Summary
प्रोटोकॉल अवायवीय रूप से सुसंस्कृत मानव योनि बैक्टीरिया के साथ योनि उपनिवेशीकरण का एक माउस मॉडल प्रस्तुत करता है। हम प्रेवोटेला बिविया और फ्यूसोबैक्टीरियम न्यूक्लियेटम के सुझावों को शामिल करते हुए गार्डनरेला वेजाइनिस पर ध्यान केंद्रित करते हैं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग योनि टीकाकरण और अन्य अवायवीय रूप से उगाए गए बैक्टीरिया की व्यवहार्य वसूली के लिए एक गाइड के रूप में भी किया जा सकता है।
Abstract
स्तनधारी योनि को कई जीवाणु टैक्सा द्वारा उपनिवेशित किया जा सकता है। मानव योनि माइक्रोबायोम अक्सर लैक्टोबैसिलस प्रजातियों पर हावी होता है, लेकिन चार में से एक महिला बैक्टीरियल वेजिनोसिस का अनुभव करती है, जिसमें लैक्टोबैसिली का निम्न स्तर विविध एनारोबिक बैक्टीरिया के अतिवृद्धि के साथ होता है। यह स्थिति कई स्वास्थ्य जटिलताओं से जुड़ी हुई है, जिसमें प्रजनन और यौन स्वास्थ्य के जोखिम शामिल हैं। जबकि मानव योनि स्वास्थ्य में माइक्रोबियल इंटरैक्शन की जटिल प्रकृति दिखाने वाले सबूत बढ़ रहे हैं, इन विभिन्न एनारोबिक बैक्टीरिया की व्यक्तिगत भूमिकाओं को पूरी तरह से समझा नहीं गया है। यह अवायवीय रूप से उगाए गए योनि बैक्टीरिया का अध्ययन करने के लिए पर्याप्त मॉडल की कमी से जटिल है। माउस मॉडल हमें विवो में इन जीवों के जीव विज्ञान और विषाणु की जांच करने की अनुमति देते हैं। योनि जीवाणु टीकाकरण के अन्य माउस मॉडल पहले वर्णित किए गए हैं। यहां, हम एनारोबिक रूप से उगाए गए बैक्टीरिया के टीकाकरण और पारंपरिक रूप से उठाए गए सी 57 बीएल / 6 चूहों में उनकी व्यवहार्य वसूली के तरीकों का वर्णन करते हैं। योनि टीकाकरण और धोने के लिए एक नई, कम तनावपूर्ण प्रक्रियात्मक विधि भी वर्णित है। गार्डनरेला के टीकाकरण और व्यवहार्य वसूली को विस्तार से रेखांकित किया गया है, और अतिरिक्त एनारोब्स जैसे कि प्रेवोटेला बिविया और फ्यूसोबैक्टीरियम न्यूक्लियेटम के लिए रणनीतियों पर चर्चा की गई है।
Introduction
स्तनधारियों में, योनि जीवाणु प्रजातियों के एक संघ का घर है। मानव योनि माइक्रोबायोम स्तनधारियों के बीच अद्वितीय है जो जीनस लैक्टोबैसिलस के सदस्यों और संबंधित कम योनि पीएच (3.8-4.5)1,2,3,4 के सदस्यों की बहुतायत में है। इस लैक्टोबैसिलस प्रभुत्व का विघटन विभिन्न प्रकार के नकारात्मक स्वास्थ्य परिणामों से जुड़ा हुआ है।
बैक्टीरियल वेजिनोसिस (बीवी) में कम लैक्टोबैसिली और विविध एनारोबिक बैक्टीरिया की प्रचुरता में वृद्धि होती है, जैसे कि गार्डनरेला वेजाइनिस और प्रेवोटेला बिविया 5,6। बीवी वाली महिलाओं में यौन संचारित संक्रमण 7,8,9, बांझपन 10, गर्भावस्था के नुकसान 11, अपरिपक्व जन्म 12,13,14, अंतर्गर्भाशयी संक्रमण 15, गर्भाशय ग्रीवा संक्रमण16, और कैंसर16,17,18 का खतरा बढ़ जाता है . बीवी संभावित रोगजनक बैक्टीरिया द्वारा योनि उपनिवेशीकरण की उच्च संभावना से भी जुड़ा हुआ है, जैसे कि फ्यूसोबैक्टीरियम न्यूक्लियेटम 1,19,20, एमनियोटिक द्रव संक्रमण21 से एक आम अलगाव।
मानव योनि स्वास्थ्य में एनारोबिक बैक्टीरिया के महत्व के कारण, पशु मॉडल की आवश्यकता है जिसका उपयोग इन जीवों के जीव विज्ञान और रोगजनन की जांच के लिए किया जा सकता है। यहां, हम एस्ट्रोजेनाइज्ड चूहों में योनि टीकाकरण और गार्डनरेला वेजाइनिस की व्यवहार्य वसूली के तरीकों का वर्णन करते हैं और प्रेवोटेला बिविया और फ्यूसोबैक्टीरियम न्यूक्लेटम के लिए अतिरिक्त रणनीतियों का सुझाव देते हैं। मुराइन योनि उपनिवेशीकरण के अन्य मॉडल पहले वर्णित किए गए हैं, लेकिन इनने समूह बी स्ट्रेप्टोकोकस22 और नीसेरिया गोनोरिया23 जैसे संकाय एनारोबिक बैक्टीरिया के टीकाकरण और वसूली पर ध्यान केंद्रित किया है जो एरोबिक रूप से सुसंस्कृत थे। उपयुक्त प्रयोगात्मक रणनीतियों के साथ एनारोबेस का टीकाकरण और वसूली सफलतापूर्वक पूरी की जा सकती है। हम कई बैक्टीरियल टैक्सा की व्यवहार्य वसूली के लिए दृष्टिकोण पर चर्चा करते हैं और अतिरिक्त प्रजातियों / रुचि के उपभेदों की व्यवहार्यता के लिए स्थितियों के अनुभवजन्य मूल्यांकन का सुझाव देते हैं।
जीवित बैक्टीरिया द्वारा उपनिवेशीकरण का अनुमान लगाने की शास्त्रीय विधि कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) की वसूली है। पारंपरिक रूप से उठाए गए चूहों में अपने स्वयं के अंतर्जात माइक्रोबायोटा के साथ, इसके लिए एगर मीडिया पर वसूली की आवश्यकता होती है जो अंतर्जात योनि माइक्रोबायोटा के सदस्यों के खिलाफ चयन करता है, जबकि अभी भी बैक्टीरिया के टीका तनाव को बढ़ने की अनुमति देता है। यहां, हम जी वेजाइनिस24 के एक स्ट्रेप्टोमाइसिन-प्रतिरोधी अलगाव का उपयोग करते हैं जिसे स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त एगर माध्यम पर चुनिंदा रूप से पुनर्प्राप्त किया जा सकता है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि माध्यम पर्याप्त रूप से चयनात्मक है और, इसके विपरीत, कि स्ट्रेप्टोमाइसिन-प्रतिरोधी बैक्टीरिया अंतर्जात माइक्रोबायोम में मौजूद नहीं हैं, टीकाकरण से ठीक पहले एकत्र किए गए योनि लैवेज को चयनात्मक (स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त) एगर पर चढ़ाया जाना चाहिए।
इनोकुलम तैयारी के लिए सबसे अच्छी विधि प्रजातियों और बैक्टीरिया के उपभेदों के बीच भिन्न हो सकती है। चूहों में प्रयोगों की शुरुआत से पहले, प्रारंभिक कार्य संस्कृति माध्यम, विकास समापन बिंदु और इनोकुलम की तैयारी के साथ-साथ पीबीएस में ऑक्सीजन और व्यवहार्यता के लिए संवेदनशीलता के लिए बेहतर परिस्थितियों को निर्धारित करने के लिए किया जाना चाहिए। अधिक ऑक्सीजन-संवेदनशील बैक्टीरिया के मामले में, इनोकुलम की वैकल्पिक तैयारी पर विचार किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, एक उपयुक्त वाहन नियंत्रण समूह के साथ एनारोबिक संस्कृति माध्यम में)25,26।
Protocol
सभी पशु प्रयोगों को संस्थागत दिशानिर्देशों और कैलिफोर्निया सैन डिएगो विश्वविद्यालय (यूसीएसडी, प्रोटोकॉल नंबर: एस 20057, 2020-आगे) के प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड के अनुसार अनुमोदित और आयोजित किया गया था और इससे पहले वाशिंगटन विश्वविद्यालय, सेंट लुइस (प्रोटोकॉल 20110149, 2020 तक) में आयोजित किया गया था।
नोट: नीचे दिया गया प्रोटोकॉल पारंपरिक रूप से उठाए गए मादा सी 57 बीएल / चूहों का उपयोग करता है, जो टीकाकरण के समय 6-11 सप्ताह की आयु में हैं। कृपया संबंधित उद्धृत कार्य में पहले उपयोग की गई विक्रेता जानकारी और विशिष्ट आयु श्रेणियों पर ध्यान दें।
1. β-एस्ट्राडियोल 17-वैलरेट की तैयारी और प्रशासन
नोट: β-एस्ट्राडियोल 17-वैलरेट एक कार्सिनोजेन और एक प्रजनन विष है जिसे त्वचा के माध्यम से अवशोषित किया जा सकता है 27,28. पाउडर और तरल घोल की हैंडलिंग के दौरान उचित पीपीई पहनें। यह एक जलीय विष29 भी है; इसे उचित रूप से सील और लेबल कंटेनर में ठीक से निपटाएं।
- 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब वैक्यूम फिल्टर सिस्टम का उपयोग करके 0.22 μm फ़िल्टर के माध्यम से 50 एमएल तिल के तेल को फ़िल्टर करें। बाँझपन बनाए रखने के लिए केवल एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में खोलें।
- प्रयोग के लिए आवश्यक β-एस्ट्राडियोल वेलरेट समाधान की मात्रा की गणना करें: सिरिंज भरने के दौरान नमूना हानि के लिए 200 μL प्रति माउस प्लस 2-3 mL अतिरिक्त (उदाहरण के लिए, 10-माउस प्रयोग को कुल मिलाकर 4 एमएल की आवश्यकता होती है)। 5 मिलीग्राम / एमएल समाधान बनाने के लिए आवश्यक β-एस्ट्राडियोल वेलरेट की मात्रा की गणना करें और इसे सीधे 14 एमएल गोल-तल वाली ट्यूब में तौलें।
- पाउडर में झुरमुट को तोड़ने के लिए 14 एमएल ट्यूब और भंवर को कसकर कैप करें (इससे β-एस्ट्राडियोल वेलेरेट को अधिक तेज़ी से भंग करने की अनुमति मिलेगी)। 14 एमएल ट्यूब में बाँझ-फ़िल्टर किए गए तिल का तेल जोड़ें ताकि β-एस्ट्राडियोल वेलेरेट की अंतिम एकाग्रता 5 मिलीग्राम / एमएल हो।
- कसकर ढकी हुई 14 एमएल ट्यूब को 30-40 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक घूर्णन पर रखें, जब तक कि ठोस पाउडर पूरी तरह से घुल न जाए। चूहों में इंजेक्शन से पहले समाधान की एकरूपता की नेत्रहीन पुष्टि करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन तिल के तेल की चिपचिपाहट को कम करता है, जिससे इंजेक्शन लगाना आसान हो जाता है।
- β-एस्ट्राडियोल वेलरेट समाधान को 1 एमएल सिरिंज (सुई के बिना) में खींचें। बुलबुले पेश किए बिना ऐसा करने के लिए, पहले, थोड़ा सा समाधान निकालें, फिर तिल के तेल में सिरिंज की नोक रखते हुए धीरे से निष्कासित करें। घोल को फिर से धीरे-धीरे खींचें, 100 μL निशान से थोड़ा आगे बढ़ें।
- सिरिंज पर सुई में 25 ग्राम x 5/8 रखें। फिर, तिल के तेल के घोल को धीरे-धीरे बाहर निकालकर सुई को प्राइम करें जब तक कि यह सुई की नोक से बाहर आना शुरू न हो जाए। घोल को तब तक निष्कासित करें जब तक कि सिरिंज 100 μL चिह्न पर न हो। प्रति माउस एक सिरिंज तैयार करें।
- टीकाकरण से पहले 48 घंटे या 72 घंटे पर इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा β-एस्ट्राडियोल 17-वैलरेट का प्रशासन करें। प्रत्येक माउस को 5 मिलीग्राम / एमएल β-एस्ट्राडियोल वेलरेट समाधान (0.5 मिलीग्राम β-एस्ट्राडियोल वेलरेट / माउस) के 100 μL के साथ इंजेक्ट करें, जैसा कि पहलेवर्णित 22,30 था। शेष समाधान को अगले इंजेक्शन तक 72 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- चूहों के योनि टीकाकरण से ठीक पहले, टीकाकरण के दिन फिर से β-एस्ट्राडियोल वेलेरेट समाधान का उपयोग करें। घोल को 4 डिग्री सेल्सियस से निकालें और इंजेक्शन से पहले 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक घूर्णन पर रखें ताकि तिल का तेल गर्म हो जाए और कम चिपचिपा हो जाए। चरण 1.7 में वर्णित इंजेक्शन के साथ आगे बढ़ें।
2. इनोकुलम की तैयारी
नोट: इस खंड में एनारोबिक रूप से उगाए गए स्ट्रेप्टोमाइसिन प्रतिरोधी गार्डनरेला वेजाइनिस जेसीपी 8151 बी-एसएमआर24,25,31,32 से इनोकुला की तैयारी के लिए सामान्य कदम शामिल हैं। इस खंड में सभी चरणों को एक अवायवीय कक्ष में किया जाना चाहिए।
- तैयार एनवाईसी III शोरबा, आगर और पीबीएस सहित किसी भी अभिकर्मकों को उपयोग से कम से कम 24 घंटे पहले एक अवायवीय कक्ष में चक्रित करें।
नोट: यहां, 5% हाइड्रोजन गैस मिश्रण के साथ एक विनाइल एनारोबिक कक्ष का उपयोग किया गया था। आंतरिक ऑक्सीजन एकाग्रता आमतौर पर 0 पीपीएम पर टिकी होती है, हालांकि कक्ष में सामग्री को साइकिल चलाते समय निम्न-स्तरीय क्षणिक वृद्धि (10-25 पीपीएम) हो सकती है। - योनि टीकाकरण से दो दिन पहले, एनारोबिक कक्ष में एनवाईसी III एगर प्लेट पर जमे हुए ग्लिसरॉल स्टॉक से गार्डनरेला को बाहर निकालें। कक्ष के अंदर और बाहर परिवहन के दौरान ग्लिसरॉल स्टॉक को जमे हुए रखने के लिए सूखी बर्फ से भरे एक छोटे कंटेनर (जैसे एक खाली पिपेट टिप बॉक्स) का उपयोग करें।
- योनि टीकाकरण से 1 दिन पहले, एनवाईसी III शोरबा के 10 एमएल को टीका लगाने के लिए प्लेट से 5-10 अलग-अलग गार्डनरेला कॉलोनियों का उपयोग करें। तरल संस्कृति को 37 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे के लिए रात भर बढ़ने दें। संस्कृति माध्यम का एक दूसरा 1 एमएल एलिकोट शामिल करें जिसे बिना टीका लगाए छोड़ दिया गया है और इसे टीकाकृत संस्कृति के साथ इनक्यूबेट करें ताकि यह पुष्टि हो सके कि माध्यम अदूषित है।
- तरल संस्कृति से इनोकुलम तैयार करें जैसा कि नीचे वर्णित है। जितना संभव हो एनारोबिक कक्ष में इनोकुलम की तैयारी करें।
- 1.5 एमएल क्यूवेट (1: 5 कमजोर पड़ने) में 800 μL ताजा मीडिया में 200 μL संस्कृति जोड़कर संस्कृति ऑप्टिकल घनत्व (OD) का निर्धारण करें। 600 एनएम की तरंग दैर्ध्य पर पतला संस्कृति के घनत्व (ओडी) को मापने के लिए एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करें (रिक्त स्थान के रूप में अकेले ताजा मीडिया के साथ एक अलग क्यूवेट का उपयोग करें)। 16 घंटे की संस्कृति के वास्तविक ओडी600 प्राप्त करने के लिए ओडी रीडिंग को 5 से गुणा करें।
- प्रयोग के लिए आवश्यक इनोकुलम की मात्रा की गणना करें। उदाहरण के लिए, 15 चूहों को प्रति माउस 20 μL के इनोकुलम के साथ संक्रमित करने के लिए, 15 x 20 μL = 300 μL इनोकुलम की आवश्यकता होती है। आवश्यकता से लगभग 25% अधिक इनोकुलम तैयार करें, इसलिए 15 चूहों के लिए, 300 μL + (0.25 x 300 μL) = 375 μL इनोकुलम तैयार करें।
- चरण 2.4.1 में निर्धारित OD600 का उपयोग करते हुए, चरण 2.4.2 में गणना की गई मात्रा मेंOD 600 = 5.0 इनोकुलम प्राप्त करने के लिए 16 h संस्कृति की मात्रा की गणना करें जिसे नीचे काटने और पुन: निलंबित करने की आवश्यकता है। उदाहरण के लिए, यदि संस्कृति काOD 600 1.5 है, और आवश्यक इनोकुलम मात्रा 375 μL है, तो नीचे की जाने वाली संस्कृति की मात्रा (375 μL x 5)/1.5 = 1250 μL है।
- चरण 2.4.3 में गणना की गई संस्कृति की मात्रा को समझें। एक बाँझ माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में। 1-3 मिनट के लिए 16,000 x g पर सेंट्रीफ्यूजिंग करके बैक्टीरिया को गोली मार दें।
- सतह पर तैरने वाले को हटा दें और चरण 2.4.2 में गणना की गई मात्रा पर एनारोबिक पीबीएस में गोली को फिर से निलंबित करें। इनोकुलम अब 5.0 के गणना किए गए ओडी600 पर होगा। यदि लागू हो, तो असंक्रमित नियंत्रण समूह में चूहों के लिए वाहन नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए पीबीएस की एक ट्यूब भी तैयार करें।
- एनारोबिक कक्ष से इनोकुलम ट्यूब को हटाने से पहले, पीबीएस में 1:10 से 1:10 x 106 तक एक सीरियल कमजोर पड़ने की श्रृंखला तैयार करें। स्पॉट प्लेट 5 इनोकुलम के सीएफयू को निर्धारित करने के लिए मल्टीचैनल पाइप का उपयोग करके एगर प्लेट पर प्रत्येक कमजोर पड़ने की प्रतिकृति बनाता है। यह प्री-इनोक्यूलेशन सीएफयू है।
3. गार्डनरेला के साथ योनि पूर्व-लैवेज और टीकाकरण
- एनारोबिक कक्ष में योनि लैवेज / वॉश ट्यूब तैयार करें (यह चरण 2.4 में इनोकुलम तैयारी के रूप में एक ही समय में किया जा सकता है। 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में बाँझ, एनारोबिक पीबीएस के पिपेट 70 μL माउस संख्या के साथ लेबल किया गया है। प्रति माउस एक धोने ट्यूब तैयार करें। ट्यूबों को कसकर बंद करें और उन्हें एनारोबिक कक्ष से बाहर निकालें।
- चरण 3.1 में तैयार किए गए अलग-अलग ट्यूबों से 50 μL एनारोबिक पीबीएस के साथ प्रत्येक माउस पर एक योनि लैवेज करें। ये योनि लैवेज प्री-इनोक्यूलेशन वॉश हैं और इनका उपयोग डाउनस्ट्रीम माप और परख के लिए किया जा सकता है।
- दूसरे β-एस्ट्राडियोल वेलरेट इंजेक्शन (चरण 1.8) के प्रशासन के बाद, प्रत्येक माउस को एक पिंजरे या एक साफ कठोर सतह के ऊपर रखें जिसे वह अपने फोरपाव्स के साथ पकड़ सकता है। धीरे से पूंछ के मध्य भाग को पकड़ें और उठाएं ताकि पिछले हिस्से को थोड़ा ऊंचा किया जाए और योनि का उद्घाटन उजागर हो।
- पिपेट और पी -200 फ़िल्टर टिप का उपयोग करके, उपयुक्त माउस के अनुरूप वॉश ट्यूब से पीबीएस के 50 μL खींचें। धीरे से पिपेट टिप को योनि लुमेन ~ 2-3 मिमी में डालें, और 50 μL मात्रा को धीरे-धीरे, 3x-4x में डालें।
- एकत्रित धोने की सामग्री (~ 50 μL) को उसी धोने की ट्यूब में वापस स्थानांतरित करें, जिससे यह आया था, वॉश ट्यूब में ऊपर और नीचे पाइप करें जिसमें अभी भी शेष 20 μL PBS है। यदि अत्यधिक बलगम है और नोक बंद हो जाती है, तो शेष सामग्री को इकट्ठा करने के लिए एक साफ पी -200 टिप का उपयोग करें और इसे उसी धोने की ट्यूब में रखें।
- योनि से प्रत्येक माउस की योनि में केंद्रित जीवाणु निलंबन या वाहन नियंत्रण के 20 μL का प्रबंधन करें। प्रत्येक माउस को उस माउस के लिए योनि लैवेज के तुरंत बाद टीका लगाएं (यानी, अगले पर जाने से पहले प्रत्येक माउस के लिए अनुक्रम में लैवेज और टीकाकरण करें)। इस प्रक्रिया को सरल बनाने के लिए, दो पी 200 पिपेट का उपयोग करें- एक लैवेज के लिए 50 μL तक सेट और दूसरा टीकाकरण के लिए 20 μL तक।
- चरण 3.2.1 में वर्णित माउस को रोकें। पी -200 टिप का उपयोग करके, योनि में बैक्टीरिया निलंबन के 20 μL पिपेट। दो अलग-अलग जीवाणु प्रजातियों / उपभेदों का उपयोग करके सह-टीकाकरण प्रयोगों के लिए, प्रत्येक जीवाणु निलंबन के 10 μL का उपयोग करें और टीकाकरण से पहले दो उपभेदों को मिलाने से बचें।
नोट: योनि से बाहर निकलने से बचने के लिए कुल टीकाकरण की मात्रा 20 μL से अधिक नहीं होनी चाहिए। - प्रत्येक माउस के पिछले छोर को 10-20 सेकंड तक पकड़ना जारी रखें ताकि प्रशासित मात्रा को योनि इंट्रोइटस में तुरंत पूल होने से रोका जा सके। फिर, माउस को एक नए पिंजरे / रिसेप्टेकल में या पिंजरे के साथियों के साथ रखें जिन्हें पहले से ही टीका लगाया गया है।
- चरण 3.2 दोहराएँ। और चरण 3.3। प्रत्येक माउस के लिए। चूहों को उन जानवरों के साथ पिंजरे में वापस न रखें जिन्हें अभी तक टीका नहीं लगाया गया है। यह टीकाकरण से पहले चूहों को स्ट्रेप्टोमाइसिन प्रतिरोधी बैक्टीरिया के लिए अनजाने में संपर्क में आने से रोकता है।
- चरण 3.2.1 में वर्णित माउस को रोकें। पी -200 टिप का उपयोग करके, योनि में बैक्टीरिया निलंबन के 20 μL पिपेट। दो अलग-अलग जीवाणु प्रजातियों / उपभेदों का उपयोग करके सह-टीकाकरण प्रयोगों के लिए, प्रत्येक जीवाणु निलंबन के 10 μL का उपयोग करें और टीकाकरण से पहले दो उपभेदों को मिलाने से बचें।
- सभी चूहों को टीका लगाए जाने के बाद, इनोकुलम ट्यूब को एनारोबिक कक्ष में वापस चक्रित करें। चरण 2.5 में वर्णित एक और सीरियल कमजोर पड़ने की तैयारी और प्लेट करें। यह टीकाकरण के बाद का सीएफयू है। टीकाकरण के बाद और टीकाकरण से पहले की प्लेटों से सीएफयू की तुलना यह निर्धारित करने के लिए करें कि जानवरों के टीकाकरण के दौरान एनारोबिक कक्ष के बाहर रहते हुए इनोकुलम की व्यवहार्यता कम हो गई है या नहीं।
- चरण 3.2 में एकत्र किए गए योनि लैवेज को प्लेट करें। चयनात्मक एगर पर (इस मामले में, 1 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन)। प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस पर एनारोबिक कक्ष में 1-2 दिनों के लिए इनक्यूबेट करें और विकास की जांच करें।
नोट: विकास इंगित करता है कि माइक्रोबायोम के अंतर्जात सदस्य चयन मार्कर के प्रतिरोधी हैं और इसलिए, लक्ष्य जीव की सीएफयू गणना को अस्पष्ट कर सकते हैं।
4. व्यवहार्य गार्डनरेला उपनिवेशीकरण निर्धारित करने के लिए योनि लैवेज का संग्रह
- योनि उपनिवेशीकरण का विश्लेषण करने के लिए चुनिंदा समय बिंदुओं पर योनि धोने को इकट्ठा करें। चरण 3.2 में वर्णित के रूप में एकत्र करें।
- संग्रह के तुरंत बाद, योनि लैवेज को एक अवायवीय कक्ष में चक्रित करें। चरण 2.5 में वर्णित के रूप में चयनात्मक आगर पर सीरियल कमजोर पड़ने और चढ़ाना करने के लिए प्रत्येक लैवेज के 10 μL का उपयोग करें। CFU गणना का उपयोग गार्डनरेला (या रुचि के एक अन्य एनारोब) द्वारा योनि उपनिवेशीकरण के माप के रूप में करें।
5. बलिदान, विच्छेदन और ऊतक समरूपीकरण
- प्रत्येक माउस से एकत्र किए जा रहे प्रत्येक अंग के लिए एक 5 एमएल ट्यूब तैयार करें (उदाहरण के लिए, यदि योनि, गर्भाशय ग्रीवा और गर्भाशय सभी एकत्र किए जा रहे हैं, तो प्रति माउस तीन ट्यूब तैयार करें)। एनारोबिक कक्ष में बाँझ एनारोबिक 1x PBS (या अन्य समरूपीकरण मीडिया) के साथ प्रत्येक ट्यूब भरें। योनि और सेरविश एकत्र करने के लिए उपयोग की जाने वाली ट्यूबों के लिए पीबीएस के 1 एमएल का उपयोग करें और गर्भाशय के सींगों को इकट्ठा करने के लिए उपयोग की जाने वाली ट्यूबों के लिए 750 μL का उपयोग करें।
- एक बार पीबीएस जोड़े जाने के बाद, प्रत्येक व्यक्तिगत ट्यूब का वजन करें (यह पूर्व-संग्रह वजन है और इसका उपयोग प्रत्येक कटाई ऊतक के कुल वजन को निर्धारित करने के लिए किया जाएगा)। यदि एनारोबिक कक्ष में एक पैमाना उपलब्ध नहीं है, तो ट्यूबों को कसकर कैप करें और उन्हें वजन करने के लिए कक्ष से बाहर निकालें, फिर उन्हें वापस चक्रित करें।
नोट: ट्यूब तैयारी और वजन संग्रह बलिदान से 1 दिन पहले किया जा सकता है, लेकिन वाष्पीकरण को रोकने के लिए ट्यूबों को कसकर सील किए गए कैप के साथ एनारोबिक कक्ष में रखा जाना चाहिए। - चरण 3.1 में वर्णित योनि लैवेज ट्यूबों का एक सेट तैयार करें। बलिदान पर अंतिम लवेज इकट्ठा करने के लिए। इसके अलावा, बलिदान के दौरान मानक स्टील विच्छेदन उपकरणों को कुल्ला और निष्फल करने के लिए उपयोग करने के लिए 70% -90% इथेनॉल का 50 एमएल बीकर का 50 एमएल बीकर तैयार करें।
- एनारोबिक कक्ष से पीबीएस से भरे अंग संग्रह ट्यूबों को साइकिल से बाहर निकालें। ट्यूबों को कसकर बंद रखें जब तक कि ऊतक जोड़े जाने के लिए तैयार न हों।
- IACUC-अनुमोदित विधियों का उपयोग करके प्रत्येक माउस का त्याग करें। चरण 3.2.2 में वर्णित अंतिम लैवेज निष्पादित करें। और 3.2.3. या तो बलिदान से तुरंत पहले या उसके तुरंत बाद।
- विच्छेदन और ऊतक संग्रह शुरू करें। 70% इथेनॉल के साथ प्रत्येक माउस के पेट और पीछे स्प्रे करें। इथेनॉल के बीकर में कैंची को निष्फल करें, उन्हें सूखने दें, और फिर माउस एब्डोमिनोपेल्विक गुहा को काटने के लिए एक ऊर्ध्वाधर बनाएं।
- त्वचा को वापस खींचने के लिए बाँझ बल का उपयोग करें और धीरे से आंतों को शरीर की गुहा से बाहर और खुले मैदान के किनारे पर धकेलें, जो प्रजनन पथ को उजागर करेगा।
नोट: सावधान रहें कि आंतों को पंचर या छेद न करें क्योंकि वे स्ट्रेप्टोमाइसिन-प्रतिरोधी बैक्टीरिया को परेशान कर सकते हैं जो प्रयोगात्मक परिणामों को भ्रमित कर सकते हैं। - अधिकतम योनि ऊतक एकत्र करने के लिए, नेक्रोपसी के दौरान जघन हड्डी को तोड़ दें। बाँझ कैंची का उपयोग करके, योनि में कटौती न करने के लिए सावधान रहते हुए जघन हड्डी (जघन सिम्फिसिस) के केंद्र को क्लिप करें। बाँझ बल के दो सेटों का उपयोग करके, श्रोणि के प्रत्येक पक्ष को पकड़ें और श्रोणि को पार्श्व रूप से खोलें, नीचे योनि के निचले हिस्से को उजागर करें।
- गर्भाशय ग्रीवा (आसपास के ऊतक की तुलना में एक कठिन संरचना) को धीरे से पकड़ने के लिए बल का उपयोग करें। बृहदान्त्र को उजागर करने के लिए धीरे से गर्भाशय ग्रीवा पर खींचें, पीछे छिपा हुआ है और योनि से निकटता से जुड़ा हुआ है।
- योनि को बाहरी संयोजी ऊतकों से मुक्त करने के लिए छोटी कैंची का उपयोग करें। योनि को बृहदान्त्र से सावधानीपूर्वक अलग करें और आंत्र पथ को छिद्रित करने से बचें। जब पूरी तरह से रिहा हो जाता है, तो माउस शरीर से छोड़ने के लिए कैंची और स्निप के साथ इंट्रोइटस पर योनि को फ्लैंक करें।
- गर्भाशय के सींगों को अधिक दृश्यमान बनाने के लिए थोड़ा ऊपर खींचते समय गर्भाशय ग्रीवा पर एक कोमल पकड़ बनाए रखें। दूसरे हाथ से, गर्भाशय के सींगों को मुक्त करने के लिए दाईं और बाईं ओर अंडाशय के नीचे सीधे काट लें। शरीर गुहा से अब डिस्कनेक्ट किए गए प्रजनन पथ को हटा दें और इसे बाँझ पेट्री प्लेट में रखें।
- रेजर का उपयोग करके, गर्भाशय के सींग, गर्भाशय ग्रीवा और योनि को अलग करें। प्रत्येक ऊतक को उसके संबंधित लेबल संग्रह ट्यूब में रखें। यदि साइटोकिन्स एकत्र किए जाने वाले हैं, तो ऊतक के अतिरिक्त ट्यूबों को बर्फ पर रखें।
- ऊतक को जोड़ने के बाद प्रत्येक ट्यूब को फिर से तौलें। यह पोस्ट-कलेक्शन वजन है। ऊतक के कुल वजन को प्राप्त करने के लिए पोस्ट-संग्रह वजन से पूर्व-संग्रह वजन घटाएं।
- अपने संग्रह ट्यूबों में अंगों को समरूप बनाने के लिए एक हैंडहेल्ड होमोजेनाइज़र का उपयोग करें। गार्डनरेला जेसीपी 8151 बी के लिए, जैव सुरक्षा कैबिनेट (एरोबिक रूप से) या एनारोबिक कक्ष में इस चरण को करें।
- नमूनों के बीच हैंडहेल्ड होमोजेनाइज़र के धोने और सड़न रोकनेवाला उपचार के लिए ट्यूबों के कई सेट तैयार करें। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक सेट में तीन 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब हैं: एक डीआई पानी से भरा है, एक 70% इथेनॉल के साथ, और तीसरा 1 एक्स पीबीएस के साथ। प्रत्येक माउस उपचार समूह के लिए धोने की ट्यूबों का एक अलग सेट तैयार करें।
- होमोजेनाइज़र को साफ करने के लिए, प्रत्येक वॉश ट्यूब में ब्लेड को तरल में कम करें और उपकरण को अधिकतम गति में बदल दें। लगभग 3 सेकंड के लिए तीन ट्यूबों में से प्रत्येक में होमोजेनाइज़र रखें। धोने का क्रम डीआई पानी (भौतिक मलबे को हटाने के लिए), फिर इथेनॉल (स्वच्छता के लिए), और अंत में 1x PBS (बेअसर करने के लिए) है। प्रत्येक कुल्ला के बीच अतिरिक्त तरल पदार्थ को हटाने के लिए जांच को पेपर तौलिया या डिस्पोजेबल बेंच पैड पर हिलाएं।
- प्रारंभिक कुल्ला करने के बाद, होमोजिनाइज़र जांच को संग्रह ट्यूब के निचले हिस्से में कम करके ऊतकों को समरूप करें, ऊतक को नीचे फंसाएं। ऊतक को पीसने के लिए होमोजेनाइज़र चालू करें, धीरे से जलमग्न रहते हुए जांच को लगभग 5 गुना ऊपर और नीचे ले जाएं। लगभग 15-30 सेकंड के लिए प्रत्येक अंग को समरूप करें।
- ट्यूब से होमोजेनाइज़र को बंद करने और हटाने के बाद, पूर्ण ऊतक व्यवधान सुनिश्चित करने के लिए सामग्री का नेत्रहीन निरीक्षण करें। यह गर्भाशय ग्रीवा और योनि के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, जो कभी-कभी जांच द्वारा पकड़े जाने में विफल रहते हैं।
नोट: यह ठीक है अगर गर्भाशय के सींगों पर कुछ अतिरिक्त वसा पूरी तरह से समरूप नहीं होती है। - चरण 5.14.1.-5.14.4., प्रत्येक नमूने के बीच जांच को धोना और स्टरलाइज़ करना दोहराएं। प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह के लिए वॉश ट्यूब के एक नए सेट पर स्विच करें।
- होमोजिनाइज्ड नमूनों के साथ ट्यूबों को एनारोबिक कक्ष में ले जाएं। प्रत्येक ऊतक के जीवाणु बोझ को निर्धारित करने के लिए, मिश्रण करने के लिए नमूने का संक्षिप्त सौम्य भंवर करें, फिर सीएफयू निर्धारण के लिए चुनिंदा एगर पर सीरियल कमजोर पड़ने और चढ़ाना के लिए ऊतक होमोजेनेट के 100 μL को हटा दें (पहला कमजोर पड़ने 1 x 100 है)। यदि पता लगाने की कम सीमा की आवश्यकता है, तो 200-250 μL अनडिल्यूटेड होमोजेनेट का स्प्रेड-प्लेटिंग करें।
Representative Results
एक उदाहरण प्रयोग का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व कुछ तरीकों को दिखाता है जो वर्णित प्रोटोकॉल (चित्रा 1) को पूरा कर सकते हैं।
कुछ जानवर अपने योनि माइक्रोबायोम में अंतर्जात रोगाणुओं को ले जाएंगे जो गैर-चयनात्मक मीडिया पर बढ़ेंगे। यहां वर्णित विधियां अध्ययन किए गए जीवाणु उपभेदों के स्ट्रेप्टोमाइसिन-प्रतिरोधी आइसोलेट्स पर भरोसा करती हैं, साथ ही स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त चयनात्मक मीडिया के साथ, अंतर्जात बैक्टीरिया (चित्रा 2 ए, बी) के खिलाफ चयन करने के लिए। स्ट्रेप्टोमाइसिन प्रतिरोध के लिए सहज रूप से विकसित होना संभव है, इसलिए संक्रमण (दिन 0 वॉश) से पहले चूहों की जांच करने से यह स्थापित करने में मदद मिल सकती है कि क्या यह एक समस्या हो सकती है।
योनि धोने से व्यवहार्य बैक्टीरिया की वसूली एगर मीडिया पर सीरियल कमजोर पड़ने और चढ़ाना द्वारा पूरी की जाती है। एक मानक पेट्री डिश 5 μL स्पॉट की 6 x 6 सरणी तक पकड़ सकती है, जिससे 10 गुना सीरियल कमजोर पड़ने का उपयोग करके प्रत्येक नमूने के लिए परिमाण के छह आदेशों में छह प्रतिकृति स्थानों से बैक्टीरियल टिटर्स की गणना की जा सकती है (चित्रा 3 ए)। इस विधि का उपयोग गार्डनरेला से लेकर प्रेवोटेला और फ्यूसोबैक्टीरियम (चित्रा 3 बी-डी) तक बैक्टीरिया के टिटर्स की गणना करने के लिए किया जा सकता है।
साथ में, ये विधियां परिकल्पनाओं का परीक्षण करने और महिला प्रजनन पथ के जीवाणु उपनिवेशीकरण / संक्रमण के बारे में व्याख्या करने की अनुमति देती हैं। उदाहरण के लिए, योनि धोने और योनि ऊतक होमोजेनेट्स में गार्डनरेला टिटर्स की तुलना ने इन तरीकों (चित्रा 4 ए) के बीच सामंजस्य का प्रदर्शन किया। इसी तरह, एक योनि सह-टीकाकरण मॉडल में, प्रेवोटेला मोनो-संक्रमण (चित्रा 4 बी) की तुलना में गार्डनरेला सह-संक्रमण के दौरान गर्भाशय के ऊतकों में प्रेवोटेला के टिटर्स काफी अधिक (लगभग 20 गुना) थे। अंत में, प्रजनन पथ उपनिवेशीकरण / संक्रमण की प्रक्रियाओं में विशिष्ट जीन और उनके उत्पादों द्वारा निभाई गई भूमिकाओं को स्थापित करने के लिए इन मॉडलों में जंगली-प्रकार बनाम उत्परिवर्ती जीवाणु उपभेदों की तुलना की जा सकती है। उदाहरण के लिए, फ्यूसोबैक्टीरियम के एक उत्परिवर्ती तनाव में कार्बोहाइड्रेट साइलिक एसिड के परिवहन और उपभोग की क्षमता की कमी थी, जिससे टीकाकरण के 3 दिनों के बाद उपनिवेशीकरण का स्तर कम हो गया (चित्रा 4 सी)।
चित्र 1: एक उदाहरण प्रयोग33 का योजनाबद्ध. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 2: चयनात्मक बनाम गैर-चयनात्मक एगर पर अंतर्जात मुराइन योनि रोगाणुओं का विकास। पांच मादा C57Bl/6 चूहों (1-5) से योनि लैवेज को दो अलग-अलग NYC III आगर प्लेटों पर खींचा गया और अवायवीय रूप से इनक्यूबेट किया गया। (ए) बाईं ओर की प्लेट में कोई एंटीबायोटिक्स नहीं होते हैं और मुराइन योनि पथ से अंतर्जात एनारोबिक बैक्टीरिया के विकास की अनुमति देता है। (बी) दाईं ओर की प्लेट में 1 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन होता है और अंतर्जात बैक्टीरिया के विकास के खिलाफ चयन करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: योनि धोने से व्यवहार्य जी वेजाइनिस, पी बिविया और एफ न्यूक्लेटम सीएफयू की वसूली। (ए) जी वेजाइनिस जेसीपी 8151 बी-एसएमआर इनोकुलम के सीएफयू, एनवाईसी III एगर पर कमजोर पड़ने की श्रृंखला के रूप में प्रतिकृति-प्लेटेड। (बी-डी) मोनो-संक्रमित जानवरों के योनि लैवेज से व्यवहार्य (बी) जी वेजाइनिस24, (सी) पी बिविया25, और (डी) एफ न्यूक्लेटम26 की वसूली। प्रत्येक ग्राफ (बी-डी) के लिए, डेटा को दो स्वतंत्र प्रयोगों से जोड़ा जाता है, जिसमें प्रति प्रयोग24,25,26 10-15 चूहे होते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 4: एक मुराइन योनि टीकाकरण मॉडल में एनारोबिक बैक्टीरियल औपनिवेशीकरण का आगे का विश्लेषण। (A) योनि के धुले में G. योनि के टिटर्स का संबंध जी. वेजाइनिस टिटर्स से है, जो टीकाकरण के बाद 24 घंटे और 72 घंटे में योनि ऊतक होमोजेनेट्स से बरामद होते हैं (दो स्वतंत्र प्रयोगों का संयोजन, n = 10 प्रत्येक)। स्पीयरमैन के रैंक सहसंबंध परीक्षण द्वारा निर्धारित महत्व)24. (बी) जी वेजाइनिस के साथ सह-संक्रमण से गर्भाशय के सींग ऊतक में पी. बिविया टिटर्स में वृद्धि होती है, जब पी. बिविया मोनो-संक्रमित जानवरों की तुलना में टीकाकरण के 48 घंटे बाद (दो स्वतंत्र प्रयोगों का संयोजन, प्रत्येक में प्रति समूह 6-10 चूहे होते हैं)। मान-व्हिटनी यू-टेस्ट द्वारा निर्धारित महत्व, ** पी = 0.0017)25। (ग) बाधित सियालिक एसिड ट्रांसपोर्टर (Ω सियाट) के साथ एफ न्यूक्लेटम उत्परिवर्ती ने टीकाकरण के बाद 72 घंटे में एफ न्यूक्लेटम वाइल्ड-टाइप की तुलना में मोनो-संक्रमित चूहों के योनि लैवेज में टिटर्स को कम कर दिया है (दो स्वतंत्र प्रयोगों का संयोजन, प्रत्येक समूह में 10 चूहों के साथ)। मान-व्हिटनी यू-टेस्ट द्वारा निर्धारित महत्व, ** पी < 0.01)26। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
पूरक फ़ाइल 1: एनारोबिक स्थितियों के तहत उगाए गए विभिन्न योनि बैक्टीरिया के लिए उपयोग किए जाने वाले तरीकों के उदाहरण। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Discussion
यहां वर्णित मॉडल पहले प्रकाशित योनि टीकाकरण मॉडल से अलग होने का सबसे महत्वपूर्ण तरीका एनारोबिक रूप से सुसंस्कृत बैक्टीरिया का उपयोग है, जिसे व्यवहार्य इनोकुलम की तैयारी और चूहों से बैक्टीरिया की वसूली के लिए विशेष विचार की आवश्यकता होती है। ऊपर दिए गए प्रोटोकॉल में विशिष्ट कदम उपयोग किए गए बैक्टीरिया की प्रजातियों / तनाव के आधार पर थोड़ा भिन्न हो सकते हैं, जैसा कि पूरक फ़ाइल 1 में सुझाव दिया गया है। इसके अतिरिक्त, यह पांडुलिपि बैक्टीरिया और योनि धोने के प्रशासन के लिए एक नई प्रक्रियात्मक विधि का वर्णन करती है जिसके लिए अन्वेषक की ओर से कम अनुभव और चूहों के लिए कम संयम की आवश्यकता होती है। यदि प्रयोगकर्ता चरण 3.2 में वर्णित संयम के रूप के साथ सहज नहीं है। और चरण 3.3., चूहों को प्रयोगात्मक डिजाइन और संस्थागत आईएसीयूसी दिशानिर्देशों के अनुसार संज्ञाहरण के साथ या बिना पहले वर्णित34 के रूप में वर्णित किया जा सकता है।
मुराइन मॉडल में एनारोबिक रूप से सुसंस्कृत बैक्टीरिया के उपयोग के लिए एक महत्वपूर्ण चेतावनी यह है कि कुछ चरण (जैसे कि जीवित जानवरों को शामिल करना) एनारोबिक कक्ष के बाहर किया जाना चाहिए। इसलिए, इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम वे हैं जिनमें रुचि के बैक्टीरिया को एरोबिक वातावरण के संपर्क में लाया जाएगा, जैसे कि चूहों के टीकाकरण के दौरान। इस मॉडल में किसी भी नए एनारोब के उपयोग के लिए ऑक्सीजन के संपर्क में व्यवहार्यता बनाए रखने की इसकी क्षमता में प्रारंभिक जांच की आवश्यकता होगी (जैसे कि चरण 2.5 और चरण 3.4 में वर्णित पूर्व और बाद के टीकाकरण सीएफयू की तुलना)। जीव की ऑक्सीजन और पीबीएस संवेदनशीलता की डिग्री के आधार पर, इनोकुलम तैयारी के विभिन्न तरीकों पर विचार किया जाना चाहिए (पूरक फ़ाइल 1, चरण 2.4.5.)। वेजाइनिस जेसीपी 8151 बी का उपयोग करके टीकाकरण के लिए, हमने पाया है कि पीबीएस में इनोकुलम की एक ट्यूब तैयार की जा सकती है और सभी चूहों को संक्रमित करने के लिए उपयोग की जा सकती है। यदि एक अलग एनारोबिक जीवाणु का उपयोग किया जा रहा है जो ऑक्सीजन के प्रति अधिक संवेदनशील है, तो इनोकुलम को प्रत्येक माउस के लिए अलग-अलग ट्यूबों में तैयार किया जा सकता है ताकि ट्यूब के बार-बार खुलने / बंद होने की आवश्यकता न हो। इसी तरह, यदि रुचि की जीवाणु प्रजाति जी वेजाइनिस की तुलना में पीबीएस में जीवित रहने में अधिक तेज़ / कम सक्षम है, तो टीकाकरण इसके बजाय संस्कृति मीडिया में तैयार किया जा सकता है। यदि उपयोग किए जाने वाले माध्यम में कम करने वाले एजेंट होते हैं, जैसे कि सीडीसी एनारोब माध्यम जिसका उपयोग प्रेवोटेला बिविया (पूरक फ़ाइल 1, चरण 2.1 और चरण 2.2.) को कल्चर करने के लिए किया जाता है, तो बैक्टीरिया में ऑक्सीजन एक्सपोजर से सुरक्षा भी बढ़ जाएगी।
होमोजेनाइजेशन के वैकल्पिक तरीकों पर भी विचार किया जा सकता है, जैसे कि बीड बीटिंग22,35, जो ट्यूब कैप बंद करके किया जाता है और इसलिए, हैंडहेल्ड होमोजेनाइज़र की तुलना में कम ऑक्सीजन पेश कर सकता है। इसके अतिरिक्त, अधिक ऑक्सीजन-संवेदनशील जीवों को मीडिया के लिए लंबे समय तक संतुलन समय की आवश्यकता हो सकती है। रेसाज़ुरिन जैसे ऑक्सीजन संकेतक का उपयोग यह जांचने के लिए किया जा सकता है कि अवायवीय स्थितियां पहुंच गई हैं (चरण 2.1.)। एनारोबिक जार जैसे वैकल्पिक तरीके परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं और उपयोग से पहले जीवाणु व्यवहार्यता के लिए जांच की जानी चाहिए।
प्रायोगिक जीव की ऑक्सीजन संवेदनशीलता और तेजी भी लैवेज / होमोजेनाइजेशन (पूरक फ़ाइल 1, चरण 3.2 और चरण 5.1.) के दौरान माउस से व्यवहार्य बैक्टीरिया की सफल वसूली में भूमिका निभा सकती है। अत्यधिक संवेदनशील जीवों के लिए, लैवेज लेने और चढ़ाए जाने के बीच का समय व्यवहार्यता का नुकसान कर सकता है और जीवाणु योनि उपनिवेशीकरण का कृत्रिम रूप से कम अनुमान लगा सकता है। इस प्रभाव को कम करने के लिए, एकत्र किए गए लैवेज को तुरंत ताजा एनारोबिक संस्कृति मीडिया (कम करने वाले एजेंट के साथ) में पतला किया जा सकता है। इसी तरह, बैक्टीरिया की व्यवहार्यता बढ़ाने के लिए पीबीएस के बजाय ताजा संस्कृति मीडिया में अंग समरूपीकरण किया जा सकता है और ऑक्सीजन जोखिम को कम करने के लिए एनारोबिक कक्ष में भी किया जा सकता है।
किसी दिए गए प्रयोग के उद्देश्य के आधार पर, प्रयोगकर्ता को नियंत्रण समूहों पर ध्यान देना चाहिए। परिकल्पनाओं का परीक्षण करने के लिए, असंक्रमित नियंत्रण चूहों के आधारभूत उपाय जो अकेले वाहन के साथ नकली इलाज किए जाते हैं, यह स्थापित करने में मदद करेंगे कि क्या केमोकाइन / साइटोकिन्स या संक्रमण के अन्य विशिष्ट परिणामों का प्रेरण है। उपयोग किया जाने वाला नियंत्रण वाहन टीकाकरण के लिए उपयोग किए जाने वाले वाहन के समान होना चाहिए, इसलिए यदि बैक्टीरिया को संस्कृति मीडिया में टीका लगाया जाता है, तो बिना टीकाकरण वाले संस्कृति मीडिया को नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाना चाहिए (पूरक फ़ाइल 1, चरण 2.4.5.)।
इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधियों को एनारोबिक रूप से बढ़ने में सक्षम संकाय बैक्टीरिया पर भी लागू किया जा सकता है, लेकिन पारंपरिक रूप से एरोबिक संस्कृति स्थितियों (जैसे एस्चेरिचिया कोलाई या ग्रुप बी स्ट्रेप्टोकोकस) का उपयोग करके अध्ययन किया जाता है। यह शरीर की साइटों में इन जीवों द्वारा संक्रमण के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक हो सकता है, जिनके बारे में माना जाता है कि गर्भाशय ग्रीवा जैसे ऑक्सीजन का निम्न स्तर होता है। यह हो सकता है कि एक संकाय जीव कम ऑक्सीजन वाले साइटों को अधिक सफलतापूर्वक संक्रमित करता है जब एरोबिक रूप से की तुलना में इनोकुलम को अवायवीय रूप से तैयार किया जाता है। इस तरह के प्रयोग में, सीएफयू गणना के लिए व्यवहार्य बैक्टीरिया की वसूली के लिए एनारोबिक स्थितियों की आवश्यकता नहीं हो सकती है।
Disclosures
लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।
Acknowledgments
हम इन मॉडलों के विकास के दौरान तकनीकी सहायता के लिए लिन फोस्टर को स्वीकार करते हैं। हम आणविक माइक्रोबायोलॉजी विभाग और महिला संक्रामक रोग अनुसंधान केंद्र (एएल के लिए), और मार्च ऑफ डाइम्स (एएल को बेसिल ओ'कॉनर पुरस्कार) से स्टार्टअप फंड की सराहना करते हैं, जिसने प्रारंभिक चरण के प्रयोगों का समर्थन करने में मदद की। एलर्जी और संक्रामक रोगों के राष्ट्रीय संस्थान (R01 AI114635) ने भी इन मॉडलों के विकास का समर्थन किया।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-estradiol 17-valerate | Sigma | E1631 | estrogenization of mice |
| 0.22 µm, 50 mL Steriflip vacuum filter | Fisher | SCGP00525 | sterile filtering sesame oil |
| 14 mL tube | Falcon | 352059 | estrogenization of mice |
| 190-proof ethanol | Koptec | V1105M | dissection, tissue homogenization, CDC and Columbia media |
| 1x PBS | Fisher | MT21040CM | vaginal lavage, G. vaginlalis inoculum prep, tissue collection and homogenization |
| 25 G × 5/8 -in needle | BD | 305122 | estrogenization of mice |
| 5 mL tube | Falcon | 352063 | Tissue collection and homogenization |
| Anaerobic chamber | Coy | 7200000 | Growth of anaerobic bacteria |
| Bacto agar | Fisher | DF0140074 | G. vaginalis, F. nucleatum, and P. bivia agar plates |
| Bacto peptone | Fisher | DF0118170 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Columbia broth | Fisher | DF0944170 | Columbia media for F. nucleatum growth |
| Defibrinated sheep blood | Hemostat | DSB500 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | mouse/tissue dissection |
| Glucose | Sigma | G7528 | NYCIII media for G. vaginalis growth |
| Handheld homogenizer | ISC Bio | 3305500 | Tissue homogenization |
| Hemin | Sigma | 51280 | CDC anaerobic media for P. bivia growth, Columbia media for F. nucleatum growth |
| HEPES | Cellgro | 25-060-Cl | NYCIII media for G. vaginalis growth |
| Horse serum | Hemostat | SHS500 | NYCIII media for G. vaginalis growth |
| Hydrogen gas mix (5% hydrogen, 10% CO2, 85% nitrogen) | Matheson | Gas for anaerobic chamber | |
| Isofluorane | VetOne | 502017 | mouse anaethesia at sacrifice |
| L-cysteine | Sigma | C1276 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| L-glutamate | Sigma | G1626 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Milli-Q Water Purifier | Millipore | IQ-7000 | for making media and homogenization |
| NaCl | Sigma | S3014 | NYCIII media for G. vaginalis growth |
| NaOH tablets | Sigma | S5881 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Nitrogen gas | Airgas | Gas for anaerobic chamber | |
| p-200 filter tips | ISC Bio | P-1237-200 | vaginal lavages and bacterial inoculations |
| pancreatic digest of casein | Sigma | 70169 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Proteose peptone #3 | Fisher | DF-122-17-4 | NYCIII media for G. vaginalis growth |
| Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | mouse/tissue dissection |
| Sesame oil | Fisher | ICN15662191 | estrogenization of mice |
| Single edge surgical carbon steel razor blades | VWR | 55411-050 | tissue dissection |
| Sodium chloride | Sigma | S3014 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Spectrophotometer | BioChrom | 80-3000-45 | measuring bacterial OD600 |
| Streptomycin | Gibco | 11860038 | add to agar media to make selective plates |
| Tuberculin slip tip 1ml syringe | BD | 309659 | estrogenization of mice |
| Vitaim K3 | Sigma | M5625 | Columbia media for F. nucleatum growth |
| Vitamin K1 | Sigma | 95271 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Yeast extract | Fisher | DF0127-17-9 | NYCIII media for G. vaginalis growth |
References
- Hillier, S. L., Krohn, M. A., Rabe, L. K., Klebanoff, S. J., Eschenbach, D. A. The normal vaginal flora, H2O2-producing lactobacilli, and bacterial vaginosis in pregnant women. Clinical Infectious Diseases. 16, Suppl 4 273-281 (1993).
- Ravel, J., et al.
- Hill, G. B., Eschenbach, D. A., Holmes, K. K.
- van de Wijgert, J. The vaginal microbiome and sexually transmitted infections are interlinked: Consequences for treatment and prevention. PLoS Medicine. 14 (12), 1002478 (2017).
- Srinivasan, S., et al. Bacterial communities in women with bacterial vaginosis: high resolution phylogenetic analyses reveal relationships of microbiota to clinical criteria. PLoS One. 7 (6), 37818 (2012).
- Shipitsyna, E., et al. Composition of the vaginal microbiota in women of reproductive age-sensitive and specific molecular diagnosis of bacterial vaginosis is possible. PLoS One. 8 (4), 60670 (2013).
- Brotman, R. M., et al. Bacterial vaginosis assessed by gram stain and diminished colonization resistance to incident gonococcal, chlamydial, and trichomonal genital infection. The Journal of Infectious Diseases. 202 (12), 1907-1915 (2010).
- Peipert, J. F., et al. Bacterial vaginosis, race, and sexually transmitted infections: does race modify the association. Sexually Transmitted Diseases. 35 (4), 363-367 (2008).
- Wiesenfeld, H. C., Hillier, S. L., Krohn, M. A., Landers, D. V., Sweet, R. L. Bacterial vaginosis is a strong predictor of Neisseria gonorrhoeae and Chlamydia trachomatis infection. Clinical Infectious Diseases. 36 (5), 663-668 (2003).
- Spandorfer, S. D., Neuer, A., Giraldo, P. C., Rosenwaks, Z., Witkin, S. S. Relationship of abnormal vaginal flora, proinflammatory cytokines and idiopathic infertility in women undergoing IVF. The Journal of Reproductive Medicine. 46 (9), 806-810 (2001).
- Ralph, S. G., Rutherford, A. J., Wilson, J. D. Influence of bacterial vaginosis on conception and miscarriage in the first trimester: cohort study. BMJ. 319 (7204), 220-223 (1999).
- Holst, E., Goffeng, A. R., Andersch, B. Bacterial vaginosis and vaginal microorganisms in idiopathic premature labor and association with pregnancy outcome. Journal of Clinical Microbiology. 32 (1), 176-186 (1994).
- DiGiulio, D. B., et al. Microbial prevalence, diversity and abundance in amniotic fluid during preterm labor: a molecular and culture-based investigation. PLoS One. 3 (8), 3056 (2008).
- Svare, J. A., Schmidt, H., Hansen, B. B., Lose, G. Bacterial vaginosis in a cohort of Danish pregnant women: Prevalence and relationship with preterm delivery, low birthweight and perinatal infections. British Journal of Obstetrics and Gynaecology. 113 (12), 1419-1425 (2006).
- Ádám, A., et al. Culture- and PCR-based detection of BV associated microbiological profile of the removed IUDs and correlation with the time period of IUD in place and the presence of the symptoms of genital tract infection. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials. 17 (1), 40 (2018).
- Di Paola, M., et al. Characterization of cervico-vaginal microbiota in women developing persistent high-risk Human Papillomavirus infection. Scientific Reports. 7 (1), 10200 (2017).
- Bullman, S., et al. Analysis of Fusobacterium persistence and antibiotic response in colorectal cancer. Science. 358 (6369), 1443-1448 (2017).
- Brennan, C. A., Garrett, W. S. Gut microbiota, inflammation, and colorectal cancer. Annual Review of Microbiology. 70, 395-411 (2016).
- Hill, G. B. Preterm birth: associations with genital and possibly oral microflora. Annals of Periodontology. 3 (1), 222-232 (1998).
- Hitti, J., et al. Vaginal indicators of amniotic fluid infection in preterm labor. Obstetrics & Gynecology. 97 (2), 211-219 (2001).
- DiGiulio, D. B.
- Patras, K. A., Doran, K. S. A murine model of Group B Streptococcus vaginal colonization. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54708 (2016).
- Jerse, A. E., et al. Estradiol-treated female mice as surrogate hosts for Neisseria gonorrhoeae genital tract infections. Frontiers in Microbiology. 2, 107 (2011).
- Gilbert, N. M., Lewis, W. G., Lewis, A. L. Clinical features of bacterial vaginosis in a murine model of vaginal infection with Gardnerella vaginalis. PLoS One. 8 (3), 59539 (2013).
- Gilbert, N. M., et al. Gardnerella vaginalis and Prevotella bivia trigger distinct and overlapping phenotypes in a mouse model of bacterial vaginosis. The Journal of Infectious Diseases. 220 (7), 1099-1108 (2019).
- Agarwal, K., et al. Glycan cross-feeding supports mutualism between Fusobacterium and the vaginal microbiota. PLOS Biology. 18 (8), 3000788 (2020).
- Liehr, J. G. Is estradiol a genotoxic mutagenic carcinogen. Endocrine Reviews. 21 (1), 40-54 (2000).
- Yager, J. D., Davidson, N. E.
- Adeel, M., Song, X., Wang, Y., Francis, D., Yang, Y. Environmental impact of estrogens on human, animal and plant life: A critical review. Environment International. 99, 107-119 (2017).
- Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L.
- Lewis, W. G., Robinson, L. S., Gilbert, N. M., Perry, J. C., Lewis, A. L. Degradation, foraging, and depletion of mucus sialoglycans by the vagina-adapted Actinobacterium Gardnerella vaginalis. Journal of Biological Chemistry. 288 (17), 12067-12079 (2013).
- Robinson, L. S., et al. Genome sequences of 15 Gardnerella vaginalis strains isolated from the vaginas of women with and without bacterial vaginosis. Genome Announcements. 4 (5), 00879 (2016).
- Adapted from "mouse posterior turn" by BioRender.com. BioRender.com. , Available from: https://app.biorender.com/biorender-templates (2022).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e2771 (2012).
- Verollet, R. A major step towards efficient sample preparation with bead-beating. Biotechniques. 44 (6), 832-833 (2008).
