Summary
Le protocole présente un modèle murin de colonisation vaginale avec des bactéries vaginales humaines en culture anaérobie. Nous nous concentrons sur Gardnerella vaginalis, tout en incluant des suggestions pour Prevotella bivia et Fusobacterium nucleatum. Ce protocole peut également être utilisé comme guide pour les inoculations vaginales et la récupération viable d’autres bactéries cultivées en anaérobiose.
Abstract
Le vagin des mammifères peut être colonisé par de nombreux taxons bactériens. Le microbiome vaginal humain est souvent dominé par les espèces de Lactobacillus , mais une femme sur quatre souffre de vaginose bactérienne, dans laquelle un faible niveau de lactobacilles s’accompagne d’une prolifération de diverses bactéries anaérobies. Cette condition a été associée à de nombreuses complications de santé, y compris des risques pour la santé reproductive et sexuelle. Bien qu’il y ait de plus en plus de preuves montrant la nature complexe des interactions microbiennes dans la santé vaginale humaine, les rôles individuels de ces différentes bactéries anaérobies ne sont pas entièrement compris. Ceci est compliqué par le manque de modèles adéquats pour étudier les bactéries vaginales cultivées en anaérobiose. Les modèles murins nous permettent d’étudier la biologie et la virulence de ces organismes in vivo. D’autres modèles murins d’inoculation bactérienne vaginale ont déjà été décrits. Ici, nous décrivons les méthodes d’inoculation de bactéries cultivées en anaérobiose et leur récupération viable chez des souris C57Bl/6 d’élévation conventionnelle. Une nouvelle méthode procédurale moins stressante pour l’inoculation et le lavage vaginaux est également décrite. L’inoculation et la récupération viable de Gardnerella sont décrites en détail, et des stratégies pour d’autres anaérobies tels que Prevotella bivia et Fusobacterium nucleatum sont discutées.
Introduction
Chez les mammifères, le vagin abrite un consortium d’espèces bactériennes. Le microbiome vaginal humain est unique parmi les mammifères par son abondance de membres du genre Lactobacillus et le faible pH vaginal correspondant (3,8-4,5)1,2,3,4. La perturbation de cette dominance de Lactobacillus est associée à une variété de résultats négatifs pour la santé.
Dans la vaginose bactérienne (VB), il y a moins de lactobacilles et une abondance accrue de diverses bactéries anaérobies, telles que Gardnerella vaginalis et Prevotella bivia 5,6. Les femmes atteintes de VB courent un risque accru d’infections sexuellement transmissibles 7,8,9, d’infertilité 10, de pertes de grossesse 11, de naissances prématurées 12,13,14, d’infections intra-utérines 15, d’infections cervicales 16 et de cancer16,17,18 . La VB est également associée à une probabilité plus élevée de colonisation vaginale par des bactéries potentiellement pathogènes, telles que Fusobacterium nucleatum 1,19,20, un isolat commun des infections du liquide amniotique 21.
En raison de l’importance des bactéries anaérobies dans la santé vaginale humaine, il existe un besoin de modèles animaux qui peuvent être utilisés pour étudier la biologie et la pathogenèse de ces organismes. Ici, nous décrivons des méthodes d’inoculation vaginale et de récupération viable de Gardnerella vaginalis chez des souris œstrogéniques et suggérons des stratégies supplémentaires pour Prevotella bivia et Fusobacterium nucleatum. D’autres modèles de colonisation vaginale murine ont déjà été décrits, mais ils se sont concentrés sur l’inoculation et la récupération de bactéries anaérobies facultatives telles que Streptococcus22 du groupe B et Neisseria gonorrhoeae23 qui ont été cultivées en aérobiose. L’inoculation et la récupération des anaérobies obligatoires peuvent être accomplies avec succès avec des stratégies expérimentales appropriées. Nous discutons des approches pour le rétablissement viable de plusieurs taxons bactériens et suggérons une évaluation empirique des conditions de viabilité d’autres espèces / souches d’intérêt.
La méthode classique d’estimation de la colonisation par des bactéries vivantes est la récupération des unités formant colonie (UFC). Chez les souris élevées de manière conventionnelle avec leur propre microbiote endogène, cela nécessite une récupération sur gélose qui sélectionne les membres du microbiote vaginal endogène tout en permettant à la souche inoculée de bactéries de se développer. Ici, nous utilisons un isolat résistant à la streptomycine de G. vaginalis24 qui peut être récupéré sélectivement sur un milieu gélosé contenant de la streptomycine. Pour s’assurer que le milieu est suffisamment sélectif et, inversement, que les bactéries résistantes à la streptomycine ne sont pas présentes dans le microbiome endogène, les lavages vaginaux prélevés juste avant l’inoculation doivent être plaqués sur gélose sélective (contenant de la streptomycine).
La meilleure méthode de préparation de l’inoculum peut varier selon les espèces et les souches de bactéries. Avant le début des expériences sur la souris, des travaux préliminaires doivent être effectués pour déterminer les conditions préférables pour le milieu de culture, le critère de croissance et la préparation de l’inoculum, ainsi que la sensibilité à l’oxygène et la viabilité dans le PBS. Dans le cas de bactéries plus sensibles à l’oxygène, d’autres préparations de l’inoculum peuvent être envisagées (p. ex. dans un milieu de culture anaérobie avec un groupe témoin approprié du véhicule)25,26.
Protocol
Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées et menées conformément aux directives institutionnelles et au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire de l’Université de Californie à San Diego (UCSD, numéro de protocole: S20057, 2020-au-delà) et avant cela à l’Université de Washington, St. Louis (Protocole 20110149, jusqu’en 2020).
REMARQUE: Le protocole ci-dessous utilise des souris C57Bl / femelles élevées de manière conventionnelle, âgées de 6 à 11 semaines au moment de l’inoculation. Veuillez noter les informations sur les fournisseurs et les tranches d’âge spécifiques utilisées précédemment dans le travail cité pertinent.
1. Préparation et administration du β-estradiol-17-valérate
NOTE: β-estradiol 17-valérate est un cancérogène et une toxine reproductrice qui peut être absorbée par la peau27,28. Porter l’EPI approprié pendant la manipulation de la poudre et de la solution liquide. C’est aussi une toxine aquatique29 ; jetez-le correctement dans un contenant scellé et étiqueté de façon appropriée.
- Filtrer stériliser jusqu’à 50 ml d’huile de sésame à travers un filtre de 0,22 μm à l’aide d’un système de filtre à vide à tube conique de 50 ml. Ouvrir uniquement dans une enceinte de biosécurité pour maintenir la stérilité.
- Calculer le volume de solution de valérate de β-estradiol nécessaire pour l’expérience : 200 μL par souris plus 2 à 3 mL supplémentaires pour tenir compte de la perte d’échantillon pendant le remplissage de la seringue (p. ex., une expérience sur 10 souris nécessite 4 mL au total). Calculer la quantité de valérate de β-estradiol nécessaire pour fabriquer une solution à 5 mg/mL et peser directement dans un tube à fond rond de 14 mL.
- Boucher hermétiquement le tube de 14 ml et le vortex pour briser les amas dans la poudre (cela permettra au valérate de β-estradiol de se dissoudre plus rapidement). Ajouter de l’huile de sésame filtrée stérile dans le tube de 14 mL afin que la concentration finale de valérate de β-estradiol soit de 5 mg/mL.
- Placer le tube hermétiquement bouché de 14 mL sur un rotateur à 37 °C pendant 30 à 40 minutes, jusqu’à ce que la poudre solide se dissolve complètement. Confirmer visuellement l’homogénéité de la solution avant injection chez la souris. L’incubation à 37 °C diminue la viscosité de l’huile de sésame, ce qui facilite son injection.
- Aspirer β-estradiol valérate dans une seringue de 1 mL (sans aiguille). Pour ce faire sans introduire de bulles, prélevez d’abord un peu de la solution, puis expulsez doucement tout en gardant l’embout de la seringue dans l’huile de sésame. Aspirer à nouveau la solution lentement, légèrement au-delà de la barre des 100 μL.
- Placez une aiguille de 25 G x 5/8 pouces sur la seringue. Ensuite, amorcez l’aiguille en expulsant lentement la solution d’huile de sésame jusqu’à ce qu’elle commence à sortir de la pointe de l’aiguille. Expulser la solution jusqu’à ce que la seringue soit à la marque de 100 μL. Préparez une seringue par souris.
- Administrer le β-estradiol-valérate de 17 par injection intrapéritonéale 48 h ou 72 h avant l’inoculation. Injecter à chaque souris 100 μL de la solution de valérate de β-estradiol à 5 mg/mL (0,5 mg β-valérate d’estradiol/souris), comme décrit précédemment22,30. Conserver le reste de la solution à 4 °C pendant 72 h jusqu’à la prochaine injection.
- Administrer à nouveau la solution de valérate de β-estradiol le jour de l’inoculation, immédiatement avant l’inoculation vaginale des souris. Retirer la solution à 4 °C et la placer sur un rotateur à 37 °C pendant 30 min avant l’injection pour permettre à l’huile de sésame de se réchauffer et de devenir moins visqueuse. Procéder aux injections comme décrit à l’étape 1.7.
2. Préparation de l’inoculum
NOTE: Cette section contient les étapes générales pour la préparation de l’inocula à partir de Gardnerella vaginalis résistant à la streptomycine de culture anaérobie JCP8151B-SmR 24,25,31,32. Toutes les étapes de cette section doivent être effectuées dans une chambre anaérobie.
- Mettez en cycle tous les réactifs, y compris le bouillon préparé NYC III, l’agar et le PBS, dans une chambre anaérobie pour équilibrer au moins 24 heures avant utilisation.
NOTE: Ici, une chambre anaérobie vinylique équilibrée avec un mélange d’hydrogène gazeux à 5% a été utilisée. La concentration interne d’oxygène est généralement de 0 ppm, bien qu’il puisse y avoir de faibles augmentations transitoires (10-25 ppm) lors du cycle des matériaux dans la chambre. - Deux jours avant l’inoculation vaginale, étaler Gardnerella d’un stock de glycérol congelé sur une plaque de gélose NYC III dans la chambre anaérobie. Utilisez un petit récipient (comme une boîte de pointe de pipette vide) rempli de glace sèche pour garder le stock de glycérol congelé pendant le transport à l’intérieur et à l’extérieur de la chambre.
- 1 jour avant l’inoculation vaginale, utiliser 5 à 10 colonies individuelles de Gardnerella de la plaque pour inoculer 10 ml de bouillon NYC III. Laisser pousser la culture liquide pendant une nuit pendant 16 h à 37 °C. Inclure une deuxième partie aliquote de 1 mL du milieu de culture qui n’est pas inoculée et l’incuber avec la culture inoculée pour confirmer que le milieu n’est pas contaminé.
- Préparer l’inoculum à partir de la culture liquide comme décrit ci-dessous. Effectuez la préparation de l’inoculum dans la chambre anaérobie autant que possible.
- Déterminer la densité optique (DO) de culture en ajoutant 200 μL de culture à 800 μL de milieu frais dans une cuvette de 1,5 mL (dilution 1:5). Utiliser un spectrophotomètre pour mesurer la densité (DO) de la culture diluée à une longueur d’onde de 600 nm (utiliser une cuvette séparée avec du milieu frais seul comme blanc). Multipliez la lecture OD par 5 pour obtenir la ODréelle 600 de la culture de 16 h.
- Calculer le volume d’inoculum nécessaire à l’expérience. Par exemple, pour infecter 15 souris avec un inoculum de 20 μL par souris, 15 x 20 μL = 300 μL d’inoculum sont nécessaires. Préparez environ 25% plus d’inoculum que nécessaire, donc pour 15 souris, préparez 300 μL + (0,25 x 300 μL) = 375 μL d’inoculum.
- À l’aide de la DO 600 déterminée à l’étape 2.4.1., calculer le volume de la culture de 16 h qui doit être filée et remise en suspension pour obtenir un inoculum de DO600 = 5,0 dans le volume calculé à l’étape 2.4.2. Par exemple, si la DO600 de la culture est de 1,5 et que le volume d’inoculum nécessaire est de 375 μL, le volume de culture à filer est de (375 μL x 5)/1,5 = 1250 μL.
- Pipeter le volume de culture calculé à l’étape 2.4.3. dans un tube microcentrifuge stérile. Enduire les bactéries en centrifugeant à 16 000 x g pendant 1 à 3 min.
- Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille dans du PBS anaérobie au volume calculé à l’étape 2.4.2. L’inoculum sera maintenant à un OD600 calculé de 5,0. S’il y a lieu, préparez également un tube de PBS pour servir de véhicule de contrôle pour les souris du groupe témoin non infecté.
- Avant de retirer le tube d’inoculum de la chambre anaérobie, préparer une série de dilutions en série de 1:10 à 1:10 x 106 dans PBS. La plaque de dispersion 5 réplique de chaque dilution sur une plaque de gélose à l’aide d’une pipette multicanal pour déterminer l’UFC de l’inoculum. Il s’agit de l’UFC de pré-inoculation.
3. Pré-lavage vaginal et inoculation avec Gardnerella
- Préparer les tubes de lavage vaginal dans la chambre anaérobie (cela peut être fait en même temps que la préparation de l’inoculum à l’étape 2.4.). Pipeter 70 μL de PBS anaérobie stérile dans des tubes microcentrifugés de 1,5 mL étiquetés avec des numéros de souris. Préparez un tube de lavage par souris. Fermez hermétiquement les tubes et faites-les sortir de la chambre anaérobie.
- Effectuer un lavage vaginal sur chaque souris avec 50 μL de PBS anaérobie provenant des tubes individuels préparés à l’étape 3.1. Ces lavages vaginaux sont les lavages préalables à la vaccination et peuvent être utilisés pour les mesures et les tests en aval.
- Après l’administration de la deuxième injection de valérate d’β-estradiol (étape 1.8), placez chaque souris sur une cage ou une surface dure propre qu’elle peut saisir avec ses pattes antérieures. Saisissez doucement la partie médiane de la queue et soulevez de manière à ce que l’arrière-train soit légèrement surélevé et que l’ouverture vaginale soit exposée.
- À l’aide d’une pipette et de l’embout du filtre p-200, aspirer 50 μL de PBS du tube de lavage correspondant à la souris appropriée. Insérez doucement l’embout de la pipette dans la lumière vaginale ~2-3 mm et pipettez doucement le volume de 50 μL, 3x-4x.
- Transférer le matériau de lavage recueilli (~ 50 μL) dans le même tube de lavage d’où il provient, pipeter de haut en bas dans le tube de lavage qui contient encore les 20 μL restants de PBS. S’il y a trop de mucus et que l’embout est bouché, utilisez un embout p-200 propre pour recueillir le matériau restant et le placer dans le même tube de lavage.
- Administrer par voie vaginale 20 μL de la suspension bactérienne concentrée ou du contrôle du véhicule dans le vagin de chaque souris. Vaccinez chaque souris immédiatement après le lavage vaginal pour cette souris (c.-à-d. effectuez le lavage et l’inoculation en séquence pour chaque souris avant de passer à la suivante). Pour simplifier ce processus, utilisez deux pipettes p200, l’une réglée à 50 μL pour les lavages et l’autre à 20 μL pour les inoculations.
- Retenez la souris comme décrit à l’étape 3.2.1. À l’aide d’une pointe p-200, pipeter 20 μL de suspension bactérienne dans le vagin. Pour les expériences de co-inoculation utilisant deux espèces/souches bactériennes différentes, utiliser 10 μL de chaque suspension bactérienne et éviter de mélanger les deux souches avant l’inoculation.
REMARQUE: Le volume total d’inoculation ne doit pas dépasser 20 μL pour éviter les débordements hors du vagin. - Continuez à maintenir l’extrémité postérieure de chaque souris pendant 10 à 20 s pour éviter que le volume administré ne s’accumule immédiatement au niveau de l’introït vaginal. Ensuite, placez la souris dans une nouvelle cage / réceptacle ou avec des compagnons de cage qui ont déjà été inoculés.
- Répétez l’étape 3.2. et étape 3.3. pour chaque souris. Ne replacez jamais des souris dans une cage avec des animaux qui n’ont pas encore été inoculés. Cela empêche l’exposition accidentelle des souris à des bactéries résistantes à la streptomycine avant l’inoculation.
- Retenez la souris comme décrit à l’étape 3.2.1. À l’aide d’une pointe p-200, pipeter 20 μL de suspension bactérienne dans le vagin. Pour les expériences de co-inoculation utilisant deux espèces/souches bactériennes différentes, utiliser 10 μL de chaque suspension bactérienne et éviter de mélanger les deux souches avant l’inoculation.
- Une fois que toutes les souris ont été inoculées, faites revenir le tube d’inoculum dans la chambre anaérobie. Préparer et plaquer une autre dilution en série comme décrit à l’étape 2.5. C’est l’UFC post-inoculation. Comparer les UFC des plaques post-inoculation et pré-inoculation pour déterminer si la viabilité de l’inoculum a diminué à l’extérieur de la chambre anaérobie pendant l’inoculation des animaux.
- Plaquez les lavages vaginaux recueillis à l’étape 3.2. sur gélose sélective (dans ce cas, 1 mg/mL de streptomycine). Incuber les plaques pendant 1-2 jours dans une chambre anaérobie à 37 ° C et examiner la croissance.
REMARQUE : La croissance indique que les membres endogènes du microbiome sont résistants au marqueur de sélection et peuvent, par conséquent, masquer le dénombrement de l’UFC de l’organisme cible.
4. Collecte de lavages vaginaux pour déterminer la colonisation viable de Gardnerella
- Recueillir les lavages vaginaux à des moments choisis pour analyser la colonisation vaginale. Collecter comme décrit à l’étape 3.2.
- Immédiatement après la collecte, faites circuler les lavages vaginaux dans une chambre anaérobie. Utiliser 10 μL de chaque lavage pour effectuer la dilution en série et le placage sur gélose sélective comme décrit à l’étape 2.5. Utilisez le nombre d’UFC comme mesure de la colonisation vaginale par Gardnerella (ou un autre anaérobie d’intérêt).
5. Sacrifice, dissection et homogénéisation tissulaire
- Préparez un tube de 5 mL pour chaque organe prélevé sur chaque souris (par exemple, si le vagin, le col de l’utérus et l’utérus sont tous prélevés, préparez trois tubes par souris). Remplissez chaque tube avec du PBS anaérobie 1x stérile (ou d’autres milieux d’homogénéisation) dans la chambre anaérobie. Utilisez 1 mL de PBS pour les tubes utilisés pour recueillir les vagins et les cervices et 750 μL pour les tubes utilisés pour recueillir les cornes utérines.
- Une fois le PBS ajouté, peser chaque tube (il s’agit du poids avant la collecte et sera utilisé pour déterminer le poids total de chaque tissu prélevé). Si une balance n’est pas disponible dans la chambre anaérobie, fermez hermétiquement les tubes et faites-les sortir de la chambre pour les peser, puis refaites-les entrer.
REMARQUE: La préparation du tube et la collecte du poids peuvent être effectuées 1 jour avant le sacrifice, mais les tubes doivent être conservés dans la chambre anaérobie avec des bouchons hermétiquement scellés pour éviter l’évaporation. - Préparez un ensemble de tubes de lavage vaginal comme décrit à l’étape 3.1. pour recueillir le lavage final au sacrifice. Préparez également un bécher de 50 ml d’eau désionisée (DI) et un deuxième bécher de 50 ml d’éthanol à 70 % à 90 % à utiliser pour rincer et stériliser les instruments de dissection en acier standard pendant le sacrifice.
- Sortez les tubes de prélèvement d’organes remplis de PBS de la chambre anaérobie. Gardez les tubes hermétiquement fermés jusqu’à ce que les tissus soient prêts à être ajoutés.
- Sacrifiez chaque souris en utilisant des méthodes approuvées par l’IACUC. Effectuez le lavage final comme décrit aux étapes 3.2.2. et 3.2.3. soit immédiatement avant le sacrifice, soit immédiatement après.
- Commencer la dissection et le prélèvement de tissu. Vaporiser sur l’abdomen et le dos de chaque souris avec de l’éthanol à 70%. Stérilisez les ciseaux dans un bécher d’éthanol, laissez-les sécher, puis faites une seule découpe verticale dans la cavité abdomino-pelvienne de la souris.
- Utilisez des pinces stériles pour retirer la peau et pousser doucement les intestins hors de la cavité corporelle et sur le côté du champ ouvert, ce qui exposera l’appareil reproducteur.
REMARQUE: Veillez à ne pas percer ou percer les intestins car ils peuvent abriter des bactéries résistantes à la streptomycine qui peuvent confondre les résultats expérimentaux. - Pour recueillir le maximum de tissu vaginal, cassez l’os pubien pendant la nécropsie. À l’aide de ciseaux stériles, coupez le centre de l’os pubien (la symphyse pubienne) tout en prenant soin de ne pas couper dans le vagin. À l’aide de deux paires de pinces stériles, saisissez chaque côté du bassin et ouvrez le bassin latéralement, exposant la partie inférieure du vagin en dessous.
- Utilisez une pince pour saisir doucement le col de l’utérus (une structure plus dure par rapport aux tissus environnants). Tirez doucement sur le col de l’utérus pour exposer le côlon, caché derrière et étroitement relié au vagin.
- Utilisez de petits ciseaux pour libérer le vagin des tissus conjonctifs externes. Séparez soigneusement le vagin du côlon et évitez de percer le tractus intestinal. Lorsqu’il est complètement relâché, flanquez le vagin à l’introït avec des ciseaux et une coupe pour libérer du corps de la souris.
- Maintenez une prise douce sur le col de l’utérus tout en tirant légèrement vers le haut pour rendre les cornes utérines plus visibles. De l’autre main, coupez directement sous les ovaires sur les côtés droit et gauche pour libérer les cornes utérines. Retirez l’appareil reproducteur maintenant déconnecté de la cavité corporelle et placez-le dans une plaque de Petri stérile.
- À l’aide d’un rasoir, séparez les cornes utérines, le col de l’utérus et le vagin. Placez chaque tissu dans son tube de prélèvement étiqueté respectif. Si des cytokines doivent être recueillies, placez les tubes sur de la glace après l’ajout de tissu.
- Pesez à nouveau chaque tube après l’ajout du tissu. Il s’agit du poids post-collecte. Soustrayez le poids avant la collecte du poids après la collecte pour obtenir le poids total du tissu.
- Utilisez un homogénéisateur portatif pour homogénéiser les organes dans leurs tubes de collecte. Pour Gardnerella JCP8151B, effectuez cette étape dans l’enceinte de biosécurité (aérobie) ou dans la chambre anaérobie.
- Préparer plusieurs jeux de tubes pour le lavage et le traitement aseptique de l’homogénéisateur portatif entre les échantillons. Assurez-vous que chaque ensemble comporte trois tubes coniques de 50 ml : un rempli d’eau DI, un avec de l’éthanol à 70 % et le troisième avec 1x PBS. Préparez un jeu distinct de tubes de lavage pour chaque groupe de traitement de souris.
- Pour nettoyer l’homogénéisateur, abaissez les lames dans le liquide de chaque tube de lavage et tournez l’instrument à vitesse maximale. Maintenez l’homogénéisateur dans chacun des trois tubes pendant environ 3 s. L’ordre de lavage est l’eau DI (pour enlever les débris physiques), puis l’éthanol (pour désinfecter), et enfin 1x PBS (pour neutraliser). Agitez la sonde sur une serviette en papier ou un tampon de table jetable pour éliminer l’excès de liquide entre chaque rinçage.
- Après le rinçage initial, homogénéiser les tissus en abaissant la sonde homogénéisante au fond du tube de collecte, en emprisonnant le tissu en dessous. Allumez l’homogénéisateur pour broyer le tissu, en déplaçant doucement la sonde de haut en bas d’environ 5x tout en restant immergée. Homogénéiser chaque organe pendant environ 15-30 s.
- Après avoir éteint et retiré l’homogénéisateur du tube, inspectez visuellement le contenu pour assurer une perturbation complète des tissus. Ceci est particulièrement important pour le col de l’utérus et le vagin, qui ne parviennent parfois pas à être attrapés par la sonde.
REMARQUE: Ce n’est pas grave si un excès de graisse sur les cornes utérines ne s’homogénéise pas complètement. - Répéter les étapes 5.14.1.-5.14.4., laver et stériliser la sonde entre chaque échantillon. Passer à un nouvel ensemble de tubes de lavage pour chaque groupe expérimental.
- Déplacer les tubes avec des échantillons homogénéisés dans la chambre anaérobie. Pour déterminer la charge bactérienne de chaque tissu, effectuer un bref tourbillon doux de l’échantillon à mélanger, puis prélever 100 μL d’homogénat tissulaire pour la dilution en série et placage sur gélose sélective pour la détermination de l’UFC (la première dilution est de 1 x 100). Si une limite inférieure de détection est requise, effectuer un étalement de 200 à 250 μL d’homogénat non dilué.
Representative Results
Une représentation schématique d’un exemple d’expérience montre quelques-unes des façons dont on pourrait exécuter le protocole décrit (Figure 1).
Certains animaux transportent des microbes endogènes dans leur microbiome vaginal qui se développeront sur des milieux non sélectifs. Les méthodes décrites ici reposent sur des isolats résistants à la streptomycine des souches bactériennes étudiées, ainsi que sur des milieux sélectifs contenant de la streptomycine, pour sélectionner les bactéries endogènes (Figure 2A,B). Il est possible que la résistance à la streptomycine se développe spontanément, de sorte que la vérification des souris avant l’infection (lavages au jour 0) peut aider à déterminer si cela peut être un problème.
La récupération des bactéries viables des lavages vaginaux est réalisée par dilution en série et placage sur un milieu gélosé. Une boîte de Pétri standard peut contenir jusqu’à un réseau 6 x 6 de taches de 5 μL, ce qui permet de dénombrer les titres bactériens à partir de six répliques de taches sur six ordres de grandeur pour chaque échantillon si l’on utilise des dilutions en série 10 fois (figure 3A). Cette méthode peut être utilisée pour dénombrer les titres de bactéries allant de Gardnerella à Prevotella et Fusobacterium (Figure 3B-D).
Ensemble, ces méthodes permettent de tester des hypothèses et de faire des interprétations sur la colonisation bactérienne / infection de l’appareil reproducteur féminin. Par exemple, une comparaison des titres de Gardnerella dans les lavages vaginaux et les homogénats de tissus vaginaux a démontré une concordance entre ces méthodes (figure 4A). De même, dans un modèle de co-inoculation vaginale, les titres de Prevotella dans le tissu utérin étaient significativement plus élevés (environ 20 fois) pendant la co-infection à Gardnerella par rapport à la mono-infection à Prevotella (Figure 4B). Enfin, les souches bactériennes de type sauvage par rapport aux souches bactériennes mutantes peuvent être comparées dans ces modèles afin d’établir les rôles joués par des gènes spécifiques et leurs produits dans les processus de colonisation / infection de l’appareil reproducteur. Par exemple, une souche mutante de Fusobacterium qui n’a pas la capacité de transporter et de consommer l’acide sialique glucidique a entraîné une baisse des niveaux de colonisation 3 jours après l’inoculation (figure 4C).
Figure 1 : Schéma d’un exemple d’expérience33. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Croissance des microbes vaginaux murins endogènes sur gélose sélective versus non sélective. Les lavages vaginaux de cinq souris C57Bl/6 femelles (1-5) ont été striés sur deux plaques de gélose NYC III différentes et incubés en anaérobiose. (A) La plaque de gauche ne contient pas d’antibiotiques et permet la croissance de bactéries anaérobies endogènes à partir du tractus vaginal murin. (B) La plaque de droite contient 1 mg/mL de streptomycine et sélectionne contre la croissance de bactéries endogènes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Récupération des UFC viables de G. vaginalis, P. bivia et F. nucleatum à partir de lavages vaginaux. (A) UFC de l’inoculum G. vaginalis JCP8151B-SmR, plaqué réplique en série de dilution sur gélose NYC III. (B-D) Récupération de (B) G. vaginalis24, (C) P. bivia25 et (D) F. nucleatum26 viables à partir des lavages vaginaux d’animaux mono-infectés. Pour chaque graphique (B-D), les données sont combinées à partir de deux expériences indépendantes, avec 10-15 souris par expérience24,25,26. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Analyse plus approfondie de la colonisation bactérienne anaérobie dans un modèle murin d’inoculation vaginale. (A) Les titres de G. vaginalis dans les lavages vaginaux sont en corrélation avec les titres de G. vaginalis récupérés à partir d’homogénats de tissus vaginaux 24 h et 72 heures après l’inoculation (combinaison de deux expériences indépendantes, n = 10 chacune). Signification déterminée par le test de corrélation de rang de Spearman)24. (B) La co-infection par G. vaginalis entraîne une augmentation des titres de P. bivia dans le tissu de la corne utérine par rapport aux animaux mono-infectés par P. bivia 48 heures après l’inoculation (combinaison de deux expériences indépendantes, chacune avec 6 à 10 souris par groupe). Signification déterminée par le test U de Mann-Whitney, **p = 0,0017)25. (C) Le mutant F. nucleatum avec transporteur d’acide sialique perturbé (Ω SiaT) a diminué les titres dans les lavages vaginaux de souris mono-infectées par rapport à F. nucleatum de type sauvage 72 heures après l’inoculation (combinaison de deux expériences indépendantes, chacune avec 10 souris par groupe. Signification déterminée par le test U de Mann-Whitney, **p < 0,01)26. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Fichier supplémentaire 1 : Exemples de méthodes utilisées pour différentes bactéries vaginales cultivées dans des conditions anaérobies. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Discussion
La façon la plus importante dont le modèle décrit ici diffère des modèles d’inoculation vaginale publiés précédemment est l’utilisation de bactéries en culture anaérobie, qui nécessitent des considérations spéciales pour la préparation d’inoculum viable et la récupération des bactéries chez les souris. Les étapes spécifiques du protocole ci-dessus peuvent varier légèrement selon l’espèce ou la souche de bactéries utilisée, comme suggéré dans le dossier supplémentaire 1. De plus, ce manuscrit décrit une nouvelle méthode procédurale pour l’administration de bactéries et de lavages vaginaux qui nécessite moins d’expérience de la part de l’investigateur et moins de retenue pour les souris. Si l’expérimentateur n’est pas à l’aise avec la forme de contention décrite à l’étape 3.2. et l’étape 3.3., les souris peuvent plutôt être éraflées comme décrit précédemment34 avec ou sans anesthésie selon la conception expérimentale et les directives institutionnelles de l’IACUC.
Une mise en garde importante à l’utilisation de bactéries cultivées en anaérobiose dans les modèles murins est que certaines étapes (telles que celles impliquant des animaux vivants) doivent être effectuées à l’extérieur de la chambre anaérobie. Par conséquent, les étapes les plus critiques de ce protocole sont celles dans lesquelles les bactéries d’intérêt seront exposées à un environnement aérobie, comme lors de l’inoculation des souris. L’utilisation de tout nouvel anaérobie dans ce modèle nécessitera une étude préliminaire de sa capacité à maintenir sa viabilité en cas d’exposition à l’oxygène (comme la comparaison des UFC avant et après l’inoculation, comme décrit aux étapes 2.5 et 3.4). Selon le degré d’oxygène et la sensibilité au PBS de l’organisme, différentes méthodes de préparation de l’inoculum doivent être envisagées (dossier supplémentaire 1, étape 2.4.5.). Pour les inoculations utilisant G. vaginalis JCP8151B, nous avons constaté qu’un seul tube d’inoculum peut être préparé dans du PBS et utilisé pour infecter toutes les souris. Si une bactérie anaérobie différente est utilisée et plus sensible à l’oxygène, l’inoculum peut plutôt être préparé dans des tubes séparés pour chaque souris afin qu’il ne soit pas nécessaire d’ouvrir / fermer le tube de manière répétée. De même, si l’espèce bactérienne d’intérêt est plus exigeante / moins capable de survivre dans le PBS que G. vaginalis, l’inoculation peut plutôt être préparée dans des milieux de culture. Si le milieu utilisé contient des agents réducteurs, tels que le milieu anaérobie CDC utilisé pour la culture de Prevotella bivia (dossier supplémentaire 1, étape 2.1. et étape 2.2.), la bactérie aura également une protection accrue contre l’exposition à l’oxygène.
D’autres méthodes d’homogénéisation peuvent également être envisagées, telles que le battement du cordon22,35, qui se fait avec le bouchon du tube fermé et peut donc introduire moins d’oxygène que l’homogénéisateur portatif. De plus, les organismes plus sensibles à l’oxygène peuvent nécessiter un temps d’équilibre plus long pour les milieux. Un indicateur d’oxygène tel que la résazurine peut être utilisé pour vérifier que les conditions anaérobies ont été atteintes (étape 2.1.). D’autres méthodes telles que les pots anaérobies peuvent affecter les résultats et doivent être vérifiées pour la viabilité bactérienne avant utilisation.
La sensibilité à l’oxygène et la minutie de l’organisme expérimental peuvent également jouer un rôle dans la récupération réussie des bactéries viables de la souris pendant le lavage/homogénéisation (dossier supplémentaire 1, étape 3.2. et étape 5.1.). Pour les organismes très sensibles, le temps écoulé entre le lavage pris et le plaquage peut entraîner une perte de viabilité et provoquer une estimation artificiellement basse de la colonisation vaginale bactérienne. Pour atténuer cet effet, les lavages collectés peuvent être immédiatement dilués dans des milieux de culture anaérobies frais (avec agent réducteur). De même, l’homogénéisation des organes peut être effectuée dans des milieux de culture frais plutôt que dans du PBS pour augmenter la viabilité bactérienne et peut également être effectuée dans la chambre anaérobie elle-même pour minimiser l’exposition à l’oxygène.
Selon le but d’une expérience donnée, l’expérimentateur doit prêter attention aux groupes témoins. Pour tester les hypothèses, les mesures de base de souris témoins non infectées qui sont simulées traitées avec le véhicule seul aideront à établir s’il y a induction de chimiokines / cytokines ou d’autres résultats spécifiques de l’infection. Le véhicule témoin utilisé doit être le même que celui utilisé pour l’inoculation, donc si les bactéries sont inoculées dans des milieux de culture, les milieux de culture non inoculés doivent être utilisés comme témoin (dossier supplémentaire 1, étape 2.4.5.).
Les méthodes décrites dans ce protocole pourraient également être appliquées à des bactéries facultatives capables de se développer en anaérobiose, mais qui sont traditionnellement étudiées en utilisant des conditions de culture aérobie (comme Escherichia coli ou Streptocoque du groupe B). Cela pourrait être particulièrement pertinent pour les infections par ces organismes dans les sites du corps qui sont censés contenir de faibles niveaux d’oxygène, comme le col de l’utérus. Il se peut qu’un organisme facultatif infecte plus efficacement les sites avec moins d’oxygène lorsque l’inoculum est préparé en anaérobiose que par voie aérobie. Dans une telle expérience, la récupération de bactéries viables pour le dénombrement de l’UFC peut ne pas nécessiter de conditions anaérobies.
Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Nous remercions Lynne Foster pour son assistance technique lors de l’élaboration de ces modèles. Nous apprécions les fonds de démarrage du Département de microbiologie moléculaire et du Center for Women’s Infectious Disease Research (à AL), ainsi que la March of Dimes (prix Basil O’Connor à AL) qui ont aidé à soutenir les expériences à un stade précoce. L’Institut national des allergies et des maladies infectieuses (R01 AI114635) a également soutenu le développement de ces modèles.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-estradiol 17-valerate | Sigma | E1631 | estrogenization of mice |
| 0.22 µm, 50 mL Steriflip vacuum filter | Fisher | SCGP00525 | sterile filtering sesame oil |
| 14 mL tube | Falcon | 352059 | estrogenization of mice |
| 190-proof ethanol | Koptec | V1105M | dissection, tissue homogenization, CDC and Columbia media |
| 1x PBS | Fisher | MT21040CM | vaginal lavage, G. vaginlalis inoculum prep, tissue collection and homogenization |
| 25 G × 5/8 -in needle | BD | 305122 | estrogenization of mice |
| 5 mL tube | Falcon | 352063 | Tissue collection and homogenization |
| Anaerobic chamber | Coy | 7200000 | Growth of anaerobic bacteria |
| Bacto agar | Fisher | DF0140074 | G. vaginalis, F. nucleatum, and P. bivia agar plates |
| Bacto peptone | Fisher | DF0118170 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Columbia broth | Fisher | DF0944170 | Columbia media for F. nucleatum growth |
| Defibrinated sheep blood | Hemostat | DSB500 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | mouse/tissue dissection |
| Glucose | Sigma | G7528 | NYCIII media for G. vaginalis growth |
| Handheld homogenizer | ISC Bio | 3305500 | Tissue homogenization |
| Hemin | Sigma | 51280 | CDC anaerobic media for P. bivia growth, Columbia media for F. nucleatum growth |
| HEPES | Cellgro | 25-060-Cl | NYCIII media for G. vaginalis growth |
| Horse serum | Hemostat | SHS500 | NYCIII media for G. vaginalis growth |
| Hydrogen gas mix (5% hydrogen, 10% CO2, 85% nitrogen) | Matheson | Gas for anaerobic chamber | |
| Isofluorane | VetOne | 502017 | mouse anaethesia at sacrifice |
| L-cysteine | Sigma | C1276 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| L-glutamate | Sigma | G1626 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Milli-Q Water Purifier | Millipore | IQ-7000 | for making media and homogenization |
| NaCl | Sigma | S3014 | NYCIII media for G. vaginalis growth |
| NaOH tablets | Sigma | S5881 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Nitrogen gas | Airgas | Gas for anaerobic chamber | |
| p-200 filter tips | ISC Bio | P-1237-200 | vaginal lavages and bacterial inoculations |
| pancreatic digest of casein | Sigma | 70169 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Proteose peptone #3 | Fisher | DF-122-17-4 | NYCIII media for G. vaginalis growth |
| Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | mouse/tissue dissection |
| Sesame oil | Fisher | ICN15662191 | estrogenization of mice |
| Single edge surgical carbon steel razor blades | VWR | 55411-050 | tissue dissection |
| Sodium chloride | Sigma | S3014 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Spectrophotometer | BioChrom | 80-3000-45 | measuring bacterial OD600 |
| Streptomycin | Gibco | 11860038 | add to agar media to make selective plates |
| Tuberculin slip tip 1ml syringe | BD | 309659 | estrogenization of mice |
| Vitaim K3 | Sigma | M5625 | Columbia media for F. nucleatum growth |
| Vitamin K1 | Sigma | 95271 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Yeast extract | Fisher | DF0127-17-9 | NYCIII media for G. vaginalis growth |
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