Summary
Protokollet presenterar en musmodell av vaginal kolonisering med anaerobt odlade humana vaginala bakterier. Vi fokuserar på Gardnerella vaginalis, samtidigt som vi inkluderar förslag på Prevotella bivia och Fusobacterium nucleatum. Detta protokoll kan också användas som en guide för vaginala inokuleringar och livskraftig återhämtning av andra anaerobt odlade bakterier.
Abstract
Däggdjursvagina kan koloniseras av många bakteriella taxa. Den mänskliga vaginala mikrobiomen domineras ofta av Lactobacillus-arter, men en av fyra kvinnor upplever bakteriell vaginos, där en låg nivå av laktobaciller åtföljs av en överväxt av olika anaeroba bakterier. Detta tillstånd har förknippats med många hälsokomplikationer, inklusive risker för reproduktiv och sexuell hälsa. Medan det finns växande bevis som visar den komplexa karaktären av mikrobiella interaktioner i människors vaginala hälsa, är de enskilda rollerna hos dessa olika anaeroba bakterier inte helt förstådda. Detta kompliceras av bristen på adekvata modeller för att studera anaerobt odlade vaginala bakterier. Musmodeller tillåter oss att undersöka biologin och virulensen hos dessa organismer in vivo. Andra musmodeller av vaginal bakteriell inokulering har tidigare beskrivits. Här beskriver vi metoder för inokulering av anaerobt odlade bakterier och deras livskraftiga återhämtning i konventionellt uppvuxna C57Bl/6-möss. En ny, mindre stressande procedurmetod för vaginal inokulering och tvättning beskrivs också. Inokulering och livskraftig återhämtning av Gardnerella beskrivs i detalj, och strategier för ytterligare anaerober såsom Prevotella bivia och Fusobacterium nucleatum diskuteras.
Introduction
Hos däggdjur är vagina hem för ett konsortium av bakteriearter. Det mänskliga vaginala mikrobiomet är unikt bland däggdjur i sitt överflöd av medlemmar av släktet Lactobacillus och motsvarande lågt vaginalt pH (3,8-4,5) 1,2,3,4. Störning av denna Lactobacillus dominans är associerad med en mängd negativa hälsoutfall.
Vid bakteriell vaginos (BV) finns det färre laktobaciller och ett ökat överflöd av olika anaeroba bakterier, såsom Gardnerella vaginalis och Prevotella bivia 5,6. Kvinnor med BV löper ökad risk för sexuellt överförbara infektioner 7,8,9, infertilitet 10, graviditetsförluster 11, för tidig födsel 12,13,14, intrauterina infektioner 15, livmoderhalsinfektioner 16 och cancer16,17,18 . BV är också förknippad med en högre sannolikhet för vaginal kolonisering av potentiellt patogena bakterier, såsom Fusobacterium nucleatum 1,19,20, ett vanligt isolat från fostervatteninfektioner 21.
På grund av betydelsen av anaeroba bakterier i människors vaginala hälsa finns det ett behov av djurmodeller som kan användas för att undersöka biologin och patogenesen hos dessa organismer. Här beskriver vi metoder för vaginal inokulering och livskraftig återhämtning av Gardnerella vaginalis hos östrogeniserade möss och föreslår ytterligare strategier för Prevotella bivia och Fusobacterium nucleatum. Andra modeller av murin vaginal kolonisering har tidigare beskrivits, men dessa har fokuserat på inokulering och återhämtning av fakultativa anaeroba bakterier såsom grupp B Streptococcus22 och Neisseria gonorrhoeae23 som odlades aerobt. Inokulering och återvinning av obligatoriska anaerober kan framgångsrikt åstadkommas med lämpliga experimentella strategier. Vi diskuterar tillvägagångssätt för livskraftig återhämtning av flera bakterietaxa och föreslår empirisk utvärdering av villkor för livskraften hos ytterligare arter/stammar av intresse.
Den klassiska metoden för att uppskatta kolonisering av levande bakterier är återvinning av kolonibildande enheter (CFU). Hos konventionellt uppvuxna möss med sin egen endogena mikrobiota kräver detta återhämtning på agarmedia som selekterar mot medlemmar av den endogena vaginala mikrobioten samtidigt som den inokulerade bakteriestammen fortfarande kan växa. Här använder vi ett streptomycinresistent isolat av G. vaginalis24 som selektivt kan återvinnas på ett streptomycininnehållande agarmedium. För att säkerställa att mediet är tillräckligt selektivt och omvänt att streptomycinresistenta bakterier inte finns i det endogena mikrobiomet, bör vaginala sköljningar som samlats in strax före inokulering pläteras på selektiv (streptomycininnehållande) agar.
Den bästa metoden för ympberedning kan variera mellan arter och bakteriestammar. Innan försök på möss påbörjas bör förberedande arbete utföras för att bestämma föredragna betingelser för odlingsmediet, tillväxtslutpunkten och beredningen av inokulum, liksom känsligheten för syre och livskraft i PBS. När det gäller mer syrekänsliga bakterier kan alternativa preparat av inokulatet övervägas (t.ex. i ett anaerobt odlingsmedium med en lämplig vehikelkontrollgrupp)25,26.
Protocol
Alla djurförsök godkändes och genomfördes i enlighet med institutionella riktlinjer och Guide for the Care and Use of Laboratory Animals vid University of California San Diego (UCSD, protokollnummer: S20057, 2020-framåt) och dessförinnan vid Washington University, St. Louis (protokoll 20110149, fram till 2020).
OBS: Protokollet nedan använder konventionellt uppvuxna kvinnliga C57Bl / möss, ålder 6-11 veckor vid tidpunkten för inokuleringen. Observera leverantörsinformation och specifika åldersintervall som tidigare använts i det relevanta citerade arbetet.
1. Beredning och administrering av β-östradiol-17-valerat
OBS: β-östradiol 17-valerat är cancerframkallande och ett reproduktionstoxin som kan absorberas genom huden27,28. Använd korrekt personlig skyddsutrustning vid hantering av pulver och flytande lösning. Det är också ett vattenlevande toxin29; Kassera det ordentligt i en lämpligt förseglad och märkt behållare.
- Filtrera sterilisera upp till 50 ml sesamolja genom ett 0,22 μm filter med ett 50 ml koniskt rörvakuumfiltersystem. Öppna endast i ett biosäkerhetsskåp för att upprätthålla sterilitet.
- Beräkna volymen β-östradiolvaleratlösning som behövs för experimentet: 200 μL per mus plus 2-3 ml extra för att ta hänsyn till provförlust under sprutfyllning (t.ex. ett 10-musexperiment kräver totalt 4 ml). Beräkna mängden β-östradiolvalerat som behövs för att göra en 5 mg / ml lösning och väg den direkt i ett 14 ml rundbottnat rör.
- Täck 14 ml röret tätt och virvel för att bryta upp klumpar i pulvret (detta gör att β-östradiolvaleratet kan lösas upp snabbare). Tillsätt sterilfiltrerad sesamolja till 14 ml röret så att den slutliga koncentrationen av β-östradiolvalerat är 5 mg / ml.
- Placera det tätt kapslade 14 ml röret på en rotator vid 37 °C i 30-40 minuter tills det fasta pulvret löser sig helt. Bekräfta visuellt lösningens homogenitet före injektion i mössen. Inkubation vid 37 °C minskar sesamoljans viskositet, vilket gör den lättare att injicera.
- Dra upp β-östradiolvaleratlösning i en 1 ml spruta (utan nål). För att göra detta utan att införa bubblor, dra först upp lite av lösningen, utvisa sedan försiktigt medan du håller sprutans spets i sesamoljan. Dra upp lösningen långsamt igen, något förbi 100 μL-märket.
- Placera en 25 G x 5/8 i nålen på sprutan. Fyll sedan nålen genom att långsamt driva ut sesamoljelösningen tills den börjar komma ut ur nålspetsen. Pumpa ut lösningen tills sprutan är vid markeringen 100 μl. Förbered en spruta per mus.
- Administrera β-östradiol 17-valerat genom intraperitoneal injektion vid 48 timmar eller 72 timmar före inokulering. Injicera varje mus med 100 μl 5 mg/ml β-estradiolvaleratlösning (0,5 mg β-östradiolvalerat/mus) enligt beskrivningeni 22,30. Förvara den återstående lösningen vid 4 °C i 72 timmar tills nästa injektion.
- Administrera β-östradiolvaleratlösningen igen på inokulationsdagen, omedelbart före vaginal inokulering av mössen. Ta bort lösningen från 4 °C och placera den på en rotator vid 37 °C i 30 minuter före injektion så att sesamoljan värms upp och blir mindre trögflytande. Fortsätt med injektioner enligt beskrivningen i steg 1.7.
2. Beredning av ympning
OBS: Detta avsnitt innehåller de allmänna stegen för beredning av inokula från anaerobt odlad streptomycinresistent Gardnerella vaginalis JCP8151B-SmR 24,25,31,32. Alla steg i detta avsnitt ska göras i en anaerob kammare.
- Cykla alla reagens, inklusive beredd NYC III-buljong, agar och PBS, till en anaerob kammare för att balansera minst 24 timmar före användning.
OBS: Här användes en vinyl anaerob kammare i jämvikt med 5% vätgasblandning. Den inre syrekoncentrationen vilar vanligtvis vid 0 ppm, även om det kan finnas övergående ökningar på låg nivå (10-25 ppm) när man cyklar material in i kammaren. - Två dagar före vaginal inokulering, stryka ut Gardnerella från ett fryst glycerollager på en NYC III-agarplatta i den anaeroba kammaren. Använd en liten behållare (t.ex. en tom pipettspetslåda) fylld med torris för att hålla glycerolstammen frusen under transport in och ut ur kammaren.
- 1 dag före vaginal inokulering, använd 5-10 individuella Gardnerella-kolonier från plattan för att inokulera 10 ml NYC III-buljong. Låt den flytande kulturen växa över natten i 16 timmar vid 37 °C. Inkludera en andra alikvot på 1 ml av odlingsmediet som lämnas oinokulerad och inkubera den tillsammans med den inokulerade kulturen för att bekräfta att mediet inte är förorenat.
- Förbered inokulatet från flytande kultur enligt beskrivningen nedan. Utför inokulumpreparatet i den anaeroba kammaren så mycket som möjligt.
- Bestäm kulturens optiska densitet (OD) genom att tillsätta 200 μl kultur till 800 μl färska medier i en 1,5 ml kyvett (spädning 1:5). Använd en spektrofotometer för att mäta densiteten (OD) hos den utspädda kulturen vid en våglängd på 600 nm (använd en separat kyvett med enbart färska medier som blindämne). Multiplicera OD-avläsningen med 5 för att få den faktiska OD600 av 16-timmarskulturen.
- Beräkna volymen av inokulum som behövs för experimentet. Till exempel, för att infektera 15 möss med en ympning på 20 μL per mus behövs 15 x 20 μL = 300 μL inokulum. Förbered cirka 25% mer ympning än vad som behövs, så förbered 300 μL + (0,25 x 300 μL) = 375 μL inokulum för 15 möss.
- Beräkna med hjälp av OD 600 som bestämdes i steg 2.4.1 volymen av 16-timmarskulturen som måste spinnas ner och återsuspenderas för att få en OD600 = 5,0-inokulat i den volym som beräknats i steg 2.4.2. Till exempel, om OD600 av kulturen är 1,5 och den inokulumvolym som behövs är 375 μL, är volymen kultur som ska snurras ner (375 μL x 5) / 1,5 = 1250 μL.
- Pipettera kulturvolymen beräknad i steg 2.4.3. i ett sterilt mikrocentrifugrör. Pellet bakterierna genom centrifugering vid 16 000 x g i 1-3 min.
- Avlägsna supernatanten och suspendera pelleten på nytt i anaerobt PBS vid den volym som beräknats i steg 2.4.2. Inokulatet kommer nu att ligga på en beräknad OD600 på 5,0. Om tillämpligt, förbered också ett rör med PBS för att fungera som vehikelkontroll för möss i den oinfekterade kontrollgruppen.
- Innan inokulatröret avlägsnas från den anaeroba kammaren förbereds en serie serieutspädningar från 1:10 till 1:10 x 106 i PBS. Spotplatta 5 replikerar varje utspädning på en agarplatta med hjälp av en flerkanalig pipet för att bestämma inokulatets CFU. Detta är CFU före inokulering.
3. Vaginal försköljning och ympning med Gardnerella
- Förbered vaginal sköljning / tvättrör i den anaeroba kammaren (detta kan göras samtidigt som inokulatberedning i steg 2.4.). Pipettera 70 μL steril, anaerob PBS till 1,5 ml mikrocentrifugrör märkta med musnummer. Förbered ett tvättrör per mus. Stäng rören ordentligt och cykla dem ut ur den anaeroba kammaren.
- Utför en vaginal sköljning på varje mus med 50 μL anaerob PBS från de enskilda rören som beretts i steg 3.1. Dessa vaginala sköljningar är tvättar före inokulering och kan användas för nedströms mätningar och analyser.
- Efter administrering av den andra injektionen med β-östradiolvalerat (steg 1.8), placera varje mus ovanpå en bur eller en ren hård yta som den kan greppa med sina framtassar. Ta försiktigt tag i mitten av svansen och lyft så att bakkvarteren är något förhöjda och vaginalöppningen exponeras.
- Dra med pipett och p-200 filterspets upp 50 μL PBS från tvättröret motsvarande lämplig mus. För försiktigt in pipettspetsen i vaginallumen ~ 2-3 mm och pipettera 50 μL volymen in och ut försiktigt, 3x-4x.
- Överför det uppsamlade tvättmaterialet (~ 50 μL) tillbaka till samma tvättrör som det kom från, pipettera upp och ner i tvättröret som fortfarande innehåller de återstående 20 μL PBS. Om det finns överdriven slem och spetsen blir igensatt, använd en ren p-200-spets för att samla upp det återstående materialet och placera det i samma tvättrör.
- Administrera 20 μl av den koncentrerade bakterieupphängningen eller vehikelkontrollen vagina i varje mus vagina. Inokulera varje mus omedelbart efter den vaginala sköljningen för den musen (dvs. utför sköljning och inokulering i följd för varje mus innan du går vidare till nästa). För att förenkla denna process, använd två p200-pipetter-en inställd på 50 μL för sköljningar och den andra till 20 μL för inokuleringar.
- Håll fast musen enligt beskrivningen i steg 3.2.1. Använd en p-200-spets, pipettera 20 μL bakteriell suspension i slidan. För saminokuleringsexperiment med två olika bakteriearter/stammar, använd 10 μL av varje bakteriesuspension och undvik att blanda de två stammarna före inokulering.
OBS: Den totala inokuleringsvolymen bör inte överstiga 20 μL för att undvika spill ut ur slidan. - Fortsätt att hålla upp bakänden av varje mus i 10-20 s för att förhindra att den administrerade volymen omedelbart samlas vid vaginal introitus. Placera sedan musen i en ny bur/behållare eller med burkamrater som redan har vaccinerats.
- Upprepa steg 3.2. och steg 3.3. för varje mus. Placera aldrig möss tillbaka i en bur med djur som ännu inte har inokulerats. Detta förhindrar oavsiktlig exponering av möss för streptomycinresistenta bakterier före ympning.
- Håll fast musen enligt beskrivningen i steg 3.2.1. Använd en p-200-spets, pipettera 20 μL bakteriell suspension i slidan. För saminokuleringsexperiment med två olika bakteriearter/stammar, använd 10 μL av varje bakteriesuspension och undvik att blanda de två stammarna före inokulering.
- När alla möss har inokulerats, cykla inokulumröret tillbaka in i den anaeroba kammaren. Bered och platta ytterligare en serieutspädning enligt beskrivningen i steg 2.5. Detta är CFU efter inokulering. Jämför CFU: erna från postinokulerings- och preinokuleringsplattorna för att avgöra om inokulatets livskraft minskade utanför den anaeroba kammaren under inokuleringen av djuren.
- Platta vaginala sköljningar som samlats in i steg 3.2. på selektiv agar (i detta fall 1 mg/ml streptomycin). Inkubera plattorna i 1-2 dagar i en anaerob kammare vid 37 °C och undersök tillväxten.
OBS: Tillväxt indikerar att endogena medlemmar av mikrobiomet är resistenta mot selektionsmarkören och kan därför dölja CFU-uppräkningen av målorganismen.
4. Insamling av vaginala sköljningar för att bestämma livskraftig Gardnerella-kolonisering
- Samla vaginala tvättar vid utvalda tidpunkter för att analysera vaginal kolonisering. Samla in enligt beskrivningen i steg 3.2.
- Omedelbart efter insamling, cykla vaginala sköljningar i en anaerob kammare. Använd 10 μl av varje sköljning för att utföra serieutspädning och plätering på selektiv agar enligt beskrivningen i steg 2.5. Använd CFU räknas som ett mått på vaginal kolonisering av Gardnerella (eller annan anaerob av intresse).
5. Offer, dissektion och vävnadshomogenisering
- Förbered ett 5 ml rör för varje organ som samlas in från varje mus (till exempel, om vagina, livmoderhals och livmoder samlas in, förbered tre rör per mus). Fyll varje rör med steril anaerob 1x PBS (eller annat homogeniseringsmedium) i den anaeroba kammaren. Använd 1 ml PBS för rör som används för att samla vaginor och cervices och 750 μL för rör som används för att samla livmoderhorn.
- När PBS har tillsatts, väg varje enskilt rör (detta är vikten före insamling och kommer att användas för att bestämma den totala vikten av varje skördad vävnad). Om en våg inte är tillgänglig i den anaeroba kammaren, tätt lock rören och cykla dem ut ur kammaren som ska vägas och cykla sedan in dem igen.
OBS: Rörberedning och viktuppsamling kan göras 1 dag före offring, men rör bör förvaras i den anaeroba kammaren med lock tätt förseglade för att förhindra avdunstning. - Förbered en uppsättning vaginala sköljrör enligt beskrivningen i steg 3.1. att samla den sista sköljningen vid offer. Förbered också en 50 ml bägare av avjoniserat (DI) vatten och en andra 50 ml bägare av 70% -90% etanol som ska användas för sköljning och sterilisering av standardståldissektionsinstrument under offret.
- Cykla ut de PBS-fyllda organuppsamlingsrören från den anaeroba kammaren. Håll rören tätt stängda tills vävnaderna är redo att tillsättas.
- Offra varje mus med IACUC-godkända metoder. Utför den slutliga sköljningen enligt beskrivningen i steg 3.2.2. och 3.2.3. antingen omedelbart före offret eller omedelbart därefter.
- Börja dissektion och vävnadssamling. Spraya ner buken och baksidan av varje mus med 70% etanol. Sterilisera saxen i en bägare etanol, låt dem torka och gör sedan en enda vertikal skär upp musens bukhålighet.
- Använd sterila pincett för att dra tillbaka huden och tryck försiktigt tarmarna ut ur kroppshålan och till sidan av det öppna fältet, vilket kommer att exponera reproduktionskanalen.
OBS: Var försiktig så att du inte punkterar eller genomborrar tarmarna eftersom de kan innehålla streptomycinresistenta bakterier som kan förvirra de experimentella resultaten. - För att samla maximal vaginal vävnad, bryt skönhetsbenet under obduktionen. Använd steril sax, klipp mitten av blygdbenet (blygdsymfysen) medan du är försiktig så att du inte skär in i slidan. Använd två uppsättningar sterila pincett, ta tag i varje sida av bäckenet och dra bäckenet öppet i sidled och exponera den nedre delen av slidan under.
- Använd pincett för att försiktigt greppa livmoderhalsen (en hårdare struktur jämfört med den omgivande vävnaden). Dra försiktigt upp livmoderhalsen för att exponera tjocktarmen, dold bakom och nära ansluten till slidan.
- Använd en liten sax för att frigöra slidan från de yttre bindväven. Separera försiktigt vagina från tjocktarmen och undvik punktering av tarmkanalen. När den är helt släppt, flankera slidan vid introitus med sax och klipp för att släppa från muskroppen.
- Håll ett försiktigt grepp om livmoderhalsen medan du drar upp något för att göra livmoderhornen mer synliga. Med den andra handen, skär direkt under äggstockarna på höger och vänster sida för att frigöra livmoderhornen. Ta bort det nu frånkopplade reproduktionsorganet från kroppshålan och placera det i en steril petriska.
- Använd en rakhyvel, separera livmoderhornen, livmoderhalsen och vagina. Placera varje vävnad i respektive märkt uppsamlingsrör. Om cytokiner ska samlas in, placera rören på is efter tillsats av vävnad.
- Väg varje rör igen efter att vävnaden har tillsatts. Detta är vikten efter insamling. Subtrahera vikten före samlingen från vikten efter insamlingen för att få vävnadens totala vikt.
- Använd en handhållen homogenisator för att homogenisera organen i deras uppsamlingsrör. För Gardnerella JCP8151B, utför detta steg i biosäkerhetsskåpet (aerobt) eller den anaeroba kammaren.
- Förbered flera uppsättningar rör för tvättning och aseptisk behandling av den handhållna homogenisatorn mellan proverna. Se till att varje uppsättning har tre 50 ml koniska rör: en fylld med DI-vatten, en med 70% etanol och den tredje med 1x PBS. Förbered en separat uppsättning tvättrör för varje musbehandlingsgrupp.
- För att rengöra homogenisatorn, sänk ner knivarna i vätskan i varje tvättrör och vrid instrumentet till maxhastighet. Håll homogenisatorn i vart och ett av de tre rören i ca 3 s. Tvättordningen är DI-vatten (för att ta bort fysiskt skräp), sedan etanol (för att sanera) och slutligen 1x PBS (för att neutralisera). Skaka sonden på en pappershandduk eller engångsbänk för att ta bort överflödig vätska mellan varje sköljning.
- Efter första sköljning, homogenisera vävnaderna genom att sänka homogenisatorsonden till botten av uppsamlingsröret och fånga vävnaden under. Slå på homogenisatorn för att mala vävnaden, flytta försiktigt sonden upp och ner cirka 5 gånger medan den förblir nedsänkt. Homogenisera varje organ i ca 15-30 s.
- Efter att ha stängt av och tagit bort homogenisatorn från röret, inspektera innehållet visuellt för att säkerställa fullständig vävnadsstörning. Detta är särskilt viktigt för livmoderhalsen och vagina, som ibland inte fångas av sonden.
OBS: Det är okej om lite överflödigt fett på livmoderhornen inte homogeniseras helt. - Upprepa steg 5.14.1.-5.14.4, tvätta och sterilisera sonden mellan varje prov. Byt till en ny uppsättning tvättrör för varje experimentgrupp.
- Flytta rören med homogeniserade prover till den anaeroba kammaren. För att bestämma bakteriebelastningen för varje vävnad, utför kortvarig försiktig virvelning av provet för att blanda, avlägsna sedan 100 μL vävnadshomogenat för serieutspädning och plätering på selektiv agar för CFU-bestämning (den första utspädningen är 1 x 100). Om en lägre detektionsgräns krävs, utför spridningsplätering av 200-250 μL outspätt homogenat.
Representative Results
En schematisk representation av ett exempelexperiment visar några av de sätt man kan utföra det beskrivna protokollet (figur 1).
Vissa djur kommer att bära endogena mikrober i sina vaginala mikrobiom som kommer att växa på icke-selektiva medier. De metoder som beskrivs här bygger på streptomycinresistenta isolat av de studerade bakteriestammarna, tillsammans med selektiva medier innehållande streptomycin, för att selektera mot endogena bakterier (figur 2A, B). Det är möjligt för streptomycinresistens att utvecklas spontant, så kontroll av möss före infektion (dag 0 tvättar) kan hjälpa till att fastställa om detta kan vara ett problem.
Återvinning av livskraftiga bakterier från vaginala tvättar sker genom serieutspädning och plätering på agarmedia. En vanlig petriskål kan rymma upp till en 6 x 6 matris med 5 μL-fläckar, vilket möjliggör räkning av bakteriella titrar från sex replikfläckar över sex storleksordningar för varje prov om man använder 10-faldiga seriella utspädningar (figur 3A). Denna metod kan användas för att räkna upp titrar av bakterier som sträcker sig från Gardnerella till Prevotella och Fusobacterium (figur 3B-D).
Tillsammans tillåter dessa metoder att man testar hypoteser och gör tolkningar om bakteriell kolonisering / infektion av det kvinnliga reproduktionsorganet. Till exempel visade en jämförelse av Gardnerella-titrar i vaginala tvättar och vaginala vävnadshomogenater överensstämmelse mellan dessa metoder (figur 4A). På samma sätt, i en vaginal saminokuleringsmodell, var titrarna av Prevotella i livmodervävnad signifikant högre (cirka 20 gånger) under Gardnerella-saminfektion jämfört med Prevotella-monoinfektion (figur 4B). Slutligen kan vildtyp kontra mutanta bakteriestammar jämföras i dessa modeller för att fastställa de roller som specifika gener och deras produkter spelar i processerna för kolonisering / infektion i reproduktionsorganen. Till exempel ledde en mutant stam av Fusobacterium som saknade förmågan att transportera och konsumera kolhydratet sialinsyra till lägre koloniseringsnivåer 3 dagar efter inokulering (figur 4C).
Figur 1: Schematisk bild av ett exempelexperiment33. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Tillväxt av endogena murina vaginala mikrober på selektiv kontra icke-selektiv agar. Vaginala sköljningar från fem kvinnliga C57Bl/6-möss (1-5) strimlades på två olika NYC III-agarplattor och inkuberades anaerobt. (A) Plattan till vänster innehåller inga antibiotika och tillåter tillväxt av endogena anaeroba bakterier från murina vaginala kanaler. (B) Plattan till höger innehåller 1 mg/ml streptomycin och selekterar mot tillväxt av endogena bakterier. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Återvinning av livskraftiga G. vaginalis, P. bivia, och F. nucleatum CFUs från vaginala tvättar. (A) CFUs av G. vaginalis JCP8151B-SmR-inokulum, replikpläterad som en utspädningsserie på NYC III-agar. (B-D) Återhämtning av livsduglig (B) G. vaginalis24, (C) P. bivia25 och (D) F. nucleatum26 från vaginala sköljningar av monoinfekterade djur. För varje graf (B-D) kombineras data från två oberoende experiment, med 10-15 möss per experiment24,25,26. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Ytterligare analys av anaerob bakteriekolonisering i en murin vaginal inokuleringsmodell. (A) G. vaginalistitrar i vaginala tvättar korrelerar med G. vaginalistitrar som återvunnits från vaginala vävnadshomogenat vid 24 timmar och 72 timmar efter inokulering (kombination av två oberoende experiment, n = 10 vardera. Signifikans bestämd av Spearmans rangkorrelationstest)24. (B) Saminfektion med G. vaginalis leder till ökade P. bivia-titrar i livmoderhornvävnad jämfört med P. bivia monoinfekterade djur vid 48 timmar efter inokulering (kombination av två oberoende experiment, var och en med 6-10 möss per grupp. Signifikans bestämd av Mann-Whitney U-test, **p = 0,0017)25. (C) F. nucleatum-mutant med störd sialinsyratransportör (Ω SiaT) har minskat titrar i vaginala sköljningar hos monoinfekterade möss jämfört med F. nucleatum vildtyp vid 72 timmar efter inokulering (kombination av två oberoende experiment, vardera med 10 möss per grupp. Signifikans bestämd av Mann-Whitney U-test, **p < 0,01)26. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande fil 1: Exempel på metoder som används för olika vaginala bakterier som odlas under anaeroba förhållanden. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Det viktigaste sättet som modellen som beskrivs här skiljer sig från tidigare publicerade vaginala inokuleringsmodeller är användningen av anaerobt odlade bakterier, vilket kräver särskilda överväganden för beredning av livskraftig ympning och återvinning av bakterier från mössen. Specifika steg i protokollet ovan kan variera något beroende på vilken art/stam av bakterier som används, vilket föreslås i kompletterande fil 1. Dessutom beskriver detta manuskript en ny procedurmetod för administrering av bakterier och vaginala tvättar som kräver mindre erfarenhet från utredarens sida och mindre återhållsamhet för mössen. Om försöksledaren inte är bekväm med den form av fasthållning som beskrivs i steg 3.2. och steg 3.3., kan mössen istället scruffas som tidigare beskrivits34 med eller utan anestesi enligt experimentell design och institutionella IACUC-riktlinjer.
En viktig varning för användningen av anaerobt odlade bakterier i murina modeller är att vissa steg (såsom alla som involverar levande djur) måste göras utanför den anaeroba kammaren. Därför är de mest kritiska stegen i detta protokoll de där bakterierna av intresse kommer att utsättas för en aerob miljö, såsom under inokulering av mössen. Användningen av en ny anaerob i denna modell kommer att kräva preliminär undersökning av dess förmåga att bibehålla livskraften vid exponering för syre (såsom jämförelse av CFU före och efter inokulering enligt beskrivningen i steg 2.5 och steg 3.4). Beroende på graden av syre och PBS-känslighet hos organismen bör olika metoder för inokulatberedning övervägas (kompletterande fil 1, steg 2.4.5.). För inokuleringar med G. vaginalis JCP8151B har vi funnit att ett enda rör av inokulum kan framställas i PBS och användas för att infektera alla möss. Om en annan anaerob bakterie används som är känsligare för syre kan inokulatet istället beredas i separata rör för varje mus så att upprepad öppning/stängning av röret inte krävs. På samma sätt, om bakteriearten av intresse är mer kräsen/mindre kapabel att överleva i PBS än G. vaginalis, kan inokulering istället beredas i odlingsmedia. Om det använda mediet innehåller reduktionsmedel, såsom CDC-anaerobmediet som används för att odla Prevotella bivia (kompletterande fil 1, steg 2.1. och steg 2.2.), kommer bakterierna också att ha ökat skydd mot syreexponering.
Alternativa metoder för homogenisering kan också övervägas, såsom strängslag22,35, vilket görs med rörlocket stängt och kan därför införa mindre syre än den handhållna homogenisatorn. Dessutom kan mer syrekänsliga organismer kräva en längre jämviktstid för media. En syreindikator som resazurin kan användas för att kontrollera att anaeroba förhållanden har uppnåtts (steg 2.1.). Alternativa metoder såsom anaeroba burkar kan påverka resultaten och bör kontrolleras för bakteriell livskraft före användning.
Den experimentella organismens syrekänslighet och snabbhet kan också spela en roll för framgångsrik återhämtning av livsdugliga bakterier från musen under sköljning/homogenisering (kompletterande fil 1, steg 3.2 och steg 5.1). För mycket känsliga organismer kan tiden mellan sköljningen och plätering leda till förlust av livskraft och orsaka en artificiellt låg uppskattning av bakteriell vaginal kolonisering. För att mildra denna effekt kan uppsamlade sköljningar omedelbart spädas till färska anaeroba odlingsmedier (med reduktionsmedel). På samma sätt kan organhomogenisering göras i färskt odlingsmedium snarare än PBS för att öka bakteriell livskraft och kan också göras i själva anaeroba kammaren för att minimera syreexponeringen.
Beroende på syftet med ett givet experiment måste experimenten vara uppmärksam på kontrollgrupper. För att testa hypoteser kommer baslinjeåtgärder av oinfekterade kontrollmöss som mockbehandlas med enbart vehikel att hjälpa till att fastställa om det finns induktion av kemokiner / cytokiner eller andra specifika resultat av infektion. Det kontrollfordon som används måste vara detsamma som det vehikel som används för ympning, så om bakterierna inokuleras i odlingsmedier måste oinokulerade odlingsmedier användas som kontroll (kompletterande fil 1, steg 2.4.5).
De metoder som beskrivs i detta protokoll kan också tillämpas på fakultativa bakterier som kan växa anaerobt men som traditionellt studeras med aeroba odlingsförhållanden (såsom Escherichia coli eller grupp B Streptococcus). Detta kan vara särskilt relevant för infektioner av dessa organismer på kroppsplatser som tros innehålla låga nivåer av syre, såsom livmoderhalsen. Det kan vara så att en fakultativ organism mer framgångsrikt infekterar platser med mindre syre när inokulatet framställs anaerobt jämfört med aerobt. I ett sådant experiment, återvinning av livskraftiga bakterier för CFU uppräkning kan inte kräva anaeroba förhållanden.
Disclosures
Författarna förklarar ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Vi tackar Lynne Foster för teknisk hjälp under utvecklingen av dessa modeller. Vi uppskattar startmedel från Institutionen för molekylär mikrobiologi och Center for Women's Infectious Disease Research (till AL) och March of Dimes (Basil O'Connor-utmärkelsen till AL) som hjälpte till att stödja experiment i tidigt skede. National Institute of Allergy and Infectious Diseases (R01 AI114635) stödde också utvecklingen av dessa modeller.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-estradiol 17-valerate | Sigma | E1631 | estrogenization of mice |
| 0.22 µm, 50 mL Steriflip vacuum filter | Fisher | SCGP00525 | sterile filtering sesame oil |
| 14 mL tube | Falcon | 352059 | estrogenization of mice |
| 190-proof ethanol | Koptec | V1105M | dissection, tissue homogenization, CDC and Columbia media |
| 1x PBS | Fisher | MT21040CM | vaginal lavage, G. vaginlalis inoculum prep, tissue collection and homogenization |
| 25 G × 5/8 -in needle | BD | 305122 | estrogenization of mice |
| 5 mL tube | Falcon | 352063 | Tissue collection and homogenization |
| Anaerobic chamber | Coy | 7200000 | Growth of anaerobic bacteria |
| Bacto agar | Fisher | DF0140074 | G. vaginalis, F. nucleatum, and P. bivia agar plates |
| Bacto peptone | Fisher | DF0118170 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Columbia broth | Fisher | DF0944170 | Columbia media for F. nucleatum growth |
| Defibrinated sheep blood | Hemostat | DSB500 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | mouse/tissue dissection |
| Glucose | Sigma | G7528 | NYCIII media for G. vaginalis growth |
| Handheld homogenizer | ISC Bio | 3305500 | Tissue homogenization |
| Hemin | Sigma | 51280 | CDC anaerobic media for P. bivia growth, Columbia media for F. nucleatum growth |
| HEPES | Cellgro | 25-060-Cl | NYCIII media for G. vaginalis growth |
| Horse serum | Hemostat | SHS500 | NYCIII media for G. vaginalis growth |
| Hydrogen gas mix (5% hydrogen, 10% CO2, 85% nitrogen) | Matheson | Gas for anaerobic chamber | |
| Isofluorane | VetOne | 502017 | mouse anaethesia at sacrifice |
| L-cysteine | Sigma | C1276 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| L-glutamate | Sigma | G1626 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Milli-Q Water Purifier | Millipore | IQ-7000 | for making media and homogenization |
| NaCl | Sigma | S3014 | NYCIII media for G. vaginalis growth |
| NaOH tablets | Sigma | S5881 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Nitrogen gas | Airgas | Gas for anaerobic chamber | |
| p-200 filter tips | ISC Bio | P-1237-200 | vaginal lavages and bacterial inoculations |
| pancreatic digest of casein | Sigma | 70169 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Proteose peptone #3 | Fisher | DF-122-17-4 | NYCIII media for G. vaginalis growth |
| Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | mouse/tissue dissection |
| Sesame oil | Fisher | ICN15662191 | estrogenization of mice |
| Single edge surgical carbon steel razor blades | VWR | 55411-050 | tissue dissection |
| Sodium chloride | Sigma | S3014 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Spectrophotometer | BioChrom | 80-3000-45 | measuring bacterial OD600 |
| Streptomycin | Gibco | 11860038 | add to agar media to make selective plates |
| Tuberculin slip tip 1ml syringe | BD | 309659 | estrogenization of mice |
| Vitaim K3 | Sigma | M5625 | Columbia media for F. nucleatum growth |
| Vitamin K1 | Sigma | 95271 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Yeast extract | Fisher | DF0127-17-9 | NYCIII media for G. vaginalis growth |
References
- Hillier, S. L., Krohn, M. A., Rabe, L. K., Klebanoff, S. J., Eschenbach, D. A. The normal vaginal flora, H2O2-producing lactobacilli, and bacterial vaginosis in pregnant women. Clinical Infectious Diseases. 16, Suppl 4 273-281 (1993).
- Ravel, J., et al.
- Hill, G. B., Eschenbach, D. A., Holmes, K. K.
- van de Wijgert, J. The vaginal microbiome and sexually transmitted infections are interlinked: Consequences for treatment and prevention. PLoS Medicine. 14 (12), 1002478 (2017).
- Srinivasan, S., et al. Bacterial communities in women with bacterial vaginosis: high resolution phylogenetic analyses reveal relationships of microbiota to clinical criteria. PLoS One. 7 (6), 37818 (2012).
- Shipitsyna, E., et al. Composition of the vaginal microbiota in women of reproductive age-sensitive and specific molecular diagnosis of bacterial vaginosis is possible. PLoS One. 8 (4), 60670 (2013).
- Brotman, R. M., et al. Bacterial vaginosis assessed by gram stain and diminished colonization resistance to incident gonococcal, chlamydial, and trichomonal genital infection. The Journal of Infectious Diseases. 202 (12), 1907-1915 (2010).
- Peipert, J. F., et al. Bacterial vaginosis, race, and sexually transmitted infections: does race modify the association. Sexually Transmitted Diseases. 35 (4), 363-367 (2008).
- Wiesenfeld, H. C., Hillier, S. L., Krohn, M. A., Landers, D. V., Sweet, R. L. Bacterial vaginosis is a strong predictor of Neisseria gonorrhoeae and Chlamydia trachomatis infection. Clinical Infectious Diseases. 36 (5), 663-668 (2003).
- Spandorfer, S. D., Neuer, A., Giraldo, P. C., Rosenwaks, Z., Witkin, S. S. Relationship of abnormal vaginal flora, proinflammatory cytokines and idiopathic infertility in women undergoing IVF. The Journal of Reproductive Medicine. 46 (9), 806-810 (2001).
- Ralph, S. G., Rutherford, A. J., Wilson, J. D. Influence of bacterial vaginosis on conception and miscarriage in the first trimester: cohort study. BMJ. 319 (7204), 220-223 (1999).
- Holst, E., Goffeng, A. R., Andersch, B. Bacterial vaginosis and vaginal microorganisms in idiopathic premature labor and association with pregnancy outcome. Journal of Clinical Microbiology. 32 (1), 176-186 (1994).
- DiGiulio, D. B., et al. Microbial prevalence, diversity and abundance in amniotic fluid during preterm labor: a molecular and culture-based investigation. PLoS One. 3 (8), 3056 (2008).
- Svare, J. A., Schmidt, H., Hansen, B. B., Lose, G. Bacterial vaginosis in a cohort of Danish pregnant women: Prevalence and relationship with preterm delivery, low birthweight and perinatal infections. British Journal of Obstetrics and Gynaecology. 113 (12), 1419-1425 (2006).
- Ádám, A., et al. Culture- and PCR-based detection of BV associated microbiological profile of the removed IUDs and correlation with the time period of IUD in place and the presence of the symptoms of genital tract infection. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials. 17 (1), 40 (2018).
- Di Paola, M., et al. Characterization of cervico-vaginal microbiota in women developing persistent high-risk Human Papillomavirus infection. Scientific Reports. 7 (1), 10200 (2017).
- Bullman, S., et al. Analysis of Fusobacterium persistence and antibiotic response in colorectal cancer. Science. 358 (6369), 1443-1448 (2017).
- Brennan, C. A., Garrett, W. S. Gut microbiota, inflammation, and colorectal cancer. Annual Review of Microbiology. 70, 395-411 (2016).
- Hill, G. B. Preterm birth: associations with genital and possibly oral microflora. Annals of Periodontology. 3 (1), 222-232 (1998).
- Hitti, J., et al. Vaginal indicators of amniotic fluid infection in preterm labor. Obstetrics & Gynecology. 97 (2), 211-219 (2001).
- DiGiulio, D. B.
- Patras, K. A., Doran, K. S. A murine model of Group B Streptococcus vaginal colonization. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54708 (2016).
- Jerse, A. E., et al. Estradiol-treated female mice as surrogate hosts for Neisseria gonorrhoeae genital tract infections. Frontiers in Microbiology. 2, 107 (2011).
- Gilbert, N. M., Lewis, W. G., Lewis, A. L. Clinical features of bacterial vaginosis in a murine model of vaginal infection with Gardnerella vaginalis. PLoS One. 8 (3), 59539 (2013).
- Gilbert, N. M., et al. Gardnerella vaginalis and Prevotella bivia trigger distinct and overlapping phenotypes in a mouse model of bacterial vaginosis. The Journal of Infectious Diseases. 220 (7), 1099-1108 (2019).
- Agarwal, K., et al. Glycan cross-feeding supports mutualism between Fusobacterium and the vaginal microbiota. PLOS Biology. 18 (8), 3000788 (2020).
- Liehr, J. G. Is estradiol a genotoxic mutagenic carcinogen. Endocrine Reviews. 21 (1), 40-54 (2000).
- Yager, J. D., Davidson, N. E.
- Adeel, M., Song, X., Wang, Y., Francis, D., Yang, Y. Environmental impact of estrogens on human, animal and plant life: A critical review. Environment International. 99, 107-119 (2017).
- Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L.
- Lewis, W. G., Robinson, L. S., Gilbert, N. M., Perry, J. C., Lewis, A. L. Degradation, foraging, and depletion of mucus sialoglycans by the vagina-adapted Actinobacterium Gardnerella vaginalis. Journal of Biological Chemistry. 288 (17), 12067-12079 (2013).
- Robinson, L. S., et al. Genome sequences of 15 Gardnerella vaginalis strains isolated from the vaginas of women with and without bacterial vaginosis. Genome Announcements. 4 (5), 00879 (2016).
- Adapted from "mouse posterior turn" by BioRender.com. BioRender.com. , Available from: https://app.biorender.com/biorender-templates (2022).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e2771 (2012).
- Verollet, R. A major step towards efficient sample preparation with bead-beating. Biotechniques. 44 (6), 832-833 (2008).
