Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt, wie menschliche Haut auf nicht-adipöse diabetische (NOD)-scid-Interleukin-2-Gamma-Kettenrezeptor-Mäuse (NSG) transplantiert werden kann. Eine detaillierte Beschreibung der Vorbereitung der menschlichen Haut für die Transplantation, der Vorbereitung von Mäusen für die Transplantation, der Transplantation der Split-Thickness der menschlichen Haut und des Wiederherstellungsverfahrens nach der Transplantation sind in dem Bericht enthalten.
Abstract
Das Xenograft-Modell der menschlichen Haut, bei dem menschliche Spenderhaut auf einen immundefizienten Mauswirt transplantiert wird, ist eine wichtige Option für die translationale Forschung in der Hautimmunologie. Murine und menschliche Haut unterscheiden sich wesentlich in der Anatomie und der Zusammensetzung der Immunzellen. Daher haben traditionelle Mausmodelle Einschränkungen für die dermatologische Forschung und Arzneimittelforschung. Erfolgreiche Xenotransplantationen sind jedoch technisch anspruchsvoll und erfordern eine optimale Vorbereitung der Proben- und Maustransplantatstelle für das Überleben des Transplantats und des Wirts. Das vorliegende Protokoll bietet eine optimierte Technik zur Transplantation menschlicher Haut auf Mäuse und diskutiert notwendige Überlegungen für nachgeschaltete experimentelle Ziele. Dieser Bericht beschreibt die geeignete Vorbereitung einer menschlichen Spenderhautprobe, die Zusammenstellung eines chirurgischen Aufbaus, die Vorbereitung von Mäusen und Operationsstellen, die Hauttransplantation und die postoperative Überwachung. Die Einhaltung dieser Methoden ermöglicht die Aufrechterhaltung von Xenotransplantaten für mehr als 6 Wochen nach der Operation. Die unten beschriebenen Techniken ermöglichen eine maximale Transplantationseffizienz aufgrund der Entwicklung von technischen Kontrollen, steriler Technik und prä- und postoperativer Konditionierung. Eine angemessene Leistung des Xenograft-Modells führt zu langlebigen menschlichen Hauttransplantatproben für die experimentelle Charakterisierung der menschlichen Haut und die präklinische Prüfung von Verbindungen in vivo.
Introduction
Mausmodelle werden häufig verwendet, um Rückschlüsse auf die menschliche Biologie und Krankheiten zu ziehen, teilweise aufgrund ihrer experimentellen Reproduzierbarkeit und Fähigkeit zur genetischen Manipulation. Die Physiologie der Maus rekapituliert jedoch menschliche Organsysteme, insbesondere die Haut, nicht vollständig und hat daher Einschränkungen für die Verwendung als präklinisches Modell in der Arzneimittelentwicklung1. Anatomische Unterschiede zwischen Maus- und menschlicher Haut umfassen Unterschiede in der Epitheldicke und -architektur, das Fehlen von ekkrinen Schweißdrüsen der Maus und Variationen im Haarzyklus2. Darüber hinaus unterscheiden sich sowohl die angeborenen als auch die adaptiven Arme des Immunsystems zwischen den beiden Spezies3. Maushaut enthält eine einzigartige Immunpopulation von dendritischen epidermalen T-Zellen (DETCs), hat eine höhere Häufigkeit von dermalen γδ-T-Zellen und variiert in der Lokalisierung von Immunzellen im Vergleich zu menschlichem Gewebe4. Daher profitieren experimentelle Erkenntnisse zur menschlichen Hautbiologie und Entzündung von der Validierung mit menschlichem Gewebe. Während In-vitro - und Organoid-Kultursysteme weit verbreitete Werkzeuge zur Untersuchung von menschlichem Gewebe sind, sind diese Systeme durch fehlende oder unvollständige Immunrekonstitution und eine fehlende Verbindung zum peripheren Gefäßsystem begrenzt5. Das humanisierte Xenograft-Hauttransplantationsmodell zielt darauf ab, die therapeutische oder biologische Manipulation von Immun- und Nicht-Immunwegen in menschlichem Gewebe in vivo zu ermöglichen.
Das Xenograft-Modell der menschlichen Haut wurde verwendet, um die Hautphysiologie und Pharmakologie zu untersuchen, Immunabstoßung und -reaktionen zu analysieren, menschliche Hautkrebsmechanismen zu analysieren und Hautkrankheiten und Wundheilung zu verstehen6. Obwohl das Xenograft-Modell auf mehrere Bereiche der Hautforschung anwendbar ist, hat es einen geringeren Durchsatz als In-vitro-Studien und verfügt nicht über die Leichtigkeit der genetischen Manipulation, die in Mausmodellen verwendet wird. Die Zeitpunkte innerhalb dieses Modells können von Wochen bis Monaten reichen, und eine erfolgreiche Transplantation erfordert geeignete Einrichtungen und Geräte, um diese Operationen durchzuführen. Das Xenograft-Modell liefert jedoch biologischen und physiologischen Kontext für Experimente, während organoide Kultursysteme wie Gewebeexplantate oft die Replikation einer Vielzahl von beweglichen Teilen, wie z. B. exogenen Signalen, in bestimmten Zeitintervallen erfordern7. Daher wird dieses Modell am besten verwendet, um Befunde, die in vitro und in Mausmodellen beobachtet wurden, weiter zu validieren oder für Arbeiten, die ansonsten biologisch nicht machbar sind. Die angemessene Verwendung des Xenograft-Modells bietet eine einzigartige Gelegenheit, intaktes menschliches Gewebe in vivo zu untersuchen und zu manipulieren.
Die Optimierung des Xenograft-Hauttransplantationsmodells stützt sich auf jahrzehntelange Forschung, um die Integrität des Transplantats im Laufe der Zeit zu erhalten. Entscheidend für diesen Prozess ist die Verwendung der nicht-adipösen diabetischen (NOD)-scid-Interleukin-2-Gamma-Kettenrezeptor-Maus (NSG), der B- und T-adaptive Immunzellen, funktionelle NK-Zellen fehlen und die Mängel an Makrophagen und dendritischen Zellen aufweist8. Die immundefiziente Natur dieser NSG-Wirte ermöglicht die Transplantation von menschlichen hämatopoetischen Zellen, von Patienten abgeleiteten Krebserkrankungen und Haut 8,9,10. Trotz dieser immunsuppressiven Wirtsumgebung ist eine zusätzliche Unterdrückung der neutrophilen Immunantwort der Maus durch Anti-GR1-Verabreichung für den Transplantaterfolg erforderlich10. Die Haupthindernisse bei der Transplantation von intaktem Gewebe sind Infektionen, Abstoßungsreaktionen und Schwierigkeiten bei der Wiederherstellung des Blutflusses zum Transplantat, was manchmal zum Verlust der dermalen und epidermalen Integrität führt11. Techniken wie die Verabreichung von Anti-FR1 und die Verwendung einer geeigneten Transplantattiefe verbessern das Überleben des Transplantats10. Eine sorgfältige Optimierung ermöglicht es, menschliche Xenograft-Hauttransplantationen an NSG-Mäusen mit hoher Effizienz und Überlebensraten von 90% bis 100% durchzuführen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Die vorliegende Studie wurde in Übereinstimmung mit den Protokollen UCSF IACUC (AN191105-01H) und IRB (13-11307) genehmigt und durchgeführt. Hautproben, die im Rahmen routinemäßiger elektiver chirurgischer Eingriffe wie Hernienreparatur verworfen wurden, wurden für die vorliegende Forschung verwendet. Die Hautproben werden entweder anonymisiert und als Not Human Subjects Research zertifiziert oder, wenn klinisch identifizierende Informationen für nachgeschaltete Analysen erforderlich sind, haben die Patienten eine schriftliche Einwilligung gemäß IRB-Protokoll 13-11307 gegeben. Es wurden keine anderen Ein- oder Ausschlusskriterien verwendet. NSG-Mäuse beiderlei Geschlechts, 8-10 Wochen alt, wurden in der Studie eingesetzt. Die Mäuse wurden aus kommerziellen Quellen gewonnen (siehe Materialtabelle).
1. Verarbeitung der menschlichen Spenderhautprobe
HINWEIS: Die menschliche Hautprobe, die bei dieser Transplantation verwendet wurde, war eine große Probe, die aus dem Bauch eines gesunden Patienten entnommen wurde. Die Probe muss mindestens 15 cm x 7,5 cm groß sein. Größenbeschränkungen können sich auf die Anzahl der Mäuse auswirken, für die Haut verfügbar ist, und auf die Wahl der Transplantatgröße.
- Halten Sie die Hautprobe vor der Vorbereitung und Transplantation bei kalten Temperaturen (auf Eis; 4°C). Halten Sie die Probe feucht in einem geschlossenen Probenentnahmebecher, wobei die Gaze in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) getränkt ist.
HINWEIS: Es wird nicht empfohlen, die Hautprobe länger als 2 Tage bei 4 °C zu lagern. Es gibt jedoch Berichte, in denen die Hautproben länger gelagert werden12.
VORSICHT: Behandeln Sie sämtliches menschliches Gewebe mit den üblichen Biogefahrenvorkehrungen. - Bereiten Sie die Dermatome der menschlichen Hautprobe in einer sterilisierten Unterdruck-Gewebekulturhaube auf einer sterilisierten Dissektionsplatte vor.
- Legen Sie die Hautprobe, Epidermis mit der Seite nach oben, auf die Dissektionsplatte. Wischen Sie die Epidermis mit einem sterilen Alkohol-Vorbereitungspad und dann mit PBS ab.
- Befestigen Sie den näheren Rand der Haut mit einem 1,5-Zoll-T-Stift (siehe Materialtabelle).
- Dermatome die Hautprobe in einer Dicke von 400 μm, wobei gleichmäßiger Druck ausgeübt wird, während in einem Winkel von 30°-45° nach vorne geschnitten wird. Befolgen Sie alle gerätespezifischen Anweisungen und Sicherheitsmaßnahmen (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Einzelheiten zur Dermatomtechnik finden Sie in einem zuvor veröffentlichten Bericht13. - Bereiten Sie eine 100 mm x 20 mm große Petrischale vor, indem Sie eine sterile, mit sterilem PBS getränkte Gaze auf den Boden der Schale legen. Legen Sie die Haut, Epidermis mit der Seite nach oben, auf die nasse Gaze.
- Versiegeln und bedecken Sie die Plattenkanten mit einer halbtransparenten Dichtungsfolie (siehe Materialtabelle), um sicherzustellen, dass die Probe nicht kontaminiert ist. Lagern Sie die Probe vor dem Pfropfen bei 4° C.
2. Präoperative Konditionierung und Vorbereitung
- Bereiten Sie die sterilen Instrumente und eine sterile Operationsstation für die Transplantation vor. Verwenden Sie autoklavierte Papierhandtücher als sterile Oberflächen für die Platzierung von Instrumenten und Mäusen.
HINWEIS: Mäuse können nach dem Absetzen transplantiert werden, werden aber vorzugsweise im Alter von 8-10 Wochen transplantiert. Mäuse beiderlei Geschlechts können gepfropft werden. - Führen Sie die chirurgische Vorbereitung, wie z. B. die Haarentfernung, in einem Bereich durch, der physisch von der chirurgischen Station getrennt ist.
- Bereiten Sie den Anti-GR1 (siehe Materialtabelle) vor, indem Sie ihn auf 1 mg/ml in steriler Kochsalzlösung verdünnen. Dosieren Sie jede Maus mit 100 μg/100 μL der Anti-GR1-Lösung intraperitoneal nach Anäsieeinleitung.
- Betäuben Sie die Mäuse nacheinander mit Isofluran oder anderen institutionell zugelassenen Anästhetika.
HINWEIS: Isofluran muss während der Induktion in einer Konzentration von 3% -5% verabreicht werden. Sobald die Maus unbeweglich ist, senken Sie die Isoflurankonzentration auf 1% -3%, um für die Dauer der Operation zu wirken.- Überwachen Sie die Maus auf eine angemessene Anästhesietiefe, indem Sie die Atemfrequenz, das Fehlen einer Zehenklemmreaktion und eine angemessene rosa Färbung von Ohren und Mund beobachten.
VORSICHT: Verwenden Sie geeignete Anästhesiemaschinen und Spülmethoden und vermeiden Sie die Exposition gegenüber Isoflurandämpfen.
- Überwachen Sie die Maus auf eine angemessene Anästhesietiefe, indem Sie die Atemfrequenz, das Fehlen einer Zehenklemmreaktion und eine angemessene rosa Färbung von Ohren und Mund beobachten.
- Übertragen Sie die Maus auf ein Heizkissen oder eine andere Wärmequelle (siehe Materialtabelle).
- Verabreichen Sie die Augensalbe, indem Sie einen kleinen Tropfen Salbe mit einem behandschuhten Finger auf das Auge tupfen.
- Die Analgetika Buprenorphin (0,08 mg/kg) und Carprofen (5 mg/kg) (siehe Materialtabelle) subkutan verabreichen, indem Sie die Haut kneifen und in einem Winkel parallel zum Körper injizieren.
HINWEIS: Bereiten Sie die Analgesie vor der Behandlung nach institutionellen Protokollen vor. Befolgen Sie die institutionellen Richtlinien für die Auswahl und Verabreichung von Analgetika. Die in dieser Studie verwendete Methode der Analgesie ist in Schritt 2.7 und ergänzender Abbildung 1 beschrieben. - Verabreichen Sie das Anti-GR1 (hergestellt in Schritt 2.4) intraperitoneal, indem Sie die Maus leicht am Schwanz anheben, den Bauch freilegen und in einem Winkel von 30° mit einer Insulinspritze 1 ml (12,7 mm) injizieren.
- Verwenden Sie tiersichere elektrische Haarschneider (siehe Materialtabelle), um den mittleren und oberen Teil der Rückenseite der Maus zu rasieren.
- Reinigen Sie alle Haare und tragen Sie eine großzügige Menge Haarentfernungssalbe für 30 s bis 1 Minute auf die rasierte Haut auf.
- Wischen Sie die Haarentfernungssalbe mit einem Papiertuch und PBS vollständig ab.
3. Transplantationsverfahren
- Bringen Sie die Maus an einen sekundären chirurgischen Ort, weg von der Haarentfernungsstation.
- Sterilisieren Sie die Operationsstelle mit dem Jodtupfer in kreisenden Bewegungen, beginnend in der Mitte und trainieren Sie zum Rand des enthaarten Bereichs.
- Legen Sie ein Stück sterile Plastikfolie über die Maus und schneiden Sie ein Fenster in den Kunststoff, das etwas größer ist als die Größe des zu transplantierenden Bereichs.
- Schneiden Sie einen rechteckigen 10 mm x 10 mm großen Teil der Spenderhaut ab, der mit einem Skalpell transplantiert werden soll. Tun Sie dies, indem Sie die Spenderhaut fest mit der Rückseite der Pinzette halten und mit dem Skalpell neben der Pinzette schneiden.
- Schneiden Sie mit der chirurgischen Schere einen rechteckigen Bereich der Maushaut ab, der der Größe des Spenderhautstücks entspricht, wodurch ein Transplantatbett entsteht. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Haut vom Körper wegzuziehen, und schneiden Sie die Haut mit der Schere vom Körper weg, um zu vermeiden, dass sie tief in die Fassade einschneidet.
- Legen Sie das Spenderhautstück, Epidermis mit der Seite nach oben, auf das vorbereitete Transplantatbett.
- Manipulieren Sie die Haut mit der Rückseite der Pinzette und gleiten Sie hin und her, bis die Spenderhaut völlig flach gegen das Transplantatbett liegt.
- Fügen Sie Tropfen chirurgischen Klebstoffgewebeklebers hinzu (siehe Materialtabelle), wo die Spenderhaut auf die Maushaut trifft, und halten Sie die Maus und die Spenderhaut mit einer Pinzette für 1-2 s zusammen, so dass der Klebstoff am Gewebe haftet. Versiegeln Sie den Rand des Transplantats vollständig und lassen Sie den Klebstoff vollständig trocknen.
- Verbinden Sie die Mäuse (Abbildung 1), indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
- Schneiden Sie ein Stück Petrolatumgaze (siehe Materialtabelle), das groß genug ist, um den Transplantatbereich vollständig abzudecken.
- Bedecken Sie das Transplantat mit der Vaselinegaze und drücken Sie die Gaze mit einer Pinzette leicht gegen die Haut.
- Schneiden Sie einen Streifen eines transparenten Filmverbandes der Länge nach ab, so dass die Breite groß genug ist, um die Wunde der Maus zu bedecken.
- Drücken Sie den transparenten Folienverband mit der Klebeseite nach unten fest über die Gaze. Rollen Sie schnell die Maus, um den Verband vollständig um den Oberkörper zu wickeln, um sicherzustellen, dass er fest sitzt, ohne die Atmung zu behindern und alle Gliedmaßen frei für die Bewegung sind.
- Setzen Sie die Maus in einen Wiederherstellungskäfig und überwachen Sie sie, bis sie wachsam ist und sich bewegt. Stellen Sie eine Wärmequelle auf einem Teil des Käfigs für mindestens 15 Minuten nach der Wiederherstellung bereit.
HINWEIS: Es wird erwartet, dass sich die Tiere innerhalb von 1-5 Minuten erholen, nachdem sie in den Erholungskäfig gesetzt wurden.
- Einzeln beherbergen die Mäuse nach dem Pfropfen.
- Verabreichen Sie postoperative Analgesie gemäß den institutionellen Protokollen.
HINWEIS: Buprenorphin (0,08 mg/kg) wurde 4-6 Stunden später während der vorliegenden Studie subkutan verabreicht.
4. Postoperative Eingriffe
- Injizieren Sie 100 μL (100 μg) Anti-GR1 intraperitoneal nach 4 Tagen, 7 Tagen und 11 Tagen nach der Transplantation, um eine Transplantatabstoßung zu verhindern (ergänzende Abbildung 1).
- Ersetzen Sie die Bandagen nach Bedarf und wenn sie von Mäusen entfernt werden.
- Verbinden Sie alle Mäuse am Tag 7.
- Entfernen Sie die Bandagen am 14. Tag.
- Überwachen Sie die Mäuse auf Anzeichen einer Transplantatabstoßung und systemischen Entzündungen (Gewichtsverlust, Haarausfall, extreme Lethargie).
- Ernten Sie die Mäuse zwischen 3 und 6 Wochen nach der Transplantation.
- Euthanasieren Sie die Mäuse durch regulatorgesteuerte Kohlendioxid (CO2) -Verabreichung, gefolgt von zervikaler Dislokation.
HINWEIS: Befolgen Sie die institutionellen Richtlinien für Sterbehilfe. - Sezieren Sie die Hauttransplantate der Mäuse14. Legen Sie einen Teil des Transplantats für 24 Stunden in 10% Formalin, bevor Sie Paraffin einbetten und schneiden, um die Histologie zu färben9.
- Zerkleinern Sie die Hauttransplantate mit einer Schere und verdauen Sie sie enzymatisch mit 250 IE / ml Kollagenase IV und 0,02 mg / ml DNase in Zellkulturmedien über Nacht. Färbung der Zellen für Oberflächen- und intrazelluläre Marker nach dem zuvor beschriebenen Verfahren14.
- Euthanasieren Sie die Mäuse durch regulatorgesteuerte Kohlendioxid (CO2) -Verabreichung, gefolgt von zervikaler Dislokation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Xenotransplantate mit menschlicher Haut wurden an NSG-Mäusen in einer Superbarriere-Tiereinrichtung durchgeführt. Der Erfolg wurde durch das verlängerte Transplantat- und Mausüberleben und die Verhaltensgesundheit von Mäusen nach der Transplantation definiert. Ein schlechtes Überleben in der Woche nach der Operation wurde zunächst als größtes Hindernis für den experimentellen Erfolg beobachtet, wobei bis zu 50% der Mäuse Euthanasie benötigten. Die Verbesserung der sterilen Technik und eine bessere Unterstützung der Körpertemperatur der Maus während und unmittelbar nach der Operation erhöhten das chirurgische Überleben konstant auf über 80% und oft auf 90% -100% Überleben. Während die Zugabe von Antibiotika im Trinkwasser der Maus getestet wurde, wurde nicht festgestellt, dass sie die Ergebnisse verbesserte, und wurde als potenzieller Störfaktor der Ergebnisse eingestellt. Erfolgreich transplantierte Mäuse sollten in den Tagen nach der Transplantation aktiv und gesund erscheinen. Mäuse bewegten sich in ihrem Käfig, erkundeten, bauten Nester und aßen und tranken wie immer. Eine kranke Maus kann faul und nicht reaktiv erscheinen und möglicherweise nicht genug essen oder trinken, um ihr Gewicht zu halten. Die Ergänzung von lethargischen Mäusen mit Softfeed- und oralen Hydratationsoptionen kann die postoperative Genesung unterstützen.
Ein Xenograft, das richtig heilt, wird zuerst Schorf und dann innerhalb von etwa 50 Tagen nach der Operation erholen. Transplantate können sich im Laufe der Zeit zusammenziehen, bleiben aber an den Rändern haften, wo die Spenderhaut auf die Haut der Maus trifft (Abbildung 2). Während die Transplantat-Schorfbildung nachlassen sollte, bleiben Transplantate dicker und entzündeter als gesunde menschliche Haut (Abbildung 2). Es kann zu einer übermäßigen Kontraktion der Transplantate kommen, wodurch das verfügbare Gewebe für die Endpunktanalyse reduziert wird. Es wird erwartet, dass die Verwendung von Transplantaten in gleichbleibender Größe und die geeignete Platzierung von Transplantaten solche Probleme mildern. Alle Transplantate in fünf unabhängigen Experimenten überlebten bis zum Zeitpunkt der Ernte, bis zu 50 Tage nach der Transplantation.
Die Gewebeanalyse kann Immunhistochemie und Einzelzellanalysen nach enzymatischem Aufschluss umfassen. Ein Teil der Haut wurde durch nächtliche Verdauung in 250 IE/ml Kollagenase Typ IV und 0,02 mg/ml DNase in Zellkulturmedien verarbeitet (siehe Materialtabelle) und für Oberflächen- und intrazelluläre Marker gefärbt, wie zuvor beschrieben14. Die Analyse mittels Durchflusszytometrie ergab das anhaltende Vorhandensein menschlicher Immunzellen in den meisten Transplantaten, aber die Anzahl variierte zwischen Xenotransplantaten (Abbildung 3A). Abbildung 3B zeigt repräsentative Ergebnisse eines erfolgreichen Transplantats (links) und eines Transplantats, bei dem menschliche Immunzellen nicht erhalten wurden (rechts). Die Analyse von Hämatoxylin- und Eosin-gefärbten (H & E) -Abschnitten, die aus der Mitte des Transplantats entnommen wurden, ergab eine intakte, nicht devitalisierte Haut, die aus menschlicher Dermis und Epidermis für 35- und 50-Tage-Zeitpunkte bestand (Abbildung 4).
Abbildung 1: Methode zur Bandagierung der Maus nach der Operation. Die Maus ist unter Narkose fest in Vaselinegaze und transparenten Filmverband eingewickelt. (A) Petrolatumgaze wird über eine Fläche gelegt, die etwas größer ist als die Operationswunde. (B) Der transparente Filmverband wird vorbereitet: Ein langer Streifen wird etwas breiter geschnitten als die Vaselinegaze. Die Rückseite, die die Klebeseite des transparenten Filmverbandes bedeckt, wird teilweise entfernt. (C) Die Klebeseite der Folie wird fest gegen die Rückseite der Maus gedrückt, so dass ein Zoll Platz am vorderen Ende der Folie bleibt. (D) Die Maus ist auf den Rücken gedreht. Der überhängende vordere Teil der Folie wird auf die Maus gedrückt und der Träger entfernt. (E) Die Maus wird fest in den Film eingewickelt, und die verbleibende Stütze wird entfernt, wenn die Maus eingewickelt wird. (F) Die Maus wird erfolgreich in den Verband eingewickelt, und ihre Arme und Beine sind uneingeschränkt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Repräsentative Bilder von transplantierten Tieren vom Tag 10 bis 21 nach der Transplantation. (A-C) Drei verschiedene Mäuse mit optimalen Transplantaten am Tag 10. (D-E) Zwei verschiedene Mäuse mit Transplantationen am 21. Tag. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Immunzellchimärismus in transplantierter Haut. Durchflusszytometriedaten der Erholung menschlicher Immunzellen aus Xenotransplantaten. Die Daten beziehen sich auf die Ereignisse der Singlet-, Live-, menschlichen CD45+ Maus CD45-. (A) Anzahl der Zellen (Live Human CD45+ Events), die aus zwei unabhängigen Experimenten gewonnen wurden. (B) Repräsentative Diagramme der CD45+ -Immunzellfärbung von Mensch und Maus in einem erfolgreichen Transplantat (links) im Vergleich zu Transplantat mit erfolgloser Aufrechterhaltung des menschlichen Immunkompartiments (rechts). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Histologie der transplantierten menschlichen Haut am Tag 35 und 50. Die transplantierte Haut wurde am Tag 35 (A) oder 50 (B) von Mäusen geerntet, in 10% Formalin konserviert und für Hämatoxylin und Eosin (H & E) paraffineingebettet und gefärbt. (A) Die Epidermis zeigt eine moderate Hyperplasie (Akanthose), eine leichte Hypergranulose und eine kompakte Orthokeratose. In der papillären Dermis gibt es gelegentlich erweiterte und verstopfte Kapillaren. Melanozyten und Melaninpigment sind in der Basalschicht der Epidermis vorhanden. Die Dermis ist mäßig zellulär und besteht aus prallen ovalen Fibroblasten mit blassem synzytialem Zytoplasma und verstreuten Lymphozyten. (B) Die Epidermis besteht aus geschichtetem Plattenepithel, korbgewebter Orthokeratose in der verhornten Schicht und ist von normaler Dicke. Melanozyten und Melaninpigment sind in der Basalschicht der Epidermis vorhanden. Die Dermis zeigt ovale Fibroblasten und eine leicht verbesserte extrazelluläre Matrixablagerung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzende Abbildung 1: Zeitleiste des für die Xenograft-Studie angenommenen Protokolls. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Das Maus-Xenograft-Hauttransplantationsmodell ist eine Schlüsseltechnik zur mechanistischen Analyse menschlicher Hautimmunantworten in einer In-vivo-Umgebung 14. Erfolgreiche Xenograft-Hauttransplantationen beruhen auf der geeigneten Vorbereitung von Mäusen und Hautproben und Mäusen und der Einhaltung aseptischer Nagetierchirurgiemethoden15. Eine schnelle Abkühlung und ordnungsgemäße Lagerung von Hautproben bei kalten Temperaturen in Medien (z. B. sterile Kochsalzlösung) sind wichtig, um die Gesundheit des Gewebes vor der Transplantation sicherzustellen12. Die Entnahme von Proben mit geteilter Dicke unter Verwendung eines Instruments wie eines Dermatoms ermöglicht die Konsistenz der Probentiefe zwischen Mäusen und erhöht die Bereitstellung von Nährstoffen aus dem Wirt, um das Überleben des Transplantats zu verbessern10. Ein Verlust der Transplantatintegrität durch epidermale Ablösung kann beobachtet werden, insbesondere bei Transplantaten voller Dicke mit gestörter Blutversorgung16. Das Überleben der Maus während und nach der Operation wird durch sterile Technik, Wärmezufuhr während und nach der Operation und Techniken zur Minimierung der Operationszeit unterstützt, wie z. B. die Verwendung von chirurgischem Klebstoff15. Die Verabreichung von Anti-GR1 nach der Transplantation ermöglicht die Unterdrückung der verbleibenden Immunantwort der Maus im immundefizienten Wirt, um das Überleben des Transplantats zu fördern10. Diese Methoden erhöhen die Wahrscheinlichkeit des Überlebens von Maus und Transplantat während des Xenograft-Transplantationsmodells und verbessern die Anzahl der Versuche und die Reproduzierbarkeit von einem Experiment zum nächsten.
Obwohl äußerst nützlich, gibt es einige wichtige Einschränkungen für das Xenograft-Hauttransplantationsmodell, wie gezeigt. Erstens existiert das Transplantat in einer entzündlichen Umgebung, höchstwahrscheinlich sekundär zu vorübergehender Ischämie und Infiltration von menschlichem transplantiertem Gewebe mit murinen myeloischen Zellen. Daher spiegelt es die menschliche Haut nicht in einem stabilen Zustand wider und spiegelt möglicherweise nicht alle entzündlichen Hauterkrankungen des Menschen vollständig wider10,14. Die Untersuchung menschlicher entzündlicher Erkrankungen durch Transplantation klinischer Biopsien aus läsionaler Haut ist eine alternative Strategie, aber Einschränkungen in der Anzahl der verfügbaren Biopsien und eine inkonsistente Kontrolle der Transplantationstiefe machen diese Option weniger günstig. Darüber hinaus rekapitulieren Xenograft-Transplantate nicht die periphere Immunarchitektur des Menschen. Die Rekonstitution der Mausperipherie mit menschlichen Zellen kann ebenfalls Vorbehalte aufweisen, da die lymphatische Struktur der NSG-Maus vor der menschlichen Zelltransplantation atrophisch ist. Dies kann in einigen Einstellungen10,17 zu einer bevorzugten Zellauswahl führen. Darüber hinaus können Hauttransplantation und Immunzellerholung aus Hautproben von Maus zu Maus variieren, auch wenn keine Behandlung erfolgt. Für dieses Modell werden mindestens 10 Replikate pro Bedingung empfohlen, um konsistente Unterschiede zwischen den Gruppen zu beobachten. Die angemessene Dauer des Assays muss möglicherweise für die experimentelle Frage angepasst werden, da die Heilung und Revaskularisierung des Transplantats in den ersten Wochen nach der Transplantation erfolgt und die Wirkung der Interventionen vom Stadium der Transplantation abhängen kann.
Trotz dieser Nachteile bleibt das humane Xenograft-Hauttransplantationsmodell einer der wenigen Assays, um die Immunantwort der menschlichen Haut im intakten Organ in vivo zu untersuchen. Während transgene Mausmodelle eine mechanistische Signalwegdissektion ermöglichen können, begrenzen Unterschiede in der Anatomie, der Immunzellzusammensetzung und den dominanten Immunwegen die Translation auf menschliche Krankheiten1. Ex-vivo-Kultur von humanen Zellen, Hautorganoidmodelle und Explantatstudien an menschlichem Gewebe können alternativ verwendet werden, unterliegen aber auch Einschränkungen, einschließlich der Störung von Immunzellnetzwerken und des Austritts von Immunzellen aus dem intakten Gewebe18,19. Daher bleiben die Xenograft-Hauttransplantationsmodelle eine Schlüsselmethode für die Untersuchung therapeutischer Kandidaten und menschlicher Hautreaktionen auf Entzündungen in einer präklinischen In-vivo-Umgebung.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
MDR ist Gründer von TRex Bio und Sitryx. MDR und MML erhalten Forschungsgelder von Sitryx, Q32 und TRex Bio.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde zum Teil durch gesponserte Forschungsvereinbarungen von TRex Bio und Zuschüsse des NIH finanziert (1R01AR075864-01A1). JMM wird von der Cancer Research Society unterstützt (Grant 26005). Wir erkennen den Parnassus Flow Cytometry Core an, der teilweise durch die Zuschüsse NIH P30 DK063720, S10 1S10OD021822-01 und S10 1S10OD018040-01 unterstützt wird.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher | SF100-20 | Fixative for histology |
| 3M Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | surgical glue |
| Alexa 700 CD45 monoclonal antibody (Clone 30F11) | Thermo Fischer | 56-0451-82 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Anti-GR1 clone RB6-8C5 | BioXcell | BE0075 | Anti-rejection |
| APC mouse anti-human CD25 (Clone 2A3) | BD Biosciences | 340939 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| APC-eFluor 780 anti-human HLA-DR (Clone LN3) | eBioscience | 47-9956-42 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Autoclave pouches | VWR | 89140-800 | For autoclaving tools and paper towels |
| Brilliant Violet 60 anti-human CD4 antibody (Clone OKT4 | Biolegend | 317438 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Brilliant Violet 65 anti-human CD8a antibody (Clone RPA-T8) | Biolegend | 301042 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Brilliant Violet 711 anti-human CD3 antibody (Clone OKT3) | Biolegend | 317328 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Buprenex 0.3 mg/mL | Covetrus | 059122 | Analgesia |
| Carprofen 50 mg/mL | Zoetis | NADA # 141-199 | Analgesia |
| Collagenase Type IV | Worthington | 4188 | Skin digestion |
| D42 Dermatome blade | Humeca | 5.D42BL10 | dermatome (1 blade per sample) |
| Dermatome D42 | Humeca | 4.D42 | dermatome |
| Disposable Scalpel | Bard-Parker | 371610 | skin preparation |
| Dissecting T-Pins; 1-1/2 inch, 1000/CS 1.5 | Cole-Parmer | UX-10915-03 | To pin skin specimen for dermatome |
| Dissection scissors | medicon | 02.04.10 | sample preparation and mouse dissection |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25-1G | Skin digestion |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent | eBioscience | 00-5521-00 | Flow cytometry analysis: Cell Fixation and Permeabilization |
| eFluor-450 FOXP3 monoclonal antibody (Clone PCH101) | eBioscience | 48-4776-42 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| Electric clippers | Kent | CL8787-KIT | hair removal |
| Epredia Shandon Instant Eosin | Fisher Scientific | 6765040 | H&E |
| Epredia Shandon Instant Hematoxylin | Fisher Scientific | 6765015 | H&E |
| FITC anti-human CD45 (Clone HI30) | Tonbo Biosciences | 35-0459-T100 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Forceps | medicon | 07.60.07 | sample preparation and mouse dissection |
| Gauze | Fisherbrand | 22-362-178 | Sample preparation |
| Heating lamp | Morganville Scientific | HL0100 | Post-surgical care |
| Heating pads 4" x 10" | Pristech | 20415 | Surgical heat supply |
| Insulin 1cc 12.7 mm syringes | BD | 329410 | drug administration |
| Isoflurane | United States Pharmacopeia (USP) | NDC 66794-013-25 | Anesthesia |
| Isoflurane machine | VetEquip | 911103 | Anesthesia |
| Nair for Men | Nair | 10022600588556 | hair removal |
| Neomycin and Polymyxin Bisulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic ointment | Dechra | NDC 17478-235-35 | eye ointment to prevent drying |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | The Jackson Laboratory | 005557 | Mice |
| Paper towels | Kleenex | 100848 | May be autoclaved for sterile surfaces |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | Semitransparent sealing film |
| PE mouse anti-human CD127 (Clone HIL-7R-M21) | BD Biosciences | 557938 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| PE-Cy-7 mouse anti-Ki-67 (Clone B56) | BD Biosciences | 561283 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| PerCP-eFluor-710 CD152 (CTLA-4) monoclonal antibody (Clone 14D3) | eBioscience | 46-1529-42 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| Permeabilization Buffer 10x | eBioscience | 00-8333-56 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining buffer |
| Petri Dish 150 mm | Corning | 430597 | Sample storage |
| Plastic Wrap | Fisherbrand | 22-305-654 | Site preparation |
| Providone-Iodine Swab stick | PDI | S41350 | Site sterilization |
| Soft-Feed and Oral Hydration (Napa Nectar) | Se Lab Group Inc | NC9066511 | For supplementing poorly recovering mice post-surgery |
| Specimen Collection Cups | Fisher Scientific | 22-150-266 | sample storage |
| Sterile alcohol prep pad | Fisherbrand | 22-363-750 | skin preparation |
| Sterile PBS | Gibco | 14190-144 | Media for sample storage |
| Sterile saline | Hospira | NDC 0409-4888-02 | For drug dilution |
| Tegaderm Film 4” x 43/4” | 3M | 1626 | transparent film wound dressing |
| Vaseline Petrolatum Gauze 3” x 8” | Kendall | 414600 | wound dressing |
| Violet 510 Ghost Dye | Tonbo Biosciences | 13-0870-T100 | Flow cytometry analysis: Viability dye |
References
- Zomer, H. D., Trentin, A. G. Skin wound healing in humans and mice: Challenges in translational research. Journal of Dermatological Science. 90 (1), 3-12 (2018).
- Wong, V. W., Sorkin, M., Glotzbach, J. P., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. Surgical approaches to create murine models of human wound healing. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 969618 (2011).
- Mestas, J., Hughes, C. C. W. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. The Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
- Pasparakis, M., Haase, I., Nestle, F. O. Mechanisms regulating skin immunity and inflammation. Nature Reviews Immunology. 14 (5), 289-301 (2014).
- Sun, H., Zhang, Y. -X., Li, Y. -M. Generation of skin organoids: potential opportunities and challenges. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 3176 (2021).
- Cristóbal, L., et al. Mouse models for human skin transplantation: a systematic review. Cells Tissues Organs. 210 (4), 250-259 (2021).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/γcnull mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Meraz, I. M., et al. An improved patient-derived xenograft humanized mouse model for evaluation of lung cancer immune responses. Cancer Immunology Research. 7 (8), 1267-1279 (2019).
- Racki, W. J., et al. NOD-scid IL2rgamma(null) mouse model of human skin transplantation and allograft rejection. Transplantation. 89 (5), 527-536 (2010).
- Meehan, G. R., et al. Developing a xenograft model of human vasculature in the mouse ear pinna. Scientific Reports. 10 (1), 2058 (2020).
- Gokkaya, A., et al. Skin graft storage in platelet rich plasma (PRP). Dermatologic Therapy. 33 (1), 13178 (2020).
- Humeca, B. V. The Humeca D42 and D80 battery operated cordless dermatomes. , Available from: https://www.youtube.com/watch?v=YCRowX-TdA (2021).
- Rodriguez, R. S., et al. Memory regulatory T cells reside in human skin. The Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1027-1036 (2014).
- Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A.
- Karim, A. S., et al. Evolution of ischemia and neovascularization in a murine model of full thickness human wound healing. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 28 (6), 812-822 (2020).
- Ali, N., et al. Xenogeneic graft-versus-host-disease in NOD-scid IL-2Rγnull mice display a T-effector memory phenotype. PloS One. 7 (8), 44219 (2012).
- Souci, L., Denesvre, C.
- Holtkamp, S. J., et al. Circadian clocks guide dendritic cells into skin lymphatics. Nature Immunology. 22 (11), 1375-1381 (2021).
