Summary
Den nåværende protokollen beskriver hvordan man poder menneskelig hud på ikke-overvektige diabetiske (NOD) -scid interleukin-2 gammakjedereseptor (NSG) mus. En detaljert beskrivelse av preparatet av menneskelig hud for transplantasjon, forberedelse av mus for transplantasjon, transplantasjon av menneskelig hud med delt tykkelse og gjenopprettingsprosedyre etter transplantasjon er inkludert i rapporten.
Abstract
Den humane hud xenograftmodellen, der human donorhud transplanteres på en immundefekt musevert, er et viktig alternativ for translasjonsforskning innen hudimmunologi. Murine og menneskelig hud varierer vesentlig i anatomi og immuncellesammensetning. Derfor har tradisjonelle musemodeller begrensninger for dermatologisk forskning og narkotikaforskning. Imidlertid er vellykkede xenotransplantasjoner teknisk utfordrende og krever optimal prøve- og musetransplantasjonsstedforberedelse for transplantat- og vertsoverlevelse. Den nåværende protokollen gir en optimalisert teknikk for å transplantere menneskelig hud på mus og diskuterer nødvendige hensyn for nedstrøms eksperimentelle mål. Denne rapporten beskriver riktig forberedelse av en hudprøve fra en menneskelig donor, montering av et kirurgisk oppsett, forberedelse av mus og operasjonssted, hudtransplantasjon og overvåking etter kirurgi. Overholdelse av disse metodene muliggjør vedlikehold av xenotransplantater i over 6 uker etter operasjonen. Teknikkene som er skissert nedenfor tillater maksimal podeeffektivitet på grunn av utvikling av tekniske kontroller, steril teknikk og pre- og postkirurgisk kondisjonering. Passende utførelse av xenograftmodellen resulterer i langlivede humane hudtransplantatprøver for eksperimentell karakterisering av human hud og preklinisk testing av forbindelser in vivo.
Introduction
Musemodeller brukes ofte til å gjøre slutninger om menneskelig biologi og sykdom, delvis på grunn av deres eksperimentelle reproduserbarhet og kapasitet for genetisk manipulasjon. Musefysiologi rekapitulerer imidlertid ikke humane organsystemer fullstendig, spesielt hud, og har derfor begrensninger for bruk som preklinisk modell i legemiddelutvikling1. Anatomiske forskjeller mellom mus og menneskelig hud inkluderer forskjeller i epiteltykkelser og arkitektur, mangel på murine ekkrine svettekjertler og variasjoner i hårsykling2. Videre er både immunsystemets medfødte og adaptive armer divergerende mellom de to artene3. Mushud inneholder en unik immunpopulasjon av dendritiske epidermale T-celler (DETCs), har en høyere overflod av dermale γδ T-celler, og varierer i immuncelleundergruppelokalisering sammenlignet med humant vev4. Derfor har eksperimentelle funn angående menneskelig hudbiologi og betennelse nytte av validering med menneskelig vev. Mens in vitro og organoide kultursystemer er mye brukt verktøy for å studere menneskelig vev, er disse systemene begrenset av fraværende eller ufullstendig immunrekonstituering og mangel på forbindelse til perifer vaskulatur5. Den humaniserte xenograft hudtransplantasjonsmodellen tar sikte på å tillate terapeutisk eller biologisk manipulering av immun- og ikke-immunveier i humant vev in vivo.
Den menneskelige hud xenograft-modellen har blitt brukt til å studere hudfysiologi og farmakologi, analysere immunavvisning og responser, dissekere menneskelige hudkreftmekanismer og forstå hudsykdommer og sårheling6. Selv om den gjelder for flere felt av hudforskning, har xenograft-modellen lavere gjennomstrømning enn in vitro-studier og mangler den enkle genetiske manipulasjonen som brukes i musemodeller. Tidspunkter innenfor denne modellen kan variere fra uker til måneder, og vellykket poding krever passende fasiliteter og utstyr for å utføre disse operasjonene. Xenograft-modellen leverer imidlertid biologisk og fysiologisk kontekst til eksperimenter, mens organoide kultursystemer, som vevseksplanter, ofte krever replikering av et mylder av bevegelige deler, for eksempel eksogene signaler, med bestemte tidsintervaller7. Derfor er denne modellen best utnyttet for ytterligere å validere funn observert in vitro og i musemodeller, eller for arbeid som ellers ikke er biologisk mulig. Hensiktsmessig bruk av xenograftmodellen gir en unik mulighet til å studere og manipulere intakt humant vev in vivo.
Optimalisering av xenograft hudtransplantasjonsmodellen har stolt på flere tiår med forskning for å bevare transplantatintegritet over tid. Kritisk for denne prosessen er å bruke ikke-overvektige diabetiker (NOD) -scid interleukin-2 gammakjedereseptor (NSG) mus, som mangler B- og T-adaptive immunceller, funksjonelle NK-celler, og har mangler i makrofag og dendrittiske celler8. Den immunsviktende naturen til disse NSG-vertene tillater transplantasjon av humane hematopoietiske celler, pasientavledede kreftformer og hud 8,9,10. Til tross for dette immunsuppressive vertsmiljøet er ytterligere undertrykkelse av muse-nøytrofile immunresponser ved anti-GR1-administrering nødvendig for transplantatsuksess10. De viktigste hindringene i transplantasjon av intakt vev er infeksjon, avvisning og vanskeligheter med å gjenopprette blodstrømmen til transplantatet, noe som noen ganger fører til tap av dermal og epidermal integritet11. Teknikker inkludert administrering av anti-FR1 og bruk av passende transplantatdybde forbedrer transplantatoverlevelse10. Grundig optimalisering gjør det mulig å utføre humane xenograft hudtransplantasjoner på NSG-mus med høy effektivitet og overlevelse, fra 90% -100%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien ble godkjent og utført i samsvar med UCSF IACUC (AN191105-01H) og IRB (13-11307) protokoller. Hudprøver, kassert som en del av rutinemessige elektive kirurgiske prosedyrer, som brokkreparasjon, ble brukt til denne forskningen. Hudprøvene er enten avidentifisert og sertifisert som Not Human Subjects Research eller, hvis klinisk identifiserende informasjon er nødvendig for nedstrømsanalyser, har pasienter gitt skriftlig samtykke i henhold til IRB-protokoll 13-11307. Ingen andre inklusjons- eller eksklusjonskriterier ble benyttet. NSG-mus av begge kjønn, 8-10 ukers alder, ble ansatt i studien. Musene ble hentet fra kommersielle kilder (se Tabell over materialer).
1. Behandling av donors menneskelige hudprøve
MERK: Den menneskelige hudprøven som ble brukt i denne transplantasjonen var en stor prøve samlet fra magen til en sunn pasient. Prøven må være minst 15 cm x 7,5 cm. Størrelsesbegrensninger kan påvirke antall mus som huden er tilgjengelig for, og valget av transplantatstørrelse.
- Hold hudprøven ved kalde temperaturer (på is; 4 °C) før tilberedning og poding. Hold prøven fuktig i en lukket prøveoppsamlingskopp med gasbindet dynket i fosfatbufret saltvann (PBS).
MERK: Det anbefales ikke å oppbevare hudprøven ved 4 °C i mer enn 2 dager. Det finnes imidlertid rapporter der hudprøvene lagres over lengre tid12.
FORSIKTIG: Behandle alt humant vev med standard biohazard forholdsregler. - Forbered deg på å dermatome den menneskelige hudprøven i en sterilisert undertrykksvevskulturhette på et sterilisert disseksjonsbrett.
- Plasser hudprøven, med epidermissiden opp, på disseksjonstavlen. Tørk epidermis med en steril alkohol prep pad og deretter med PBS.
- Fest den nærmere kanten av huden på plass med en 1,5 i dissekere T-pin (se tabell over materialer).
- Dermatomer hudprøven med en tykkelse på 400 μm, og trykk jevnt mens du skjærer fremover i en 30 °-45 ° vinkel. Følg alle instrumentspesifikke instruksjoner og sikkerhetstiltak (se materialtabell).
MERK: For detaljer om dermatomteknikken, se en tidligere publisert rapport13. - Tilbered en 100 mm x 20 mm petriskål ved å plassere en steril gasbind dynket i steril PBS i bunnen av retten. Plasser huden, epidermis side opp, på vått gasbind.
- Forsegl og dekk platekantene med en halvtransparent tetningsfilm (se materialtabell) for å sikre at prøven ikke er forurenset. Oppbevar prøven ved 4 ° C før podning.
2. Kondisjonering og forberedelse før kirurgi
- Forbered de sterile instrumentene og en steril kirurgisk stasjon for podning. Bruk autoklerte papirhåndklær som sterile overflater for plassering av instrument og mus.
MERK: Mus kan bli podet etter avvenning, men er fortrinnsvis podet mellom 8-10 ukers alder. Mus av begge kjønn kan bli podet. - Utfør det kirurgiske preparatet, for eksempel hårfjerning, i et område som er fysisk skilt fra kirurgisk stasjon.
- Klargjør anti-GR1 (se materialtabell) ved å fortynne den til 1 mg/ml i steril saltvann. Dose hver mus med 100 μg/100 μL av anti-GR1-oppløsningen intraperitonealt etter anestesiinduksjon.
- Bedøv musene, en om gangen, med isofluran eller andre institusjonelt godkjente anestetika.
MERK: Isofluran må gis i en konsentrasjon på 3%-5 % under induksjon. Når musen er immobil, senk isoflurankonsentrasjonen til 1% -3% for effekt i løpet av operasjonen.- Overvåk musen for passende anestesidybde ved å observere respirasjonsfrekvens, fravær av tå-klemmerespons og passende rosa farge på ører og munn.
FORSIKTIG: Bruk egnet bedøvelsesmaskiner og rensemetoder, og unngå eksponering for isoflurandamp.
- Overvåk musen for passende anestesidybde ved å observere respirasjonsfrekvens, fravær av tå-klemmerespons og passende rosa farge på ører og munn.
- Overfør musen til en varmepute eller en annen varmekilde (se Materialtabell).
- Administrer oftalmisk salve ved å dabbe en liten dråpe salve på øyet med en hansket finger.
- Administrer analgetika buprenorfin (0,08 mg / kg) og karprofen (5 mg / kg) (se materialtabell) subkutant ved å klemme huden og injisere i en vinkel parallelt med kroppen.
MERK: Forbered forbehandlingsanalgesi etter institusjonelle protokoller. Følg institusjonelle retningslinjer for utvelgelse og administrering av analgetika. Metoden for analgesi brukt i denne studien er skissert i trinn 2.7 og supplerende figur 1. - Administrer anti-GR1 (fremstilt i trinn 2.4) intraperitonealt ved å løfte musen litt i halen, eksponere magen og injisere i en 30° vinkel ved hjelp av en insulin 1 ml (12,7 mm) sprøyte.
- Bruk dyresikre elektriske klippere (se materialtabell) til å barbere midtre og øvre del av den dorsale siden av musen.
- Fjern alt håret og påfør en sjenerøs mengde hårfjerningssalve på den barberte huden i 30 til 1 min.
- Tørk helt bort hårfjerningssalve med et papirhåndkle og PBS.
3. Transplantasjon prosedyre
- Overfør musen til et sekundært kirurgisk sted, vekk fra hårfjerningsstasjonen.
- Steriliser operasjonsstedet med jodpinnepinnen i en sirkulær bevegelse, start i midten og arbeid ut mot kanten av det depilerte området.
- Legg et stykke sterilt plastfolie over musen og kutt et vindu i plasten litt større enn størrelsen på området som skal podes.
- Klipp en rektangelformet 10 mm x 10 mm del av donorhuden som skal podes med en skalpell. Gjør dette ved å holde donorskinnet godt på plass med baksiden av tangen og kutte sammen med tangen med skalpellen.
- Bruk den kirurgiske saksen, klipp et rektangulært område av musehud som samsvarer med størrelsen på donorhudstykket, og skaper en transplantatseng. Bruk tang for å trekke huden bort fra kroppen, og klipp huden med saksen vinklet bort fra kroppen for å unngå å kutte dypt inn i faciaen.
- Plasser donorskinnstykket, med epidermissiden opp, på den forberedte transplantatsengen.
- Bruk baksiden av tangen, manipuler huden, skyv frem og tilbake til donorhuden ligger helt flatt mot transplantatsengen.
- Tilsett dråper kirurgisk limvevlim (se materialtabell) der donorhuden møter museskinnet og hold musen og donorskinnet sammen med tang i 1-2 s slik at limet fester seg til vevet. Forsegl kanten av transplantatet helt og la limet tørke helt.
- Bandasjer musene (figur 1) ved å følge trinnene nedenfor.
- Klipp et stykke petrolatumgass (se materialtabell) som er stort nok til å dekke graftområdet helt.
- Dekk transplantatet med petrolatumgassen, og trykk gasbindet lett mot huden ved hjelp av tang.
- Klipp en stripe av en gjennomsiktig film dressing på langs slik at bredden er stor nok til å dekke musens sår.
- Trykk godt på den gjennomsiktige filmdressingen, selvklebende side ned, over gasbindet. Rull musen raskt for å vikle bandasjen helt rundt overkroppen, slik at den passer tett uten å hindre respirasjon og alle lemmer er fri for bevegelse.
- Plasser musen i et gjenopprettingsbur og overvåk den til den er våken og beveger seg rundt. Gi en varmekilde på en del av buret i minst 15 minutter etter utvinning.
MERK: Dyrene forventes å komme seg innen 1-5 minutter etter at de er plassert i gjenopprettingsburet.
- Enkeltvis huser musene etter poding.
- Administrer postkirurgisk analgesi som påkrevd av institusjonelle protokoller.
Buprenorfin (0,08 mg/kg) ble gitt subkutant 4-6 timer senere i denne studien.
4. Post-kirurgiske prosedyrer
- Injiser 100 μL (100 μg) anti-GR1 intra-peritonealt etter 4 dager, 7 dager og 11 dager etter transplantat for å forhindre avstøtning av transplantat (supplerende figur 1).
- Bytt bandasjer etter behov og hvis de fjernes av mus.
- Rebandasje alle musene på dag 7.
- Fjern bandasjene på dag 14.
- Overvåk musene for tegn på avvisning av transplantat og systemisk betennelse (vekttap, hårtap, ekstrem sløvhet).
- Høst musene mellom 3 og 6 uker etter transplantat.
- Avlive musene via regulatorstyrt karbondioksid (CO2) administrasjon etterfulgt av cervikal dislokasjon.
MERK: Følg institusjonelle retningslinjer for eutanasi. - Disseker hudtransplantatene fra musene14. Plasser en del av transplantatet i 10% formalin i 24 timer før parafininnstøping og seksjonering for histologifarging9.
- Hakk hudtransplantatene med saks og fordøye enzymatisk med 250 IE/ml kollagenase IV og 0,02 mg/ml DNase i cellekulturmedier over natten. Flekk cellene for overflate- og intracellulære markører etter den tidligere beskrevne prosedyren14.
- Avlive musene via regulatorstyrt karbondioksid (CO2) administrasjon etterfulgt av cervikal dislokasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Xenotransplantater fra human hud ble utført på NSG-mus inne i et superbarriereanlegg for dyr. Suksess ble definert av den langvarige transplantat- og museoverlevelsen og atferdshelsen til mus etter transplantasjon. Dårlig overlevelse i løpet av uken etter operasjonen ble opprinnelig observert som den største barrieren for eksperimentell suksess, med opptil 50% av musene som krever eutanasi. Forbedring av steril teknikk og bedre støtte av musens kroppstemperatur under og umiddelbart etter operasjonen økte kirurgisk overlevelse konsekvent til over 80% og ofte til 90% -100% overlevelse. Mens tilsetningen av antibiotika i musens drikkevann ble forsøkt, var det ikke fast bestemt på å forbedre resultatene og ble avviklet som en potensiell konfundering av resultatene. Vellykket podede mus skal virke aktive og sunne i dagene etter transplantasjonen. Mus beveget seg rundt buret sitt, utforsket, bygde reir og spiste og drakk som vanlig. En uvel mus kan virke lat, ikke-reaktiv, og kan ikke spise eller drikke nok til å opprettholde vekten. Tilskudd av sløve mus med myk mat og oral hydrering alternativer kan hjelpe post-kirurgisk utvinning.
En xenograft som helbreder riktig, vil først scab og deretter gjenopprette innen ca 50 dager etter operasjonen. Transplantater kan trekke seg sammen over tid, men forbli festet rundt kantene der donorhuden møter musens hud (figur 2). Mens transplantatskorping bør avta, vil transplantater forbli tykkere og mer betent enn sunn menneskelig hud (figur 2). Overdreven sammentrekning av transplantater kan forekomme, noe som reduserer tilgjengelig vev for endepunktanalyse. Bruk av transplantater av konsekvent størrelse og passende plassering av transplantater forventes å redusere slike problemer. Alle transplantater gjennom fem uavhengige eksperimenter overlevde til høsttidspunktet, opptil 50 dager etter transplantasjonen.
Vevsanalyse kan omfatte immunhistokjemi og encelleanalyser etter enzymatisk fordøyelse. En del av huden ble behandlet ved nattlig fordøyelse i 250 IE / ml kollagenase type IV og 0,02 mg / ml DNase i cellekulturmedier (se materialtabell), og farget for overflate- og intracellulære markører som tidligere beskrevet14. Analyse ved flowcytometri viste vedvarende tilstedeværelse av humane immunceller i de fleste transplantater, men tellingene varierte mellom xenotransplantater (figur 3A). Figur 3B viser representative resultater fra et vellykket transplantat (venstre) og et som ikke har klart å opprettholde humane immunceller (høyre). Analyse av hematoksylin- og eosinfargede (H&E) seksjoner tatt fra midten av transplantatet viste intakt, ikke-devitalisert hud sammensatt av human dermis og epidermis for både 35 og 50 dagers tidspunkter (figur 4).
Figur 1: Metode for bandasjering av mus etter operasjon. Musen er pakket tett inn i petrolatum gasbind og gjennomsiktig film dressing under anestesi. (A) Petrolatumgass er plassert over et område som er litt større enn operasjonssåret. (B) Den gjennomsiktige filmdressingen er forberedt: en lang stripe er kuttet litt bredere enn petrolatumgassen. Underlaget som dekker limsiden av den gjennomsiktige filmdressingen fjernes delvis. (C) Den selvklebende siden av filmen presses godt mot baksiden av musen, og etterlater en tomme plass på forsiden av filmen. (D) Musen er slått på ryggen. Den overhengende fremre delen av filmen presses på musen, og baksiden fjernes. (E) Musen er tett pakket inn i filmen, og den gjenværende støtten fjernes når musen pakkes inn. (F) Musen er vellykket innpakket i dressingen, og armer og ben er ubegrenset. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representative bilder fra transplanterte dyr fra dag 10 til 21 etter transplantasjon. (A-C) Tre forskjellige mus med optimale transplantasjoner på dag 10. (D-E) To forskjellige mus med transplantasjoner på dag 21. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Immuncellekimærisme i podet hud. Flowcytometridata for gjenoppretting av humane immunceller fra xenotransplantater. Data er inngjerdet på hendelsene til singlet, live, human CD45+ mus CD45-. (A) Antall celler (Live Human CD45+ Events) gjenfunnet fra to uavhengige eksperimenter. (B) Representative plott av human og mus CD45+ immuncellefarging i et vellykket transplantat (venstre) sammenlignet med transplantat med mislykket vedlikehold av det menneskelige immunrommet (høyre). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Histologi av podet menneskehud på dag 35 og 50. Podet hud ble høstet fra mus på dag 35 (A) eller 50 (B), konservert i 10% formalin, og parafin-innebygd og farget for Hematoxylin og Eosin (H &E). (A) Epidermis viser moderat hyperplasi (acanthosis), lett hypergranulose og kompakt orthokeratose. I papillær dermis er det sporadiske dilaterte og overbelastede kapillærer. Melanocytter og melaninpigment er tilstede i basallaget av epidermis. Dermis er moderat cellulær og består av klumpete ovale fibroblaster med blek syncytial cytoplasma og spredte lymfocytter. (B) Epidermis består av stratifisert plateepitel, kurvvevd orthokeratose i cornified lag, og er av normal tykkelse. Melanocytter og melaninpigment er tilstede i basallaget av epidermis. Dermis viser ovale fibroblaster og litt forbedret ekstracellulær matriksavsetning. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur 1: Tidslinje for protokollen som ble vedtatt for xenograftstudien. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mus xenograft hudtransplantasjonsmodell er en nøkkelteknikk for mekanistisk dissekering av menneskelige hudimmunresponser i en in vivo-innstilling 14. Vellykkede hud xenograft transplantasjoner stole på riktig forberedelse av mus og hudprøver og mus og overholdelse av aseptiske gnagere kirurgi metoder15. Rask nedkjøling og riktig lagring av hudprøver ved kalde temperaturer i medier (for eksempel steril saltvann) er viktig for å sikre fortsatt vevshelse før transplantasjon12. Innsamling av prøver med delt tykkelse, ved hjelp av et instrument som en dermatom, tillater konsistens i prøvedybde mellom mus og øker tilførselen av næringsstoffer fra verten for å forbedre transplantatoverlevelsen10. Tap av transplantatintegritet med epidermal sloughing kan observeres, spesielt i fulltykkelsestransplantater med forstyrret blodtilførsel16. Museoverlevelse gjennom og etter operasjonen er hjulpet av steril teknikk, tilførsel av varme under og etter operasjonen, og teknikker som minimerer kirurgisk tid, for eksempel bruk av kirurgisk lim15. Administrasjon av anti-GR1 etter transplantasjon muliggjør undertrykkelse av de gjenværende museimmunresponsene i immunsviktverten for å fremme transplantatoverlevelse10. Disse metodene øker sannsynligheten for muse- og transplantatoverlevelse under xenografttransplantasjonsmodellen og forbedrer eksperimentelle tall og reproduserbarhet fra ett eksperiment til det neste.
Selv om det er ekstremt nyttig, er det noen viktige begrensninger for xenograft hudtransplantasjonsmodellen, som vist. For det første eksisterer transplantatet i et inflammatorisk miljø, mest sannsynlig sekundært til forbigående iskemi og infiltrasjon av humant podet vev med murine myeloide celler. Dermed reflekterer den ikke menneskelig hud i jevn tilstand og kan ikke fullt ut gjenspeile alle menneskelige inflammatoriske hudsykdommer10,14. Å studere humane inflammatoriske lidelser ved å pode kliniske biopsier fra lesjonshud er en alternativ strategi, men begrensninger i antall biopsier tilgjengelig og inkonsekvent kontroll av podedybde gjør dette alternativet mindre gunstig. I tillegg rekapitulerer ikke xenografttransplantasjoner den humane perifere immunarkitekturen. Rekonstituering av museperiferien med humane celler kan også bære forbehold, da NSG-musens lymfoide struktur er atrofisk før human celletransplantasjon; Dette kan føre til fortrinnsrett cellevalg i noen innstillinger10,17. I tillegg kan hudtransplantasjon og immuncellegjenoppretting fra hudprøver variere fra mus til mus, selv i fravær av behandling. Minst 10 replikasjoner per tilstand anbefales for denne modellen for å observere konsistente forskjeller mellom grupper. Den passende varigheten av analysen må kanskje justeres for det eksperimentelle spørsmålet, da transplantatheling og re-vaskularisering skjer i løpet av de første ukene etter transplantasjon, og effekten av intervensjoner kan avhenge av stadium av engraftment.
Til tross for disse ulempene er den humane xenograft-hudtransplantasjonsmodellen fortsatt en av de få analysene som studerer humane hudimmunresponser i det intakte organet in vivo. Mens transgene musemodeller kan tillate mekanistisk veidisseksjon, begrenser forskjeller i anatomi, immuncellesammensetning og dominerende immunveier oversettelse til menneskelig sykdom1. Ex vivo-kultur av human-avledede celler, hudorganoidmodeller og humane vevseksplantstudier kan alternativt brukes, men er også underlagt begrensninger, inkludert forstyrrelse av immuncellenettverk og utgang av immunceller fra intakt vev18,19. Derfor er xenograft-hudtransplantasjonsmodellene fortsatt en nøkkelmetode for å studere terapeutiske kandidater og menneskelige hudresponser på betennelse i en preklinisk in vivo-setting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
MDR er grunnlegger av TRex Bio og Sitryx. MDR og MML mottar forskningsmidler fra Sitryx, Q32 og TRex Bio.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble delvis finansiert av sponsede forskningsavtaler fra TRex Bio og tilskudd fra NIH (1R01AR075864-01A1). JMM er støttet av Kreftforskningsforeningen (bevilgning 26005). Vi anerkjenner Parnassus Flow Cytometry Core støttet delvis av tilskuddene NIH P30 DK063720, S10 1S10OD021822-01 og S10 1S10OD018040-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher | SF100-20 | Fixative for histology |
| 3M Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | surgical glue |
| Alexa 700 CD45 monoclonal antibody (Clone 30F11) | Thermo Fischer | 56-0451-82 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Anti-GR1 clone RB6-8C5 | BioXcell | BE0075 | Anti-rejection |
| APC mouse anti-human CD25 (Clone 2A3) | BD Biosciences | 340939 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| APC-eFluor 780 anti-human HLA-DR (Clone LN3) | eBioscience | 47-9956-42 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Autoclave pouches | VWR | 89140-800 | For autoclaving tools and paper towels |
| Brilliant Violet 60 anti-human CD4 antibody (Clone OKT4 | Biolegend | 317438 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Brilliant Violet 65 anti-human CD8a antibody (Clone RPA-T8) | Biolegend | 301042 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Brilliant Violet 711 anti-human CD3 antibody (Clone OKT3) | Biolegend | 317328 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Buprenex 0.3 mg/mL | Covetrus | 059122 | Analgesia |
| Carprofen 50 mg/mL | Zoetis | NADA # 141-199 | Analgesia |
| Collagenase Type IV | Worthington | 4188 | Skin digestion |
| D42 Dermatome blade | Humeca | 5.D42BL10 | dermatome (1 blade per sample) |
| Dermatome D42 | Humeca | 4.D42 | dermatome |
| Disposable Scalpel | Bard-Parker | 371610 | skin preparation |
| Dissecting T-Pins; 1-1/2 inch, 1000/CS 1.5 | Cole-Parmer | UX-10915-03 | To pin skin specimen for dermatome |
| Dissection scissors | medicon | 02.04.10 | sample preparation and mouse dissection |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25-1G | Skin digestion |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent | eBioscience | 00-5521-00 | Flow cytometry analysis: Cell Fixation and Permeabilization |
| eFluor-450 FOXP3 monoclonal antibody (Clone PCH101) | eBioscience | 48-4776-42 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| Electric clippers | Kent | CL8787-KIT | hair removal |
| Epredia Shandon Instant Eosin | Fisher Scientific | 6765040 | H&E |
| Epredia Shandon Instant Hematoxylin | Fisher Scientific | 6765015 | H&E |
| FITC anti-human CD45 (Clone HI30) | Tonbo Biosciences | 35-0459-T100 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Forceps | medicon | 07.60.07 | sample preparation and mouse dissection |
| Gauze | Fisherbrand | 22-362-178 | Sample preparation |
| Heating lamp | Morganville Scientific | HL0100 | Post-surgical care |
| Heating pads 4" x 10" | Pristech | 20415 | Surgical heat supply |
| Insulin 1cc 12.7 mm syringes | BD | 329410 | drug administration |
| Isoflurane | United States Pharmacopeia (USP) | NDC 66794-013-25 | Anesthesia |
| Isoflurane machine | VetEquip | 911103 | Anesthesia |
| Nair for Men | Nair | 10022600588556 | hair removal |
| Neomycin and Polymyxin Bisulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic ointment | Dechra | NDC 17478-235-35 | eye ointment to prevent drying |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | The Jackson Laboratory | 005557 | Mice |
| Paper towels | Kleenex | 100848 | May be autoclaved for sterile surfaces |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | Semitransparent sealing film |
| PE mouse anti-human CD127 (Clone HIL-7R-M21) | BD Biosciences | 557938 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| PE-Cy-7 mouse anti-Ki-67 (Clone B56) | BD Biosciences | 561283 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| PerCP-eFluor-710 CD152 (CTLA-4) monoclonal antibody (Clone 14D3) | eBioscience | 46-1529-42 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| Permeabilization Buffer 10x | eBioscience | 00-8333-56 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining buffer |
| Petri Dish 150 mm | Corning | 430597 | Sample storage |
| Plastic Wrap | Fisherbrand | 22-305-654 | Site preparation |
| Providone-Iodine Swab stick | PDI | S41350 | Site sterilization |
| Soft-Feed and Oral Hydration (Napa Nectar) | Se Lab Group Inc | NC9066511 | For supplementing poorly recovering mice post-surgery |
| Specimen Collection Cups | Fisher Scientific | 22-150-266 | sample storage |
| Sterile alcohol prep pad | Fisherbrand | 22-363-750 | skin preparation |
| Sterile PBS | Gibco | 14190-144 | Media for sample storage |
| Sterile saline | Hospira | NDC 0409-4888-02 | For drug dilution |
| Tegaderm Film 4” x 43/4” | 3M | 1626 | transparent film wound dressing |
| Vaseline Petrolatum Gauze 3” x 8” | Kendall | 414600 | wound dressing |
| Violet 510 Ghost Dye | Tonbo Biosciences | 13-0870-T100 | Flow cytometry analysis: Viability dye |
References
- Zomer, H. D., Trentin, A. G. Skin wound healing in humans and mice: Challenges in translational research. Journal of Dermatological Science. 90 (1), 3-12 (2018).
- Wong, V. W., Sorkin, M., Glotzbach, J. P., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. Surgical approaches to create murine models of human wound healing. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 969618 (2011).
- Mestas, J., Hughes, C. C. W. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. The Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
- Pasparakis, M., Haase, I., Nestle, F. O. Mechanisms regulating skin immunity and inflammation. Nature Reviews Immunology. 14 (5), 289-301 (2014).
- Sun, H., Zhang, Y. -X., Li, Y. -M. Generation of skin organoids: potential opportunities and challenges. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 3176 (2021).
- Cristóbal, L., et al. Mouse models for human skin transplantation: a systematic review. Cells Tissues Organs. 210 (4), 250-259 (2021).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/γcnull mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Meraz, I. M., et al. An improved patient-derived xenograft humanized mouse model for evaluation of lung cancer immune responses. Cancer Immunology Research. 7 (8), 1267-1279 (2019).
- Racki, W. J., et al. NOD-scid IL2rgamma(null) mouse model of human skin transplantation and allograft rejection. Transplantation. 89 (5), 527-536 (2010).
- Meehan, G. R., et al. Developing a xenograft model of human vasculature in the mouse ear pinna. Scientific Reports. 10 (1), 2058 (2020).
- Gokkaya, A., et al. Skin graft storage in platelet rich plasma (PRP). Dermatologic Therapy. 33 (1), 13178 (2020).
- Humeca, B. V. The Humeca D42 and D80 battery operated cordless dermatomes. , Available from: https://www.youtube.com/watch?v=YCRowX-TdA (2021).
- Rodriguez, R. S., et al. Memory regulatory T cells reside in human skin. The Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1027-1036 (2014).
- Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A.
- Karim, A. S., et al. Evolution of ischemia and neovascularization in a murine model of full thickness human wound healing. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 28 (6), 812-822 (2020).
- Ali, N., et al. Xenogeneic graft-versus-host-disease in NOD-scid IL-2Rγnull mice display a T-effector memory phenotype. PloS One. 7 (8), 44219 (2012).
- Souci, L., Denesvre, C.
- Holtkamp, S. J., et al. Circadian clocks guide dendritic cells into skin lymphatics. Nature Immunology. 22 (11), 1375-1381 (2021).
