Summary
يصف البروتوكول الحالي كيفية تطعيم جلد الإنسان على الفئران غير المصابة بالسمنة والسكرية (NOD) -scid interleukin-2 مستقبلات سلسلة غاما (NSG). يتضمن التقرير وصفا مفصلا لإعداد جلد الإنسان للزراعة ، وإعداد الفئران للزراعة ، وزرع جلد الإنسان ذي السماكة المنقسمة ، وإجراء التعافي بعد الزرع.
Abstract
يعد نموذج xenograft للجلد البشري ، حيث يتم زرع جلد متبرع بشري على مضيف فأر يعاني من نقص المناعة ، خيارا مهما للبحث الانتقالي في علم المناعة الجلدي. يختلف جلد الفئران والإنسان اختلافا كبيرا في التشريح وتكوين الخلايا المناعية. لذلك ، فإن نماذج الماوس التقليدية لها قيود على أبحاث الأمراض الجلدية واكتشاف الأدوية. ومع ذلك ، فإن عمليات الزرع الخارجية الناجحة تمثل تحديا تقنيا وتتطلب إعداد مثالي لموقع الكسب غير المشروع للعينات والفئران من أجل الكسب غير المشروع وبقاء المضيف. يوفر البروتوكول الحالي تقنية محسنة لزرع جلد الإنسان على الفئران ويناقش الاعتبارات اللازمة للأهداف التجريبية النهائية. يصف هذا التقرير التحضير المناسب لعينة جلد متبرع بشري ، وتجميع الإعداد الجراحي ، وإعداد الفئران والموقع الجراحي ، وزرع الجلد ، ومراقبة ما بعد الجراحة. يسمح الالتزام بهذه الطرق بالحفاظ على الطعوم الخارجية لأكثر من 6 أسابيع بعد الجراحة. تسمح التقنيات الموضحة أدناه بأقصى قدر من كفاءة التطعيم بسبب تطوير الضوابط الهندسية والتقنية المعقمة والتكييف قبل الجراحة وبعدها. ينتج عن الأداء المناسب لنموذج xenograft عينات طعم جلد الإنسان طويلة العمر للتوصيف التجريبي لجلد الإنسان والاختبار قبل السريري للمركبات في الجسم الحي.
Introduction
كثيرا ما تستخدم نماذج الفئران لعمل استنتاجات حول البيولوجيا البشرية والمرض ، ويرجع ذلك جزئيا إلى قابليتها للتكاثر التجريبي وقدرتها على التلاعب الجيني. ومع ذلك ، فإن فسيولوجيا الفئران لا تلخص تماما أنظمة الأعضاء البشرية ، وخاصة الجلد ، وبالتالي لديها قيود للاستخدام كنموذج قبل سريري في تطوير الأدوية1. تشمل الاختلافات التشريحية بين جلد الفأر والإنسان الاختلافات في سمك الظهارة والهندسة المعمارية ، ونقص الغدد العرقية المفرزة للفئران ، والاختلافات في دورة الشعر2. علاوة على ذلك ، فإن كلا من الأذرع الفطرية والتكيفية للجهاز المناعي متباعدة بين النوعين3. يحتوي جلد الفأر على مجموعة مناعية فريدة من الخلايا التائية للبشرة المتغصنة (DETCs) ، ولديه وفرة أعلى من الخلايا التائية الجلدية γδ ، ويختلف في توطين المجموعة الفرعية للخلايا المناعية مقارنة بالأنسجة البشرية4. لذلك ، تستفيد النتائج التجريبية المتعلقة ببيولوجيا الجلد البشري والالتهاب من التحقق من صحة الأنسجة البشرية. في حين أن أنظمة الزراعة العضوية والمختبرية تستخدم على نطاق واسع أدوات لدراسة الأنسجة البشرية ، فإن هذه الأنظمة محدودة بسبب إعادة تكوين المناعة الغائبة أو غير المكتملة وعدم الاتصال بالأوعية الدموية الطرفية5. يهدف نموذج زرع الجلد xenograft المتوافق مع البشر إلى السماح بالتلاعب العلاجي أو البيولوجي للمسارات المناعية وغير المناعية في الأنسجة البشرية في الجسم الحي.
تم استخدام نموذج xenograft للجلد البشري لدراسة فسيولوجيا الجلد وعلم الأدوية ، وتحليل الرفض والاستجابات المناعية ، وتشريح آليات سرطان الجلد البشري ، وفهم الأمراض الجلدية والتئام الجروح6. في حين أن نموذج xenograft قابل للتطبيق على مجالات متعددة من أبحاث الجلد ، إلا أنه يحتوي على إنتاجية أقل من الدراسات المختبرية ويفتقر إلى سهولة التلاعب الجيني المستخدم في نماذج الفئران. قد تتراوح النقاط الزمنية ضمن هذا النموذج من أسابيع إلى أشهر ، ويتطلب التطعيم الناجح مرافق ومعدات مناسبة لإجراء هذه العمليات الجراحية. ومع ذلك ، فإن نموذج xenograft يوفر السياق البيولوجي والفسيولوجي للتجارب ، في حين أن أنظمة الزراعة العضوية ، مثل explants الأنسجة ، غالبا ما تتطلب تكرار عدد لا يحصى من الأجزاء المتحركة ، مثل الإشارات الخارجية ، في فترات زمنية محددة7. لذلك ، يتم استخدام هذا النموذج بشكل أفضل للتحقق من صحة النتائج التي لوحظت في المختبر وداخل نماذج الفئران ، أو للعمل غير الممكن بيولوجيا بطريقة أخرى. يوفر الاستخدام المناسب لنموذج xenograft فرصة فريدة لدراسة ومعالجة الأنسجة البشرية السليمة في الجسم الحي.
اعتمد تحسين نموذج زراعة الجلد xenograft على عقود من البحث للحفاظ على سلامة الكسب غير المشروع بمرور الوقت. من الأهمية بمكان لهذه العملية استخدام فأر مستقبلات سلسلة جاما (NSG) غير البدين (NOD) -scid interleukin-2 ، والذي يفتقر إلى الخلايا المناعية التكيفية B و T ، والخلايا القاتلة الطبيعية الوظيفية ، ولديه أوجه قصور في الخلايا البلعمية والخلايا المتغصنة8. تسمح الطبيعة التي تعاني من نقص المناعة لمضيفات NSG هذه بزرع الخلايا المكونة للدم البشرية والسرطانات المشتقة من المريض والجلد8،9،10. على الرغم من هذه البيئة المضيفة المثبطة للمناعة ، فإن القمع الإضافي للاستجابات المناعية للعدلات في الفئران عن طريق الإدارة المضادة ل GR1 ضروري لنجاح الكسب غير المشروع10. تتمثل الحواجز الرئيسية في زرع الأنسجة السليمة في العدوى والرفض وصعوبة إعادة تدفق الدم إلى الكسب غير المشروع ، مما يؤدي في بعض الأحيان إلى فقدان سلامة الجلد والبشرة11. التقنيات بما في ذلك إعطاء مضاد FR1 واستخدام عمق الكسب غير المشروع المناسب تحسين بقاء الكسب غير المشروع10. يتيح التحسين الدقيق إجراء عمليات زرع جلد xenograft البشرية على فئران NSG بكفاءة عالية ومعدلات بقاء ، تتراوح من 90٪ إلى 100٪.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على الدراسة الحالية وتنفيذها وفقا لبروتوكولات UCSF IACUC (AN191105-01H) و IRB (13-11307). تم استخدام عينات الجلد ، التي تم التخلص منها كجزء من الإجراءات الجراحية الاختيارية الروتينية ، مثل إصلاح الفتق ، في البحث الحالي. يتم إلغاء تحديد عينات الجلد واعتمادها على أنها ليست أبحاث مواضيع بشرية أو ، إذا كانت معلومات التعريف السريري مطلوبة للتحليلات النهائية ، فقد قدم المرضى موافقة خطية بموجب بروتوكول IRB 13-11307. لم يتم استخدام أي معايير إدراج أو استبعاد أخرى. تم توظيف الفئران NSG من كلا الجنسين ، 8-10 أسابيع من العمر ، في الدراسة. تم الحصول على الفئران من مصادر تجارية (انظر جدول المواد).
1. معالجة عينة جلد الإنسان المانحة
ملاحظة: كانت عينة جلد الإنسان المستخدمة في عملية الزرع هذه عينة كبيرة تم جمعها من بطن مريض سليم. يجب ألا يقل حجم العينة عن 15 سم × 7.5 سم. قد تؤثر قيود الحجم على عدد الفئران التي يتوفر لها الجلد واختيار حجم الكسب غير المشروع.
- الحفاظ على عينة الجلد في درجات حرارة باردة (على الجليد ؛ 4 درجات مئوية) قبل التحضير والتطعيم. حافظ على رطوبة العينة في كوب مغلق لجمع العينات مع الشاش المنقوع في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
ملاحظة: لا ينصح بتخزين عينة الجلد عند 4 °C لمدة تزيد عن 2 أيام. ومع ذلك ، توجد تقارير حيث يتم تخزين عينات الجلد لفترة أطول12.
تنبيه: عالج جميع الأنسجة البشرية باحتياطات المخاطر البيولوجية القياسية. - الاستعداد لdermatome عينة الجلد البشري في غطاء معقم للأنسجة ذات الضغط السلبي على لوحة تشريح معقمة.
- ضع عينة الجلد ، جانب البشرة لأعلى ، على لوحة التشريح. امسح البشرة باستخدام وسادة تحضير كحول معقمة ثم باستخدام PBS.
- ثبت الحافة الأقرب من الجلد في مكانها باستخدام 1.5 في تشريح دبوس T (انظر جدول المواد).
- Dermatome عينة الجلد بسمك 400 ميكرومتر ، مع تطبيق ضغط ثابت أثناء القطع للأمام بزاوية 30 درجة -45 درجة. اتبع جميع التعليمات الخاصة بالجهاز وتدابير السلامة (انظر جدول المواد).
ملاحظة: للحصول على تفاصيل حول تقنية الجلد ، يرجى الاطلاع على تقرير منشور مسبقا13. - قم بإعداد طبق بتري 100 مم × 20 مم عن طريق وضع شاش معقم منقوع في PBS معقم في قاع الطبق. ضع الجلد ، بحيث يكون جانب البشرة لأعلى ، على الشاش المبلل.
- قم بإغلاق حواف اللوحة وتغطيتها بغشاء مانع للتسرب شبه شفاف (انظر جدول المواد) لضمان عدم تلوث العينة. قم بتخزين العينة عند 4 درجات مئوية قبل التطعيم.
2. تكييف وإعداد ما قبل الجراحة
- تحضير الأدوات المعقمة ومحطة جراحية معقمة للتطعيم. استخدم المناشف الورقية المعقمة كأسطح معقمة لوضع الأدوات والماوس.
ملاحظة: يمكن تطعيم الفئران بعد الفطام ولكن يفضل تطعيمها بين 8-10 أسابيع من العمر. يمكن تطعيم الفئران من أي من الجنسين. - قم بإجراء التحضير الجراحي ، مثل إزالة الشعر ، في منطقة منفصلة جسديا عن المحطة الجراحية.
- تحضير مضاد GR1 (انظر جدول المواد) عن طريق تخفيفه إلى 1 ملغ / مل في محلول ملحي معقم. جرعة كل فأر مع 100 ميكروغرام / 100 ميكرولتر من محلول مضاد GR1 داخل الصفاق بعد تحريض التخدير.
- تخدير الفئران، واحدا تلو الآخر، باستخدام إيزوفلوران أو غيره من أدوية التخدير المعتمدة مؤسسيا.
ملاحظة: يجب إعطاء إيزوفلوران بتركيز 3٪ -5٪ أثناء الحث. بمجرد أن يصبح الماوس غير متحرك ، قم بخفض تركيز الأيزوفلوران إلى 1٪ -3٪ للتأثير طوال مدة الجراحة.- راقب الماوس للحصول على عمق مناسب للتخدير من خلال مراقبة معدل التنفس ، وغياب استجابة قرصة إصبع القدم ، والتلوين الوردي المناسب للأذنين والفم.
تنبيه: استخدم آلات التخدير المناسبة وطرق الكسح ، وتجنب التعرض لأبخرة إيزوفلوران.
- راقب الماوس للحصول على عمق مناسب للتخدير من خلال مراقبة معدل التنفس ، وغياب استجابة قرصة إصبع القدم ، والتلوين الوردي المناسب للأذنين والفم.
- انقل الماوس إلى وسادة تدفئة أو مصدر حرارة آخر (انظر جدول المواد).
- تطبيق مرهم العيون عن طريق وضع قطرة صغيرة من المرهم على العين بإصبع قفاز.
- تطبيق المسكنات البوبرينورفين (0.08 ملغ/كغ) وكاربروفين (5ملغ / كغ) (انظر جدول المواد) تحت الجلد عن طريق القرص الجلد والحقن بزاوية موازية للجسم.
ملاحظة: تحضير تسكين ما قبل العلاج باتباع البروتوكولات المؤسسية. اتبع الإرشادات المؤسسية لاختيار المسكنات وإدارتها. تم توضيح طريقة التسكين المستخدمة في هذه الدراسة في الخطوة 2.7 والشكل التكميلي 1. - يتم تطبيق مضاد GR1 (المحضر في الخطوة 2.4) داخل الصفاق عن طريق رفع الماوس قليلا من الذيل، وتعريض البطن، والحقن بزاوية 30 درجة باستخدام حقنة الأنسولين 1 مل (12.7 مم).
- استخدم كليبرز كهربائي آمن للحيوانات (انظر جدول المواد) لحلق الأجزاء الوسطى والعلوية من الجانب الظهري للماوس.
- نظف كل الشعر وضع كمية وفيرة من مرهم إزالة الشعر على الجلد المحلوق لمدة 30 ثانية إلى 1 دقيقة.
- امسح تماما مرهم إزالة الشعر بمنشفة ورقية و PBS.
3. إجراء الزرع
- نقل الماوس إلى موقع جراحي ثانوي ، بعيدا عن محطة إزالة الشعر.
- تعقيم موقع الجراحة بعصا مسحة اليود في حركة دائرية ، بدءا من المنتصف والعمل نحو حافة المنطقة المزيلة للشعر.
- ضع قطعة من غلاف بلاستيكي معقم فوق الفأر وقم بقص نافذة في البلاستيك أكبر قليلا من حجم المنطقة المراد تطعيمها.
- قطع جزء مستطيل الشكل 10 مم × 10 مم من جلد المتبرع ليتم تطعيمه بمشرط. افعل ذلك عن طريق تثبيت جلد المتبرع بإحكام في مكانه مع الجانب الخلفي من الملقط والقطع جنبا إلى جنب مع الملقط بالمشرط.
- باستخدام المقص الجراحي ، قم بقص منطقة مستطيلة من جلد الفأر تتناسب مع حجم قطعة جلد المتبرع ، مما يؤدي إلى إنشاء سرير ترقيع. استخدم ملقط لسحب الجلد بعيدا عن الجسم ، وقم بقص الجلد بالمقص بزاوية بعيدا عن الجسم لتجنب القطع بعمق في الوجه.
- ضع قطعة جلد المتبرع ، بحيث يكون جانب البشرة لأعلى ، على سرير الكسب غير المشروع المجهز.
- باستخدام الجزء الخلفي من الملقط ، تعامل مع الجلد ، وانزلق ذهابا وإيابا حتى يصبح جلد المتبرع مسطحا تماما على سرير الكسب غير المشروع.
- أضف قطرات من لاصق أنسجة الغراء الجراحي (انظر جدول المواد) حيث يلتقي جلد المتبرع بجلد الفأر ويمسك جلد الفأر والمتبرع معا بالملقط لمدة 1-2 ثانية حتى يلتصق الغراء بالأنسجة. أغلق حافة الكسب غير المشروع تماما واترك الغراء يجف تماما.
- ضمادة الفئران (الشكل 1) باتباع الخطوات أدناه.
- قطع قطعة من شاش الفازلين (انظر جدول المواد) كبيرة بما يكفي لتغطية منطقة الكسب غير المشروع بالكامل.
- قم بتغطية الكسب غير المشروع بشاش الفازلين ، واضغط برفق على الشاش على الجلد باستخدام الملقط.
- قم بقص شريط من ضمادة فيلم شفاف بالطول بحيث يكون العرض كبيرا بما يكفي لتغطية جرح الماوس.
- اضغط بقوة على ضمادة الفيلم الشفافة ، الجانب اللاصق لأسفل ، فوق الشاش. لف الماوس بسرعة للف الضمادة بالكامل حول الجذع ، وتأكد من ملاءمتها بإحكام دون إعاقة التنفس وأن جميع الأطراف حرة للحركة.
- ضع الماوس في قفص الاسترداد وراقبه حتى يصبح في حالة تأهب ويتحرك. توفير مصدر حرارة على جزء من القفص لمدة 15 دقيقة على الأقل بعد التعافي.
ملاحظة: من المتوقع أن تتعافى الحيوانات في غضون 1-5 دقائق بعد وضعها في قفص التعافي.
- منزل منفردة الفئران بعد التطعيم.
- إدارة تسكين ما بعد الجراحة كما هو مطلوب من قبل البروتوكولات المؤسسية.
ملاحظة: تم إعطاء البوبرينورفين (0.08 ملغم / كغم) تحت الجلد بعد 4-6 ساعات خلال الدراسة الحالية.
4. إجراءات ما بعد الجراحة
- حقن 100 ميكرولتر (100 ميكروغرام) من مضاد GR1 داخل الصفاق في 4 أيام و 7 أيام و 11 يوما بعد التطعيم لمنع رفض الكسب غير المشروع (الشكل التكميلي 1).
- استبدل الضمادات حسب الضرورة وإذا أزيلت بواسطة الفئران.
- ضمادة جميع الفئران في اليوم 7.
- إزالة الضمادات في اليوم 14.
- راقب الفئران بحثا عن علامات رفض الكسب غير المشروع والالتهاب الجهازي (فقدان الوزن ، تساقط الشعر ، الخمول الشديد).
- حصاد الفئران بين 3 و 6 أسابيع بعد الكسب غير المشروع.
- القتل الرحيم للفئران عن طريق إدارة ثاني أكسيد الكربون (CO2) التي يتحكم فيها المنظم متبوعا بخلع عنق الرحم.
ملاحظة: اتبع الإرشادات المؤسسية للقتل الرحيم. - تشريح ترقيع الجلد من الفئران14. ضع جزءا من الكسب غير المشروع في 10٪ فورمالين لمدة 24 ساعة قبل تضمين البارافين وتقسيمه لتلطيخ الأنسجة9.
- فرم ترقيع الجلد بالمقص وهضمه إنزيميا باستخدام 250 وحدة دولية / مل من كولاجيناز الوريدي و 0.02 مجم / مل من DNase في وسط زراعة الخلايا طوال الليل. قم بتلطيخ الخلايا بحثا عن علامات سطحية وداخل الخلايا باتباع الإجراء الموصوف سابقا14.
- القتل الرحيم للفئران عن طريق إدارة ثاني أكسيد الكربون (CO2) التي يتحكم فيها المنظم متبوعا بخلع عنق الرحم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم إجراء الطعوم الأجنبية لجلد الإنسان على فئران NSG داخل منشأة حيوانية فائقة الحاجز. تم تعريف النجاح من خلال الكسب غير المشروع لفترات طويلة وبقاء الفئران والصحة السلوكية للفئران بعد الزرع. لوحظ في البداية أن ضعف البقاء على قيد الحياة خلال الأسبوع التالي للجراحة هو أكبر عائق أمام النجاح التجريبي ، حيث يحتاج ما يصل إلى 50٪ من الفئران إلى القتل الرحيم. أدى تحسين تقنية التعقيم ودعم درجات حرارة جسم الفأر بشكل أفضل أثناء الجراحة وبعدها مباشرة إلى زيادة البقاء الجراحي باستمرار إلى أكثر من 80٪ وغالبا إلى 90٪ -100٪ من البقاء على قيد الحياة. في حين تمت تجربة إضافة المضادات الحيوية في مياه شرب الفئران ، لم يتم تحديدها لتحسين النتائج وتم إيقافها كإرباك محتمل للنتائج. يجب أن تظهر الفئران المطعمة بنجاح نشطة وصحية في الأيام التالية لعملية الزرع. كانت الفئران تتحرك حول قفصها ، وتستكشف ، وتبني أعشاشها ، وتأكل وتشرب كالمعتاد. قد يبدو الفأر المريض كسولا وغير تفاعلي وقد لا يأكل أو يشرب ما يكفي للحفاظ على وزنه. قد تساعد مكملات الفئران الخاملة مع خيارات التغذية اللينة والترطيب الفموي في التعافي بعد الجراحة.
الطعم الأجنبي الذي يتعافى بشكل صحيح سوف يجرب أولا ثم يتعافى في غضون 50 يوما تقريبا من الجراحة. قد تنقبض الطعوم بمرور الوقت ولكنها تظل ملتصقة حول الحواف حيث يلتقي جلد المتبرع بجلد الفأر (الشكل 2). بينما يجب أن تهدأ قشور الكسب غير المشروع ، ستبقى الطعوم أكثر سمكا وأكثر التهابا من جلد الإنسان السليم (الشكل 2). يمكن أن يحدث تقلص مفرط في الطعوم ، مما يقلل من الأنسجة المتاحة لتحليل نقطة النهاية. من المتوقع أن يؤدي استخدام الطعوم ذات الحجم الثابت ووضع الكسب غير المشروع المناسب إلى التخفيف من هذه المشكلات. نجت جميع الطعوم خلال خمس تجارب مستقلة حتى وقت الحصاد ، حتى 50 يوما بعد الزرع.
قد يشمل تحليل الأنسجة الكيمياء المناعية وتحليلات الخلية الواحدة بعد الهضم الأنزيمي. تمت معالجة جزء من الجلد عن طريق الهضم بين عشية وضحاها في 250 وحدة دولية / مل من كولاجيناز من النوع الرابع و 0.02 ملغ / مل من DNase في وسائط زراعة الخلايا (انظر جدول المواد) ، وملطخة للعلامات السطحية وداخل الخلايا كما هو موضح سابقا14. كشف التحليل عن طريق قياس التدفق الخلوي عن الوجود المستمر للخلايا المناعية البشرية داخل معظم الطعوم ولكن الأعداد تباينت بين الطعوم الأجنبية (الشكل 3 أ). يوضح الشكل 3B نتائج تمثيلية من طعم ناجح (يسار) وفشل في الحفاظ على الخلايا المناعية البشرية (يمين). كشف تحليل أقسام الهيماتوكسيلين واليوزين الملطخة (H&E) المأخوذة من مركز الكسب غير المشروع عن جلد سليم وغير حيوي يتكون من الأدمة البشرية والبشرة لكل من النقاط الزمنية 35 و 50 يوما (الشكل 4).
الشكل 1: طريقة تضميد الفأر بعد الجراحة. يتم لف الماوس بإحكام في شاش الفازلين وخلع الملابس فيلم شفاف أثناء التخدير. (أ) يوضع شاش البترول فوق مساحة أكبر قليلا من الجرح الجراحي. (ب) يتم تحضير ضمادة الفيلم الشفافة: يتم قطع شريط طويل أعرض قليلا من شاش الفازلين. تتم إزالة الدعم الذي يغطي الجانب اللاصق من ضمادة الفيلم الشفاف جزئيا. (ج) يتم ضغط الجانب اللاصق للفيلم بقوة على الجزء الخلفي من الماوس ، مما يترك مساحة بوصة واحدة على الواجهة الأمامية للفيلم. د: يدور الماوس على ظهره. يتم ضغط الجزء الأمامي المتدلي من الفيلم على الماوس ، ويتم إزالة الدعم. (ه) الفأرة ملفوفة بإحكام في الفيلم، وإزالة الدعامة المتبقية أثناء التفاف الماوس. (و) يتم لف الفأر بنجاح في الضمادة ، وذراعيه وساقيه غير مقيدين. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: صور تمثيلية من الحيوانات المزروعة من اليوم 10 إلى 21 بعد الزرع. (أ-ج) ثلاثة فئران مختلفة مع عمليات زرع مثالية في اليوم 10. (دال - ه) فأران مختلفان مع عمليات زرع في اليوم 21. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: خيمرية الخلايا المناعية في الجلد المطعم. بيانات قياس التدفق الخلوي لاستعادة الخلايا المناعية البشرية من الطعوم الأجنبية. البيانات مسورة على أحداث مفردة ، حية ، الإنسان CD45 + الماوس CD45-. (أ) عدد الخلايا (أحداث CD45+ البشرية الحية) المستردة من تجربتين مستقلتين. (ب) قطع تمثيلية لتلطيخ الخلايا المناعية CD45 + للإنسان والفأر في طعم ناجح (يسار) مقارنة بالكسب غير المشروع مع الصيانة غير الناجحة لحجرة المناعة البشرية (يمين). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: أنسجة جلد الإنسان المطعمة في اليوم 35 و 50. تم حصاد الجلد المطعمة من الفئران في اليوم 35 (أ) أو 50 (ب) ، وحفظها في 10٪ فورمالين ، وغرست البارافين وملطخة بالهيماتوكسيلين والإيوسين (H&E). (أ) تظهر البشرة فرط تنسج معتدل (الشواك)، وفرط حبيبي طفيف، وتقرن تقويم العظام المضغوط. في الأدمة الحليمية ، هناك شعيرات دموية متوسعة ومزدحمة في بعض الأحيان. توجد الخلايا الصباغية وصبغة الميلانين في الطبقة القاعدية للبشرة. الأدمة خلوية بشكل معتدل وتتكون من خلايا ليفية بيضاوية ممتلئة الجسم مع سيتوبلازم مخلوي شاحب وخلايا ليمفاوية متناثرة. (ب) تتكون البشرة من ظهارة حرشفية طبقية ، وتقرن العظام المنسوج في الطبقة المتقرنة ، وهي ذات سمك طبيعي. توجد الخلايا الصباغية وصبغة الميلانين في الطبقة القاعدية للبشرة. تظهر الأدمة الخلايا الليفية البيضاوية وترسب المصفوفة خارج الخلية المحسن قليلا. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل التكميلي 1: الجدول الزمني للبروتوكول المعتمد لدراسة الكسب غير المشروع الأجنبي. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يعد نموذج زرع جلد الفأر xenograft تقنية رئيسية لتشريح الاستجابات المناعية لجلد الإنسان ميكانيكيا في وضع في الجسم الحي 14. تعتمد عمليات زرع الطعم الأجنبي الناجحة على التحضير المناسب للفئران وعينات الجلد والفئران والالتزام بطرق جراحة القوارض المعقمة15. يعد التبريد السريع والتخزين السليم لعينات الجلد في درجات حرارة باردة في الوسائط (مثل المحلول الملحي المعقم) أمرا مهما لضمان استمرار صحة الأنسجة قبل الزرع12. يسمح جمع العينات ذات السماكة المنقسمة ، باستخدام أداة مثل dermatome ، بالاتساق في عمق العينة بين الفئران ويزيد من توفير العناصر الغذائية من المضيف لتحسين بقاء الكسب غير المشروع10. يمكن ملاحظة فقدان سلامة الكسب غير المشروع مع تقشير البشرة ، خاصة في الطعوم كاملة السماكة مع انقطاع إمدادات الدم16. يتم مساعدة بقاء الفأر خلال الجراحة وبعدها من خلال تقنية معقمة ، وتوفير الحرارة أثناء الجراحة وبعدها ، والتقنيات التي تقلل من وقت الجراحة ، مثل استخدام الغراء الجراحي15. يسمح إعطاء مضاد GR1 بعد الزرع بقمع الاستجابات المناعية المتبقية للفأر في المضيف الذي يعاني من نقص المناعة لتعزيز بقاء الكسب غير المشروع10. تزيد هذه الطرق من احتمالية بقاء الفئران والكسب غير المشروع أثناء نموذج زرع الكسب غير المشروع الأجنبي وتحسن الأرقام التجريبية وقابلية التكاثر من تجربة إلى أخرى.
على الرغم من أنها مفيدة للغاية ، إلا أن هناك بعض القيود الرئيسية على نموذج زراعة الجلد xenograft ، كما هو موضح. أولا ، يوجد الكسب غير المشروع في بيئة التهابية ، على الأرجح ثانوية لنقص التروية العابر وتسلل الأنسجة البشرية المطعمة بالخلايا النخاعية للفئران. وبالتالي ، فإنه لا يعكس جلد الإنسان في حالة مستقرة وقد لا يعكس بشكل كامل جميع الأمراض الجلدية الالتهابية البشرية10,14. تعد دراسة الاضطرابات الالتهابية البشرية عن طريق تطعيم الخزعات السريرية من الجلد الآفة استراتيجية بديلة ، لكن القيود المفروضة على عدد الخزعات المتاحة والتحكم غير المتسق في عمق التطعيم يجعل هذا الخيار أقل ملاءمة. بالإضافة إلى ذلك ، لا تلخص عمليات زرع الكسب غير المشروع الأجنبي بنية المناعة المحيطية البشرية. كما أن إعادة تشكيل محيط الفأر بالخلايا البشرية قد ينطوي على محاذير ، حيث أن البنية اللمفاوية للفأر NSG تكون ضامرة قبل تطعيم الخلايا البشرية. قد يؤدي هذا إلى اختيار الخلية التفضيلية في بعض الإعدادات10,17. بالإضافة إلى ذلك ، قد يختلف تطعيم الجلد واستعادة الخلايا المناعية من عينات الجلد من فأر لآخر ، حتى في حالة عدم وجود علاج. يوصى باستخدام 10 نسخ متماثلة على الأقل لكل حالة لهذا النموذج لمراقبة الاختلافات المتسقة بين المجموعات. قد يلزم تعديل المدة المناسبة للفحص للسؤال التجريبي ، حيث يحدث التئام الكسب غير المشروع وإعادة الأوعية الدموية خلال الأسابيع الأولى بعد الزرع ، وقد يعتمد تأثير التدخلات على مرحلة التطعيم.
على الرغم من هذه العيوب ، يظل نموذج زرع الجلد البشري xenograft أحد المقايسات القليلة لدراسة الاستجابات المناعية للجلد البشري في العضو السليم في الجسم الحي. في حين أن نماذج الفئران المعدلة وراثيا قد تسمح بتشريح المسار الميكانيكي ، فإن الاختلافات في التشريح وتكوين الخلايا المناعية والمسارات المناعية المهيمنة تحد من الترجمة إلى المرض البشري1. يمكن استخدام الثقافة خارج الجسم الحي للخلايا المشتقة من الإنسان ، والنماذج العضوية الجلدية ، ودراسات زراعة الأنسجة البشرية بدلا من ذلك ولكنها تخضع أيضا لقيود ، بما في ذلك تعطيل شبكات الخلايا المناعية وخروج الخلايا المناعية من الأنسجة السليمة18,19. لذلك ، تظل نماذج زراعة الجلد xenograft طريقة رئيسية لدراسة المرشحين العلاجيين واستجابات الجلد البشري للالتهاب في بيئة ما قبل السريرية في الجسم الحي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
MDR هو مؤسس TRex Bio و Sitryx. تتلقى MDR و MML تمويلا بحثيا من Sitryx و Q32 و TRex Bio.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل جزئيا من خلال اتفاقيات البحث التي ترعاها TRex Bio والمنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (1R01AR075864-01A1). يتم دعم JMM من قبل جمعية أبحاث السرطان (منحة 26005). نحن نعترف بنواة قياس التدفق الخلوي Parnassus المدعومة جزئيا بمنح NIH P30 DK063720 و S10 1S10OD021822-01 و S10 1S10OD018040-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher | SF100-20 | Fixative for histology |
| 3M Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | surgical glue |
| Alexa 700 CD45 monoclonal antibody (Clone 30F11) | Thermo Fischer | 56-0451-82 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Anti-GR1 clone RB6-8C5 | BioXcell | BE0075 | Anti-rejection |
| APC mouse anti-human CD25 (Clone 2A3) | BD Biosciences | 340939 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| APC-eFluor 780 anti-human HLA-DR (Clone LN3) | eBioscience | 47-9956-42 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Autoclave pouches | VWR | 89140-800 | For autoclaving tools and paper towels |
| Brilliant Violet 60 anti-human CD4 antibody (Clone OKT4 | Biolegend | 317438 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Brilliant Violet 65 anti-human CD8a antibody (Clone RPA-T8) | Biolegend | 301042 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Brilliant Violet 711 anti-human CD3 antibody (Clone OKT3) | Biolegend | 317328 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Buprenex 0.3 mg/mL | Covetrus | 059122 | Analgesia |
| Carprofen 50 mg/mL | Zoetis | NADA # 141-199 | Analgesia |
| Collagenase Type IV | Worthington | 4188 | Skin digestion |
| D42 Dermatome blade | Humeca | 5.D42BL10 | dermatome (1 blade per sample) |
| Dermatome D42 | Humeca | 4.D42 | dermatome |
| Disposable Scalpel | Bard-Parker | 371610 | skin preparation |
| Dissecting T-Pins; 1-1/2 inch, 1000/CS 1.5 | Cole-Parmer | UX-10915-03 | To pin skin specimen for dermatome |
| Dissection scissors | medicon | 02.04.10 | sample preparation and mouse dissection |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25-1G | Skin digestion |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent | eBioscience | 00-5521-00 | Flow cytometry analysis: Cell Fixation and Permeabilization |
| eFluor-450 FOXP3 monoclonal antibody (Clone PCH101) | eBioscience | 48-4776-42 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| Electric clippers | Kent | CL8787-KIT | hair removal |
| Epredia Shandon Instant Eosin | Fisher Scientific | 6765040 | H&E |
| Epredia Shandon Instant Hematoxylin | Fisher Scientific | 6765015 | H&E |
| FITC anti-human CD45 (Clone HI30) | Tonbo Biosciences | 35-0459-T100 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Forceps | medicon | 07.60.07 | sample preparation and mouse dissection |
| Gauze | Fisherbrand | 22-362-178 | Sample preparation |
| Heating lamp | Morganville Scientific | HL0100 | Post-surgical care |
| Heating pads 4" x 10" | Pristech | 20415 | Surgical heat supply |
| Insulin 1cc 12.7 mm syringes | BD | 329410 | drug administration |
| Isoflurane | United States Pharmacopeia (USP) | NDC 66794-013-25 | Anesthesia |
| Isoflurane machine | VetEquip | 911103 | Anesthesia |
| Nair for Men | Nair | 10022600588556 | hair removal |
| Neomycin and Polymyxin Bisulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic ointment | Dechra | NDC 17478-235-35 | eye ointment to prevent drying |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | The Jackson Laboratory | 005557 | Mice |
| Paper towels | Kleenex | 100848 | May be autoclaved for sterile surfaces |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | Semitransparent sealing film |
| PE mouse anti-human CD127 (Clone HIL-7R-M21) | BD Biosciences | 557938 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| PE-Cy-7 mouse anti-Ki-67 (Clone B56) | BD Biosciences | 561283 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| PerCP-eFluor-710 CD152 (CTLA-4) monoclonal antibody (Clone 14D3) | eBioscience | 46-1529-42 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| Permeabilization Buffer 10x | eBioscience | 00-8333-56 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining buffer |
| Petri Dish 150 mm | Corning | 430597 | Sample storage |
| Plastic Wrap | Fisherbrand | 22-305-654 | Site preparation |
| Providone-Iodine Swab stick | PDI | S41350 | Site sterilization |
| Soft-Feed and Oral Hydration (Napa Nectar) | Se Lab Group Inc | NC9066511 | For supplementing poorly recovering mice post-surgery |
| Specimen Collection Cups | Fisher Scientific | 22-150-266 | sample storage |
| Sterile alcohol prep pad | Fisherbrand | 22-363-750 | skin preparation |
| Sterile PBS | Gibco | 14190-144 | Media for sample storage |
| Sterile saline | Hospira | NDC 0409-4888-02 | For drug dilution |
| Tegaderm Film 4” x 43/4” | 3M | 1626 | transparent film wound dressing |
| Vaseline Petrolatum Gauze 3” x 8” | Kendall | 414600 | wound dressing |
| Violet 510 Ghost Dye | Tonbo Biosciences | 13-0870-T100 | Flow cytometry analysis: Viability dye |
References
- Zomer, H. D., Trentin, A. G. Skin wound healing in humans and mice: Challenges in translational research. Journal of Dermatological Science. 90 (1), 3-12 (2018).
- Wong, V. W., Sorkin, M., Glotzbach, J. P., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. Surgical approaches to create murine models of human wound healing. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 969618 (2011).
- Mestas, J., Hughes, C. C. W. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. The Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
- Pasparakis, M., Haase, I., Nestle, F. O. Mechanisms regulating skin immunity and inflammation. Nature Reviews Immunology. 14 (5), 289-301 (2014).
- Sun, H., Zhang, Y. -X., Li, Y. -M. Generation of skin organoids: potential opportunities and challenges. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 3176 (2021).
- Cristóbal, L., et al. Mouse models for human skin transplantation: a systematic review. Cells Tissues Organs. 210 (4), 250-259 (2021).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/γcnull mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Meraz, I. M., et al. An improved patient-derived xenograft humanized mouse model for evaluation of lung cancer immune responses. Cancer Immunology Research. 7 (8), 1267-1279 (2019).
- Racki, W. J., et al. NOD-scid IL2rgamma(null) mouse model of human skin transplantation and allograft rejection. Transplantation. 89 (5), 527-536 (2010).
- Meehan, G. R., et al. Developing a xenograft model of human vasculature in the mouse ear pinna. Scientific Reports. 10 (1), 2058 (2020).
- Gokkaya, A., et al. Skin graft storage in platelet rich plasma (PRP). Dermatologic Therapy. 33 (1), 13178 (2020).
- Humeca, B. V. The Humeca D42 and D80 battery operated cordless dermatomes. , Available from: https://www.youtube.com/watch?v=YCRowX-TdA (2021).
- Rodriguez, R. S., et al. Memory regulatory T cells reside in human skin. The Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1027-1036 (2014).
- Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A.
- Karim, A. S., et al. Evolution of ischemia and neovascularization in a murine model of full thickness human wound healing. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 28 (6), 812-822 (2020).
- Ali, N., et al. Xenogeneic graft-versus-host-disease in NOD-scid IL-2Rγnull mice display a T-effector memory phenotype. PloS One. 7 (8), 44219 (2012).
- Souci, L., Denesvre, C.
- Holtkamp, S. J., et al. Circadian clocks guide dendritic cells into skin lymphatics. Nature Immunology. 22 (11), 1375-1381 (2021).
