossier 1, stap 3.2. en stap 5.1.). Voor hooggevoelige organismen kan de tijd tussen het nemen en vergulden van de lavage leiden tot een verlies van levensvatbaarheid en een kunstmatig lage schatting van bacteriële vaginale kolonisatie veroorzaken. Om dit effect te verzachten, kunnen verzamelde lavages onmiddellijk worden verdund tot verse anaerobe kweekmedia (met reductiemiddel). Evenzo kan orgaanhomogenisatie worden gedaan in verse kweekmedia in plaats van PBS om de bacteriële levensvatbaarheid te vergroten en kan ook worden gedaan in de anaerobe kamer zelf om de blootstelling aan zuurstof te minimaliseren.
Afhankelijk van het doel van een bepaald experiment, moet de experimentator aandacht besteden aan controlegroepen. Om hypothesen te testen, zullen basismetingen van niet-geïnfecteerde controlemuizen die alleen met een voertuig worden behandeld, helpen vaststellen of er inductie van chemokines / cytokines of andere specifieke uitkomsten van infectie is. Het gebruikte controlevoertuig moet hetzelfde zijn als het voertuig dat voor inenting wordt gebruikt, dus als de bacteriën worden ingeënt in kweekmedia, moeten niet-geinoculeerde kweekmedia als controle worden gebruikt (aanvullend dossier 1, stap 2.4.5.).
De methoden die in dit protocol worden beschreven, kunnen ook worden toegepast op facultatieve bacteriën die anaëroob kunnen groeien, maar die traditioneel worden bestudeerd met behulp van aerobe kweekomstandigheden (zoals Escherichia coli of Groep B Streptococcus). Dit kan vooral relevant zijn voor infecties door deze organismen op lichaamslocaties waarvan wordt aangenomen dat ze lage zuurstofniveaus bevatten, zoals de baarmoederhals. Het kan zijn dat een facultatief organisme met meer succes plaatsen infecteert met minder zuurstof wanneer het entmateriaal anaëroob wordt bereid in vergelijking met aëroob. In een dergelijk experiment vereist het herstel van levensvatbare bacteriën voor CFU-inventarisatie mogelijk geen anaerobe omstandigheden.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.
Acknowledgments
We erkennen Lynne Foster voor technische assistentie bij de ontwikkeling van deze modellen. We waarderen opstartfondsen van de afdeling Moleculaire Microbiologie en het Center for Women's Infectious Disease Research (tot AL), en de March of Dimes (Basil O'Connor-prijs voor AL) die hebben bijgedragen aan het ondersteunen van experimenten in een vroeg stadium. Het National Institute of Allergy and Infectious Diseases (R01 AI114635) ondersteunde ook de ontwikkeling van deze modellen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-estradiol 17-valerate | Sigma | E1631 | estrogenization of mice |
| 0.22 µm, 50 mL Steriflip vacuum filter | Fisher | SCGP00525 | sterile filtering sesame oil |
| 14 mL tube | Falcon | 352059 | estrogenization of mice |
| 190-proof ethanol | Koptec | V1105M | dissection, tissue homogenization, CDC and Columbia media |
| 1x PBS | Fisher | MT21040CM | vaginal lavage, G. vaginlalis inoculum prep, tissue collection and homogenization |
| 25 G × 5/8 -in needle | BD | 305122 | estrogenization of mice |
| 5 mL tube | Falcon | 352063 | Tissue collection and homogenization |
| Anaerobic chamber | Coy | 7200000 | Growth of anaerobic bacteria |
| Bacto agar | Fisher | DF0140074 | G. vaginalis, F. nucleatum, and P. bivia agar plates |
| Bacto peptone | Fisher | DF0118170 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Columbia broth | Fisher | DF0944170 | Columbia media for F. nucleatum growth |
| Defibrinated sheep blood | Hemostat | DSB500 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | mouse/tissue dissection |
| Glucose | Sigma | G7528 | NYCIII media for G. vaginalis growth |
| Handheld homogenizer | ISC Bio | 3305500 | Tissue homogenization |
| Hemin | Sigma | 51280 | CDC anaerobic media for P. bivia growth, Columbia media for F. nucleatum growth |
| HEPES | Cellgro | 25-060-Cl | NYCIII media for G. vaginalis growth |
| Horse serum | Hemostat | SHS500 | NYCIII media for G. vaginalis growth |
| Hydrogen gas mix (5% hydrogen, 10% CO2, 85% nitrogen) | Matheson | Gas for anaerobic chamber | |
| Isofluorane | VetOne | 502017 | mouse anaethesia at sacrifice |
| L-cysteine | Sigma | C1276 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| L-glutamate | Sigma | G1626 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Milli-Q Water Purifier | Millipore | IQ-7000 | for making media and homogenization |
| NaCl | Sigma | S3014 | NYCIII media for G. vaginalis growth |
| NaOH tablets | Sigma | S5881 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Nitrogen gas | Airgas | Gas for anaerobic chamber | |
| p-200 filter tips | ISC Bio | P-1237-200 | vaginal lavages and bacterial inoculations |
| pancreatic digest of casein | Sigma | 70169 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Proteose peptone #3 | Fisher | DF-122-17-4 | NYCIII media for G. vaginalis growth |
| Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | mouse/tissue dissection |
| Sesame oil | Fisher | ICN15662191 | estrogenization of mice |
| Single edge surgical carbon steel razor blades | VWR | 55411-050 | tissue dissection |
| Sodium chloride | Sigma | S3014 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Spectrophotometer | BioChrom | 80-3000-45 | measuring bacterial OD600 |
| Streptomycin | Gibco | 11860038 | add to agar media to make selective plates |
| Tuberculin slip tip 1ml syringe | BD | 309659 | estrogenization of mice |
| Vitaim K3 | Sigma | M5625 | Columbia media for F. nucleatum growth |
| Vitamin K1 | Sigma | 95271 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Yeast extract | Fisher | DF0127-17-9 | NYCIII media for G. vaginalis growth |
References
- Hillier, S. L., Krohn, M. A., Rabe, L. K., Klebanoff, S. J., Eschenbach, D. A. The normal vaginal flora, H2O2-producing lactobacilli, and bacterial vaginosis in pregnant women. Clinical Infectious Diseases. 16, Suppl 4 273-281 (1993).
- Ravel, J., et al.
- Hill, G. B., Eschenbach, D. A., Holmes, K. K.
- van de Wijgert, J. The vaginal microbiome and sexually transmitted infections are interlinked: Consequences for treatment and prevention. PLoS Medicine. 14 (12), 1002478 (2017).
- Srinivasan, S., et al. Bacterial communities in women with bacterial vaginosis: high resolution phylogenetic analyses reveal relationships of microbiota to clinical criteria. PLoS One. 7 (6), 37818 (2012).
- Shipitsyna, E., et al. Composition of the vaginal microbiota in women of reproductive age-sensitive and specific molecular diagnosis of bacterial vaginosis is possible. PLoS One. 8 (4), 60670 (2013).
- Brotman, R. M., et al. Bacterial vaginosis assessed by gram stain and diminished colonization resistance to incident gonococcal, chlamydial, and trichomonal genital infection. The Journal of Infectious Diseases. 202 (12), 1907-1915 (2010).
- Peipert, J. F., et al. Bacterial vaginosis, race, and sexually transmitted infections: does race modify the association. Sexually Transmitted Diseases. 35 (4), 363-367 (2008).
- Wiesenfeld, H. C., Hillier, S. L., Krohn, M. A., Landers, D. V., Sweet, R. L. Bacterial vaginosis is a strong predictor of Neisseria gonorrhoeae and Chlamydia trachomatis infection. Clinical Infectious Diseases. 36 (5), 663-668 (2003).
- Spandorfer, S. D., Neuer, A., Giraldo, P. C., Rosenwaks, Z., Witkin, S. S. Relationship of abnormal vaginal flora, proinflammatory cytokines and idiopathic infertility in women undergoing IVF. The Journal of Reproductive Medicine. 46 (9), 806-810 (2001).
- Ralph, S. G., Rutherford, A. J., Wilson, J. D. Influence of bacterial vaginosis on conception and miscarriage in the first trimester: cohort study. BMJ. 319 (7204), 220-223 (1999).
- Holst, E., Goffeng, A. R., Andersch, B. Bacterial vaginosis and vaginal microorganisms in idiopathic premature labor and association with pregnancy outcome. Journal of Clinical Microbiology. 32 (1), 176-186 (1994).
- DiGiulio, D. B., et al. Microbial prevalence, diversity and abundance in amniotic fluid during preterm labor: a molecular and culture-based investigation. PLoS One. 3 (8), 3056 (2008).
- Svare, J. A., Schmidt, H., Hansen, B. B., Lose, G. Bacterial vaginosis in a cohort of Danish pregnant women: Prevalence and relationship with preterm delivery, low birthweight and perinatal infections. British Journal of Obstetrics and Gynaecology. 113 (12), 1419-1425 (2006).
- Ádám, A., et al. Culture- and PCR-based detection of BV associated microbiological profile of the removed IUDs and correlation with the time period of IUD in place and the presence of the symptoms of genital tract infection. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials. 17 (1), 40 (2018).
- Di Paola, M., et al. Characterization of cervico-vaginal microbiota in women developing persistent high-risk Human Papillomavirus infection. Scientific Reports. 7 (1), 10200 (2017).
- Bullman, S., et al. Analysis of Fusobacterium persistence and antibiotic response in colorectal cancer. Science. 358 (6369), 1443-1448 (2017).
- Brennan, C. A., Garrett, W. S. Gut microbiota, inflammation, and colorectal cancer. Annual Review of Microbiology. 70, 395-411 (2016).
- Hill, G. B. Preterm birth: associations with genital and possibly oral microflora. Annals of Periodontology. 3 (1), 222-232 (1998).
- Hitti, J., et al. Vaginal indicators of amniotic fluid infection in preterm labor. Obstetrics & Gynecology. 97 (2), 211-219 (2001).
- DiGiulio, D. B.
- Patras, K. A., Doran, K. S. A murine model of Group B Streptococcus vaginal colonization. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54708 (2016).
- Jerse, A. E., et al. Estradiol-treated female mice as surrogate hosts for Neisseria gonorrhoeae genital tract infections. Frontiers in Microbiology. 2, 107 (2011).
- Gilbert, N. M., Lewis, W. G., Lewis, A. L. Clinical features of bacterial vaginosis in a murine model of vaginal infection with Gardnerella vaginalis. PLoS One. 8 (3), 59539 (2013).
- Gilbert, N. M., et al. Gardnerella vaginalis and Prevotella bivia trigger distinct and overlapping phenotypes in a mouse model of bacterial vaginosis. The Journal of Infectious Diseases. 220 (7), 1099-1108 (2019).
- Agarwal, K., et al. Glycan cross-feeding supports mutualism between Fusobacterium and the vaginal microbiota. PLOS Biology. 18 (8), 3000788 (2020).
- Liehr, J. G. Is estradiol a genotoxic mutagenic carcinogen. Endocrine Reviews. 21 (1), 40-54 (2000).
- Yager, J. D., Davidson, N. E.
- Adeel, M., Song, X., Wang, Y., Francis, D., Yang, Y. Environmental impact of estrogens on human, animal and plant life: A critical review. Environment International. 99, 107-119 (2017).
- Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L.
- Lewis, W. G., Robinson, L. S., Gilbert, N. M., Perry, J. C., Lewis, A. L. Degradation, foraging, and depletion of mucus sialoglycans by the vagina-adapted Actinobacterium Gardnerella vaginalis. Journal of Biological Chemistry. 288 (17), 12067-12079 (2013).
- Robinson, L. S., et al. Genome sequences of 15 Gardnerella vaginalis strains isolated from the vaginas of women with and without bacterial vaginosis. Genome Announcements. 4 (5), 00879 (2016).
- Adapted from "mouse posterior turn" by BioRender.com. BioRender.com. , Available from: https://app.biorender.com/biorender-templates (2022).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e2771 (2012).
- Verollet, R. A major step towards efficient sample preparation with bead-beating. Biotechniques. 44 (6), 832-833 (2008).
