Summary
Настоящий протокол описывает, как трансплантировать кожу человека мышам, не страдающим ожирением диабетического (NOD)-scid интерлейкина-2 рецептора гамма-цепи (NSG). В отчет включено подробное описание подготовки кожи человека к пересадке, подготовки мышей к пересадке, трансплантации расщепленной кожи человека и процедуры посттрансплантационного восстановления.
Abstract
Модель ксенотрансплантата кожи человека, в которой донорская кожа человека пересаживается иммунодефицитному мышиному хозяину, является важным вариантом для трансляционных исследований в иммунологии кожи. Мышиная и человеческая кожа существенно различаются по анатомии и составу иммунных клеток. Поэтому традиционные мышиные модели имеют ограничения для дерматологических исследований и открытия лекарств. Тем не менее, успешные ксенотрансплантаты являются технически сложными и требуют оптимальной подготовки образца и участка трансплантата мыши для выживания трансплантата и хозяина. Настоящий протокол предоставляет оптимизированную технику для трансплантации кожи человека мышам и обсуждает необходимые соображения для последующих экспериментальных целей. В этом отчете описывается надлежащая подготовка образца кожи донора человека, сборка хирургической установки, подготовка мыши и хирургического участка, трансплантация кожи и послеоперационный мониторинг. Соблюдение этих методов позволяет поддерживать ксенотрансплантаты в течение более 6 недель после операции. Методы, описанные ниже, обеспечивают максимальную эффективность прививки благодаря разработке инженерных средств контроля, стерильной техники и пред- и послеоперационного кондиционирования. Соответствующая производительность модели ксенотрансплантата приводит к получению образцов долгоживущих трансплантатов кожи человека для экспериментальной характеристики кожи человека и доклинического тестирования соединений in vivo.
Introduction
Мышиные модели часто используются для того, чтобы делать выводы о биологии и болезнях человека, отчасти из-за их экспериментальной воспроизводимости и способности к генетическим манипуляциям. Однако физиология мышей не полностью повторяет системы органов человека, особенно кожи, и поэтому имеет ограничения для использования в качестве доклинической модели при разработке лекарств1. Анатомические различия между кожей мыши и человека включают различия в толщине и архитектуре эпителия, отсутствие мышиных эккриновых потовых желез и вариации в круговороте волос2. Кроме того, как врожденные, так и адаптивные ветви иммунной системы расходятся между двумя видами3. Кожа мыши содержит уникальную иммунную популяцию дендритных эпидермальных Т-клеток (DETC), имеет более высокое обилие дермальных γδ-Т-клеток и варьируется по локализации подмножества иммунных клеток по сравнению с тканями человека4. Таким образом, экспериментальные результаты, касающиеся биологии кожи человека и воспаления, выигрывают от проверки с человеческими тканями. В то время как системы культуры in vitro и органоидные культуры широко используются для изучения тканей человека, эти системы ограничены отсутствующим или неполным восстановлением иммунитета и отсутствием связи с периферической сосудистой системой5. Гуманизированная модель трансплантации кожи ксенотрансплантата направлена на то, чтобы позволить терапевтические или биологические манипуляции с иммунными и неиммунными путями в тканях человека in vivo.
Модель ксенотрансплантата кожи человека была использована для изучения физиологии и фармакологии кожи, анализа иммунного отторжения и реакций, анализа механизмов рака кожи человека и понимания кожных заболеваний и заживления ран6. Хотя модель ксенотрансплантата применима к нескольким областям исследований кожи, она имеет более низкую пропускную способность, чем исследования in vitro , и ей не хватает простоты генетических манипуляций, используемых в мышиных моделях. Временные точки в этой модели могут варьироваться от недель до месяцев, и для успешной трансплантации требуются соответствующие средства и оборудование для выполнения этих операций. Тем не менее, модель ксенотрансплантата обеспечивает биологический и физиологический контекст для экспериментов, в то время как системы органоидных культур, такие как тканевые экспланты, часто требуют воспроизведения множества движущихся частей, таких как экзогенные сигналы, через определенные промежутки времени7. Поэтому эту модель лучше всего использовать для дальнейшей проверки результатов, наблюдаемых in vitro и в мышиных моделях, или для работы, которая в противном случае биологически невозможна. Надлежащее использование модели ксенотрансплантата дает уникальную возможность изучать и манипулировать неповрежденными тканями человека in vivo.
Оптимизация модели пересадки кожи ксенотрансплантата опиралась на десятилетия исследований для сохранения целостности трансплантата с течением времени. Критически важным для этого процесса является использование мыши без ожирения диабетического (NOD)-scid интерлейкина-2 рецептора гамма-цепи (NSG), у которого отсутствуют B и T-адаптивные иммунные клетки, функциональные NK-клетки и недостатки в макрофагах и дендритных клетках8. Иммунодефицитная природа этих хозяев NSG позволяет трансплантировать человеческие кроветворные клетки, рак пациента и кожу 8,9,10. Несмотря на эту иммуносупрессивную среду хозяина, дополнительное подавление нейтрофильных иммунных реакций мышей путем введения анти-GR1 необходимо для успеха трансплантата10. Основными препятствиями при пересадке неповрежденной ткани являются инфекция, отторжение и трудности с восстановлением притока крови к трансплантату, иногда приводящие к потере кожной и эпидермальной целостности11. Методы, включая введение анти-FR1 и использование соответствующей глубины трансплантата, улучшают выживаемость трансплантата10. Тщательная оптимизация позволяет выполнять пересадку кожи ксенотрансплантата человека на мышах NSG с высокой эффективностью и выживаемостью, в пределах 90%-100%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Настоящее исследование было одобрено и выполнено в соответствии с протоколами UCSF IACUC (AN191105-01H) и IRB (13-11307). Образцы кожи, выброшенные в рамках обычных плановых хирургических процедур, таких как грыжесечение, были использованы для настоящего исследования. Образцы кожи либо деидентифицированы и сертифицированы как Not Human Subjects Research, либо, если для последующего анализа требуется клинически идентифицирующая информация, пациенты предоставили письменное согласие в соответствии с протоколом IRB 13-11307. Никаких других критериев включения или исключения не использовалось. В исследовании были задействованы мыши NSG любого пола, в возрасте 8-10 недель. Мыши были получены из коммерческих источников (см. Таблицу материалов).
1. Обработка донорского образца кожи человека
ПРИМЕЧАНИЕ: Образец кожи человека, использованный при этой трансплантации, представлял собой большой образец, собранный из брюшной полости здорового пациента. Размер образца должен быть не менее 15 см х 7,5 см. Ограничения по размеру могут повлиять на количество мышей, для которых доступна кожа, и на выбор размера трансплантата.
- Поддерживайте образец кожи при низких температурах (на льду; 4°C) перед подготовкой и трансплантацией. Держите образец влажным в закрытой чашке для сбора образцов с марлей, смоченной в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS).
ПРИМЕЧАНИЕ: Хранить образец кожи при температуре 4 °C дольше 2 дней не рекомендуется. Однако существуют отчеты, в которых образцы кожи хранятся в течение более длительного времени12.
ВНИМАНИЕ: Обрабатывайте все ткани человека стандартными мерами предосторожности в отношении биологической опасности. - Подготовьте к дерматому образец кожи человека в стерилизованном вытяжке для культивирования тканей с отрицательным давлением на стерилизованной рассеченной доске.
- Поместите образец кожи, эпидермис стороной вверх, на рассеченную доску. Протрите эпидермис стерильной спиртовой прокладкой, а затем PBS.
- Закрепите более близкий край кожи на месте рассекающим Т-штифтом 1,5 дюйма (см. Таблицу материалов).
- Дерматом является образец кожи толщиной 400 мкм, прикладывая устойчивое давление при разрезании вперед под углом 30°-45°. Следуйте всем инструкциям и мерам безопасности для конкретного прибора (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации о технике дерматома, пожалуйста, смотрите ранее опубликованный отчет13. - Приготовьте чашку Петри размером 100 мм х 20 мм, поместив на дно тарелки стерильную марлю, смоченную в стерильной PBS. Поместите кожу, эпидермис стороной вверх, на влажную марлю.
- Запечатайте и покройте края пластин полупрозрачной уплотнительной пленкой (см. Таблицу материалов), чтобы убедиться, что образец не загрязнен. Храните образец при температуре 4°C перед трансплантацией.
2. Предоперационное кондиционирование и подготовка
- Подготовьте стерильные инструменты и стерильную хирургическую станцию для трансплантации. Используйте автоклавные бумажные полотенца в качестве стерильных поверхностей для размещения инструментов и мышей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши могут быть привиты после отъема, но предпочтительно привиты в возрасте 8-10 недель. Мыши любого пола могут быть привиты. - Выполните хирургическую подготовку, такую как удаление волос, в области, физически отделенной от хирургической станции.
- Готовят анти-GR1 (см. Таблицу материалов), разбавляя его до 1 мг/мл в стерильном физиологическом растворе. Дозируйте каждую мышь со 100 мкг/100 мкл раствора анти-GR1 внутрибрюшинно после индукции анестезии.
- Обезболивайте мышей, по одной, изофлураном или другими институционально одобренными анестетиками.
ПРИМЕЧАНИЕ: Изофлуран необходимо давать в концентрации 3%-5% во время индукции. Как только мышь станет неподвижной, уменьшите концентрацию изофлурана до 1%-3%, чтобы действовать в течение всего периода операции.- Следите за состоянием мыши на предмет соответствующей глубины анестезии, наблюдая за частотой дыхания, отсутствием реакции на защемление пальцев ног и соответствующей розовой окраской ушей и рта.
ВНИМАНИЕ: Используйте соответствующие анестезирующие механизмы и методы очистки и избегайте воздействия паров изофлурана.
- Следите за состоянием мыши на предмет соответствующей глубины анестезии, наблюдая за частотой дыхания, отсутствием реакции на защемление пальцев ног и соответствующей розовой окраской ушей и рта.
- Перенесите мышь на грелку или другой источник тепла (см. Таблицу материалов).
- Ввести офтальмологическую мазь, нанеся небольшую каплю мази на глаз пальцем в перчатке.
- Вводят анальгетики Бупренорфин (0,08 мг/кг) и Карпрофен (5 мг/кг) (см. Таблицу материалов) подкожно путем защемления кожи и введения под углом, параллельным телу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте обезболивание перед лечением в соответствии с институциональными протоколами. Следуйте институциональным рекомендациям по выбору и введению анальгетиков. Метод обезболивания, используемый в данном исследовании, описан на этапе 2.7 и дополнительном рисунке 1. - Вводят анти-GR1 (приготовленный на стадии 2.4) внутрибрюшинно, слегка поднимая мышь за хвост, обнажая брюшко и вводя под углом 30° с использованием шприца инсулина 1 мл (12,7 мм).
- Используйте безопасные для животных электрические кусачки (см. Таблицу материалов), чтобы побрить среднюю и верхнюю части спинной стороны мыши.
- Очистите все волосы и нанесите обильное количество мази для удаления волос на бритую кожу на 30 с - 1 мин.
- Полностью протрите мазь для удаления волос бумажным полотенцем и PBS.
3. Процедура трансплантации
- Переместите мышь во вторичное хирургическое место, вдали от станции удаления волос.
- Стерилизуйте место операции палочкой йодного тампона круговыми движениями, начиная с середины и отрабатывая к краю депилированной области.
- Поместите кусок стерильной полиэтиленовой пленки на мышь и вырежьте в пластике окно, немного превышающее размер области, подлежащей прививке.
- Вырежьте прямоугольную часть донорской кожи размером 10 мм х 10 мм для пересадки скальпелем. Сделайте это, крепко удерживая донорскую кожу на месте тыльной стороной щипцов и разрезая рядом щипцы скальпелем.
- Используя хирургические ножницы, отрежьте прямоугольную область кожи мыши, соответствующую размеру куска кожи донора, создав трансплантатную кровать. Используйте щипцы, чтобы оттянуть кожу от тела, и срежьте кожу ножницами, расположенными под углом от тела, чтобы избежать глубокого врезания в лицевую часть.
- Поместите кусок донорской кожи, эпидермис стороной вверх, на подготовленную трансплантатную кровать.
- Используя заднюю часть щипцов, манипулируйте кожей, скользя взад и вперед, пока донорская кожа не ляжет совершенно ровно на ложе трансплантата.
- Добавьте капли хирургического клеевого тканевого клея (см. Таблицу материалов), где донорская кожа встречается с кожей мыши и удерживайте кожу мыши и донора вместе с щипцами в течение 1-2 с, чтобы клей прилип к тканям. Полностью запечатайте край трансплантата и дайте клею полностью высохнуть.
- Перевяжите мышей (рисунок 1), следуя приведенным ниже шагам.
- Вырежьте кусок вазелиновой марли (см. Таблицу материалов), достаточно большой, чтобы полностью покрыть область трансплантата.
- Накройте трансплантат вазелиновой марлей и слегка прижмите марлю к коже с помощью щипцов.
- Вырежьте полоску прозрачной пленки, повязочной вдоль, чтобы ширина была достаточно большой, чтобы покрыть рану мыши.
- Плотно прижмите прозрачную пленку повязкой, клейкой стороной вниз, поверх марли. Быстро сверните мышь, чтобы полностью обернуть повязку вокруг туловища, гарантируя, что она плотно прилегает, не препятствуя дыханию, и все конечности свободны для движения.
- Поместите мышь в клетку для восстановления и следите за ней, пока она не насторожится и не будет двигаться. Обеспечьте источник тепла на части клетки в течение не менее 15 минут после рекуперации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидается, что животные выздоровеют в течение 1-5 минут после помещения их в клетку восстановления.
- Поодиночке размещают мышей после прививки.
- Назначать послеоперационную анальгезию в соответствии с требованиями институциональных протоколов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Бупренорфин (0,08 мг/кг) вводили подкожно через 4-6 ч во время настоящего исследования.
4. Послеоперационные процедуры
- Вводят 100 мкл (100 мкг) анти-GR1 внутриперитонеально через 4 дня, 7 дней и 11 дней после трансплантации, чтобы предотвратить отторжение трансплантата (дополнительный рисунок 1).
- Заменяйте бинты по мере необходимости и при снятии мышами.
- Перегруппируйте всех мышей на 7-й день.
- Снимите повязки на 14 день.
- Следите за мышами на наличие признаков отторжения трансплантата и системного воспаления (потеря веса, выпадение волос, крайняя вялость).
- Собирайте у мышей от 3 до 6 недель после трансплантата.
- Усыпляют мышей с помощью контролируемого регулятором введения углекислого газа (CO2) с последующим вывихом шейки матки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте институциональным рекомендациям по эвтаназии. - Рассекайте кожные трансплантаты у мышей14. Поместите часть трансплантата в 10% формалин в течение 24 ч перед встраиванием и сечением парафина для гистологического окрашивания9.
- Измельчите кожные трансплантаты ножницами и переваривайте ферментативно с 250 МЕ/мл коллагеназы IV и 0,02 мг/мл ДНКазы в клеточных культуральных средах в течение ночи. Окрашивают клетки для поверхностных и внутриклеточных маркеров в соответствии с ранее описанной процедурой14.
- Усыпляют мышей с помощью контролируемого регулятором введения углекислого газа (CO2) с последующим вывихом шейки матки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ксенотрансплантаты человеческой кожи были выполнены на мышах NSG внутри супербарьерного животного объекта. Успех был определен длительным выживанием трансплантата и мыши и поведенческим здоровьем мышей после трансплантации. Плохая выживаемость в течение недели после операции первоначально наблюдалась как самый большой барьер для успеха экспериментов, причем до 50% мышей требовали эвтаназии. Улучшение стерильной техники и лучшая поддержка температуры тела мыши во время и сразу после операции последовательно увеличивали хирургическую выживаемость до более чем 80%, а часто и до 90-100% выживаемости. В то время как добавление антибиотиков в питьевую воду для мышей было опробовано, не было определено для улучшения результатов и было прекращено в качестве потенциального путаницы результатов. Успешно привитые мыши должны казаться активными и здоровыми в течение нескольких дней после трансплантации. Мыши передвигались по своей клетке, исследовали, строили гнезда, ели и пили, как обычно. Нездоровая мышь может казаться ленивой, нереактивной и может не есть или пить достаточно, чтобы поддерживать свой вес. Добавление летаргических мышей с мягким кормом и оральной гидратацией может помочь послеоперационному восстановлению.
Ксенотрансплантат, который заживает правильно, сначала будет паршой, а затем восстановится в течение примерно 50 дней после операции. Трансплантаты могут со временем сжиматься, но остаются прилипчивыми по краям, где донорская кожа встречается с кожей мыши (рисунок 2). В то время как скатирование трансплантата должно стихать, трансплантаты будут оставаться более толстыми и воспаленными, чем здоровая кожа человека (рисунок 2). Может произойти чрезмерное сокращение трансплантатов, уменьшая доступную ткань для анализа конечных точек. Ожидается, что использование трансплантатов постоянного размера и соответствующее размещение трансплантатов смягчат такие проблемы. Все трансплантаты на протяжении пяти независимых экспериментов дожили до времени сбора урожая, до 50 дней после пересадки.
Анализ тканей может включать иммуногистохимию и одноклеточный анализ после ферментативного пищеварения. Часть кожи обрабатывали ночным пищеварением в 250 МЕ/мл коллагеназы IV типа и 0,02 мг/мл ДНКазы в клеточных культуральных средах (см. Таблицу материалов) и окрашивали для поверхностных и внутриклеточных маркеров, как описано ранее14. Анализ с помощью проточной цитометрии показал устойчивое присутствие иммунных клеток человека в большинстве трансплантатов, но количество варьировалось между ксенотрансплантатами (рисунок 3A). На рисунке 3B показаны репрезентативные результаты успешного трансплантата (слева) и того, который не смог поддерживать иммунные клетки человека (справа). Анализ гематоксилиновых и окрашенных эозином (H&E) участков, взятых из центра трансплантата, выявил неповрежденную, недевитализованную кожу, состоящую из дермы и эпидермиса человека, в течение 35 и 50 дневных временных точек (рисунок 4).
Рисунок 1: Способ перевязки мыши после операции. Мышь плотно заворачивают в вазелиновую марлю и прозрачную пленочную повязку под наркозом. (A) Вазелиновая марля помещается на область, немного большую, чем хирургическая рана. (B) Готовится прозрачная пленочная повязка: длинная полоска разрезается немного шире, чем вазелиновая марля. Подложка, покрывающая клеевую сторону прозрачной пленочной повязки, частично удаляется. (C) Клейкая сторона пленки плотно прижимается к задней части мыши, оставляя дюйм пространства на передней части пленки. (D) Мышь включена на спине. Нависающая передняя часть пленки прижимается к мыши, а задняя часть удаляется. (E) Мышь плотно заворачивается в пленку, а оставшаяся опора удаляется по мере заворачивания мыши. (F) Мышь успешно завернута в повязку, а ее руки и ноги не ограничены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Репрезентативные изображения пересаженных животных с 10 по 21 день после трансплантации. (A-C) Три разные мыши с оптимальными пересадками на 10-й день. (Д-Е) Две разные мыши с пересадками на 21 день. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Химеризм иммунных клеток в трансплантированной коже. Данные проточной цитометрии восстановления иммунных клеток человека из ксенотрансплантатов. Данные ограничены событиями синглетной, живой, человеческой CD45+ мыши CD45-. (A) Количество клеток (Live Human CD45+ Events), восстановленных в результате двух независимых экспериментов. (B) Репрезентативные графики окрашивания иммунных клеток человека и мыши CD45+ в успешном трансплантате (слева) по сравнению с трансплантатом с неудачным поддержанием иммунного компартмента человека (справа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Гистология привитой кожи человека на 35 и 50 день. Привитая кожа была собрана у мышей на 35 (A) или 50 (B), сохранена в 10% формалина, а также внедрена парафином и окрашена для гематоксилина и эозина (H & E). (А) Эпидермис показывает умеренную гиперплазию (акантоз), легкий гипергранулез и компактный ортокератоз. В сосочковой дерме иногда появляются расширенные и перегруженные капилляры. Меланоциты и пигмент меланин присутствуют в базальном слое эпидермиса. Дерма умеренно клеточная и состоит из пухлых овальных фибробластов с бледной синцитиальной цитоплазмой и рассеянными лимфоцитами. (B) Эпидермис содержит слоистый плоский эпителий, ортокератоз корзинчатого плетения в ороговенном слое и имеет нормальную толщину. Меланоциты и пигмент меланин присутствуют в базальном слое эпидермиса. Дерма показывает овальные фибробласты и слегка усиленное отложение внеклеточного матрикса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок 1: Хронология протокола, принятого для исследования ксенотрансплантата. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Модель пересадки кожи ксенотрансплантата мыши является ключевым методом механистического препарирования иммунных реакций кожи человека в условиях in vivo 14. Успешная трансплантация ксенотрансплантата кожи зависит от соответствующей подготовки мышей и образцов кожи и мышей и соблюдения асептических методов хирургии грызунов15. Быстрое охлаждение и надлежащее хранение образцов кожи при низких температурах в средах (таких как стерильный физиологический раствор) важны для обеспечения непрерывного здоровья тканей до трансплантации12. Сбор образцов с разделенной толщиной с использованием такого инструмента, как дерматом, обеспечивает согласованность глубины образца между мышами и увеличивает поступление питательных веществ от хозяина для улучшения выживаемости трансплантата10. Может наблюдаться потеря целостности трансплантата при эпидермальном слажении, особенно в трансплантатах полной толщины с нарушенным кровоснабжением16. Выживанию мышей во время и после операции способствует стерильная техника, предоставление тепла во время и после операции и методы, которые минимизируют хирургическое время, такие как использование хирургического клея15. Введение анти-GR1 после трансплантации позволяет подавить оставшиеся иммунные реакции мыши у иммунодефицитного хозяина, чтобы способствовать выживанию трансплантата10. Эти методы увеличивают вероятность выживания мышей и трансплантатов во время модели трансплантации ксенотрансплантата и улучшают экспериментальные цифры и воспроизводимость от одного эксперимента к другому.
Несмотря на чрезвычайную полезность, существуют некоторые ключевые ограничения для модели пересадки кожи ксенотрансплантата, как было продемонстрировано. Во-первых, трансплантат существует в воспалительной среде, скорее всего, вторичной по отношению к транзиторной ишемии и инфильтрации привитой ткани человека мышиными миелоидными клетками. Таким образом, он не отражает кожу человека в устойчивом состоянии и может не полностью отражать все воспалительные заболевания кожи человека10,14. Изучение воспалительных заболеваний человека путем пересадки клинических биопсий из пораженной кожи является альтернативной стратегией, но ограничения в количестве доступных биопсий и непоследовательный контроль глубины пересадки делают этот вариант менее благоприятным. Кроме того, трансплантаты ксенотрансплантата не повторяют периферическую иммунную архитектуру человека. Восстановление периферии мыши человеческими клетками также может иметь предостережения, поскольку лимфоидная структура мыши NSG атрофична до приживления клеток человека; это может привести к предпочтительному выбору ячеек в некоторых настройках10,17. Кроме того, приживление кожи и восстановление иммунных клеток из образцов кожи могут варьироваться от мыши к мыши, даже при отсутствии лечения. Для этой модели рекомендуется по крайней мере 10 реплик на условие для наблюдения последовательных различий между группами. Соответствующая продолжительность анализа, возможно, должна быть скорректирована для экспериментального вопроса, так как заживление и реваскуляризация трансплантата происходят в течение первых недель после трансплантации, а эффект вмешательств может зависеть от стадии приживления.
Несмотря на эти недостатки, модель пересадки кожи ксенотрансплантата человека остается одним из немногих анализов для изучения иммунных реакций кожи человека в неповрежденном органе in vivo. В то время как трансгенные мышиные модели могут допускать механистическое рассечение путей, различия в анатомии, составе иммунных клеток и доминирующих иммунных путях ограничивают трансляцию к заболеванию человека1. Культура ex vivo клеток человеческого происхождения, модели органоидов кожи и эксплантные исследования тканей человека могут быть альтернативно использованы, но также подвержены ограничениям, включая нарушение иммунных клеточных сетей и выход иммунных клеток из интактной ткани18,19. Таким образом, модели пересадки кожи ксенотрансплантата остаются ключевым методом для изучения терапевтических кандидатов и реакций кожи человека на воспаление в доклинических условиях in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
MDR является основателем TRex Bio и Sitryx. MDR и MML получают финансирование исследований от Sitryx, Q32 и TRex Bio.
Acknowledgments
Эта работа частично финансировалась за счет спонсируемых исследовательских соглашений от TRex Bio и грантов от NIH (1R01AR075864-01A1). JMM поддерживается Обществом исследований рака (грант 26005). Мы признаем, что парнасское проточное цитометрическое ядро частично поддерживается грантами NIH P30 DK063720, S10 1S10OD021822-01 и S10 1S10OD018040-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher | SF100-20 | Fixative for histology |
| 3M Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | surgical glue |
| Alexa 700 CD45 monoclonal antibody (Clone 30F11) | Thermo Fischer | 56-0451-82 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Anti-GR1 clone RB6-8C5 | BioXcell | BE0075 | Anti-rejection |
| APC mouse anti-human CD25 (Clone 2A3) | BD Biosciences | 340939 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| APC-eFluor 780 anti-human HLA-DR (Clone LN3) | eBioscience | 47-9956-42 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Autoclave pouches | VWR | 89140-800 | For autoclaving tools and paper towels |
| Brilliant Violet 60 anti-human CD4 antibody (Clone OKT4 | Biolegend | 317438 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Brilliant Violet 65 anti-human CD8a antibody (Clone RPA-T8) | Biolegend | 301042 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Brilliant Violet 711 anti-human CD3 antibody (Clone OKT3) | Biolegend | 317328 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Buprenex 0.3 mg/mL | Covetrus | 059122 | Analgesia |
| Carprofen 50 mg/mL | Zoetis | NADA # 141-199 | Analgesia |
| Collagenase Type IV | Worthington | 4188 | Skin digestion |
| D42 Dermatome blade | Humeca | 5.D42BL10 | dermatome (1 blade per sample) |
| Dermatome D42 | Humeca | 4.D42 | dermatome |
| Disposable Scalpel | Bard-Parker | 371610 | skin preparation |
| Dissecting T-Pins; 1-1/2 inch, 1000/CS 1.5 | Cole-Parmer | UX-10915-03 | To pin skin specimen for dermatome |
| Dissection scissors | medicon | 02.04.10 | sample preparation and mouse dissection |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25-1G | Skin digestion |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent | eBioscience | 00-5521-00 | Flow cytometry analysis: Cell Fixation and Permeabilization |
| eFluor-450 FOXP3 monoclonal antibody (Clone PCH101) | eBioscience | 48-4776-42 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| Electric clippers | Kent | CL8787-KIT | hair removal |
| Epredia Shandon Instant Eosin | Fisher Scientific | 6765040 | H&E |
| Epredia Shandon Instant Hematoxylin | Fisher Scientific | 6765015 | H&E |
| FITC anti-human CD45 (Clone HI30) | Tonbo Biosciences | 35-0459-T100 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Forceps | medicon | 07.60.07 | sample preparation and mouse dissection |
| Gauze | Fisherbrand | 22-362-178 | Sample preparation |
| Heating lamp | Morganville Scientific | HL0100 | Post-surgical care |
| Heating pads 4" x 10" | Pristech | 20415 | Surgical heat supply |
| Insulin 1cc 12.7 mm syringes | BD | 329410 | drug administration |
| Isoflurane | United States Pharmacopeia (USP) | NDC 66794-013-25 | Anesthesia |
| Isoflurane machine | VetEquip | 911103 | Anesthesia |
| Nair for Men | Nair | 10022600588556 | hair removal |
| Neomycin and Polymyxin Bisulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic ointment | Dechra | NDC 17478-235-35 | eye ointment to prevent drying |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | The Jackson Laboratory | 005557 | Mice |
| Paper towels | Kleenex | 100848 | May be autoclaved for sterile surfaces |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | Semitransparent sealing film |
| PE mouse anti-human CD127 (Clone HIL-7R-M21) | BD Biosciences | 557938 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| PE-Cy-7 mouse anti-Ki-67 (Clone B56) | BD Biosciences | 561283 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| PerCP-eFluor-710 CD152 (CTLA-4) monoclonal antibody (Clone 14D3) | eBioscience | 46-1529-42 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| Permeabilization Buffer 10x | eBioscience | 00-8333-56 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining buffer |
| Petri Dish 150 mm | Corning | 430597 | Sample storage |
| Plastic Wrap | Fisherbrand | 22-305-654 | Site preparation |
| Providone-Iodine Swab stick | PDI | S41350 | Site sterilization |
| Soft-Feed and Oral Hydration (Napa Nectar) | Se Lab Group Inc | NC9066511 | For supplementing poorly recovering mice post-surgery |
| Specimen Collection Cups | Fisher Scientific | 22-150-266 | sample storage |
| Sterile alcohol prep pad | Fisherbrand | 22-363-750 | skin preparation |
| Sterile PBS | Gibco | 14190-144 | Media for sample storage |
| Sterile saline | Hospira | NDC 0409-4888-02 | For drug dilution |
| Tegaderm Film 4” x 43/4” | 3M | 1626 | transparent film wound dressing |
| Vaseline Petrolatum Gauze 3” x 8” | Kendall | 414600 | wound dressing |
| Violet 510 Ghost Dye | Tonbo Biosciences | 13-0870-T100 | Flow cytometry analysis: Viability dye |
References
- Zomer, H. D., Trentin, A. G. Skin wound healing in humans and mice: Challenges in translational research. Journal of Dermatological Science. 90 (1), 3-12 (2018).
- Wong, V. W., Sorkin, M., Glotzbach, J. P., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. Surgical approaches to create murine models of human wound healing. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 969618 (2011).
- Mestas, J., Hughes, C. C. W. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. The Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
- Pasparakis, M., Haase, I., Nestle, F. O. Mechanisms regulating skin immunity and inflammation. Nature Reviews Immunology. 14 (5), 289-301 (2014).
- Sun, H., Zhang, Y. -X., Li, Y. -M. Generation of skin organoids: potential opportunities and challenges. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 3176 (2021).
- Cristóbal, L., et al. Mouse models for human skin transplantation: a systematic review. Cells Tissues Organs. 210 (4), 250-259 (2021).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/γcnull mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Meraz, I. M., et al. An improved patient-derived xenograft humanized mouse model for evaluation of lung cancer immune responses. Cancer Immunology Research. 7 (8), 1267-1279 (2019).
- Racki, W. J., et al. NOD-scid IL2rgamma(null) mouse model of human skin transplantation and allograft rejection. Transplantation. 89 (5), 527-536 (2010).
- Meehan, G. R., et al. Developing a xenograft model of human vasculature in the mouse ear pinna. Scientific Reports. 10 (1), 2058 (2020).
- Gokkaya, A., et al. Skin graft storage in platelet rich plasma (PRP). Dermatologic Therapy. 33 (1), 13178 (2020).
- Humeca, B. V. The Humeca D42 and D80 battery operated cordless dermatomes. , Available from: https://www.youtube.com/watch?v=YCRowX-TdA (2021).
- Rodriguez, R. S., et al. Memory regulatory T cells reside in human skin. The Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1027-1036 (2014).
- Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A.
- Karim, A. S., et al. Evolution of ischemia and neovascularization in a murine model of full thickness human wound healing. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 28 (6), 812-822 (2020).
- Ali, N., et al. Xenogeneic graft-versus-host-disease in NOD-scid IL-2Rγnull mice display a T-effector memory phenotype. PloS One. 7 (8), 44219 (2012).
- Souci, L., Denesvre, C.
- Holtkamp, S. J., et al. Circadian clocks guide dendritic cells into skin lymphatics. Nature Immunology. 22 (11), 1375-1381 (2021).
