Summary
Mevcut protokol, insan derisinin obez olmayan diyabetik (NOD)-scid interlökin-2 gama zinciri reseptörü (NSG) farelere nasıl aşılanacağını açıklamaktadır. Nakil için insan derisinin hazırlanması, nakil için farelerin hazırlanması, bölünmüş kalınlıkta insan derisinin nakli ve nakil sonrası iyileşme prosedürünün ayrıntılı bir açıklaması raporda yer almaktadır.
Abstract
İnsan donör derisinin immün yetmezlikli bir fare konağına nakledildiği insan derisi ksenograft modeli, cilt immünolojisinde translasyonel araştırmalar için önemli bir seçenektir. Murin ve insan derisi anatomi ve bağışıklık hücresi kompozisyonunda önemli ölçüde farklılık gösterir. Bu nedenle, geleneksel fare modellerinin dermatolojik araştırma ve ilaç keşfi için sınırlamaları vardır. Bununla birlikte, başarılı ksenotransplantasyonlar teknik olarak zordur ve greft ve konakçı sağkalımı için optimal numune ve fare greft bölgesi hazırlığı gerektirir. Mevcut protokol, insan derisinin farelere nakli için optimize edilmiş bir teknik sağlar ve aşağı akış deneysel amaçları için gerekli hususları tartışır. Bu rapor, bir insan donör cilt örneğinin uygun şekilde hazırlanmasını, cerrahi bir kurulumun montajını, fare ve cerrahi alan hazırlığını, cilt naklini ve cerrahi sonrası izlemeyi açıklamaktadır. Bu yöntemlere bağlılık, ksenogreftlerin ameliyat sonrası 6 haftadan fazla bir süre boyunca sürdürülmesini sağlar. Aşağıda özetlenen teknikler, mühendislik kontrollerinin, steril tekniğin ve ameliyat öncesi ve sonrası şartlandırmanın geliştirilmesi nedeniyle maksimum aşılama verimliliğine izin vermektedir. Ksenograft modelinin uygun performansı, insan derisinin deneysel karakterizasyonu ve bileşiklerin in vivo klinik öncesi testleri için uzun ömürlü insan derisi greft örnekleri ile sonuçlanır.
Introduction
Fare modelleri, kısmen deneysel tekrarlanabilirlikleri ve genetik manipülasyon kapasiteleri nedeniyle, insan biyolojisi ve hastalığı hakkında çıkarımlar yapmak için sıklıkla kullanılır. Bununla birlikte, fare fizyolojisi insan organ sistemlerini, özellikle cildi tamamen özetlemez ve bu nedenle ilaç geliştirmede klinik öncesi bir model olarak kullanım sınırlamaları vardır1. Fare ve insan derisi arasındaki anatomik farklılıklar arasında epitel kalınlıkları ve mimarisindeki farklılıklar, murin ekrin ter bezlerinin eksikliği ve saç döngüsündeki farklılıklarbulunur 2. Ayrıca, bağışıklık sisteminin hem doğuştan gelen hem de adaptif kolları iki tür arasında farklıdır3. Fare derisi, dendritik epidermal T hücrelerinin (DETC'ler) benzersiz bir bağışıklık popülasyonunu içerir, daha yüksek miktarda dermal γδ T hücresine sahiptir ve insan dokusuna kıyasla bağışıklık hücresi alt kümesi lokalizasyonunda değişir4. Bu nedenle, insan derisi biyolojisi ve inflamasyonu ile ilgili deneysel bulgular, insan dokusu ile doğrulamadan yararlanmaktadır. İn vitro ve organoid kültür sistemleri insan dokusunu incelemek için yaygın olarak kullanılan araçlar olsa da, bu sistemler eksik veya eksik immün rekonstrüksiyon ve periferik vaskülatür5 ile bağlantı eksikliği ile sınırlıdır. İnsanlaştırılmış ksenograft deri nakli modeli, insan dokularındaki immün ve immün olmayan yolakların in vivo olarak terapötik veya biyolojik manipülasyonuna izin vermeyi amaçlamaktadır.
İnsan derisi ksenograft modeli, cilt fizyolojisi ve farmakolojisini incelemek, bağışıklık reddini ve yanıtlarını analiz etmek, insan derisi kanseri mekanizmalarını incelemek ve cilt hastalıklarını ve yara iyileşmesini anlamak için kullanılmıştır6. Cilt araştırmasının birden fazla alanına uygulanabilir olsa da, ksenogreft modeli, in vitro çalışmalardan daha düşük verime sahiptir ve fare modellerinde kullanılan genetik manipülasyon kolaylığından yoksundur. Bu modeldeki zaman noktaları haftalardan aylara kadar değişebilir ve başarılı aşılama, bu ameliyatları gerçekleştirmek için uygun tesis ve ekipman gerektirir. Bununla birlikte, ksenograft modeli deneylere biyolojik ve fizyolojik bağlam sağlarken, doku eksplantları gibi organoid kültür sistemleri genellikle belirli zaman aralıklarında eksojen sinyaller gibi sayısız hareketli parçanın çoğaltılmasını gerektirir7. Bu nedenle, bu model en iyi şekilde in vitro ve fare modellerinde gözlemlenen bulguları daha da doğrulamak veya biyolojik olarak mümkün olmayan işler için kullanılır. Ksenograft modelinin uygun kullanımı, bozulmamış insan dokusunu in vivo olarak incelemek ve manipüle etmek için eşsiz bir fırsat sağlar.
Ksenograft cilt nakli modelinin optimizasyonu, zaman içinde greft bütünlüğünü korumak için onlarca yıllık araştırmalara dayanmaktadır. Bu süreç için kritik olan, B ve T adaptif bağışıklık hücrelerinden, fonksiyonel NK hücrelerinden yoksun olan ve makrofaj ve dendritik hücrelerde eksiklikleri olan obez olmayan diyabetik (NOD)-scid interlökin-2 gama zinciri reseptörü (NSG) faresini kullanmaktır8. Bu NSG konakçılarının immün yetmezlikli doğası, insan hematopoetik hücrelerinin, hasta kaynaklı kanserlerin ve cildin 8,9,10 transplantasyonuna izin verir. Bu immünsüpresif konakçı ortama rağmen, anti-GR1 uygulaması ile fare nötrofilik immün yanıtlarının daha fazla baskılanması greft başarısı için gereklidir10. Sağlam doku naklinde başlıca engeller enfeksiyon, reddetme ve greftten kan akışını yeniden kurmada zorluktur, bazen dermal ve epidermal bütünlüğün kaybına yol açar11. Anti-FR1 uygulaması ve uygun greft derinliğinin kullanımını içeren teknikler greft sağkalımını iyileştirir10. Titiz optimizasyon, NSG fareleri üzerinde% 90 ila% 100 arasında değişen yüksek verimlilik ve hayatta kalma oranları ile insan ksenograft cilt nakillerinin gerçekleştirilmesini mümkün kılar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma UCSF IACUC (AN191105-01H) ve IRB (13-11307) protokollerine uygun olarak onaylanmış ve gerçekleştirilmiştir. Bu araştırma için fıtık onarımı gibi rutin elektif cerrahi prosedürlerin bir parçası olarak atılan deri örnekleri kullanılmıştır. Cilt örnekleri ya İnsan Denekler Araştırması Değil olarak tanımlanmamış ve sertifikalandırılmıştır ya da aşağı akış analizleri için klinik olarak tanımlayıcı bilgiler gerekiyorsa, hastalar IRB protokolü 13-11307 kapsamında yazılı onay vermiştir. Başka hiçbir dahil etme veya hariç tutma kriteri kullanılmamıştır. Çalışmada her iki cinsiyetten de 8-10 haftalık NSG fareleri kullanıldı. Fareler ticari kaynaklardan elde edilmiştir (bakınız Malzeme Tablosu).
1. Donör insan derisi örneğinin işlenmesi
NOT: Bu nakilde kullanılan insan derisi örneği, sağlıklı bir hastanın karnından toplanan büyük bir örnektir. Örnek en az 15 cm x 7,5 cm olmalıdır. Boyut sınırlamaları, cildin mevcut olduğu fare sayısını ve greft boyutunun seçimini etkileyebilir.
- Hazırlama ve aşılamadan önce cilt örneğini soğuk sıcaklıklarda (buz üzerinde; 4 ° C) tutun. Numuneyi, fosfat tamponlu salin (PBS) içine batırılmış gazlı bezle kapalı bir numune toplama kabında nemli tutun.
NOT: Cilt örneğinin 4 °C'de 2 günden daha uzun süre saklanması önerilmez. Bununla birlikte, cilt örneklerinin daha uzun süre saklandığı raporlar mevcuttur12.
DİKKAT: Tüm insan dokularını standart biyolojik tehlike önlemleriyle tedavi edin. - İnsan derisi örneğini, sterilize edilmiş bir diseksiyon panosu üzerindeki sterilize edilmiş bir negatif basınçlı doku kültürü davlumbazında dermatome hazırlamaya hazırlanın.
- Cilt örneğini, epidermis tarafını yukarıya, diseksiyon panosuna yerleştirin. Epidermisi steril bir alkol hazırlama pedi ve ardından PBS ile silin.
- Cildin daha yakın kenarını, T-pimini parçalara ayırırken 1,5 ile yerine sabitleyin (bkz.
- Cilt örneğini 400 μm kalınlığında dermatomlayın, 30 ° -45 ° 'lik bir açıyla ileri doğru keserken sabit basınç uygulayın. Cihaza özel tüm talimatları ve güvenlik önlemlerini izleyin (bkz.
NOT: Dermatom tekniği hakkında ayrıntılı bilgi için lütfen daha önce yayınlanmış bir rapor13'e bakınız. - Kabın dibine steril PBS'ye batırılmış steril bir gazlı bez yerleştirerek 100 mm x 20 mm'lik bir Petri kabı hazırlayın. Cildi, epidermis tarafı yukarıya, ıslak gazlı bezin üzerine yerleştirin.
- Numunenin kirlenmediğinden emin olmak için plaka kenarlarını yarı saydam bir sızdırmazlık filmi ile kapatın ve örtün (bkz. Aşılamadan önce numuneyi 4° C'de saklayın.
2. Ameliyat öncesi kondisyon ve hazırlık
- Steril aletleri ve aşılama için steril bir cerrahi istasyon hazırlayın. Alet ve fare yerleşimi için otoklavlanmış kağıt havluları steril yüzeyler olarak kullanın.
NOT: Fareler sütten kesildikten sonra aşılanabilir, ancak tercihen 8-10 haftalıkken aşılanırlar. Her iki cinsiyetten fareler de aşılanabilir. - Epilasyon gibi cerrahi hazırlığı, cerrahi istasyondan fiziksel olarak ayrılmış bir alanda gerçekleştirin.
- Anti-GR1'i (bakınız Malzeme Tablosu) steril salin içinde 1 mg/mL'ye seyrelterek hazırlayın. Her fareye anestezi indüksiyonunu takiben intraperitoneal olarak 100 μg / 100 μL anti-GR1 çözeltisi ile dozlayın.
- Fareleri birer birer izofluran veya diğer kurumsal olarak onaylanmış anesteziklerle uyuşturun.
NOT: İzofluran indüksiyon sırasında% 3-% 5'lik bir konsantrasyonda verilmelidir. Fare hareketsiz hale geldiğinde, ameliyat süresini etkilemek için izofluran konsantrasyonunu% 1 -% 3'e düşürün.- Solunum hızını, ayak parmağını sıkıştırma yanıtının yokluğunu ve kulakların ve ağzın uygun pembe renklenmesini gözlemleyerek fareyi uygun anestezi derinliği açısından izleyin.
DİKKAT: Uygun anestezik makineleri ve süpürme yöntemlerini kullanın ve izofluran buharlarına maruz kalmaktan kaçının.
- Solunum hızını, ayak parmağını sıkıştırma yanıtının yokluğunu ve kulakların ve ağzın uygun pembe renklenmesini gözlemleyerek fareyi uygun anestezi derinliği açısından izleyin.
- Fareyi bir ısıtma yastığına veya başka bir ısı kaynağına aktarın (bkz.
- Eldivenli bir parmakla göze küçük bir damla merhem sürerek oftalmik merhemi uygulayın.
- Analjezikler Buprenorfin (0.08 mg / kg) ve Karprofen (5 mg / kg) ( bakınız Malzeme Tablosu) cildi sıkıştırarak ve vücuda paralel bir açıyla enjekte ederek deri altından uygulayın.
NOT: Tedavi öncesi analjeziyi kurumsal protokollere uygun olarak hazırlayın. Analjeziklerin seçimi ve uygulanması için kurumsal yönergeleri izleyin. Bu çalışmada kullanılan analjezi yöntemi adım 2.7 ve Ek Şekil 1'de özetlenmiştir. - Anti-GR1'i (adım 2.4'te hazırlanan) fareyi kuyruğundan hafifçe kaldırarak, karnı açığa çıkararak ve insülin 1 mL (12.7 mm) şırınga kullanarak 30° açıyla enjekte ederek intraperitoneal olarak uygulayın.
- Farenin sırt tarafının orta ve üst kısımlarını tıraş etmek için hayvanlara uygun elektrikli makaslar kullanın (bkz.
- Tüm saçları temizleyin ve tıraş olmuş cilde 30 s ila 1 dakika boyunca bol miktarda epilasyon merhemi uygulayın.
- Epilasyon merhemini bir kağıt havlu ve PBS ile tamamen silin.
3. Transplantasyon prosedürü
- Fareyi epilasyon istasyonundan uzakta ikincil bir cerrahi yere aktarın.
- Cerrahi bölgeyi, iyot çubuk çubuğu ile dairesel bir hareketle, ortadan başlayarak ve epilasyon yapılan alanın kenarına doğru çalışarak sterilize edin.
- Farenin üzerine bir parça steril plastik sargı yerleştirin ve plastiğin içindeki pencereyi, aşılanacak alanın boyutundan biraz daha büyük olarak kesin.
- Donör derisinin dikdörtgen şeklindeki 10 mm x 10 mm'lik bir kısmını neşterle aşılamak üzere kesin. Bunu, donör derisini forsepslerin arka tarafı ile sıkıca yerinde tutarak ve forsepslerin yanında neşterle keserek yapın.
- Cerrahi makası kullanarak, donör cilt parçasının boyutuna uyan fare derisinin dikdörtgen bir alanını kırpın ve bir greft yatağı oluşturun. Cildi vücuttan uzaklaştırmak için forseps kullanın ve fasiya derinlemesine kesilmesini önlemek için cildi vücuttan uzağa açılı makasla kesin.
- Donör deri parçasını, epidermis tarafı yukarıya, hazırlanan greft yatağına yerleştirin.
- Forsepslerin arkasını kullanarak, cildi manipüle edin, donör cilt greft yatağına karşı tamamen düz durana kadar ileri geri kaydırın.
- Donör cildinin fare derisiyle buluştuğu cerrahi tutkal dokusu yapıştırıcısı damlaları ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve fare ve donör cildini forseps ile birlikte 1-2 s boyunca tutun, böylece yapıştırıcı dokulara yapışır. Greftin kenarını tamamen kapatın ve yapıştırıcının tamamen kurumasını bekleyin.
- Aşağıdaki adımları izleyerek fareleri bandajlayın (Şekil 1).
- Greft alanını tamamen kaplayacak kadar büyük bir parça petrolatum gazlı bez (bkz.
- Grefti petrolatum gazlı bezle örtün ve forseps kullanarak gazlı bezi cilde hafifçe bastırın.
- Şeffaf bir film pansuman şeridini uzunlamasına kesin, böylece genişlik farenin yarasını örtecek kadar büyük olur.
- Şeffaf film pansumanını, yapışkan tarafı aşağıya, gazlı bezin üzerine sıkıca bastırın. Pansumanı gövdenin etrafına tamamen sarmak için fareyi hızlı bir şekilde yuvarlayın, solunumu engellemeden sıkıca oturduğundan ve tüm uzuvların hareket için serbest olduğundan emin olun.
- Fareyi bir kurtarma kafesine yerleştirin ve uyanana ve hareket edene kadar izleyin. İyileşmeyi takiben kafesin bir kısmında en az 15 dakika boyunca bir ısı kaynağı sağlayın.
NOT: Hayvanların kurtarma kafesine yerleştirildikten sonra 1-5 dakika içinde iyileşmeleri beklenir.
- Aşılamayı takiben fareleri tek başına barındırın.
- Cerrahi sonrası analjezi kurumsal protokollerin gerektirdiği şekilde uygulanır.
NOT: Buprenorfin (0.08 mg/kg) bu çalışma sırasında 4-6 saat sonra deri altından uygulandı.
4. Ameliyat sonrası işlemler
- Greft reddini önlemek için greftlemeden 4 gün, 7 gün ve 11 gün sonra periton içi olarak 100 μL (100 μg) anti-GR1 enjekte edin (Ek Şekil 1).
- Bandajları gerektiği gibi ve fareler tarafından çıkarılırsa değiştirin.
- 7. günde tüm fareleri geri alın.
- Bandajları 14. günde çıkarın.
- Greft reddi ve sistemik inflamasyon belirtileri (kilo kaybı, saç dökülmesi, aşırı uyuşukluk) için fareleri izleyin.
- Greftten 3 ila 6 hafta sonra fareleri hasat edin.
- Regülatör kontrollü karbondioksit (CO2) uygulaması ve ardından servikal çıkık yoluyla fareleri ötenazileştirin.
NOT: Ötanazi için kurumsal yönergeleri izleyin. - Cilt greftlerini farelerden disseke edin14. Histoloji boyama9 için parafin gömme ve kesitleme işleminden önce greftin bir kısmını 24 saat boyunca% 10 formalin içine yerleştirin.
- Cilt greftlerini makasla kesin ve gece boyunca hücre kültürü ortamında 250 IU / mL Kollajenaz IV ve 0.02 mg / mL DNaz ile enzimatik olarak sindirin. Daha önce tarif edilen prosedür14'ü takiben yüzey ve hücre içi belirteçler için hücreleri lekeleyin.
- Regülatör kontrollü karbondioksit (CO2) uygulaması ve ardından servikal çıkık yoluyla fareleri ötenazileştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İnsan derisi ksenogreftleri, süper bariyerli bir hayvan tesisinde NSG fareleri üzerinde gerçekleştirildi. Başarı, nakil sonrası farelerin uzun süreli greft ve fare sağkalımı ve davranışsal sağlığı ile tanımlanmıştır. Ameliyatı takip eden hafta boyunca zayıf sağkalım başlangıçta deneysel başarının önündeki en büyük engel olarak gözlendi ve farelerin% 50'sine kadarı ötenazi gerektiriyordu. Steril tekniğin iyileştirilmesi ve ameliyat sırasında ve hemen sonrasında fare vücut ısısının daha iyi desteklenmesi, cerrahi sağkalımı tutarlı bir şekilde% 80'in üzerine ve genellikle% 90-100 sağkalıma yükseltti. Fare içme suyuna antibiyotik eklenmesi denenirken, sonuçları iyileştirmek için belirlenmedi ve sonuçların potansiyel bir karıştırıcısı olarak kesildi. Başarılı bir şekilde aşılanmış fareler, nakli takip eden günlerde aktif ve sağlıklı görünmelidir. Fareler kafeslerinin etrafında hareket ediyor, keşfediyor, yuva yapıyor ve her zamanki gibi yiyip içiyorlardı. Hasta olmayan bir fare tembel, reaktif olmayan görünebilir ve kilosunu korumak için yeterince yemek yemiyor veya içmiyor olabilir. Uyuşuk farelerin yumuşak besleme ve oral hidrasyon seçenekleriyle takviyesi, cerrahi sonrası iyileşmeye yardımcı olabilir.
Doğru şekilde iyileşen bir ksenogreft, önce kabuk kabuk dökecek ve daha sonra ameliyattan yaklaşık 50 gün sonra iyileşecektir. Greftler zamanla büzülebilir, ancak donör cildinin farenin derisiyle buluştuğu kenarların etrafında yapışkan kalır (Şekil 2). Greft kabuklanması azalırken, greftler sağlıklı insan derisinden daha kalın ve iltihaplı kalacaktır (Şekil 2). Greftlerin aşırı kasılması meydana gelebilir ve bu da son nokta analizi için mevcut dokuyu azaltır. Sürekli büyüklükte greftlerin kullanılması ve uygun greft yerleştirilmesinin bu tür sorunları hafifletmesi beklenmektedir. Beş bağımsız deney boyunca tüm greftler, nakil sonrası 50 güne kadar hasat zamanına kadar hayatta kaldı.
Doku analizi, enzimatik sindirimi takiben immünohistokimya ve tek hücre analizlerini içerebilir. Cildin bir kısmı, hücre kültürü ortamında 250 IU / mL Kollajenaz Tip IV ve 0.02 mg / mL DNaz içinde gece sindirimi ile işlendi (bakınız Malzeme Tablosu) ve daha önce tarif edildiği gibi yüzey ve hücre içi belirteçler için boyandı14. Akım sitometrisi ile yapılan analiz, çoğu greftte insan bağışıklık hücrelerinin sürekli varlığını ortaya koymuştur, ancak sayımlar ksenogreftler arasında değişmiştir (Şekil 3A). Şekil 3B, başarılı bir greftten (solda) ve insan bağışıklık hücrelerini koruyamayan (sağda) temsili sonuçları göstermektedir. Greftin merkezinden alınan hematoksilin ve eozin boyalı (H&E) kesitlerin analizi, hem 35 hem de 50 günlük zaman dilimleri için insan dermisi ve epidermisinden oluşan sağlam, cansızlaşmış olmayan bir deri ortaya çıkardı (Şekil 4).
Şekil 1: Ameliyattan sonra fareyi bandajlama yöntemi. Fare, anestezi altındayken petrolatum gazlı bez ve şeffaf film pansumanı ile sıkıca sarılır. (A) Petrolatum gazlı bez, cerrahi yaradan biraz daha büyük bir alana yerleştirilir. (B) Şeffaf film pansumanı hazırlanır: uzun bir şerit petrolatum gazlı bezden biraz daha geniş kesilir. Şeffaf film pansumanının yapışkan tarafını kaplayan destek kısmen çıkarılır. (C) Filmin yapışkan tarafı, farenin arkasına sıkıca bastırılır ve filmin ön ucunda bir inç boşluk bırakılır. (D) Fare sırt üstü çevrili. Filmin çıkıntılı ön kısmı farenin üzerine bastırılır ve destek çıkarılır. (E) Fare filme sıkıca sarılır ve fare sarılırken kalan destek çıkarılır. (F) Fare pansumana başarıyla sarılır ve kolları ve bacakları kısıtlanmamıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Nakledilen hayvanlardan 10. günden nakil sonrası 21. güne kadar temsili görüntüler. (A-C) 10. günde optimal nakli olan üç farklı fare. (D-E) 21. günde nakli olan iki farklı fare. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Aşılanmış deride immün hücre kimerizmi. Ksenogreftlerden insan immün hücre geri kazanımının akış sitometrisi verileri. Veriler, singlet, canlı, insan CD45 + fare CD45- olayları hakkında geçitlidir. (A) İki bağımsız deneyden elde edilen hücre sayısı (Canlı İnsan CD45+ Olayları). (B) Başarılı bir greftte (solda) insan ve fare CD45 + immün hücre boyamasının temsili çizimleri, insan bağışıklık bölmesinin başarısız bakımı ile greftle karşılaştırıldığında (sağda). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: 35. ve 50. günlerde aşılanmış insan derisinin histolojisi. Aşılanmış deri, 35 (A) veya 50 (B) gününde farelerden toplandı,% 10 formalin içinde korundu ve parafin gömülü ve Hematoksilin ve Eozin (H & E) için boyandı. (A) Epidermis orta derecede hiperplazi (akantoz), hafif hipergranüloz ve kompakt ortokeratoz gösterir. Papiller dermiste, ara sıra genişlemiş ve tıkalı kılcal damarlar vardır. Melanositler ve melanin pigmenti epidermisin bazal tabakasında bulunur. Dermis orta derecede hücreseldir ve soluk sinsityal sitoplazma ve dağınık lenfositlere sahip dolgun oval fibroblastlardan oluşur. (B) Epidermis, kornifiye tabakada tabakalaşmış skuamöz epitel, sepet örgülü ortokerozdan oluşur ve normal kalınlıktadır. Melanositler ve melanin pigmenti epidermisin bazal tabakasında bulunur. Dermiste oval fibroblastlar ve biraz artmış hücre dışı matriks birikimi görülür. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: Ksenograft çalışması için kabul edilen protokolün zaman çizelgesi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fare ksenograft cilt nakli modeli, insan derisi bağışıklık tepkilerini in vivo bir ortamda mekanik olarak incelemek için anahtar bir tekniktir14. Başarılı deri ksenogreft nakilleri, farelerin ve cilt örneklerinin ve farelerin uygun şekilde hazırlanmasına ve aseptik kemirgen cerrahisi yöntemlerine uyulmasına bağlıdır15. Hızlı soğutma ve cilt örneklerinin soğuk sıcaklıklarda (steril salin gibi) uygun şekilde depolanması, nakil öncesi doku sağlığının devam etmesini sağlamak için önemlidir12. Dermatom gibi bir alet kullanılarak bölünmüş kalınlıkta örneklerin toplanması, fareler arasındaki numune derinliğinde tutarlılığa izin verir ve greft sağkalımını iyileştirmek için konakçıdan besin tedarikini arttırır10. Epidermal sloughing ile greft bütünlüğünün kaybı, özellikle kan akımı bozulmuş tam kalınlıktaki greftlerde gözlenebilir16. Ameliyat sırasında ve sonrasında farenin hayatta kalması, steril teknik, ameliyat sırasında ve sonrasında ısı sağlanması ve cerrahi tutkal kullanımı gibi cerrahi süreyi en aza indiren teknikler15 ile desteklenir. Transplantasyonu takiben anti-GR1 uygulaması, greft sağkalımını desteklemek için immün yetmezlikli konakçıda kalan fare immün yanıtlarının baskılanmasına izin verir10. Bu yöntemler, ksenogreft nakli modeli sırasında fare ve greft sağkalımı olasılığını arttırır ve deneysel sayıları ve bir deneyden diğerine tekrarlanabilirliği geliştirir.
Son derece yararlı olmasına rağmen, gösterildiği gibi, ksenograft cilt nakli modelinde bazı önemli sınırlamalar vardır. İlk olarak, greft enflamatuar bir ortamda bulunur, büyük olasılıkla geçici iskemiye ve insan aşılanmış dokusunun murin miyeloid hücrelerle infiltrasyonuna sekonder olarak bulunur. Bu nedenle, insan derisini sabit bir durumda yansıtmaz ve tüm insan enflamatuar cilt hastalıklarını tam olarak yansıtmayabilir10,14. Lezyonel deriden klinik biyopsileri aşılayarak insan enflamatuar bozukluklarını incelemek alternatif bir stratejidir, ancak mevcut biyopsi sayısındaki sınırlamalar ve greftleme derinliğinin tutarsız kontrolü bu seçeneği daha az elverişli hale getirmektedir. Ek olarak, ksenogreft nakilleri insan periferik immün mimarisini özetlemez. Fare çevresinin insan hücreleri ile yeniden yapılandırılması da uyarılar içerebilir, çünkü NSG fare lenfoid yapısı insan hücresi engraftasyonundan önce atrofiktir; bu, bazı ayarlarda tercihli hücre seçimine yol açabilir10,17. Ek olarak, cilt engraftmanı ve cilt örneklerinden bağışıklık hücresi geri kazanımı, tedavinin yokluğunda bile fareden fareye değişebilir. Bu modelin gruplar arasındaki tutarlı farklılıkları gözlemlemesi için koşul başına en az 10 çoğaltma önerilir. Greft iyileşmesi ve yeniden vaskülarizasyon transplantasyonu takip eden ilk haftalarda meydana geldiğinden, tahlilin uygun süresinin deneysel soru için ayarlanması gerekebilir ve müdahalelerin etkisi engraftmanın aşamasına bağlı olabilir.
Bu dezavantajlara rağmen, insan ksenograft cilt nakli modeli, bozulmamış organdaki insan derisi bağışıklık tepkilerini in vivo olarak inceleyen birkaç tahlilden biri olmaya devam etmektedir. Transgenik fare modelleri mekanik yol diseksiyonuna izin verebilirken, anatomi, bağışıklık hücresi bileşimi ve baskın bağışıklık yollarındaki farklılıklar insan hastalığına geçişi sınırlar1. İnsan kaynaklı hücrelerin Ex vivo kültürü, deri organoid modelleri ve insan dokusu eksplant çalışmaları alternatif olarak kullanılabilir, ancak bağışıklık hücresi ağlarının bozulması ve bağışıklık hücrelerinin bozulmamış dokudan çıkması da dahil olmak üzere sınırlamalara tabidir18,19. Bu nedenle, ksenograft cilt nakli modelleri, klinik öncesi in vivo bir ortamda terapötik adayları ve inflamasyona karşı insan derisi yanıtlarını incelemek için kilit bir yöntem olmaya devam etmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
MDR, TRex Bio ve Sitryx'in kurucusudur. MDR ve MML, Sitryx, Q32 ve TRex Bio'dan araştırma fonu almaktadır.
Acknowledgments
Bu çalışma kısmen TRex Bio'nun sponsorlu araştırma anlaşmaları ve NIH'den (1R01AR075864-01A1) gelen hibelerle finanse edilmiştir. JMM, Kanser Araştırma Derneği tarafından desteklenmektedir (hibe 26005). Parnassus Flow Cytometry Core'un kısmen NIH P30 DK063720, S10 1S10OD021822-01 ve S10 1S10OD018040-01 hibeleriyle desteklendiğini kabul ediyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher | SF100-20 | Fixative for histology |
| 3M Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | surgical glue |
| Alexa 700 CD45 monoclonal antibody (Clone 30F11) | Thermo Fischer | 56-0451-82 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Anti-GR1 clone RB6-8C5 | BioXcell | BE0075 | Anti-rejection |
| APC mouse anti-human CD25 (Clone 2A3) | BD Biosciences | 340939 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| APC-eFluor 780 anti-human HLA-DR (Clone LN3) | eBioscience | 47-9956-42 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Autoclave pouches | VWR | 89140-800 | For autoclaving tools and paper towels |
| Brilliant Violet 60 anti-human CD4 antibody (Clone OKT4 | Biolegend | 317438 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Brilliant Violet 65 anti-human CD8a antibody (Clone RPA-T8) | Biolegend | 301042 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Brilliant Violet 711 anti-human CD3 antibody (Clone OKT3) | Biolegend | 317328 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Buprenex 0.3 mg/mL | Covetrus | 059122 | Analgesia |
| Carprofen 50 mg/mL | Zoetis | NADA # 141-199 | Analgesia |
| Collagenase Type IV | Worthington | 4188 | Skin digestion |
| D42 Dermatome blade | Humeca | 5.D42BL10 | dermatome (1 blade per sample) |
| Dermatome D42 | Humeca | 4.D42 | dermatome |
| Disposable Scalpel | Bard-Parker | 371610 | skin preparation |
| Dissecting T-Pins; 1-1/2 inch, 1000/CS 1.5 | Cole-Parmer | UX-10915-03 | To pin skin specimen for dermatome |
| Dissection scissors | medicon | 02.04.10 | sample preparation and mouse dissection |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25-1G | Skin digestion |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent | eBioscience | 00-5521-00 | Flow cytometry analysis: Cell Fixation and Permeabilization |
| eFluor-450 FOXP3 monoclonal antibody (Clone PCH101) | eBioscience | 48-4776-42 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| Electric clippers | Kent | CL8787-KIT | hair removal |
| Epredia Shandon Instant Eosin | Fisher Scientific | 6765040 | H&E |
| Epredia Shandon Instant Hematoxylin | Fisher Scientific | 6765015 | H&E |
| FITC anti-human CD45 (Clone HI30) | Tonbo Biosciences | 35-0459-T100 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Forceps | medicon | 07.60.07 | sample preparation and mouse dissection |
| Gauze | Fisherbrand | 22-362-178 | Sample preparation |
| Heating lamp | Morganville Scientific | HL0100 | Post-surgical care |
| Heating pads 4" x 10" | Pristech | 20415 | Surgical heat supply |
| Insulin 1cc 12.7 mm syringes | BD | 329410 | drug administration |
| Isoflurane | United States Pharmacopeia (USP) | NDC 66794-013-25 | Anesthesia |
| Isoflurane machine | VetEquip | 911103 | Anesthesia |
| Nair for Men | Nair | 10022600588556 | hair removal |
| Neomycin and Polymyxin Bisulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic ointment | Dechra | NDC 17478-235-35 | eye ointment to prevent drying |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | The Jackson Laboratory | 005557 | Mice |
| Paper towels | Kleenex | 100848 | May be autoclaved for sterile surfaces |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | Semitransparent sealing film |
| PE mouse anti-human CD127 (Clone HIL-7R-M21) | BD Biosciences | 557938 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| PE-Cy-7 mouse anti-Ki-67 (Clone B56) | BD Biosciences | 561283 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| PerCP-eFluor-710 CD152 (CTLA-4) monoclonal antibody (Clone 14D3) | eBioscience | 46-1529-42 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| Permeabilization Buffer 10x | eBioscience | 00-8333-56 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining buffer |
| Petri Dish 150 mm | Corning | 430597 | Sample storage |
| Plastic Wrap | Fisherbrand | 22-305-654 | Site preparation |
| Providone-Iodine Swab stick | PDI | S41350 | Site sterilization |
| Soft-Feed and Oral Hydration (Napa Nectar) | Se Lab Group Inc | NC9066511 | For supplementing poorly recovering mice post-surgery |
| Specimen Collection Cups | Fisher Scientific | 22-150-266 | sample storage |
| Sterile alcohol prep pad | Fisherbrand | 22-363-750 | skin preparation |
| Sterile PBS | Gibco | 14190-144 | Media for sample storage |
| Sterile saline | Hospira | NDC 0409-4888-02 | For drug dilution |
| Tegaderm Film 4” x 43/4” | 3M | 1626 | transparent film wound dressing |
| Vaseline Petrolatum Gauze 3” x 8” | Kendall | 414600 | wound dressing |
| Violet 510 Ghost Dye | Tonbo Biosciences | 13-0870-T100 | Flow cytometry analysis: Viability dye |
References
- Zomer, H. D., Trentin, A. G. Skin wound healing in humans and mice: Challenges in translational research. Journal of Dermatological Science. 90 (1), 3-12 (2018).
- Wong, V. W., Sorkin, M., Glotzbach, J. P., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. Surgical approaches to create murine models of human wound healing. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 969618 (2011).
- Mestas, J., Hughes, C. C. W. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. The Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
- Pasparakis, M., Haase, I., Nestle, F. O. Mechanisms regulating skin immunity and inflammation. Nature Reviews Immunology. 14 (5), 289-301 (2014).
- Sun, H., Zhang, Y. -X., Li, Y. -M. Generation of skin organoids: potential opportunities and challenges. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 3176 (2021).
- Cristóbal, L., et al. Mouse models for human skin transplantation: a systematic review. Cells Tissues Organs. 210 (4), 250-259 (2021).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/γcnull mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Meraz, I. M., et al. An improved patient-derived xenograft humanized mouse model for evaluation of lung cancer immune responses. Cancer Immunology Research. 7 (8), 1267-1279 (2019).
- Racki, W. J., et al. NOD-scid IL2rgamma(null) mouse model of human skin transplantation and allograft rejection. Transplantation. 89 (5), 527-536 (2010).
- Meehan, G. R., et al. Developing a xenograft model of human vasculature in the mouse ear pinna. Scientific Reports. 10 (1), 2058 (2020).
- Gokkaya, A., et al. Skin graft storage in platelet rich plasma (PRP). Dermatologic Therapy. 33 (1), 13178 (2020).
- Humeca, B. V. The Humeca D42 and D80 battery operated cordless dermatomes. , Available from: https://www.youtube.com/watch?v=YCRowX-TdA (2021).
- Rodriguez, R. S., et al. Memory regulatory T cells reside in human skin. The Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1027-1036 (2014).
- Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A.
- Karim, A. S., et al. Evolution of ischemia and neovascularization in a murine model of full thickness human wound healing. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 28 (6), 812-822 (2020).
- Ali, N., et al. Xenogeneic graft-versus-host-disease in NOD-scid IL-2Rγnull mice display a T-effector memory phenotype. PloS One. 7 (8), 44219 (2012).
- Souci, L., Denesvre, C.
- Holtkamp, S. J., et al. Circadian clocks guide dendritic cells into skin lymphatics. Nature Immunology. 22 (11), 1375-1381 (2021).
