Summary
El presente protocolo describe cómo injertar piel humana en ratones diabéticos no obesos (NOD)-scid receptor de cadena gamma (NSG) con interleucina-2. En el informe se incluye una descripción detallada de la preparación de la piel humana para el trasplante, la preparación de ratones para el trasplante, el trasplante de piel humana de espesor dividido y el procedimiento de recuperación posterior al trasplante.
Abstract
El modelo de xenoinjerto de piel humana, en el que la piel de un donante humano se trasplanta a un huésped de ratón inmunodeficiente, es una opción importante para la investigación traslacional en inmunología de la piel. La piel murina y humana difieren sustancialmente en anatomía y composición de células inmunes. Por lo tanto, los modelos tradicionales de ratón tienen limitaciones para la investigación dermatológica y el descubrimiento de fármacos. Sin embargo, los xenotrasplantes exitosos son técnicamente desafiantes y requieren una preparación óptima del sitio de injerto de muestra y ratón para la supervivencia del injerto y del huésped. El presente protocolo proporciona una técnica optimizada para trasplantar piel humana en ratones y discute las consideraciones necesarias para los objetivos experimentales posteriores. Este informe describe la preparación adecuada de una muestra de piel de donante humano, el ensamblaje de una configuración quirúrgica, la preparación del ratón y del sitio quirúrgico, el trasplante de piel y el monitoreo postquirúrgico. La adherencia a estos métodos permite el mantenimiento de los xenoinjertos durante más de 6 semanas después de la cirugía. Las técnicas descritas a continuación permiten la máxima eficiencia de injerto debido al desarrollo de controles de ingeniería, técnica estéril y acondicionamiento pre y postquirúrgico. El rendimiento adecuado del modelo de xenoinjerto da como resultado muestras de injerto de piel humana de larga vida para la caracterización experimental de la piel humana y las pruebas preclínicas de compuestos in vivo.
Introduction
Los modelos de ratón se utilizan con frecuencia para hacer inferencias sobre la biología humana y la enfermedad, en parte debido a su reproducibilidad experimental y capacidad de manipulación genética. Sin embargo, la fisiología del ratón no recapitula completamente los sistemas de órganos humanos, particularmente la piel, y por lo tanto tiene limitaciones para su uso como modelo preclínico en el desarrollo de fármacos1. Las diferencias anatómicas entre la piel del ratón y la humana incluyen diferencias en el grosor epitelial y la arquitectura, la falta de glándulas sudoríparas ecrinas murinas y las variaciones en el ciclo del cabello2. Además, tanto el brazo innato como el adaptativo del sistema inmune son divergentes entre las dos especies3. La piel de ratón contiene una población inmune única de células T epidérmicas dendríticas (DETC), tiene una mayor abundancia de células T γδ dérmicas y varía en la localización de subconjuntos de células inmunes en comparación con el tejido humano4. Por lo tanto, los hallazgos experimentales sobre la biología de la piel humana y la inflamación se benefician de la validación con tejido humano. Mientras que los sistemas de cultivo in vitro y organoides son herramientas ampliamente utilizadas para estudiar el tejido humano, estos sistemas están limitados por la reconstitución inmune ausente o incompleta y la falta de conexión con la vasculatura periférica5. El modelo humanizado de trasplante de piel de xenoinjerto tiene como objetivo permitir la manipulación terapéutica o biológica de las vías inmunes y no inmunes en tejidos humanos in vivo.
El modelo de xenoinjerto de piel humana se ha utilizado para estudiar la fisiología y farmacología de la piel, analizar el rechazo inmune y las respuestas, diseccionar los mecanismos del cáncer de piel humano y comprender las enfermedades de la piel y la cicatrización de heridas6. Si bien es aplicable a múltiples campos de investigación de la piel, el modelo de xenoinjerto tiene un rendimiento menor que los estudios in vitro y carece de la facilidad de manipulación genética empleada en modelos de ratón. Los puntos de tiempo dentro de este modelo pueden variar de semanas a meses, y el injerto exitoso requiere instalaciones y equipos adecuados para realizar estas cirugías. Sin embargo, el modelo de xenoinjerto proporciona contexto biológico y fisiológico a los experimentos, mientras que los sistemas de cultivo de organoides, como los explantes de tejidos, a menudo requieren replicar una miríada de partes móviles, como señales exógenas, a intervalos de tiempo específicos7. Por lo tanto, este modelo se utiliza mejor para validar aún más los hallazgos observados in vitro y dentro de modelos de ratón, o para trabajos que no son biológicamente factibles. El uso apropiado del modelo de xenoinjerto ofrece una oportunidad única para estudiar y manipular tejido humano intacto in vivo.
La optimización del modelo de trasplante de piel de xenoinjerto se ha basado en décadas de investigación para preservar la integridad del injerto a lo largo del tiempo. Fundamental para este proceso es utilizar el ratón receptor de cadena gamma (NSG) diabético no obeso (NOD)-scid interleucina-2, que carece de células inmunes adaptativas B y T, células NK funcionales y tiene deficiencias en macrófagos y células dendríticas8. La naturaleza inmunodeficiente de estos huéspedes NSG permite el trasplante de células hematopoyéticas humanas, cánceres derivados de pacientes y piel 8,9,10. A pesar de este ambiente inmunosupresor del huésped, la supresión adicional de las respuestas inmunes neutrofílicas del ratón mediante la administración anti-GR1 es necesaria para el éxito del injerto10. Los principales obstáculos en el trasplante de tejido intacto son la infección, el rechazo y la dificultad para restablecer el flujo sanguíneo al injerto, lo que a veces conduce a la pérdida de integridad dérmica y epidérmica11. Las técnicas que incluyen la administración de anti-FR1 y el uso de una profundidad de injerto adecuada mejoran la supervivencia del injerto10. La optimización meticulosa permite realizar trasplantes de piel de xenoinjerto humano en ratones NSG con altas tasas de eficiencia y supervivencia, que oscilan entre el 90% y el 100%.
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Protocol
El presente estudio fue aprobado y realizado de acuerdo con los protocolos UCSF IACUC (AN191105-01H) e IRB (13-11307). Para la presente investigación se utilizaron muestras de piel, descartadas como parte de procedimientos quirúrgicos electivos de rutina, como la reparación de hernias. Las muestras de piel se desidentifican y se certifican como Investigación con sujetos no humanos o, si se requiere información de identificación clínica para los análisis posteriores, los pacientes proporcionaron un consentimiento por escrito bajo el protocolo IRB 13-11307. No se utilizaron otros criterios de inclusión o exclusión. En el estudio se emplearon ratones NSG de ambos sexos, de 8 a 10 semanas de edad. Los ratones se obtuvieron de fuentes comerciales (ver Tabla de materiales).
1. Procesamiento de la muestra de piel humana del donante
NOTA: La muestra de piel humana utilizada en este trasplante fue una muestra grande recolectada del abdomen de un paciente sano. La muestra debe ser de al menos 15 cm x 7,5 cm. Las limitaciones de tamaño pueden afectar el número de ratones para los que hay piel disponible y la elección del tamaño del injerto.
- Mantener la muestra de piel a temperaturas frías (sobre hielo; 4°C) antes de la preparación y el injerto. Mantenga la muestra húmeda en una taza cerrada de recolección de muestras con la gasa empapada en solución salina tamponada con fosfato (PBS).
NOTA: No se recomienda almacenar la muestra de piel a 4 °C durante más de 2 días. Sin embargo, existen informes en los que las muestras de piel se almacenan durante más tiempo12.
PRECAUCIÓN: Trate todo el tejido humano con las precauciones estándar de riesgo biológico. - Prepárese para dermatomar la muestra de piel humana en una campana de cultivo de tejido esterilizada con presión negativa en una placa de disección esterilizada.
- Coloque la muestra de piel, con la epidermis hacia arriba, en la tabla de disección. Limpie la epidermis con una almohadilla estéril de preparación de alcohol y luego con PBS.
- Fije el borde más cercano de la piel en su lugar con un pasador en T de disección de 1.5 pulgadas (consulte la Tabla de materiales).
- Dermata la muestra de piel a un espesor de 400 μm, aplicando una presión constante mientras se corta hacia adelante en un ángulo de 30°-45°. Siga todas las instrucciones y medidas de seguridad específicas del instrumento (consulte la Tabla de materiales).
NOTA: Para obtener detalles sobre la técnica del dermatoma, consulte un informe publicado anteriormente13. - Prepare una placa de Petri de 100 mm x 20 mm colocando una gasa estéril empapada en PBS estéril en el fondo del plato. Coloque la piel, con el lado de la epidermis hacia arriba, sobre la gasa húmeda.
- Selle y cubra los bordes de la placa con una película de sellado semitransparente (consulte la Tabla de materiales) para asegurarse de que la muestra no esté contaminada. Conservar la muestra a 4°C antes del injerto.
2. Acondicionamiento y preparación preoperatoria
- Prepare los instrumentos estériles y una estación quirúrgica estéril para el injerto. Use toallas de papel esterilizadas en autoclave como superficies estériles para la colocación de instrumentos y ratones.
NOTA: Los ratones pueden ser injertados después del destete, pero son preferiblemente injertados entre las 8-10 semanas de edad. Se pueden injertar ratones de ambos sexos. - Realice la preparación quirúrgica, como la depilación, en un área físicamente separada de la estación quirúrgica.
- Prepare el anti-GR1 (ver Tabla de materiales) diluyéndolo a 1 mg/ml en solución salina estéril. Dosificar cada ratón con 100 μg/100 μL de la solución anti-GR1 por vía intraperitoneal después de la inducción de la anestesia.
- Anestesiar a los ratones, uno a la vez, con isoflurano u otros anestésicos aprobados institucionalmente.
NOTA: El isoflurano debe administrarse a una concentración del 3% al 5% durante la inducción. Una vez que el ratón esté inmóvil, reduzca la concentración de isoflurano a 1% -3% para efectuar durante la duración de la cirugía.- Controle el ratón para determinar la profundidad adecuada de la anestesia observando la frecuencia respiratoria, la ausencia de respuesta de pellizco del dedo del pie y la coloración rosada adecuada de las orejas y la boca.
PRECAUCIÓN: Use maquinaria anestésica y métodos de eliminación apropiados, y evite la exposición a vapores de isoflurano.
- Controle el ratón para determinar la profundidad adecuada de la anestesia observando la frecuencia respiratoria, la ausencia de respuesta de pellizco del dedo del pie y la coloración rosada adecuada de las orejas y la boca.
- Transfiera el ratón a una almohadilla térmica u otra fuente de calor (consulte la Tabla de materiales).
- Administre el ungüento oftálmico frotando una pequeña gota de ungüento en el ojo con un dedo enguantado.
- Administrar analgésicos buprenorfina (0,08 mg/kg) y carprofeno (5 mg/kg) (ver Tabla de materiales) por vía subcutánea pellizcando la piel e inyectando en ángulo paralelo al cuerpo.
NOTA: Preparar la analgesia pre-tratamiento siguiendo protocolos institucionales. Seguir las pautas institucionales para la selección y administración de analgésicos. El método de analgesia utilizado en este estudio se describe en el paso 2.7 y en la Figura complementaria 1. - Administrar el anti-GR1 (preparado en el paso 2.4) por vía intraperitoneal levantando ligeramente el ratón por la cola, exponiendo el abdomen e inyectando en un ángulo de 30° con una jeringa de insulina de 1 ml (12,7 mm).
- Use cortapelos eléctricos seguros para animales (consulte la Tabla de materiales) para afeitar las partes media y superior del lado dorsal del ratón.
- Limpie todo el vello y aplique una cantidad generosa de ungüento depilatorio sobre la piel afeitada durante 30 s a 1 min.
- Limpie completamente el ungüento depilatorio con una toalla de papel y PBS.
3. Procedimiento de trasplante
- Transfiera el ratón a un lugar quirúrgico secundario, lejos de la estación de depilación.
- Esterilice el sitio quirúrgico con la varilla de hisopo de yodo en un movimiento circular, comenzando en el medio y trabajando hacia el borde del área depilada.
- Coloque un trozo de envoltura de plástico estéril sobre el mouse y corte una ventana en el plástico ligeramente más grande que el tamaño del área a injertar.
- Corte una porción en forma de rectángulo de 10 mm x 10 mm de piel donante para ser injertada con un bisturí. Haga esto sosteniendo firmemente la piel del donante en su lugar con la parte posterior de los fórceps y cortando junto a los fórceps con el bisturí.
- Usando las tijeras quirúrgicas, corte un área rectangular de piel de ratón que coincida con el tamaño de la pieza de piel del donante, creando un lecho de injerto. Use fórceps para separar la piel del cuerpo y corte la piel con las tijeras en ángulo lejos del cuerpo para evitar cortar profundamente la facia.
- Coloque la pieza de piel del donante, con la epidermis hacia arriba, sobre el lecho de injerto preparado.
- Usando la parte posterior de los fórceps, manipule la piel, deslizándose hacia adelante y hacia atrás hasta que la piel del donante quede completamente plana contra el lecho del injerto.
- Agregue gotas de adhesivo de tejido de pegamento quirúrgico (consulte la Tabla de materiales) donde la piel del donante se encuentre con la piel del ratón y sostenga la piel del ratón y del donante junto con pinzas durante 1-2 s para que el pegamento se adhiera a los tejidos. Selle completamente el borde del injerto y deje que el pegamento se seque completamente.
- Vendar los ratones (Figura 1) siguiendo los pasos a continuación.
- Corte un trozo de gasa de vaselina (consulte la Tabla de materiales) lo suficientemente grande como para cubrir completamente el área del injerto.
- Cubra el injerto con la gasa de vaselina y presione ligeramente la gasa contra la piel con fórceps.
- Corte una tira de un apósito de película transparente a lo largo para que el ancho sea lo suficientemente grande como para cubrir la herida del ratón.
- Presione firmemente el apósito de película transparente, con el lado adhesivo hacia abajo, sobre la gasa. Haga rodar rápidamente el ratón para envolver el apósito completamente alrededor del torso, asegurándose de que se ajuste bien sin impedir la respiración y que todas las extremidades estén libres para el movimiento.
- Coloque el ratón en una jaula de recuperación y monitoréelo hasta que esté alerta y en movimiento. Proporcione una fuente de calor en una parte de la jaula durante al menos 15 minutos después de la recuperación.
NOTA: Se espera que los animales se recuperen dentro de 1-5 minutos después de colocarlos en la jaula de recuperación.
- Alojar individualmente a los ratones después del injerto.
- Administrar analgesia postquirúrgica según lo exijan los protocolos institucionales.
NOTA: La buprenorfina (0,08 mg/kg) se administró por vía subcutánea 4-6 h más tarde durante el presente estudio.
4. Procedimientos postquirúrgicos
- Inyecte 100 μL (100 μg) de anti-GR1 por vía intraperitoneal a los 4 días, 7 días y 11 días después del injerto para prevenir el rechazo del injerto (Figura complementaria 1).
- Reemplace los vendajes según sea necesario y si los ratones los quitan.
- Vuelva a vendar a todos los ratones el día 7.
- Retire los vendajes el día 14.
- Controle a los ratones para detectar signos de rechazo del injerto e inflamación sistémica (pérdida de peso, pérdida de cabello, letargo extremo).
- Cosechar los ratones entre 3 y 6 semanas después del injerto.
- Eutanasia a los ratones a través de la administración de dióxido de carbono (CO2) controlada por el regulador seguida de dislocación cervical.
NOTA: Siga las pautas institucionales para la eutanasia. - Diseccionar los injertos de piel de los ratones14. Colocar una porción del injerto en formalina al 10% durante 24 h antes de la incrustación y seccionamiento de parafina para tinción histológica9.
- Picar los injertos de piel con tijeras y digerir enzimáticamente con 250 UI / ml de colagenasa IV y 0,02 mg / ml de DNasa en medios de cultivo celular durante la noche. Teñir las células para marcadores superficiales e intracelulares siguiendo el procedimiento descrito anteriormente14.
- Eutanasia a los ratones a través de la administración de dióxido de carbono (CO2) controlada por el regulador seguida de dislocación cervical.
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Representative Results
Se realizaron xenoinjertos de piel humana en ratones NSG dentro de una instalación de animales de súper barrera. El éxito se definió por la supervivencia prolongada del injerto y del ratón y la salud conductual de los ratones después del trasplante. La mala supervivencia durante la semana posterior a la cirugía se observó inicialmente como la mayor barrera para el éxito experimental, con hasta el 50% de los ratones que requieren eutanasia. La mejora de la técnica estéril y un mejor soporte de las temperaturas corporales del ratón durante e inmediatamente después de la cirugía aumentaron la supervivencia quirúrgica consistentemente a más del 80% y, a menudo, al 90% -100% de supervivencia. Si bien se probó la adición de antibióticos en el agua potable del ratón, no se determinó que mejorara los resultados y se suspendió como un posible factor de confusión de los resultados. Los ratones injertados con éxito deben aparecer activos y sanos en los días posteriores al trasplante. Los ratones se movían alrededor de su jaula, explorando, construyendo nidos y comiendo y bebiendo como de costumbre. Un ratón enfermo puede parecer perezoso, no reactivo y puede no estar comiendo o bebiendo lo suficiente para mantener su peso. La suplementación de ratones letárgicos con alimentación blanda y opciones de hidratación oral puede ayudar a la recuperación postquirúrgica.
Un xenoinjerto que está sanando correctamente primero formará una costra y luego se recuperará dentro de los 50 días posteriores a la cirugía. Los injertos pueden contraerse con el tiempo, pero permanecen adherentes alrededor de los bordes donde la piel del donante se encuentra con la piel del ratón (Figura 2). Si bien las costras del injerto deben disminuir, los injertos permanecerán más gruesos e inflamados que la piel humana sana (Figura 2). Puede ocurrir una contracción excesiva de los injertos, reduciendo el tejido disponible para el análisis de puntos finales. Se espera que la utilización de injertos de tamaño consistente y la colocación adecuada de los injertos mitiguen estos problemas. Todos los injertos a lo largo de cinco experimentos independientes sobrevivieron hasta el momento de la cosecha, hasta 50 días después del trasplante.
El análisis tisular puede incluir inmunohistoquímica y análisis unicelulares después de la digestión enzimática. Una porción de piel fue procesada por digestión nocturna en 250 UI/mL de colagenasa tipo IV y 0,02 mg/mL de DNasa en medios de cultivo celular (ver Tabla de materiales), y teñida para marcadores superficiales e intracelulares como se describió anteriormente14. El análisis por citometría de flujo reveló la presencia sostenida de células inmunes humanas dentro de la mayoría de los injertos, pero los recuentos variaron entre los xenoinjertos (Figura 3A). La Figura 3B muestra resultados representativos de un injerto exitoso (izquierda) y uno que no ha logrado mantener las células inmunes humanas (derecha). El análisis de las secciones teñidas con hematoxilina y eosina (H&E) tomadas del centro del injerto reveló piel intacta, no desvitalizada, compuesta de dermis humana y epidermis durante 35 y 50 días (Figura 4).
Figura 1: Método para vendar ratones después de la cirugía. El ratón está envuelto firmemente en gasa de vaselina y apósito de película transparente mientras está bajo anestesia. (A) La gasa de vaselina se coloca sobre un área ligeramente más grande que la herida quirúrgica. (B) Se prepara el aderezo de película transparente: se corta una tira larga ligeramente más ancha que la gasa de vaselina. El respaldo que cubre el lado adhesivo del apósito de película transparente se retira parcialmente. (C) El lado adhesivo de la película se presiona firmemente contra la parte posterior del mouse, dejando una pulgada de espacio en la parte frontal de la película. (D) El ratón está girado sobre su espalda. La parte frontal sobresaliente de la película se presiona sobre el ratón y se retira el respaldo. (E) El ratón está bien envuelto en la película, y el soporte restante se retira a medida que se envuelve el ratón. (F) El ratón se envuelve con éxito en el apósito, y sus brazos y piernas no están restringidos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes representativas de animales trasplantados del día 10 al 21 después del trasplante. (A-C) Tres ratones diferentes con trasplantes óptimos en el día 10. (D-E) Dos ratones diferentes con trasplantes el día 21. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Quimerismo de células inmunes en piel injertada. Datos de citometría de flujo de la recuperación de células inmunes humanas a partir de xenoinjertos. Los datos están cerrados en los eventos de ratón CD45+ humano singlete, vivo CD45+ CD45-. (A) Número de células (eventos CD45+ humanos vivos) recuperadas de dos experimentos independientes. (B) Gráficos representativos de tinción de células inmunes CD45+ humanas y de ratón en un injerto exitoso (izquierda) en comparación con el injerto con mantenimiento fallido del compartimiento inmune humano (derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Histología de la piel humana injertada en los días 35 y 50. La piel injertada se recolectó de ratones en el día 35 (A) o 50 (B), se conservó en formalina al 10%, y se incrustó en parafina y se tiñó para hematoxilina y eosina (H&E). (A) La epidermis muestra hiperplasia moderada (acantosis), hipergranulosis leve y ortoqueratosis compacta. En la dermis papilar, hay capilares dilatados y congestionados ocasionales. Los melanocitos y el pigmento de melanina están presentes en la capa basal de la epidermis. La dermis es moderadamente celular y está compuesta de fibroblastos ovalados regordetes con citoplasma sincitial pálido y linfocitos dispersos. (B) La epidermis comprende epitelio escamoso estratificado, ortoqueratosis de tejido de cesta en la capa cornificada, y es de espesor normal. Los melanocitos y el pigmento de melanina están presentes en la capa basal de la epidermis. La dermis muestra fibroblastos ovalados y una deposición de matriz extracelular ligeramente mejorada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura complementaria 1: Cronología del protocolo adoptado para el estudio de xenoinjertos. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
El modelo de trasplante de piel de xenoinjerto de ratón es una técnica clave para diseccionar mecánicamente las respuestas inmunes de la piel humana en un entorno in vivo 14. El éxito de los trasplantes de xenoinjerto de piel se basa en la preparación adecuada de ratones y muestras de piel y ratones y en la adherencia a los métodos de cirugía aséptica con roedores15. El enfriamiento rápido y el almacenamiento adecuado de muestras de piel a temperaturas frías en medios (como solución salina estéril) son importantes para garantizar la salud continua del tejido antes del trasplante12. La recolección de muestras de espesor dividido, utilizando un instrumento como un dermatoma, permite la consistencia en la profundidad de la muestra entre ratones y aumenta la provisión de nutrientes del huésped para mejorar la supervivencia del injerto10. Se puede observar pérdida de la integridad del injerto con desprendimiento epidérmico, particularmente en injertos de espesor total con suministro de sangre interrumpido16. La supervivencia del ratón durante y después de la cirugía es ayudada por la técnica estéril, la provisión de calor durante y después de la cirugía, y técnicas que minimizan el tiempo quirúrgico, como la utilización de pegamento quirúrgico15. La administración de anti-GR1 después del trasplante permite la supresión de las respuestas inmunes restantes del ratón en el huésped inmunodeficiente para promover la supervivencia del injerto10. Estos métodos aumentan la probabilidad de supervivencia del ratón y del injerto durante el modelo de trasplante de xenoinjerto y mejoran los números experimentales y la reproducibilidad de un experimento al siguiente.
Aunque es extremadamente útil, existen algunas limitaciones clave para el modelo de trasplante de piel de xenoinjerto, como se demostró. En primer lugar, el injerto existe en un ambiente inflamatorio, muy probablemente secundario a isquemia transitoria e infiltración de tejido injertado humano con células mieloides murinas. Por lo tanto, no refleja la piel humana en un estado estacionario y puede no reflejar completamente todas las enfermedades inflamatorias de la piel humanas10,14. El estudio de los trastornos inflamatorios humanos mediante el injerto de biopsias clínicas de piel lesionada es una estrategia alternativa, pero las limitaciones en el número de biopsias disponibles y el control inconsistente de la profundidad del injerto hacen que esta opción sea menos favorable. Además, los trasplantes de xenoinjerto no recapitulan la arquitectura inmune periférica humana. La reconstitución de la periferia del ratón con células humanas también puede tener advertencias, ya que la estructura linfoide del ratón NSG es atrófica antes del injerto de células humanas; Esto puede conducir a la selección preferencial de células en algunos entornos10,17. Además, el injerto de piel y la recuperación de células inmunes de muestras de piel pueden variar de ratón a ratón, incluso en ausencia de tratamiento. Se recomiendan al menos 10 réplicas por condición para que este modelo observe diferencias consistentes entre los grupos. Es posible que sea necesario ajustar la duración apropiada del ensayo para la pregunta experimental, ya que la cicatrización y la revascularización del injerto ocurren durante las primeras semanas después del trasplante, y el efecto de las intervenciones puede depender de la etapa del injerto.
A pesar de estos inconvenientes, el modelo de trasplante de piel de xenoinjerto humano sigue siendo uno de los pocos ensayos para estudiar las respuestas inmunes de la piel humana en el órgano intacto in vivo. Si bien los modelos de ratones transgénicos pueden permitir la disección de vías mecanicistas, las diferencias en la anatomía, la composición de las células inmunes y las vías inmunes dominantes limitan la traducción a la enfermedad humana1. El cultivo ex vivo de células derivadas del ser humano, los modelos de organoides cutáneos y los estudios de explante de tejidos humanos pueden utilizarse alternativamente, pero también están sujetos a limitaciones, incluida la interrupción de las redes de células inmunitarias y la salida de células inmunitarias del tejido intacto18,19. Por lo tanto, los modelos de trasplante de piel de xenoinjerto siguen siendo un método clave para estudiar candidatos terapéuticos y respuestas de la piel humana a la inflamación en un entorno preclínico in vivo.
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Disclosures
MDR es fundador de TRex Bio y Sitryx. MDR y MML reciben fondos de investigación de Sitryx, Q32 y TRex Bio.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado en parte por acuerdos de investigación patrocinados por TRex Bio y subvenciones de los NIH (1R01AR075864-01A1). JMM cuenta con el apoyo de la Sociedad de Investigación del Cáncer (subvención 26005). Reconocemos el Parnassus Flow Cytometry Core apoyado en parte por las subvenciones NIH P30 DK063720, S10 1S10OD021822-01 y S10 1S10OD018040-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher | SF100-20 | Fixative for histology |
| 3M Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | surgical glue |
| Alexa 700 CD45 monoclonal antibody (Clone 30F11) | Thermo Fischer | 56-0451-82 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Anti-GR1 clone RB6-8C5 | BioXcell | BE0075 | Anti-rejection |
| APC mouse anti-human CD25 (Clone 2A3) | BD Biosciences | 340939 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| APC-eFluor 780 anti-human HLA-DR (Clone LN3) | eBioscience | 47-9956-42 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Autoclave pouches | VWR | 89140-800 | For autoclaving tools and paper towels |
| Brilliant Violet 60 anti-human CD4 antibody (Clone OKT4 | Biolegend | 317438 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Brilliant Violet 65 anti-human CD8a antibody (Clone RPA-T8) | Biolegend | 301042 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Brilliant Violet 711 anti-human CD3 antibody (Clone OKT3) | Biolegend | 317328 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Buprenex 0.3 mg/mL | Covetrus | 059122 | Analgesia |
| Carprofen 50 mg/mL | Zoetis | NADA # 141-199 | Analgesia |
| Collagenase Type IV | Worthington | 4188 | Skin digestion |
| D42 Dermatome blade | Humeca | 5.D42BL10 | dermatome (1 blade per sample) |
| Dermatome D42 | Humeca | 4.D42 | dermatome |
| Disposable Scalpel | Bard-Parker | 371610 | skin preparation |
| Dissecting T-Pins; 1-1/2 inch, 1000/CS 1.5 | Cole-Parmer | UX-10915-03 | To pin skin specimen for dermatome |
| Dissection scissors | medicon | 02.04.10 | sample preparation and mouse dissection |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25-1G | Skin digestion |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent | eBioscience | 00-5521-00 | Flow cytometry analysis: Cell Fixation and Permeabilization |
| eFluor-450 FOXP3 monoclonal antibody (Clone PCH101) | eBioscience | 48-4776-42 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| Electric clippers | Kent | CL8787-KIT | hair removal |
| Epredia Shandon Instant Eosin | Fisher Scientific | 6765040 | H&E |
| Epredia Shandon Instant Hematoxylin | Fisher Scientific | 6765015 | H&E |
| FITC anti-human CD45 (Clone HI30) | Tonbo Biosciences | 35-0459-T100 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Forceps | medicon | 07.60.07 | sample preparation and mouse dissection |
| Gauze | Fisherbrand | 22-362-178 | Sample preparation |
| Heating lamp | Morganville Scientific | HL0100 | Post-surgical care |
| Heating pads 4" x 10" | Pristech | 20415 | Surgical heat supply |
| Insulin 1cc 12.7 mm syringes | BD | 329410 | drug administration |
| Isoflurane | United States Pharmacopeia (USP) | NDC 66794-013-25 | Anesthesia |
| Isoflurane machine | VetEquip | 911103 | Anesthesia |
| Nair for Men | Nair | 10022600588556 | hair removal |
| Neomycin and Polymyxin Bisulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic ointment | Dechra | NDC 17478-235-35 | eye ointment to prevent drying |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | The Jackson Laboratory | 005557 | Mice |
| Paper towels | Kleenex | 100848 | May be autoclaved for sterile surfaces |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | Semitransparent sealing film |
| PE mouse anti-human CD127 (Clone HIL-7R-M21) | BD Biosciences | 557938 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| PE-Cy-7 mouse anti-Ki-67 (Clone B56) | BD Biosciences | 561283 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| PerCP-eFluor-710 CD152 (CTLA-4) monoclonal antibody (Clone 14D3) | eBioscience | 46-1529-42 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| Permeabilization Buffer 10x | eBioscience | 00-8333-56 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining buffer |
| Petri Dish 150 mm | Corning | 430597 | Sample storage |
| Plastic Wrap | Fisherbrand | 22-305-654 | Site preparation |
| Providone-Iodine Swab stick | PDI | S41350 | Site sterilization |
| Soft-Feed and Oral Hydration (Napa Nectar) | Se Lab Group Inc | NC9066511 | For supplementing poorly recovering mice post-surgery |
| Specimen Collection Cups | Fisher Scientific | 22-150-266 | sample storage |
| Sterile alcohol prep pad | Fisherbrand | 22-363-750 | skin preparation |
| Sterile PBS | Gibco | 14190-144 | Media for sample storage |
| Sterile saline | Hospira | NDC 0409-4888-02 | For drug dilution |
| Tegaderm Film 4” x 43/4” | 3M | 1626 | transparent film wound dressing |
| Vaseline Petrolatum Gauze 3” x 8” | Kendall | 414600 | wound dressing |
| Violet 510 Ghost Dye | Tonbo Biosciences | 13-0870-T100 | Flow cytometry analysis: Viability dye |
References
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