Summary
Het huidige protocol beschrijft hoe de menselijke huid kan worden geënt op niet-obese diabetische (NOD) -scid interleukine-2 gammaketen receptor (NSG) muizen. Een gedetailleerde beschrijving van de voorbereiding van de menselijke huid voor transplantatie, de voorbereiding van muizen voor transplantatie, transplantatie van de menselijke huid van gespleten dikte en de herstelprocedure na de transplantatie zijn opgenomen in het rapport.
Abstract
Het human skin xenograft model, waarbij de menselijke donorhuid wordt getransplanteerd op een immunodeficiënte muisgastheer, is een belangrijke optie voor translationeel onderzoek in de huidimmunologie. Murine en menselijke huid verschillen aanzienlijk in anatomie en samenstelling van immuuncellen. Daarom hebben traditionele muismodellen beperkingen voor dermatologisch onderzoek en medicijnontdekking. Succesvolle xenotransplantaties zijn echter technisch uitdagend en vereisen een optimale voorbereiding van de monster- en muistransplantaatlocatie voor de overleving van transplantaten en gastheer. Het huidige protocol biedt een geoptimaliseerde techniek voor het transplanteren van menselijke huid op muizen en bespreekt noodzakelijke overwegingen voor downstream experimentele doelen. Dit rapport beschrijft de juiste voorbereiding van een menselijk donorhuidmonster, assemblage van een chirurgische opstelling, muis- en chirurgische sitevoorbereiding, huidtransplantatie en postoperatieve monitoring. Naleving van deze methoden maakt het mogelijk om xenografts gedurende meer dan 6 weken na de operatie te onderhouden. De onderstaande technieken maken maximale entefficiëntie mogelijk dankzij de ontwikkeling van technische controles, steriele techniek en pre- en postoperatieve conditionering. Passende prestaties van het xenograftmodel resulteren in langlevende menselijke huidtransplantatiemonsters voor experimentele karakterisering van de menselijke huid en preklinisch testen van verbindingen in vivo.
Introduction
Muismodellen worden vaak gebruikt om conclusies te trekken over menselijke biologie en ziekte, deels vanwege hun experimentele reproduceerbaarheid en capaciteit voor genetische manipulatie. De fysiologie van muizen vat echter de menselijke orgaansystemen, met name de huid, niet volledig samen en heeft daarom beperkingen voor gebruik als preklinisch model bij de ontwikkeling van geneesmiddelen1. Anatomische verschillen tussen muis en menselijke huid omvatten verschillen in epitheliale diktes en architectuur, gebrek aan murine eccriene zweetklieren en variaties in haarcyclus2. Bovendien verschillen zowel de aangeboren als de adaptieve armen van het immuunsysteem tussen de twee soorten3. Muizenhuid bevat een unieke immuunpopulatie van dendritische epidermale T-cellen (DETC's), heeft een hogere abundantie van dermale γδ T-cellen en varieert in lokalisatie van immuuncelsubsets in vergelijking met menselijk weefsel4. Daarom hebben experimentele bevindingen met betrekking tot menselijke huidbiologie en ontsteking baat bij validatie met menselijk weefsel. Hoewel in vitro en organoïde kweeksystemen op grote schaal worden gebruikt om menselijk weefsel te bestuderen, worden deze systemen beperkt door afwezige of onvolledige immuunreconstitutie en een gebrek aan verbinding met perifere vasculatuur5. Het gehumaniseerde xenograft huidtransplantatiemodel heeft tot doel therapeutische of biologische manipulatie van immuun- en niet-immuunroutes in menselijke weefsels in vivo mogelijk te maken.
Het xenograftmodel van de menselijke huid is gebruikt om huidfysiologie en farmacologie te bestuderen, immuunafstoting en -reacties te analyseren, menselijke huidkankermechanismen te ontleden en huidziekten en wondgenezing te begrijpen6. Hoewel het xenograftmodel van toepassing is op meerdere gebieden van huidonderzoek, heeft het een lagere doorvoer dan in vitro studies en mist het het gemak van genetische manipulatie dat wordt gebruikt in muismodellen. Tijdspunten binnen dit model kunnen variëren van weken tot maanden, en succesvol enten vereist geschikte faciliteiten en apparatuur om deze operaties uit te voeren. Het xenograftmodel biedt echter biologische en fysiologische context aan experimenten, terwijl organoïde kweeksystemen, zoals weefselexplantaten, vaak een groot aantal bewegende delen, zoals exogene signalen, met specifieke tijdsintervallen vereisen7. Daarom kan dit model het best worden gebruikt om bevindingen die in vitro en binnen muismodellen zijn waargenomen, verder te valideren, of voor werk dat anders biologisch niet haalbaar is. Het juiste gebruik van het xenograftmodel biedt een unieke kans om intact menselijk weefsel in vivo te bestuderen en te manipuleren.
Optimalisatie van het xenograft huidtransplantatiemodel is gebaseerd op tientallen jaren van onderzoek om de integriteit van het transplantaat in de loop van de tijd te behouden. Cruciaal voor dit proces is het gebruik van de niet-obese diabetische (NOD) -scid interleukine-2 gammaketenreceptor (NSG) muis, die B- en T-adaptieve immuuncellen, functionele NK-cellen mist en tekortkomingen heeft in macrofaag en dendritische cellen8. De immunodeficiënte aard van deze NSG-gastheren maakt de transplantatie van menselijke hematopoëtische cellen, van patiënten afgeleide kankers en huid 8,9,10 mogelijk. Ondanks deze immunosuppressieve gastheeromgeving is aanvullende onderdrukking van neutrofiele immuunresponsen bij muizen door anti-GR1-toediening noodzakelijk voor transplantaatsucces10. De belangrijkste obstakels bij het transplanteren van intact weefsel zijn infectie, afstoting en moeilijkheden bij het herstellen van de bloedtoevoer naar het transplantaat, wat soms leidt tot verlies van dermale en epidermale integriteit11. Technieken, waaronder toediening van anti-FR1 en het gebruik van de juiste graftdiepte, verbeteren de overleving van het transplantaat10. Zorgvuldige optimalisatie maakt het mogelijk om menselijke xenograft huidtransplantaties uit te voeren op NSG-muizen met een hoge efficiëntie en overlevingskansen, variërend van 90% -100%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De huidige studie werd goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met ucsf IACUC (AN191105-01H) en IRB (13-11307) protocollen. Huidmonsters, weggegooid als onderdeel van routinematige electieve chirurgische procedures, zoals hernia-reparatie, werden gebruikt voor het huidige onderzoek. De huidmonsters worden gedeïdentificeerd en gecertificeerd als Not Human Subjects Research of, als klinisch identificerende informatie vereist is voor downstream-analyses, hebben patiënten schriftelijke toestemming gegeven onder IRB-protocol 13-11307. Er werden geen andere inclusie- of exclusiecriteria gebruikt. NSG-muizen van beide geslachten, 8-10 weken oud, werden gebruikt in de studie. De muizen werden verkregen uit commerciële bronnen (zie Tabel van Materialen).
1. Verwerking van een monster van de menselijke huid van de donor
OPMERKING: Het menselijke huidmonster dat bij deze transplantatie werd gebruikt, was een groot monster verzameld uit de buik van een gezonde patiënt. Het monster moet ten minste 15 cm x 7,5 cm zijn. Groottebeperkingen kunnen van invloed zijn op het aantal muizen waarvoor huid beschikbaar is en de keuze van de graftgrootte.
- Houd het huidmonster bij koude temperaturen (op ijs; 4°C) voor bereiding en enting. Houd het monster vochtig in een gesloten monsterbeker met het gaas gedrenkt in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS).
OPMERKING: Het wordt niet aanbevolen om het huidmonster langer dan 2 dagen bij 4 °C te bewaren. Er bestaan echter meldingen waarbij de huidmonsters langer worden bewaard12.
LET OP: Behandel al het menselijk weefsel met standaard voorzorgsmaatregelen voor biologisch risico. - Bereid je voor om het menselijke huidmonster te dermatomen in een gesteriliseerde onderdruk weefselkweekkap op een gesteriliseerde dissectieplaat.
- Plaats het huidmonster, epidermiszijde naar boven, op het dissectiebord. Veeg de opperhuid af met een steriel alcoholvoorbereidingskussen en vervolgens met PBS.
- Pin de rand van de huid op zijn plaats met een 1,5 in het ontleden van T-pin (zie Materiaaltabel).
- Dermatome het huidmonster op een dikte van 400 μm, waarbij constante druk wordt uitgeoefend terwijl het naar voren snijdt in een hoek van 30 ° -45 °. Volg alle instrumentspecifieke instructies en veiligheidsmaatregelen (zie materiaaltabel).
OPMERKING: Voor details over de dermatome techniek, zie een eerder gepubliceerd rapport13. - Bereid een petrischaaltje van 100 mm x 20 mm door een steriel gaas gedrenkt in steriel PBS op de bodem van de schaal te plaatsen. Plaats de huid, opperhuidzijde naar boven, op het natte gaas.
- Sluit de plaatranden af en bedek deze met een semitransparante afdichtingsfolie (zie materiaaltabel) om ervoor te zorgen dat het monster niet verontreinigd is. Bewaar het monster bij 4°C voordat u gaat enten.
2. Pre-operatieve conditionering en voorbereiding
- Bereid de steriele instrumenten en een steriel chirurgisch station voor op enten. Gebruik geautoclaveerde papieren handdoeken als steriele oppervlakken voor het plaatsen van instrumenten en muizen.
OPMERKING: Muizen kunnen worden geënt na het spenen, maar worden bij voorkeur geënt tussen de leeftijd van 8-10 weken. Muizen van beide geslachten kunnen worden geënt. - Voer het chirurgische preparaat, zoals ontharing, uit in een gebied dat fysiek gescheiden is van het chirurgische station.
- Bereid de anti-GR1 (zie materiaaltabel) door deze te verdunnen tot 1 mg/ml steriele zoutoplossing. Doseer elke muis met 100 μg/100 μL van de anti-GR1-oplossing intraperitoneaal na anesthesie-inductie.
- Verdoof de muizen, één voor één, met isofluraan of andere institutioneel goedgekeurde anesthetica.
OPMERKING: Isofluraan moet worden gegeven in een concentratie van 3% -5% tijdens inductie. Zodra de muis onbeweeglijk is, verlaagt u de isofluraanconcentratie tot 1% -3% om effect te sorteren voor de duur van de operatie.- Controleer de muis op de juiste diepte van de anesthesie door de ademhalingsfrequentie, afwezigheid van teenknijprespons en de juiste roze kleuring van oren en mond te observeren.
LET OP: Gebruik geschikte anesthetische machines en opruimmethoden en vermijd blootstelling aan isofluraandampen.
- Controleer de muis op de juiste diepte van de anesthesie door de ademhalingsfrequentie, afwezigheid van teenknijprespons en de juiste roze kleuring van oren en mond te observeren.
- Breng de muis over op een verwarmingskussen of een andere warmtebron (zie Materiaaltabel).
- Dien de oogzalf toe door een kleine druppel zalf op het oog te deppen met een gehandschoende vinger.
- Dien analgetica Buprenorfine (0,08 mg/kg) en Carprofen (5 mg/kg) (zie Materiaaltabel) subcutaan toe door de huid te knijpen en te injecteren onder een hoek parallel aan het lichaam.
OPMERKING: Bereid de analgesie voor de behandeling voor volgens institutionele protocollen. Volg institutionele richtlijnen voor de selectie en toediening van pijnstillers. De in dit onderzoek gebruikte methode van analgesie wordt beschreven in stap 2.7 en aanvullende figuur 1. - Dien de anti-GR1 (bereid in stap 2.4) intraperitoneaal toe door de muis lichtjes bij de staart op te tillen, de buik bloot te stellen en in een hoek van 30° te injecteren met een insulinespuit van 1 ml (12,7 mm).
- Gebruik dierveilige elektrische tondeuses (zie Materiaaltabel) om de middelste en bovenste delen van de dorsale zijde van de muis te scheren.
- Verwijder al het haar en breng een royale hoeveelheid ontharingszalf aan op de geschoren huid gedurende 30 s tot 1 min.
- Veeg de ontharingszalf volledig weg met een papieren handdoek en PBS.
3. Transplantatieprocedure
- Breng de muis over naar een secundaire chirurgische locatie, weg van het ontharingsstation.
- Steriliseer de chirurgische plaats met de jodiumuitstrijkjesstok in een cirkelvormige beweging, beginnend in het midden en werkend naar de rand van het ontharende gebied.
- Leg een stuk steriele plasticfolie over de muis en knip een raam in het plastic dat iets groter is dan de grootte van het te enten gebied.
- Snijd een rechthoekig deel van de donorhuid van 10 mm x 10 mm om te worden geënt met een scalpel. Doe dit door de donorhuid stevig op zijn plaats te houden met de achterkant van de tang en met het scalpel langs de tang te snijden.
- Knip met behulp van de chirurgische schaar een rechthoekig gebied van de muizenhuid dat overeenkomt met de grootte van het donorhuidstuk, waardoor een transplantaatbed ontstaat. Gebruik een tang om de huid van het lichaam weg te trekken en knip de huid af met de schaar schuin van het lichaam om te voorkomen dat je diep in de facia snijdt.
- Plaats het stuk donorhuid, epidermiszijde naar boven, op het voorbereide transplantaatbed.
- Gebruik de achterkant van de tang om de huid te manipuleren en heen en weer te glijden totdat de donorhuid volledig plat tegen het transplantaatbed ligt.
- Voeg druppels chirurgische lijmweefsellijm toe (zie Materiaaltabel) waar de donorhuid de muizenhuid ontmoet en houd de muizen- en donorhuid samen met een tang gedurende 1-2 s zodat de lijm zich aan de weefsels hecht. Sluit de rand van de ent volledig af en laat de lijm volledig drogen.
- Verband de muizen (figuur 1) volgens de onderstaande stappen.
- Snijd een stuk vaseline gaas (zie Tabel van Materialen) groot genoeg om het entgebied volledig te bedekken.
- Bedek het transplantaat met het vaselinegaas en druk het gaas lichtjes tegen de huid met een tang.
- Snijd een strook van een transparant filmverband in de lengte, zodat de breedte groot genoeg is om de wond van de muis te bedekken.
- Druk het transparante filmverband, de kleefkant naar beneden, stevig op het gaas. Rol de muis snel om het verband volledig rond de romp te wikkelen, zodat het strak past zonder de ademhaling te belemmeren en alle ledematen vrij zijn voor beweging.
- Plaats de muis in een herstelkooi en controleer hem totdat hij alert is en beweegt. Zorg voor een warmtebron op een deel van de kooi gedurende ten minste 15 minuten na herstel.
OPMERKING: Van de dieren wordt verwacht dat ze binnen 1-5 minuten herstellen nadat ze in de herstelkooi zijn geplaatst.
- Huisvest de muizen afzonderlijk na het enten.
- Dien postoperatieve analgesie toe zoals vereist door institutionele protocollen.
OPMERKING: Buprenorfine (0,08 mg/kg) werd subcutaan toegediend 4-6 uur later tijdens dit onderzoek.
4. Postoperatieve ingrepen
- Injecteer 100 μL (100 μg) anti-GR1 intra-peritoneaal 4 dagen, 7 dagen en 11 dagen na het transplanteren om afstoting van transplantaten te voorkomen (aanvullende figuur 1).
- Vervang verbanden indien nodig en indien verwijderd door muizen.
- Herbandeer alle muizen op dag 7.
- Verwijder de verbanden op dag 14.
- Controleer de muizen op tekenen van transplantaatafstoting en systemische ontsteking (gewichtsverlies, haaruitval, extreme lethargie).
- Oogst de muizen tussen 3 en 6 weken na het transplantaat.
- Euthanaseer de muizen via regulator-gecontroleerde kooldioxide (CO2) toediening gevolgd door cervicale dislocatie.
OPMERKING: Volg de institutionele richtlijnen voor euthanasie. - Ontleed de huidtransplantaties van de muizen14. Plaats een deel van het transplantaat in 10% formaline gedurende 24 uur voordat paraffine wordt ingesloten en gesneden voor histologiekleuring9.
- Gehakt de huidtransplantaten met een schaar en verteerbaar enzymatisch met 250 IE/ml Collagenase IV en 0,02 mg/ml DNase in celkweekmedia 's nachts. Kleur de cellen voor oppervlakte- en intracellulaire markers volgens de eerder beschreven procedure14.
- Euthanaseer de muizen via regulator-gecontroleerde kooldioxide (CO2) toediening gevolgd door cervicale dislocatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Xenografts van de menselijke huid werden uitgevoerd op NSG-muizen in een superbarrièredierfaciliteit. Succes werd bepaald door de langdurige overleving van transplantaten en muizen en gedragsgezondheid van muizen na de transplantatie. Slechte overleving in de week na de operatie werd aanvankelijk waargenomen als de grootste barrière voor experimenteel succes, met tot 50% van de muizen die euthanasie nodig hadden. Het verbeteren van de steriele techniek en een betere ondersteuning van de lichaamstemperatuur van muizen tijdens en onmiddellijk na de operatie verhoogde de chirurgische overleving consequent tot meer dan 80% en vaak tot 90% -100% overleving. Hoewel de toevoeging van antibiotica in het drinkwater van de muis werd getest, werd niet vastgesteld om de resultaten te verbeteren en werd het stopgezet als een potentiële confounder van de resultaten. Succesvol geënte muizen moeten actief en gezond lijken in de dagen na de transplantatie. Muizen bewogen zich rond hun kooi, verkenden, bouwden nesten en aten en dronken zoals gewoonlijk. Een zieke muis kan lui lijken, niet-reactief en eet of drinkt mogelijk niet genoeg om zijn gewicht te behouden. Suppletie van lethargische muizen met soft-feed en orale hydratatie-opties kan helpen bij postoperatief herstel.
Een xenograft dat correct geneest, zal eerst korst en vervolgens herstellen binnen ongeveer 50 dagen na de operatie. Grafts kunnen na verloop van tijd samentrekken, maar blijven aanhangen rond de randen waar de donorhuid de huid van de muis ontmoet (figuur 2). Hoewel het schuren van transplantaten zou moeten verdwijnen, zullen grafts dikker en meer ontstoken blijven dan een gezonde menselijke huid (figuur 2). Overmatige samentrekking van grafts kan optreden, waardoor het beschikbare weefsel voor eindpuntanalyse wordt verminderd. Verwacht wordt dat het gebruik van grafts van consistente grootte en de juiste plaatsing van transplantaten dergelijke problemen zal verminderen. Alle grafts gedurende vijf onafhankelijke experimenten overleefden tot het moment van oogst, tot 50 dagen na de transplantatie.
Weefselanalyse kan immunohistochemie en eencellige analyses omvatten na enzymatische spijsvertering. Een deel van de huid werd verwerkt door nachtelijke vertering in 250 IE/ml Collagenase Type IV en 0,02 mg/ml DNase in celkweekmedia (zie Tabel van materialen), en gekleurd voor oppervlakte- en intracellulaire markers zoals eerder beschreven14. Analyse door flowcytometrie onthulde de aanhoudende aanwezigheid van menselijke immuuncellen in de meeste grafts, maar de tellingen varieerden tussen xenografts (figuur 3A). Figuur 3B toont representatieve resultaten van een succesvol transplantaat (links) en een transplantaat dat er niet in is geslaagd om menselijke immuuncellen te behouden (rechts). Analyse van hematoxyline en eosine-gekleurde (H &E) secties genomen vanuit het midden van het transplantaat onthulde intacte, niet-gedevitaliseerde huid bestaande uit menselijke dermis en epidermis voor zowel 35 als 50 dag tijdspunten (figuur 4).
Figuur 1: Methode voor het verbinden van muizen na de operatie. De muis is strak gewikkeld in vaseline gaas en transparant filmverband terwijl hij onder narcose is. (A) Vaseline gaas wordt geplaatst over een gebied dat iets groter is dan de chirurgische wond. (B) Het doorzichtige filmverband wordt bereid: een lange strook wordt iets breder gesneden dan het vaselinegaas. De achterkant die de kleefzijde van het transparante filmverband bedekt, wordt gedeeltelijk verwijderd. (C) De zelfklevende kant van de film wordt stevig tegen de achterkant van de muis gedrukt, waardoor er een centimeter ruimte overblijft aan de voorkant van de film. (D) De muis wordt op zijn rug gedraaid. Het overhangende voorste gedeelte van de film wordt op de muis gedrukt en de achterkant wordt verwijderd. (E) De muis is stevig ingepakt in de film en de resterende steun wordt verwijderd terwijl de muis wordt ingepakt. (F) De muis is met succes in het verband gewikkeld en zijn armen en benen zijn niet gehinderd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatieve beelden van getransplanteerde dieren van dag 10 tot 21 na de transplantatie. (A-C) Drie verschillende muizen met optimale transplantaties op dag 10. (D-E) Twee verschillende muizen met transplantaties op dag 21. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Immuuncelchimerisme in getransplanteerde huid. Flowcytometriegegevens van het herstel van menselijke immuuncellen uit xenografts. Gegevens worden afgesloten over de gebeurtenissen van singlet, live, menselijke CD45 + muis CD45-. (A) Aantal cellen (Live Human CD45+ Events) hersteld van twee onafhankelijke experimenten. (B) Representatieve plots van cd45+ immuuncelkleuring bij mens en muis in een succesvol transplantaat (links) in vergelijking met transplantaat met mislukt onderhoud van het menselijke immuuncompartiment (rechts). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Histologie van de getransplanteerde menselijke huid op dag 35 en 50. Getransplanteerde huid werd geoogst van muizen op dag 35 (A) of 50 (B), bewaard in 10% formaline, en paraffine-ingebed en gekleurd voor Hematoxyline en Eosine (H &E). (A) De epidermis vertoont matige hyperplasie (acanthosis), lichte hypergranulose en compacte orthokeratose. In de papillaire dermis zijn er af en toe verwijde en verstopte haarvaten. Melanocyten en melaninepigment zijn aanwezig in de basale laag van de opperhuid. De dermis is matig cellulair en bestaat uit mollige ovale fibroblasten met bleek syncytieel cytoplasma en verspreide lymfocyten. (B) De epidermis bestaat uit gestratificeerd plaveiselepitheel, mandgevlochten orthokeratose in de verhoornde laag en is van normale dikte. Melanocyten en melaninepigment zijn aanwezig in de basale laag van de opperhuid. De dermis vertoont ovale fibroblasten en licht verbeterde extracellulaire matrixafzetting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Tijdlijn van het protocol dat is aangenomen voor het xenograftonderzoek. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het huidtransplantatiemodel van de muis xenograft is een belangrijke techniek om immuunresponsen van de menselijke huid mechanistisch te ontleden in een in vivo setting14. Succesvolle huid xenotransplantaties zijn afhankelijk van een geschikte voorbereiding van muizen en huidmonsters en muizen en naleving van aseptische knaagdierchirurgiemethoden15. Snelle koeling en goede opslag van huidmonsters bij koude temperaturen in media (zoals steriele zoutoplossing) zijn belangrijk om de gezondheid van het weefsel te behouden voorafgaand aan transplantatie12. Verzameling van split-thickness monsters, met behulp van een instrument zoals een dermatoom, maakt consistentie in monsterdiepte tussen muizen mogelijk en verhoogt de toevoer van voedingsstoffen van de gastheer om de overleving van het transplantaat te verbeteren10. Verlies van transplantaatintegriteit met epidermale sloughing kan worden waargenomen, met name bij transplantaten van volledige dikte met verstoorde bloedtoevoer16. De overleving van muizen door en na de operatie wordt geholpen door steriele techniek, warmtevoorziening tijdens en na de operatie en technieken die de chirurgische tijd minimaliseren, zoals het gebruik van chirurgische lijm15. Toediening van anti-GR1 na transplantatie maakt onderdrukking van de resterende immuunresponsen van de muis in de immunodeficiënte gastheer mogelijk om de overleving van het transplantaat te bevorderen10. Deze methoden verhogen de kans op overleving van muizen en transplantaten tijdens het xenografttransplantatiemodel en verbeteren de experimentele aantallen en reproduceerbaarheid van het ene experiment naar het andere.
Hoewel uiterst nuttig, zijn er enkele belangrijke beperkingen aan het xenograft huidtransplantatiemodel, zoals aangetoond. Ten eerste bestaat het transplantaat in een inflammatoire omgeving, hoogstwaarschijnlijk secundair aan voorbijgaande ischemie en infiltratie van menselijk getransplanteerd weefsel met muizenmyeloïde cellen. Het weerspiegelt dus niet de menselijke huid in een stabiele toestand en weerspiegelt mogelijk niet volledig alle menselijke inflammatoire huidziekten10,14. Het bestuderen van menselijke ontstekingsaandoeningen door het enten van klinische biopsieën van de laesiehuid is een alternatieve strategie, maar beperkingen in het aantal beschikbare biopsieën en inconsistente controle van de entdiepte maken deze optie minder gunstig. Bovendien recapituleren xenografttransplantaties niet de menselijke perifere immuunarchitectuur. Het reconstitueren van de periferie van de muis met menselijke cellen kan ook kanttekeningen bevatten, omdat de lymfoïde structuur van de NSG-muis atrofisch is voorafgaand aan menselijke celtransplantatie; dit kan leiden tot voorkeurscelselectie in sommige instellingen10,17. Bovendien kunnen huidtransplantatie en immuuncelherstel van huidmonsters variëren van muis tot muis, zelfs als er geen behandeling is. Ten minste 10 replicaties per aandoening worden aanbevolen voor dit model om consistente verschillen tussen groepen waar te nemen. De juiste duur van de test moet mogelijk worden aangepast voor de experimentele vraag, aangezien transplantaatgenezing en re-vascularisatie optreden in de eerste weken na de transplantatie en het effect van interventies kan afhangen van het stadium van engraftment.
Ondanks deze nadelen blijft het menselijke xenograft huidtransplantatiemodel een van de weinige testen om de immuunresponsen van de menselijke huid in het intacte orgaan in vivo te bestuderen. Hoewel transgene muismodellen mechanistische paddissectie mogelijk kunnen maken, beperken verschillen in anatomie, immuuncelsamenstelling en dominante immuunroutes de vertaling naar menselijke ziekte1. Ex vivo kweek van van de mens afgeleide cellen, huidorganoïde modellen en explantstudies naar menselijk weefsel kunnen als alternatief worden gebruikt, maar zijn ook onderhevig aan beperkingen, waaronder verstoring van immuuncelnetwerken en uitgang van immuuncellen uit het intacte weefsel18,19. Daarom blijven de xenograft huidtransplantatiemodellen een belangrijke methode voor het bestuderen van therapeutische kandidaten en menselijke huidreacties op ontstekingen in een preklinische in vivo setting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
MDR is een van de oprichters van TRex Bio en Sitryx. MDR en MML ontvangen onderzoeksfinanciering van Sitryx, Q32 en TRex Bio.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door gesponsorde onderzoeksovereenkomsten van TRex Bio en subsidies van de NIH (1R01AR075864-01A1). JMM wordt ondersteund door de Cancer Research Society (subsidie 26005). We erkennen de Parnassus Flow Cytometry Core die gedeeltelijk wordt ondersteund door subsidies NIH P30 DK063720, S10 1S10OD021822-01 en S10 1S10OD018040-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher | SF100-20 | Fixative for histology |
| 3M Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | surgical glue |
| Alexa 700 CD45 monoclonal antibody (Clone 30F11) | Thermo Fischer | 56-0451-82 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Anti-GR1 clone RB6-8C5 | BioXcell | BE0075 | Anti-rejection |
| APC mouse anti-human CD25 (Clone 2A3) | BD Biosciences | 340939 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| APC-eFluor 780 anti-human HLA-DR (Clone LN3) | eBioscience | 47-9956-42 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Autoclave pouches | VWR | 89140-800 | For autoclaving tools and paper towels |
| Brilliant Violet 60 anti-human CD4 antibody (Clone OKT4 | Biolegend | 317438 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Brilliant Violet 65 anti-human CD8a antibody (Clone RPA-T8) | Biolegend | 301042 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Brilliant Violet 711 anti-human CD3 antibody (Clone OKT3) | Biolegend | 317328 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Buprenex 0.3 mg/mL | Covetrus | 059122 | Analgesia |
| Carprofen 50 mg/mL | Zoetis | NADA # 141-199 | Analgesia |
| Collagenase Type IV | Worthington | 4188 | Skin digestion |
| D42 Dermatome blade | Humeca | 5.D42BL10 | dermatome (1 blade per sample) |
| Dermatome D42 | Humeca | 4.D42 | dermatome |
| Disposable Scalpel | Bard-Parker | 371610 | skin preparation |
| Dissecting T-Pins; 1-1/2 inch, 1000/CS 1.5 | Cole-Parmer | UX-10915-03 | To pin skin specimen for dermatome |
| Dissection scissors | medicon | 02.04.10 | sample preparation and mouse dissection |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25-1G | Skin digestion |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent | eBioscience | 00-5521-00 | Flow cytometry analysis: Cell Fixation and Permeabilization |
| eFluor-450 FOXP3 monoclonal antibody (Clone PCH101) | eBioscience | 48-4776-42 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| Electric clippers | Kent | CL8787-KIT | hair removal |
| Epredia Shandon Instant Eosin | Fisher Scientific | 6765040 | H&E |
| Epredia Shandon Instant Hematoxylin | Fisher Scientific | 6765015 | H&E |
| FITC anti-human CD45 (Clone HI30) | Tonbo Biosciences | 35-0459-T100 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Forceps | medicon | 07.60.07 | sample preparation and mouse dissection |
| Gauze | Fisherbrand | 22-362-178 | Sample preparation |
| Heating lamp | Morganville Scientific | HL0100 | Post-surgical care |
| Heating pads 4" x 10" | Pristech | 20415 | Surgical heat supply |
| Insulin 1cc 12.7 mm syringes | BD | 329410 | drug administration |
| Isoflurane | United States Pharmacopeia (USP) | NDC 66794-013-25 | Anesthesia |
| Isoflurane machine | VetEquip | 911103 | Anesthesia |
| Nair for Men | Nair | 10022600588556 | hair removal |
| Neomycin and Polymyxin Bisulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic ointment | Dechra | NDC 17478-235-35 | eye ointment to prevent drying |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | The Jackson Laboratory | 005557 | Mice |
| Paper towels | Kleenex | 100848 | May be autoclaved for sterile surfaces |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | Semitransparent sealing film |
| PE mouse anti-human CD127 (Clone HIL-7R-M21) | BD Biosciences | 557938 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| PE-Cy-7 mouse anti-Ki-67 (Clone B56) | BD Biosciences | 561283 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| PerCP-eFluor-710 CD152 (CTLA-4) monoclonal antibody (Clone 14D3) | eBioscience | 46-1529-42 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| Permeabilization Buffer 10x | eBioscience | 00-8333-56 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining buffer |
| Petri Dish 150 mm | Corning | 430597 | Sample storage |
| Plastic Wrap | Fisherbrand | 22-305-654 | Site preparation |
| Providone-Iodine Swab stick | PDI | S41350 | Site sterilization |
| Soft-Feed and Oral Hydration (Napa Nectar) | Se Lab Group Inc | NC9066511 | For supplementing poorly recovering mice post-surgery |
| Specimen Collection Cups | Fisher Scientific | 22-150-266 | sample storage |
| Sterile alcohol prep pad | Fisherbrand | 22-363-750 | skin preparation |
| Sterile PBS | Gibco | 14190-144 | Media for sample storage |
| Sterile saline | Hospira | NDC 0409-4888-02 | For drug dilution |
| Tegaderm Film 4” x 43/4” | 3M | 1626 | transparent film wound dressing |
| Vaseline Petrolatum Gauze 3” x 8” | Kendall | 414600 | wound dressing |
| Violet 510 Ghost Dye | Tonbo Biosciences | 13-0870-T100 | Flow cytometry analysis: Viability dye |
References
- Zomer, H. D., Trentin, A. G. Skin wound healing in humans and mice: Challenges in translational research. Journal of Dermatological Science. 90 (1), 3-12 (2018).
- Wong, V. W., Sorkin, M., Glotzbach, J. P., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. Surgical approaches to create murine models of human wound healing. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 969618 (2011).
- Mestas, J., Hughes, C. C. W. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. The Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
- Pasparakis, M., Haase, I., Nestle, F. O. Mechanisms regulating skin immunity and inflammation. Nature Reviews Immunology. 14 (5), 289-301 (2014).
- Sun, H., Zhang, Y. -X., Li, Y. -M. Generation of skin organoids: potential opportunities and challenges. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 3176 (2021).
- Cristóbal, L., et al. Mouse models for human skin transplantation: a systematic review. Cells Tissues Organs. 210 (4), 250-259 (2021).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/γcnull mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Meraz, I. M., et al. An improved patient-derived xenograft humanized mouse model for evaluation of lung cancer immune responses. Cancer Immunology Research. 7 (8), 1267-1279 (2019).
- Racki, W. J., et al. NOD-scid IL2rgamma(null) mouse model of human skin transplantation and allograft rejection. Transplantation. 89 (5), 527-536 (2010).
- Meehan, G. R., et al. Developing a xenograft model of human vasculature in the mouse ear pinna. Scientific Reports. 10 (1), 2058 (2020).
- Gokkaya, A., et al. Skin graft storage in platelet rich plasma (PRP). Dermatologic Therapy. 33 (1), 13178 (2020).
- Humeca, B. V. The Humeca D42 and D80 battery operated cordless dermatomes. , Available from: https://www.youtube.com/watch?v=YCRowX-TdA (2021).
- Rodriguez, R. S., et al. Memory regulatory T cells reside in human skin. The Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1027-1036 (2014).
- Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A.
- Karim, A. S., et al. Evolution of ischemia and neovascularization in a murine model of full thickness human wound healing. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 28 (6), 812-822 (2020).
- Ali, N., et al. Xenogeneic graft-versus-host-disease in NOD-scid IL-2Rγnull mice display a T-effector memory phenotype. PloS One. 7 (8), 44219 (2012).
- Souci, L., Denesvre, C.
- Holtkamp, S. J., et al. Circadian clocks guide dendritic cells into skin lymphatics. Nature Immunology. 22 (11), 1375-1381 (2021).
