Summary
Detta protokoll beskriver hur man ympar mänsklig hud på icke-överviktiga diabetiker (NOD) -scid interleukin-2 gamma chain receptor (NSG) möss. En detaljerad beskrivning av beredningen av mänsklig hud för transplantation, förberedelse av möss för transplantation, transplantation av mänsklig hud med delad tjocklek och återhämtningsförfarande efter transplantation ingår i rapporten.
Abstract
Den mänskliga hudxenograftmodellen, där mänsklig donatorhud transplanteras på en immunbristmusvärd, är ett viktigt alternativ för translationell forskning inom hudimmunologi. Murin och mänsklig hud skiljer sig väsentligt i anatomi och immuncellsammansättning. Därför har traditionella musmodeller begränsningar för dermatologisk forskning och läkemedelsupptäckt. Framgångsrika xenotransplanter är dock tekniskt utmanande och kräver optimal förberedelse av prov- och mustransplantatplats för transplantat och värdöverlevnad. Detta protokoll tillhandahåller en optimerad teknik för att transplantera mänsklig hud på möss och diskuterar nödvändiga överväganden för nedströms experimentella mål. Denna rapport beskriver lämplig beredning av ett humant donatorhudprov, montering av en kirurgisk installation, förberedelse av mus och kirurgisk plats, hudtransplantation och postkirurgisk övervakning. Anslutning till dessa metoder möjliggör underhåll av xenografter i över 6 veckor efter operationen. De tekniker som beskrivs nedan möjliggör maximal ympningseffektivitet på grund av utvecklingen av tekniska kontroller, steril teknik och pre- och postkirurgisk konditionering. Lämplig prestanda för xenograftmodellen resulterar i långlivade humana hudtransplantatprover för experimentell karakterisering av mänsklig hud och preklinisk testning av föreningar in vivo.
Introduction
Musmodeller används ofta för att dra slutsatser om mänsklig biologi och sjukdom, delvis på grund av deras experimentella reproducerbarhet och förmåga till genetisk manipulation. Musfysiologi rekapitulerar dock inte helt mänskliga organsystem, särskilt hud, och har därför begränsningar för användning som preklinisk modell vid läkemedelsutveckling1. Anatomiska skillnader mellan mus och mänsklig hud inkluderar skillnader i epiteltjocklekar och arkitektur, brist på murina ekkrina svettkörtlar och variationer i hårcykling2. Dessutom skiljer sig både immunsystemets medfödda och adaptiva armar mellan de två arterna3. Mushud innehåller en unik immunpopulation av dendritiska epidermala T-celler (DETC), har ett högre överflöd av dermala γδ T-celler och varierar i immuncelldelmängd lokalisering jämfört med mänsklig vävnad4. Därför drar experimentella fynd om mänsklig hudbiologi och inflammation nytta av validering med mänsklig vävnad. Medan in vitro - och organoidodlingssystem är allmänt använda verktyg för att studera mänsklig vävnad, är dessa system begränsade av frånvarande eller ofullständig immunrekonstitution och brist på anslutning till perifer vaskulatur5. Den humaniserade xenograft-hudtransplantationsmodellen syftar till att möjliggöra terapeutisk eller biologisk manipulation av immun- och icke-immunvägar i mänskliga vävnader in vivo.
Den mänskliga hudxenograftmodellen har använts för att studera hudfysiologi och farmakologi, analysera immunavstötning och svar, dissekera mänskliga hudcancermekanismer och förstå hudsjukdomar och sårläkning6. Även om den är tillämplig på flera områden av hudforskning, har xenograftmodellen lägre genomströmning än in vitro-studier och saknar den lätthet av genetisk manipulation som används i musmodeller. Tidpunkter inom denna modell kan variera från veckor till månader, och framgångsrik ympning kräver lämpliga anläggningar och utrustning för att utföra dessa operationer. Xenograftmodellen levererar emellertid biologiskt och fysiologiskt sammanhang till experiment, medan organoidodlingssystem, såsom vävnadsutplanteringar, ofta kräver replikering av en myriad av rörliga delar, såsom exogena signaler, vid specifika tidsintervall7. Därför används denna modell bäst för att ytterligare validera fynd som observerats in vitro och inom musmodeller, eller för arbete som annars inte är biologiskt genomförbart. Lämplig användning av xenograftmodellen ger en unik möjlighet att studera och manipulera intakt mänsklig vävnad in vivo.
Optimering av xenograft hudtransplantationsmodell har förlitat sig på årtionden av forskning för att bevara transplantatintegriteten över tid. Avgörande för denna process är att använda den icke-överviktiga diabetiska (NOD) -scid interleukin-2 gamma chain receptor (NSG) musen, som saknar B- och T-adaptiva immunceller, funktionella NK-celler och har brister i makrofag och dendritiska celler8. Den immunbristiga naturen hos dessa NSG-värdar möjliggör transplantation av humana hematopoetiska celler, patient-härledda cancerformer och hud 8,9,10. Trots denna immunsuppressiva värdmiljö är ytterligare undertryckande av musens neutrofila immunsvar genom administrering av anti-GR1 nödvändig för transplantatframgång10. De viktigaste hindren vid transplantation av intakt vävnad är infektion, avstötning och svårigheter att återupprätta blodflödet till transplantatet, vilket ibland leder till förlust av dermal och epidermal integritet11. Tekniker inklusive administrering av anti-FR1 och användning av lämpligt transplantatdjup förbättrartransplantatöverlevnaden 10. Noggrann optimering gör det möjligt att utföra mänskliga xenografthudtransplantationer på NSG-möss med hög effektivitet och överlevnad, från 90% -100%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna studie godkändes och utfördes i enlighet med UCSF IACUC (AN191105-01H) och IRB (13-11307) protokoll. Hudprover, kasserade som en del av rutinmässiga elektiva kirurgiska ingrepp, såsom bråckreparation, användes för den nuvarande forskningen. Hudproverna är antingen avidentifierade och certifierade som Not Human Subjects Research eller, om kliniskt identifierande information krävs för nedströmsanalyser, gav patienter skriftligt samtycke enligt IRB-protokoll 13-11307. Inga andra inklusions- eller exklusionskriterier användes. NSG-möss av båda könen, 8-10 veckors ålder, anställdes i studien. Mössen erhölls från kommersiella källor (se Materialförteckning).
1. Behandling av donatorns hudprov från människa
OBS: Det mänskliga hudprovet som användes vid denna transplantation var ett stort prov som samlades in från buken hos en frisk patient. Provet måste vara minst 15 cm x 7,5 cm. Storleksbegränsningar kan påverka antalet möss för vilka hud är tillgänglig och valet av transplantatstorlek.
- Håll hudprovet kallt (på is; 4 °C) före beredning och ympning. Förvara provet fuktigt i en sluten uppsamlingskopp med gasväven indränkt i fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
OBS: Förvaring av hudprovet vid 4 °C längre än 2 dagar rekommenderas inte. Det finns dock rapporter där hudproverna lagras under en längre tid12.
VARNING: Behandla all mänsklig vävnad med vanliga försiktighetsåtgärder för biohazard. - Förbered dig på att dermatomera det mänskliga hudprovet i en steriliserad vävnadsodlingshuv med negativt tryck på ett steriliserat dissektionskort.
- Placera hudprovet, epidermis sida uppåt, på dissektionsbrädet. Torka av epidermis med en steril alkoholförberedelseplatta och sedan med PBS.
- Fäst den närmare kanten av huden på plats med en 1,5 i dissekerande T-stift (se Materialförteckning).
- Dermatom hudprovet vid en tjocklek på 400 μm, applicera stadigt tryck medan du skär framåt i en 30 ° -45 ° vinkel. Följ alla instrumentspecifika instruktioner och säkerhetsåtgärder (se Materialförteckning).
OBS: För detaljer om dermatomtekniken, se en tidigare publicerad rapport13. - Förbered en 100 mm x 20 mm petriskål genom att placera en steril gasväv som blötläggs i steril PBS längst ner i skålen. Placera huden, epidermis sida uppåt, på den våta gasbindningen.
- Försegla och täck plattkanterna med en halvtransparent tätningsfilm (se materialtabell) för att säkerställa att provet inte är förorenat. Förvara provet vid 4 °C före ympning.
2. Konditionering och förberedelse före operationen
- Förbered de sterila instrumenten och en steril kirurgisk station för ympning. Använd autoklaverade pappershanddukar som sterila ytor för instrument- och musplacering.
OBS: Möss kan ympas efter avvänjning men ympas helst mellan 8-10 veckors ålder. Möss av båda könen kan ympas. - Utför den kirurgiska förberedelsen, såsom hårborttagning, i ett område som är fysiskt skilt från operationsstationen.
- Bered anti-GR1 (se materialtabell) genom att späda den till 1 mg/ml i steril saltlösning. Dosera varje mus med 100 μg/100 μl av anti-GR1-lösningen intraperitonealt efter anestesinduktion.
- Bedöva mössen, en i taget, med isofluran eller andra institutionellt godkända anestetika.
OBS: Isofluran måste ges i en koncentration på 3%-5% under induktion. När musen är orörlig, sänk isoflurankoncentrationen till 1% -3% för att påverka under hela operationen.- Övervaka musen för lämpligt anestesidjup genom att observera andningsfrekvens, frånvaro av tå-nypa-respons och lämplig rosa färgning av öron och mun.
VARNING: Använd lämpliga anestesimaskiner och rensningsmetoder och undvik exponering för isofluranångor.
- Övervaka musen för lämpligt anestesidjup genom att observera andningsfrekvens, frånvaro av tå-nypa-respons och lämplig rosa färgning av öron och mun.
- Överför musen till en värmedyna eller en annan värmekälla (se Materialförteckning).
- Administrera den oftalmiska salvan genom att dabba en liten droppe salva på ögat med ett handskefinger.
- Administrera smärtstillande medel Buprenorfin (0,08 mg/kg) och Carprofen (5 mg/kg) (se materialförteckning) subkutant genom att klämma fast huden och injicera i en vinkel parallell med kroppen.
OBS: Förbered analgesi före behandling enligt institutionella protokoll. Följ institutionella riktlinjer för val och administrering av smärtstillande medel. Metoden för analgesi som används i denna studie beskrivs i steg 2.7 och kompletterande figur 1. - Administrera anti-GR1 (beredd i steg 2.4) intraperitonealt genom att lyfta musen något i svansen, exponera buken och injicera i 30° vinkel med en insulinspruta på 1 ml (12,7 mm).
- Använd djursäkra elektriska klippare (se materialtabell) för att raka de mellersta och övre delarna av musens dorsala sida.
- Rensa allt hår och applicera en generös mängd hårborttagningssalva på den rakade huden i 30 s till 1 min.
- Torka helt bort hårborttagningssalva med en pappershandduk och PBS.
3. Förfarande vid transplantation
- Överför musen till en sekundär kirurgisk plats, bort från hårborttagningsstationen.
- Sterilisera operationsplatsen med jodpinnen i en cirkulär rörelse, börja i mitten och träna mot kanten av det depilerade området.
- Placera en bit steril plastfolie över musen och skär ett fönster i plasten som är något större än storleken på området som ska ympas.
- Skär en rektangelformad 10 mm x 10 mm del av donatorhuden som ska ympas med en skalpell. Gör detta genom att hålla givarhuden ordentligt på plats med baksidan av tången och skära längs tången med skalpellen.
- Använd den kirurgiska saxen och klipp ett rektangulärt område av mushud som matchar storleken på donatorhudstycket och skapa en transplantatbädd. Använd pincett för att dra bort huden från kroppen och skär huden med saxen vinklad bort från kroppen för att undvika att skära djupt in i ansiktsbehandlingen.
- Placera donatorhudstycket, epidermis sida uppåt, på den förberedda transplantatbädden.
- Använd baksidan av tången, manipulera huden, glida fram och tillbaka tills donatorhuden ligger helt platt mot transplantatbädden.
- Tillsätt droppar kirurgiskt limvävnadslim (se materialtabell) där donatorhuden möter mushuden och håll musen och donatorhuden tillsammans med pincett i 1-2 s så att limet fäster vid vävnaderna. Försegla transplantatets kant helt och låt limet torka helt.
- Bandage mössen (figur 1) enligt stegen nedan.
- Skär en bit petrolatumgasväv (se materialtabell) tillräckligt stor för att täcka transplantatområdet helt.
- Täck transplantatet med petrolatumgasbindningen och tryck lätt gasbindningen mot huden med pincett.
- Skär en remsa av en transparent filmförband på längden så att bredden är tillräckligt stor för att täcka musens sår.
- Tryck fast det genomskinliga filmförbandet, limsidan nedåt, över gasbindningen. Rulla snabbt musen för att linda förbandet helt runt bålen, se till att det sitter tätt utan att hindra andning och alla lemmar är fria för rörelse.
- Placera musen i en återhämtningsbur och övervaka den tills den är vaken och rör sig. Ge en värmekälla på en del av buren i minst 15 minuter efter återhämtning.
OBS: Djuren förväntas återhämta sig inom 1-5 minuter efter att ha placerat dem i återhämtningsburen.
- Ensam rymmer mössen efter ympning.
- Administrera postkirurgisk analgesi enligt kraven i institutionella protokoll.
OBS: Buprenorfin (0,08 mg/kg) administrerades subkutant 4-6 timmar senare under denna studie.
4. Postkirurgiska ingrepp
- Injicera 100 μl (100 μg) anti-GR1 intra-peritonealt vid 4 dagar, 7 dagar och 11 dagar efter ympning för att förhindra transplantatavstötning (tilläggsfigur 1).
- Byt ut bandage vid behov och om de tas bort av möss.
- Rebandage alla möss på dag 7.
- Ta bort bandagen på dag 14.
- Övervaka mössen för tecken på transplantatavstötning och systemisk inflammation (viktminskning, håravfall, extrem slöhet).
- Skörda mössen mellan 3 och 6 veckor efter transplantatet.
- Avliva mössen via regulatorstyrd koldioxid (CO2) administrering följt av cervikal dislokation.
OBS: Följ institutionella riktlinjer för dödshjälp. - Dissekera hudtransplantaten från mössen14. Placera en del av transplantatet i 10% formalin i 24 timmar före paraffinbäddning och sektionering för histologifärgning9.
- Hacka hudtransplantaten med sax och smält enzymatiskt med 250 IE / ml kollagenas IV och 0,02 mg / ml DNas i cellodlingsmedier över natten. Färga cellerna för yt- och intracellulära markörer enligt den tidigare beskrivna proceduren14.
- Avliva mössen via regulatorstyrd koldioxid (CO2) administrering följt av cervikal dislokation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Människohudxenografter utfördes på NSG-möss inuti en superbarriärdjuranläggning. Framgång definierades av den långvariga transplantat- och musöverlevnaden och beteendehälsan hos möss efter transplantation. Dålig överlevnad under veckan efter operationen observerades ursprungligen som det största hindret för experimentell framgång, med upp till 50% av mössen som krävde eutanasi. Förbättrad steril teknik och bättre stöd för muskroppstemperaturer under och omedelbart efter operationen ökade kirurgisk överlevnad konsekvent till över 80% och ofta till 90% -100% överlevnad. Medan tillsatsen av antibiotika i musens dricksvatten testades, var det inte fast beslutet att förbättra resultaten och avbröts som en potentiell förvirring av resultaten. Framgångsrikt ympade möss bör verka aktiva och friska under dagarna efter transplantationen. Möss rörde sig runt i sin bur, utforskade, byggde bon och åt och drack som vanligt. En sjuk mus kan verka lat, icke-reaktiv och kanske inte äter eller dricker tillräckligt för att behålla sin vikt. Tillskott av slöa möss med mjukmatning och orala hydreringsalternativ kan hjälpa till efter kirurgisk återhämtning.
En xenograft som läker korrekt kommer först att sårskorpa och sedan återhämta sig inom cirka 50 dagar efter operationen. Transplantat kan dra ihop sig med tiden men förbli vidhäftande runt kanterna där donatorhuden möter musens hud (figur 2). Medan ympskabbning bör avta, kommer transplantaten att förbli tjockare och mer inflammerade än frisk mänsklig hud (figur 2). Överdriven sammandragning av transplantat kan uppstå, vilket minskar tillgänglig vävnad för slutpunktsanalys. Användning av transplantat av konsekvent storlek och lämplig transplantatplacering förväntas mildra sådana problem. Alla transplantat under fem oberoende experiment överlevde till skördetiden, upp till 50 dagar efter transplantationen.
Vävnadsanalys kan innefatta immunhistokemi och encellsanalyser efter enzymatisk matsmältning. En del av huden bearbetades genom matsmältning över natten i 250 IE / ml kollagenas typ IV och 0,02 mg / ml DNas i cellodlingsmedier (se materialtabell) och färgades för yt- och intracellulära markörer som tidigare beskrivits14. Analys med flödescytometri avslöjade den ihållande närvaron av humana immunceller i de flesta transplantat men antalet varierade mellan xenografter (figur 3A). Figur 3B visar representativa resultat från ett framgångsrikt transplantat (vänster) och ett som har misslyckats med att upprätthålla mänskliga immunceller (höger). Analys av hematoxylin och eosinfärgade (H&E) sektioner tagna från mitten av transplantatet avslöjade intakt, icke-devitaliserad hud bestående av human dermis och epidermis för både 35 och 50 dagars tidspunkter (Figur 4).
Figur 1: Metod för bandage mus efter operationen. Musen lindas tätt i petrolatumgasväv och transparent filmförband under anestesi. (A) Petrolatumgasväv placeras över ett område som är något större än det kirurgiska såret. (B) Det genomskinliga filmförbandet bereds: en lång remsa skärs något bredare än petrolatumgasväven. Underlaget som täcker limsidan av det transparenta filmförbandet avlägsnas delvis. (C) Filmens självhäftande sida pressas ordentligt mot musens baksida och lämnar en tum utrymme på filmens främre ände. (D) Musen är vänd på ryggen. Den överhängande främre delen av filmen pressas på musen och baksidan tas bort. (E) Musen är tätt insvept i filmen och det återstående stödet tas bort när musen lindas. (F) Musen är framgångsrikt insvept i förbandet och dess armar och ben är obehindrade. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representativa bilder från transplanterade djur från dag 10 till 21 efter transplantation. (A-C) Tre olika möss med optimala transplantationer vid dag 10. (D-E) Två olika möss med transplantationer dag 21. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Immuncellchimerism i ympad hud. Flödescytometridata för human immuncellåtervinning från xenografter. Data är gated på händelserna singlet, live, mänsklig CD45 + mus CD45-. (A) Antal celler (Live Human CD45+ Events) som återhämtats från två oberoende experiment. (B) Representativa diagram över CD45+ immuncellfärgning hos människa och mus i ett framgångsrikt transplantat (vänster) jämfört med transplantat med misslyckat underhåll av det mänskliga immunfacket (höger). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Histologi av ympad mänsklig hud vid dag 35 och 50. Ympad hud skördades från möss på dag 35 (A) eller 50 (B), konserverad i 10% formalin och paraffinbäddad och färgad för hematoxylin och Eosin (H&E). (A) Epidermis visar måttlig hyperplasi (akantos), lätt hypergranulos och kompakt ortokeratos. I papillärdermis finns det enstaka dilaterade och överbelastade kapillärer. Melanocyter och melaninpigment är närvarande i epidermis basala skikt. Dermis är måttligt cellulär och består av fylliga ovala fibroblaster med blek syncytial cytoplasma och spridda lymfocyter. (B) Epidermis består av stratifierat skivepitel, korgvävt ortokeratos i det kornade skiktet och har normal tjocklek. Melanocyter och melaninpigment är närvarande i epidermis basala skikt. Dermis visar ovala fibroblaster och något förbättrad extracellulär matrisavsättning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 1: Tidslinje för det protokoll som antagits för xenograftstudien. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Musxenograft-hudtransplantationsmodellen är en nyckelteknik för att mekanistiskt dissekera människors immunsvar i en in vivo-inställning 14. Framgångsrika hudxenografttransplantationer är beroende av lämplig beredning av möss och hudprover och möss och vidhäftning till aseptiska gnagarkirurgimetoder15. Snabb kylning och korrekt förvaring av hudprover vid kalla temperaturer i media (t.ex. steril saltlösning) är viktigt för att säkerställa fortsatt vävnadshälsa före transplantation12. Insamling av prover med delad tjocklek, med hjälp av ett instrument som ett dermatom, möjliggör konsistens i provdjupet mellan möss och ökar tillhandahållandet av näringsämnen från värden för att förbättra transplantatöverlevnaden10. Förlust av transplantatintegritet med epidermal sloughing kan observeras, särskilt i fulltjocklekstransplantat med störd blodtillförsel16. Musöverlevnad genom och efter operationen stöds av steril teknik, tillhandahållande av värme under och efter operationen och tekniker som minimerar kirurgisk tid, såsom att använda kirurgiskt lim15. Administrering av anti-GR1 efter transplantation möjliggör undertryckande av de återstående immunsvaren hos musen i den immunbristvärden för att främja transplantatöverlevnad10. Dessa metoder ökar sannolikheten för mus- och transplantatöverlevnad under xenografttransplantationsmodellen och förbättrar experimentella antal och reproducerbarhet från ett experiment till nästa.
Även om det är extremt användbart finns det några viktiga begränsningar för xenograft-hudtransplantationsmodellen, vilket har visats. För det första existerar transplantatet i en inflammatorisk miljö, troligen sekundär till övergående ischemi och infiltration av mänsklig ympad vävnad med murina myeloida celler. Således återspeglar det inte mänsklig hud i ett stabilt tillstånd och kanske inte helt återspeglar alla mänskliga inflammatoriska hudsjukdomar10,14. Att studera mänskliga inflammatoriska störningar genom ympning av kliniska biopsier från lesionell hud är en alternativ strategi, men begränsningar i antalet tillgängliga biopsier och inkonsekvent kontroll av ympningsdjupet gör detta alternativ mindre gynnsamt. Dessutom rekapitulerar xenografttransplantationer inte den mänskliga perifera immunarkitekturen. Rekonstituering av musens periferi med mänskliga celler kan också bära försiktighetsåtgärder, eftersom NSG-musens lymfoida struktur är atrofisk före mänsklig cellingraftment; Detta kan leda till preferenscellval i vissa inställningar10,17. Dessutom kan hudtransplantation och immuncellåterhämtning från hudprover variera från mus till mus, även i avsaknad av behandling. Minst 10 replikat per villkor rekommenderas för den här modellen för att observera konsekventa skillnader mellan grupper. Den lämpliga varaktigheten av analysen kan behöva justeras för den experimentella frågan, eftersom transplantatläkning och re-vaskularisering sker under de första veckorna efter transplantationen, och effekten av ingrepp kan bero på stadiet av engraftment.
Trots dessa nackdelar är den mänskliga xenograft-hudtransplantationsmodellen fortfarande en av få analyser för att studera immunsvar från mänsklig hud i det intakta organet in vivo. Medan transgena musmodeller kan möjliggöra mekanistisk vägdissektion, begränsar skillnader i anatomi, immuncellsammansättning och dominerande immunvägar översättning till mänsklig sjukdom1. Ex vivo-odling av celler som härrör från människa, hudorganoidmodeller och explantstudier av mänsklig vävnad kan användas alternativt men är också föremål för begränsningar, inklusive störningar i immuncellnätverk och utgång av immunceller från den intakta vävnaden18,19. Därför är xenograft-hudtransplantationsmodellerna fortfarande en nyckelmetod för att studera terapeutiska kandidater och humana hudsvar på inflammation i en preklinisk in vivo-miljö.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
MDR är en av grundarna av TRex Bio och Sitryx. MDR och MML får forskningsmedel från Sitryx, Q32 och TRex Bio.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades delvis av sponsrade forskningsavtal från TRex Bio och bidrag från NIH (1R01AR075864-01A1). JMM stöds av Cancer Research Society (bidrag 26005). Vi erkänner Parnassus Flow Cytometry Core som delvis stöds av bidrag NIH P30 DK063720, S10 1S10OD021822-01 och S10 1S10OD018040-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher | SF100-20 | Fixative for histology |
| 3M Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | surgical glue |
| Alexa 700 CD45 monoclonal antibody (Clone 30F11) | Thermo Fischer | 56-0451-82 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Anti-GR1 clone RB6-8C5 | BioXcell | BE0075 | Anti-rejection |
| APC mouse anti-human CD25 (Clone 2A3) | BD Biosciences | 340939 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| APC-eFluor 780 anti-human HLA-DR (Clone LN3) | eBioscience | 47-9956-42 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Autoclave pouches | VWR | 89140-800 | For autoclaving tools and paper towels |
| Brilliant Violet 60 anti-human CD4 antibody (Clone OKT4 | Biolegend | 317438 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Brilliant Violet 65 anti-human CD8a antibody (Clone RPA-T8) | Biolegend | 301042 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Brilliant Violet 711 anti-human CD3 antibody (Clone OKT3) | Biolegend | 317328 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Buprenex 0.3 mg/mL | Covetrus | 059122 | Analgesia |
| Carprofen 50 mg/mL | Zoetis | NADA # 141-199 | Analgesia |
| Collagenase Type IV | Worthington | 4188 | Skin digestion |
| D42 Dermatome blade | Humeca | 5.D42BL10 | dermatome (1 blade per sample) |
| Dermatome D42 | Humeca | 4.D42 | dermatome |
| Disposable Scalpel | Bard-Parker | 371610 | skin preparation |
| Dissecting T-Pins; 1-1/2 inch, 1000/CS 1.5 | Cole-Parmer | UX-10915-03 | To pin skin specimen for dermatome |
| Dissection scissors | medicon | 02.04.10 | sample preparation and mouse dissection |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25-1G | Skin digestion |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent | eBioscience | 00-5521-00 | Flow cytometry analysis: Cell Fixation and Permeabilization |
| eFluor-450 FOXP3 monoclonal antibody (Clone PCH101) | eBioscience | 48-4776-42 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| Electric clippers | Kent | CL8787-KIT | hair removal |
| Epredia Shandon Instant Eosin | Fisher Scientific | 6765040 | H&E |
| Epredia Shandon Instant Hematoxylin | Fisher Scientific | 6765015 | H&E |
| FITC anti-human CD45 (Clone HI30) | Tonbo Biosciences | 35-0459-T100 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Forceps | medicon | 07.60.07 | sample preparation and mouse dissection |
| Gauze | Fisherbrand | 22-362-178 | Sample preparation |
| Heating lamp | Morganville Scientific | HL0100 | Post-surgical care |
| Heating pads 4" x 10" | Pristech | 20415 | Surgical heat supply |
| Insulin 1cc 12.7 mm syringes | BD | 329410 | drug administration |
| Isoflurane | United States Pharmacopeia (USP) | NDC 66794-013-25 | Anesthesia |
| Isoflurane machine | VetEquip | 911103 | Anesthesia |
| Nair for Men | Nair | 10022600588556 | hair removal |
| Neomycin and Polymyxin Bisulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic ointment | Dechra | NDC 17478-235-35 | eye ointment to prevent drying |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | The Jackson Laboratory | 005557 | Mice |
| Paper towels | Kleenex | 100848 | May be autoclaved for sterile surfaces |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | Semitransparent sealing film |
| PE mouse anti-human CD127 (Clone HIL-7R-M21) | BD Biosciences | 557938 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| PE-Cy-7 mouse anti-Ki-67 (Clone B56) | BD Biosciences | 561283 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| PerCP-eFluor-710 CD152 (CTLA-4) monoclonal antibody (Clone 14D3) | eBioscience | 46-1529-42 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| Permeabilization Buffer 10x | eBioscience | 00-8333-56 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining buffer |
| Petri Dish 150 mm | Corning | 430597 | Sample storage |
| Plastic Wrap | Fisherbrand | 22-305-654 | Site preparation |
| Providone-Iodine Swab stick | PDI | S41350 | Site sterilization |
| Soft-Feed and Oral Hydration (Napa Nectar) | Se Lab Group Inc | NC9066511 | For supplementing poorly recovering mice post-surgery |
| Specimen Collection Cups | Fisher Scientific | 22-150-266 | sample storage |
| Sterile alcohol prep pad | Fisherbrand | 22-363-750 | skin preparation |
| Sterile PBS | Gibco | 14190-144 | Media for sample storage |
| Sterile saline | Hospira | NDC 0409-4888-02 | For drug dilution |
| Tegaderm Film 4” x 43/4” | 3M | 1626 | transparent film wound dressing |
| Vaseline Petrolatum Gauze 3” x 8” | Kendall | 414600 | wound dressing |
| Violet 510 Ghost Dye | Tonbo Biosciences | 13-0870-T100 | Flow cytometry analysis: Viability dye |
References
- Zomer, H. D., Trentin, A. G. Skin wound healing in humans and mice: Challenges in translational research. Journal of Dermatological Science. 90 (1), 3-12 (2018).
- Wong, V. W., Sorkin, M., Glotzbach, J. P., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. Surgical approaches to create murine models of human wound healing. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 969618 (2011).
- Mestas, J., Hughes, C. C. W. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. The Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
- Pasparakis, M., Haase, I., Nestle, F. O. Mechanisms regulating skin immunity and inflammation. Nature Reviews Immunology. 14 (5), 289-301 (2014).
- Sun, H., Zhang, Y. -X., Li, Y. -M. Generation of skin organoids: potential opportunities and challenges. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 3176 (2021).
- Cristóbal, L., et al. Mouse models for human skin transplantation: a systematic review. Cells Tissues Organs. 210 (4), 250-259 (2021).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/γcnull mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Meraz, I. M., et al. An improved patient-derived xenograft humanized mouse model for evaluation of lung cancer immune responses. Cancer Immunology Research. 7 (8), 1267-1279 (2019).
- Racki, W. J., et al. NOD-scid IL2rgamma(null) mouse model of human skin transplantation and allograft rejection. Transplantation. 89 (5), 527-536 (2010).
- Meehan, G. R., et al. Developing a xenograft model of human vasculature in the mouse ear pinna. Scientific Reports. 10 (1), 2058 (2020).
- Gokkaya, A., et al. Skin graft storage in platelet rich plasma (PRP). Dermatologic Therapy. 33 (1), 13178 (2020).
- Humeca, B. V. The Humeca D42 and D80 battery operated cordless dermatomes. , Available from: https://www.youtube.com/watch?v=YCRowX-TdA (2021).
- Rodriguez, R. S., et al. Memory regulatory T cells reside in human skin. The Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1027-1036 (2014).
- Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A.
- Karim, A. S., et al. Evolution of ischemia and neovascularization in a murine model of full thickness human wound healing. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 28 (6), 812-822 (2020).
- Ali, N., et al. Xenogeneic graft-versus-host-disease in NOD-scid IL-2Rγnull mice display a T-effector memory phenotype. PloS One. 7 (8), 44219 (2012).
- Souci, L., Denesvre, C.
- Holtkamp, S. J., et al. Circadian clocks guide dendritic cells into skin lymphatics. Nature Immunology. 22 (11), 1375-1381 (2021).
