Summary
Den nuværende protokol beskriver, hvordan man transplanterer menneskelig hud på ikke-overvægtige diabetiske (NOD) -scid interleukin-2 gammakædereceptor (NSG) mus. Rapporten indeholder en detaljeret beskrivelse af klargøring af menneskers hud til transplantation, klargøring af mus til transplantation, transplantation af menneskelig hud med delt tykkelse og genopretningsprocedure efter transplantation.
Abstract
Den humane hud xenograft-model, hvor human donorhud transplanteres på en immundefekt musevært, er en vigtig mulighed for translationel forskning inden for hudimmunologi. Murine og menneskelig hud adskiller sig væsentligt i anatomi og immuncellesammensætning. Derfor har traditionelle musemodeller begrænsninger for dermatologisk forskning og lægemiddelopdagelse. Imidlertid er vellykkede xenotransplanter teknisk udfordrende og kræver optimal forberedelse af prøve- og musetransplantatstedet til podning og værtsoverlevelse. Den nuværende protokol giver en optimeret teknik til transplantation af menneskelig hud på mus og diskuterer nødvendige overvejelser for nedstrøms eksperimentelle mål. Denne rapport beskriver den passende forberedelse af en human donor hudprøve, samling af en kirurgisk opsætning, mus og kirurgisk sted forberedelse, hudtransplantation og post-kirurgisk overvågning. Overholdelse af disse metoder muliggør vedligeholdelse af xenotransplantater i over 6 uger efter operationen. Teknikkerne skitseret nedenfor tillader maksimal podningseffektivitet på grund af udviklingen af tekniske kontroller, steril teknik og præ- og postkirurgisk konditionering. Passende ydeevne af xenograftmodellen resulterer i langlivede humane hudtransplantatprøver til eksperimentel karakterisering af human hud og præklinisk testning af forbindelser in vivo.
Introduction
Musemodeller bruges ofte til at drage slutninger om menneskelig biologi og sygdom, dels på grund af deres eksperimentelle reproducerbarhed og kapacitet til genetisk manipulation. Musefysiologi rekapitulerer imidlertid ikke fuldstændigt menneskelige organsystemer, især hud, og har derfor begrænsninger for anvendelse som præklinisk model i lægemiddeludvikling1. Anatomiske forskelle mellem mus og menneskelig hud omfatter forskelle i epiteltykkelser og arkitektur, mangel på murine ekkrine svedkirtler og variationer i hårcykling2. Desuden er både immunsystemets medfødte og adaptive arme divergerende mellem de to arter3. Musens hud indeholder en unik immunpopulation af dendritiske epidermale T-celler (DETC'er), har en højere overflod af dermale γδ T-celler og varierer i immuncelleundergruppelokalisering sammenlignet med humant væv4. Derfor drager eksperimentelle fund vedrørende human hudbiologi og betændelse fordel af validering med humant væv. Mens in vitro - og organoidkultursystemer er almindeligt anvendte værktøjer til at studere humant væv, er disse systemer begrænset af fraværende eller ufuldstændig immunrekonstitution og manglende forbindelse til perifer vaskulatur5. Den humaniserede xenograft hudtransplantationsmodel sigter mod at muliggøre terapeutisk eller biologisk manipulation af immun- og ikke-immunveje i humant væv in vivo.
Den menneskelige hud xenograft model er blevet brugt til at studere hudfysiologi og farmakologi, analysere immunafvisning og reaktioner, dissekere menneskelige hudkræftmekanismer og forstå hudsygdomme og sårheling6. Selvom den er anvendelig på flere hudforskningsområder, har xenograft-modellen lavere gennemstrømning end in vitro-undersøgelser og mangler den lette genetiske manipulation, der anvendes i musemodeller. Tidspunkter inden for denne model kan variere fra uger til måneder, og vellykket podning kræver passende faciliteter og udstyr til at udføre disse operationer. Xenograft-modellen leverer imidlertid biologisk og fysiologisk kontekst til eksperimenter, mens organoidkultursystemer, såsom vævseksplanter, ofte kræver replikering af et utal af bevægelige dele, såsom eksogene signaler, med bestemte tidsintervaller7. Derfor bruges denne model bedst til yderligere at validere fund observeret in vitro og inden for musemodeller eller til arbejde, der ellers ikke er biologisk muligt. Hensigtsmæssig brug af xenograftmodellen giver en enestående mulighed for at studere og manipulere intakt humant væv in vivo.
Optimering af xenograft hudtransplantationsmodellen har været afhængig af årtiers forskning for at bevare transplantatintegriteten over tid. Kritisk for denne proces er at udnytte den ikke-overvægtige diabetiske (NOD) -scid interleukin-2 gamma chain receptor (NSG) mus, som mangler B og T adaptive immunceller, funktionelle NK-celler og har mangler i makrofag og dendritiske celler8. Den immundefekte karakter af disse NSG-værter muliggør transplantation af humane hæmatopoietiske celler, patientafledte kræftformer og hud 8,9,10. På trods af dette immunsuppressive værtsmiljø er yderligere undertrykkelse af musens neutrofile immunrespons ved administration af anti-GR1 nødvendig for transplantatsucces10. De største hindringer ved transplantation af intakt væv er infektion, afvisning og vanskeligheder med at genoprette blodgennemstrømningen til transplantatet, hvilket undertiden fører til tab af dermal og epidermal integritet11. Teknikker, herunder administration af anti-FR1 og brug af passende transplantatdybde, forbedrer graftoverlevelsen10. Omhyggelig optimering gør det muligt at udføre human xenograft hudtransplantationer på NSG-mus med høj effektivitet og overlevelsesrater, der spænder fra 90% -100%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne undersøgelse blev godkendt og udført i overensstemmelse med UCSF IACUC (AN191105-01H) og IRB (13-11307) protokoller. Hudprøver, kasseret som en del af rutinemæssige elektive kirurgiske procedurer, såsom brokreparation, blev brugt til den nuværende forskning. Hudprøverne er enten afidentificerede og certificeret som ikke-human forsøgsforskning, eller, hvis klinisk identificerende oplysninger er nødvendige for downstream-analyser, gav patienterne skriftligt samtykke i henhold til IRB-protokol 13-11307. Der blev ikke anvendt andre inklusions- eller eksklusionskriterier. NSG-mus af begge køn, 8-10 uger gamle, blev ansat i undersøgelsen. Musene blev hentet fra kommercielle kilder (se Materialetabel).
1. Behandling af donors hudprøve
BEMÆRK: Den menneskelige hudprøve, der blev brugt i denne transplantation, var en stor prøve indsamlet fra maven hos en sund patient. Prøven skal være mindst 15 cm x 7,5 cm. Størrelsesbegrænsninger kan påvirke antallet af mus, for hvilke hud er tilgængelig, og valget af transplantatstørrelse.
- Hold hudprøven ved kolde temperaturer (på is; 4 °C) inden klargøring og podning. Prøven opbevares fugtig i en lukket prøveopsamlingskop med gazen gennemblødt i fosfatbufferet saltvand (PBS).
BEMÆRK: Det anbefales ikke at opbevare hudprøven ved 4 °C i mere end 2 dage. Der findes dog rapporter, hvor hudprøverne opbevares i længere tid12.
FORSIGTIG: Behandl alt humant væv med standard biohazard forholdsregler. - Forbered dig på at dermatome den menneskelige hudprøve i en steriliseret undertryksvævskulturhætte på et steriliseret dissektionsbræt.
- Placer hudprøven med epidermissiden opad på dissektionsbrættet. Tør epidermis af med en steril alkoholforberedelsespude og derefter med PBS.
- Fastgør den nærmere kant af huden på plads med en 1,5 i dissekerende T-stift (se Materialetabel).
- Dermatome hudprøven i en tykkelse på 400 μm og påfører konstant tryk, mens den skæres fremad i en vinkel på 30°-45°. Følg alle instrumentspecifikke instruktioner og sikkerhedsforanstaltninger (se Materialetabel).
BEMÆRK: For detaljer om dermatomteknikken henvises til en tidligere offentliggjort rapport13. - Forbered en 100 mm x 20 mm petriskål ved at placere en steril gaze gennemblødt i steril PBS i bunden af fadet. Placer huden, epidermis side opad, på den våde gasbind.
- Pladekanterne forsegles og dækkes med en halvgennemsigtig tætningsfilm (se Materialetabel) for at sikre, at prøven ikke er forurenet. Prøven opbevares ved 4 °C inden podning.
2. Konditionering og forberedelse før operationen
- Forbered de sterile instrumenter og en steril kirurgisk station til podning. Brug autoklaverede papirhåndklæder som sterile overflader til placering af instrumenter og mus.
BEMÆRK: Mus kan podes efter fravænning, men podes fortrinsvis mellem 8-10 uger. Mus af begge køn kan podes. - Udfør det kirurgiske præparat, såsom hårfjerning, i et område, der er fysisk adskilt fra den kirurgiske station.
- Forbered anti-GR1 (se materialetabel) ved at fortynde den til 1 mg / ml i sterilt saltvand. Doser hver mus med 100 μg/100 μL af anti-GR1-opløsningen intraperitonealt efter anæstesiinduktion.
- Anæstetiser musene, en ad gangen, med isofluran eller andre institutionelt godkendte anæstetika.
BEMÆRK: Isofluran skal gives i en koncentration på 3%-5% under induktion. Når musen er ubevægelig, sænkes isoflurankoncentrationen til 1%-3% for at påvirke i løbet af operationen.- Overvåg musen for passende dybde af anæstesi ved at observere respirationsfrekvens, fravær af tåspidsrespons og passende lyserød farve af ører og mund.
FORSIGTIG: Brug passende bedøvelsesmaskiner og rensningsmetoder, og undgå udsættelse for isoflurandampe.
- Overvåg musen for passende dybde af anæstesi ved at observere respirationsfrekvens, fravær af tåspidsrespons og passende lyserød farve af ører og mund.
- Overfør musen til en varmepude eller en anden varmekilde (se Materialetabel).
- Administrer den oftalmiske salve ved at duppe en lille dråbe salve på øjet med en behandsket finger.
- Administrer analgetika Buprenorphin (0,08 mg/kg) og Carprofen (5 mg/kg) (se Materialetabel) subkutant ved at klemme huden og injicere i en vinkel parallelt med kroppen.
BEMÆRK: Forbered analgesi før behandling efter institutionelle protokoller. Følg institutionelle retningslinjer for udvælgelse og administration af analgetika. Metoden til analgesi, der anvendes i denne undersøgelse, er skitseret i trin 2.7 og supplerende figur 1. - Anti-GR1 (forberedt i trin 2.4) administreres intraperitonealt ved at løfte musen let ved halen, udsætte maven og injicere i en 30° vinkel ved hjælp af en insulinsprøjte på 1 ml (12,7 mm).
- Brug dyresikre elektriske klippere (se Materialetabel) til at barbere den midterste og øverste del af musens dorsale side.
- Ryd alt håret og påfør en generøs mængde hårfjerningssalve på den barberede hud i 30 s til 1 min.
- Tør hårfjerningssalve helt af med et køkkenrulle og PBS.
3. Transplantationsprocedure
- Overfør musen til et sekundært kirurgisk sted væk fra hårfjerningsstationen.
- Steriliser det kirurgiske sted med jodpindpinden i en cirkulær bevægelse, der starter i midten og arbejder ud mod kanten af det depilerede område.
- Læg et stykke steril plastfolie over musen og skær et vindue i plasten, der er lidt større end størrelsen på det område, der skal podes.
- Skær en rektangelformet 10 mm x 10 mm del af donorhuden, der skal podes med en skalpel. Gør dette ved at holde donorhuden fast på plads med bagsiden af tangen og skære sammen med tangen med skalpellen.
- Brug den kirurgiske saks til at klippe et rektangulært område af musehud, der matcher størrelsen på donorhudstykket, hvilket skaber en graftseng. Brug tang til at trække huden væk fra kroppen, og klip huden med saksen vinklet væk fra kroppen for at undgå at skære dybt ind i ansigtet.
- Placer donorhudstykket med epidermissiden opad på den forberedte podningsseng.
- Brug bagsiden af tangen til at manipulere huden og glide frem og tilbage, indtil donorhuden ligger helt fladt mod transplantatsengen.
- Tilsæt dråber kirurgisk limvævslim (se Materialetabel), hvor donorhuden møder musehuden og hold musen og donorhuden sammen med tang i 1-2 s, så limen klæber til vævene. Forsegl kanten af transplantatet helt, og lad limen tørre helt.
- Bandage musene (figur 1) ved at følge nedenstående trin.
- Skær et stykke petrolatumgasbind (se Materialetabel), der er stort nok til at dække transplantatområdet helt.
- Dæk transplantatet med petrolatumgassen, og tryk let gasbindet mod huden ved hjælp af tang.
- Skær en strimmel af en gennemsigtig filmdressing på langs, så bredden er stor nok til at dække musens sår.
- Tryk fast på den gennemsigtige filmdressing, klæbende side nedad, over gasbindet. Rul hurtigt musen for at vikle dressingen helt rundt om torsoen, så den passer tæt uden at hindre åndedrættet, og alle lemmer er fri til bevægelse.
- Placer musen i et genopretningsbur, og overvåg den, indtil den er opmærksom og bevæger sig rundt. Sørg for en varmekilde på en del af buret i mindst 15 minutter efter genvinding.
BEMÆRK: Dyrene forventes at komme sig inden for 1-5 minutter efter at have placeret dem i genopretningsburet.
- Enkeltvis huse musene efter podning.
- Administrer postkirurgisk analgesi som krævet i institutionelle protokoller.
BEMÆRK: Buprenorphin (0,08 mg/kg) blev administreret subkutant 4-6 timer senere i denne undersøgelse.
4. Postkirurgiske procedurer
- Injicer 100 μL (100 μg) anti-GR1 intra-peritonealt efter 4 dage, 7 dage og 11 dage efter podning for at forhindre transplantatafstødning (supplerende figur 1).
- Udskift bandager efter behov, og hvis de fjernes af mus.
- Rebandage alle musene på dag 7.
- Fjern bandagerne på dag 14.
- Overvåg musene for tegn på transplantatafstødning og systemisk betændelse (vægttab, hårtab, ekstrem sløvhed).
- Høst musene mellem 3 og 6 uger efter podning.
- Afliv musene via regulatorstyret kuldioxid (CO2) administration efterfulgt af cervikal dislokation.
BEMÆRK: Følg institutionelle retningslinjer for aktiv dødshjælp. - Disseker hudtransplantaterne fra musene14. Anbring en del af transplantatet i 10% formalin i 24 timer før paraffinindlejring og sektionering til histologifarvning9.
- Hak hudtransplantaterne med en saks og fordøje enzymatisk med 250 IE/ml kollagenase IV og 0,02 mg/ml DNase i cellekulturmedier natten over. Plet cellerne for overflade- og intracellulære markører efter den tidligere beskrevne procedure14.
- Afliv musene via regulatorstyret kuldioxid (CO2) administration efterfulgt af cervikal dislokation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Human hud xenografts blev udført på NSG mus inde i en super-barriere dyr facilitet. Succes blev defineret af den langvarige transplantat- og museoverlevelse og adfærdsmæssige sundhed hos mus efter transplantation. Dårlig overlevelse i ugen efter operationen blev oprindeligt observeret som den største barriere for eksperimentel succes, hvor op til 50% af musene krævede eutanasi. Forbedring af steril teknik og bedre understøttelse af musens kropstemperaturer under og umiddelbart efter operationen øgede kirurgisk overlevelse konsekvent til over 80% og ofte til 90% -100% overlevelse. Mens tilsætning af antibiotika i musens drikkevand blev afprøvet, var det ikke fast besluttet på at forbedre resultaterne og blev afbrudt som en potentiel confounder af resultater. Succesfuldt podede mus skal virke aktive og sunde i dagene efter transplantationen. Mus bevægede sig rundt i deres bur, udforskede, byggede reder og spiste og drak som normalt. En utilpas mus kan virke doven, ikke-reaktiv og spiser eller drikker muligvis ikke nok til at opretholde sin vægt. Tilskud af sløve mus med soft-feed og oral hydrering muligheder kan hjælpe post-kirurgisk opsving.
En xenograft, der heler korrekt, vil først skorpe og derefter komme sig inden for ca. 50 dage efter operationen. Transplantater kan trække sig sammen over tid, men forbliver klæbende rundt om kanterne, hvor donorhuden møder musens hud (figur 2). Mens graft scabbing bør aftage, vil transplantater forblive tykkere og mere betændt end sund menneskelig hud (figur 2). Overdreven sammentrækning af transplantater kan forekomme, hvilket reducerer tilgængeligt væv til slutpunktsanalyse. Brug af konsekvent størrelse transplantater og passende graftplacering forventes at afbøde sådanne problemer. Alle transplantater gennem fem uafhængige eksperimenter overlevede til høsttidspunktet, op til 50 dage efter transplantationen.
Vævsanalyse kan omfatte immunhistokemi og enkeltcelleanalyser efter enzymatisk fordøjelse. En del af huden blev behandlet ved fordøjelse natten over i 250 IE / ml kollagenase type IV og 0,02 mg / ml DNase i cellekulturmedier (se materialetabel) og farvet til overflade- og intracellulære markører som tidligere beskrevet14. Analyse ved flowcytometri afslørede den vedvarende tilstedeværelse af humane immunceller inden for de fleste transplantater, men antallet varierede mellem xenotransplantater (figur 3A). Figur 3B viser repræsentative resultater fra et vellykket transplantat (venstre) og et, der ikke har opretholdt humane immunceller (højre). Analyse af hæmatoxylin og eosinfarvede (H&E) sektioner taget fra midten af transplantatet afslørede intakt, ikke-devitaliseret hud sammensat af human dermis og epidermis for både 35 og 50 dages tidspunkter (figur 4).
Figur 1: Metode til bandage mus efter operation. Musen er pakket tæt ind i petrolatumgasbind og gennemsigtig filmdressing under anæstesi. (A) Petrolatumgasbind placeres over et område, der er lidt større end operationssåret. (B) Den gennemsigtige filmdressing forberedes: en lang strimmel skæres lidt bredere end petrolatumgassen. Bagsiden dækker klæbende side af den gennemsigtige filmdressing fjernes delvist. (C) Filmens klæbende side presses fast mod musens bagside, hvilket efterlader en tomme plads på filmens forende. (D) Musen er vendt på ryggen. Den overhængende forreste del af filmen presses på musen, og bagsiden fjernes. (E) Musen er tæt pakket ind i filmen, og den resterende støtte fjernes, når musen pakkes ind. (F) Musen er med succes pakket ind i bandagen, og dens arme og ben er uhæmmede. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentative billeder fra transplanterede dyr fra dag 10 til 21 efter transplantationen. (A-C) Tre forskellige mus med optimale transplantationer på dag 10. (D-E) To forskellige mus med transplantationer på dag 21. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Immuncellekimerisme i podet hud. Flowcytometridata for human immuncellegendannelse fra xenotransplantater. Data er gated på begivenhederne af singlet, live, human CD45+ mus CD45-. (A) Antal celler (levende humane CD45+ hændelser) genvundet fra to uafhængige eksperimenter. (B) Repræsentative plots af human og mus CD45+ immuncellefarvning i et vellykket transplantat (venstre) sammenlignet med transplantat med mislykket vedligeholdelse af det humane immunrum (højre). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Histologi af podet menneskelig hud på dag 35 og 50. Podet hud blev høstet fra mus på dag 35 (A) eller 50 (B), konserveret i 10% formalin og paraffinindlejret og farvet til hæmatoxylin og eosin (H&E). (A) Epidermis viser moderat hyperplasi (acanthosis), let hypergranulose og kompakt orthokeratose. I papillær dermis er der lejlighedsvis udvidede og overbelastede kapillærer. Melanocytter og melaninpigment er til stede i det basale lag af epidermis. Dermis er moderat cellulær og består af fyldige ovale fibroblaster med bleg syncytial cytoplasma og spredte lymfocytter. (B) Epidermis omfatter stratificeret pladeepitel, kurvvævet orthokeratose i det cornificerede lag og er af normal tykkelse. Melanocytter og melaninpigment er til stede i det basale lag af epidermis. Dermis viser ovale fibroblaster og lidt forbedret ekstracellulær matrixaflejring. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 1: Tidsplan for den protokol, der er vedtaget for xenograftundersøgelsen. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mus xenograft hudtransplantationsmodellen er en nøgleteknik til mekanisk at dissekere menneskers hudimmunresponser i en in vivo-indstilling 14. Vellykkede hudtransplantationer er afhængige af passende forberedelse af mus og hudprøver og mus og overholdelse af aseptiske gnaveroperationsmetoder15. Hurtig afkøling og korrekt opbevaring af hudprøver ved kolde temperaturer i medier (såsom sterilt saltvand) er vigtigt for at sikre fortsat vævssundhed inden transplantation12. Indsamling af prøver med delt tykkelse ved hjælp af et instrument som et dermatom tillader konsistens i prøvedybden mellem mus og øger tilførslen af næringsstoffer fra værten for at forbedre graftoverlevelsen10. Tab af transplantatintegritet med epidermal sloughing kan observeres, især i transplantater med fuld tykkelse med forstyrret blodforsyning16. Museoverlevelse gennem og efter operationen understøttes af steril teknik, tilvejebringelse af varme under og efter operationen og teknikker, der minimerer kirurgisk tid, såsom brug af kirurgisk lim15. Administration af anti-GR1 efter transplantation muliggør undertrykkelse af de resterende museimmunresponser i den immundefekte vært for at fremme graftoverlevelse10. Disse metoder øger sandsynligheden for muse- og transplantatoverlevelse under xenografttransplantationsmodellen og forbedrer eksperimentelle tal og reproducerbarhed fra et eksperiment til det næste.
Selvom det er yderst nyttigt, er der nogle vigtige begrænsninger for xenograft hudtransplantationsmodellen, som demonstreret. For det første eksisterer transplantatet i et inflammatorisk miljø, sandsynligvis sekundært til forbigående iskæmi og infiltration af humant podet væv med murine myeloide celler. Således afspejler det ikke menneskelig hud i en stabil tilstand og afspejler muligvis ikke fuldt ud alle menneskelige inflammatoriske hudsygdomme10,14. At studere humane inflammatoriske lidelser ved podning af kliniske biopsier fra læsionshud er en alternativ strategi, men begrænsninger i antallet af tilgængelige biopsier og inkonsekvent kontrol af podningsdybde gør denne mulighed mindre gunstig. Derudover rekapitulerer xenografttransplantationer ikke den menneskelige perifere immunarkitektur. Rekonstituering af musens periferi med humane celler kan også bære forbehold, da NSG-musens lymfoide struktur er atrofisk før human celletransplantation; Dette kan føre til præferencecellevalg i nogle indstillinger10,17. Derudover kan hudtransplantation og immuncellegendannelse fra hudprøver variere fra mus til mus, selv i mangel af behandling. Mindst 10 replikater pr. betingelse anbefales til denne model for at observere konsistente forskelle mellem grupper. Den passende varighed af analysen skal muligvis justeres til det eksperimentelle spørgsmål, da transplantatheling og re-vaskularisering forekommer i de første uger efter transplantation, og effekten af interventioner kan afhænge af engraftmentstadiet.
På trods af disse ulemper forbliver den menneskelige xenograft hudtransplantationsmodel en af de få assays til at studere human hudimmunrespons i det intakte organ in vivo. Mens transgene musemodeller kan give mulighed for mekanistisk dissektion, begrænser forskelle i anatomi, immuncellesammensætning og dominerende immunveje oversættelse til human sygdom1. Ex vivo-dyrkning af humane celler, hudorganoidmodeller og humant vævseksplantatundersøgelser kan anvendes alternativt, men er også underlagt begrænsninger, herunder forstyrrelse af immuncellenetværk og udgang af immunceller fra det intakte væv18,19. Derfor forbliver xenograft hudtransplantationsmodellerne en nøglemetode til at studere terapeutiske kandidater og menneskelige hudresponser på inflammation i en præklinisk in vivo-indstilling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
MDR er grundlægger af TRex Bio og Sitryx. MDR og MML modtager forskningsmidler fra Sitryx, Q32 og TRex Bio.
Acknowledgments
Dette arbejde blev delvist finansieret af sponsorerede forskningsaftaler fra TRex Bio og tilskud fra NIH (1R01AR075864-01A1). JMM er støttet af Kræftens Bekæmpelse (bevilling 26005). Vi anerkender Parnassus Flow Cytometry Core delvist støttet af tilskud NIH P30 DK063720, S10 1S10OD021822-01 og S10 1S10OD018040-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher | SF100-20 | Fixative for histology |
| 3M Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | surgical glue |
| Alexa 700 CD45 monoclonal antibody (Clone 30F11) | Thermo Fischer | 56-0451-82 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Anti-GR1 clone RB6-8C5 | BioXcell | BE0075 | Anti-rejection |
| APC mouse anti-human CD25 (Clone 2A3) | BD Biosciences | 340939 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| APC-eFluor 780 anti-human HLA-DR (Clone LN3) | eBioscience | 47-9956-42 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Autoclave pouches | VWR | 89140-800 | For autoclaving tools and paper towels |
| Brilliant Violet 60 anti-human CD4 antibody (Clone OKT4 | Biolegend | 317438 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Brilliant Violet 65 anti-human CD8a antibody (Clone RPA-T8) | Biolegend | 301042 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Brilliant Violet 711 anti-human CD3 antibody (Clone OKT3) | Biolegend | 317328 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Buprenex 0.3 mg/mL | Covetrus | 059122 | Analgesia |
| Carprofen 50 mg/mL | Zoetis | NADA # 141-199 | Analgesia |
| Collagenase Type IV | Worthington | 4188 | Skin digestion |
| D42 Dermatome blade | Humeca | 5.D42BL10 | dermatome (1 blade per sample) |
| Dermatome D42 | Humeca | 4.D42 | dermatome |
| Disposable Scalpel | Bard-Parker | 371610 | skin preparation |
| Dissecting T-Pins; 1-1/2 inch, 1000/CS 1.5 | Cole-Parmer | UX-10915-03 | To pin skin specimen for dermatome |
| Dissection scissors | medicon | 02.04.10 | sample preparation and mouse dissection |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25-1G | Skin digestion |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent | eBioscience | 00-5521-00 | Flow cytometry analysis: Cell Fixation and Permeabilization |
| eFluor-450 FOXP3 monoclonal antibody (Clone PCH101) | eBioscience | 48-4776-42 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| Electric clippers | Kent | CL8787-KIT | hair removal |
| Epredia Shandon Instant Eosin | Fisher Scientific | 6765040 | H&E |
| Epredia Shandon Instant Hematoxylin | Fisher Scientific | 6765015 | H&E |
| FITC anti-human CD45 (Clone HI30) | Tonbo Biosciences | 35-0459-T100 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Forceps | medicon | 07.60.07 | sample preparation and mouse dissection |
| Gauze | Fisherbrand | 22-362-178 | Sample preparation |
| Heating lamp | Morganville Scientific | HL0100 | Post-surgical care |
| Heating pads 4" x 10" | Pristech | 20415 | Surgical heat supply |
| Insulin 1cc 12.7 mm syringes | BD | 329410 | drug administration |
| Isoflurane | United States Pharmacopeia (USP) | NDC 66794-013-25 | Anesthesia |
| Isoflurane machine | VetEquip | 911103 | Anesthesia |
| Nair for Men | Nair | 10022600588556 | hair removal |
| Neomycin and Polymyxin Bisulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic ointment | Dechra | NDC 17478-235-35 | eye ointment to prevent drying |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | The Jackson Laboratory | 005557 | Mice |
| Paper towels | Kleenex | 100848 | May be autoclaved for sterile surfaces |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | Semitransparent sealing film |
| PE mouse anti-human CD127 (Clone HIL-7R-M21) | BD Biosciences | 557938 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| PE-Cy-7 mouse anti-Ki-67 (Clone B56) | BD Biosciences | 561283 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| PerCP-eFluor-710 CD152 (CTLA-4) monoclonal antibody (Clone 14D3) | eBioscience | 46-1529-42 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| Permeabilization Buffer 10x | eBioscience | 00-8333-56 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining buffer |
| Petri Dish 150 mm | Corning | 430597 | Sample storage |
| Plastic Wrap | Fisherbrand | 22-305-654 | Site preparation |
| Providone-Iodine Swab stick | PDI | S41350 | Site sterilization |
| Soft-Feed and Oral Hydration (Napa Nectar) | Se Lab Group Inc | NC9066511 | For supplementing poorly recovering mice post-surgery |
| Specimen Collection Cups | Fisher Scientific | 22-150-266 | sample storage |
| Sterile alcohol prep pad | Fisherbrand | 22-363-750 | skin preparation |
| Sterile PBS | Gibco | 14190-144 | Media for sample storage |
| Sterile saline | Hospira | NDC 0409-4888-02 | For drug dilution |
| Tegaderm Film 4” x 43/4” | 3M | 1626 | transparent film wound dressing |
| Vaseline Petrolatum Gauze 3” x 8” | Kendall | 414600 | wound dressing |
| Violet 510 Ghost Dye | Tonbo Biosciences | 13-0870-T100 | Flow cytometry analysis: Viability dye |
References
- Zomer, H. D., Trentin, A. G. Skin wound healing in humans and mice: Challenges in translational research. Journal of Dermatological Science. 90 (1), 3-12 (2018).
- Wong, V. W., Sorkin, M., Glotzbach, J. P., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. Surgical approaches to create murine models of human wound healing. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 969618 (2011).
- Mestas, J., Hughes, C. C. W. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. The Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
- Pasparakis, M., Haase, I., Nestle, F. O. Mechanisms regulating skin immunity and inflammation. Nature Reviews Immunology. 14 (5), 289-301 (2014).
- Sun, H., Zhang, Y. -X., Li, Y. -M. Generation of skin organoids: potential opportunities and challenges. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 3176 (2021).
- Cristóbal, L., et al. Mouse models for human skin transplantation: a systematic review. Cells Tissues Organs. 210 (4), 250-259 (2021).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/γcnull mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Meraz, I. M., et al. An improved patient-derived xenograft humanized mouse model for evaluation of lung cancer immune responses. Cancer Immunology Research. 7 (8), 1267-1279 (2019).
- Racki, W. J., et al. NOD-scid IL2rgamma(null) mouse model of human skin transplantation and allograft rejection. Transplantation. 89 (5), 527-536 (2010).
- Meehan, G. R., et al. Developing a xenograft model of human vasculature in the mouse ear pinna. Scientific Reports. 10 (1), 2058 (2020).
- Gokkaya, A., et al. Skin graft storage in platelet rich plasma (PRP). Dermatologic Therapy. 33 (1), 13178 (2020).
- Humeca, B. V. The Humeca D42 and D80 battery operated cordless dermatomes. , Available from: https://www.youtube.com/watch?v=YCRowX-TdA (2021).
- Rodriguez, R. S., et al. Memory regulatory T cells reside in human skin. The Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1027-1036 (2014).
- Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A.
- Karim, A. S., et al. Evolution of ischemia and neovascularization in a murine model of full thickness human wound healing. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 28 (6), 812-822 (2020).
- Ali, N., et al. Xenogeneic graft-versus-host-disease in NOD-scid IL-2Rγnull mice display a T-effector memory phenotype. PloS One. 7 (8), 44219 (2012).
- Souci, L., Denesvre, C.
- Holtkamp, S. J., et al. Circadian clocks guide dendritic cells into skin lymphatics. Nature Immunology. 22 (11), 1375-1381 (2021).
