Здесь мы представляем протокол изоляции БММ от крыс SD, называемый методом вторичной адгезии.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Выделение клеток моноцитарно-макрофаговой линии из костей крыс методом вторичной адгезии
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
При снижении минеральной плотности костной ткани кости чаще ломаются, что негативно сказывается на качестве жизни пациента. Рост и развитие костей в основном регулируются остеобластами и остеокластами. Широко признано, что остеокласты получают из моноцитарно-макрофаговых клеток костного мозга (BBM). БММ и другие гемопоэтические стволовые клетки расположены в полости костного мозга. Поэтому выделение одиночных стабильных БММ из разных и гетерогенных клеточных популяций является огромной проблемой. Здесь мы представляем протокол изоляции БММ от крыс SD, называемый методом вторичной адгезии. Адгезивные клетки, культивируемые в течение 24-48 ч в первичной культуре, собирали. Проточный цитометрический анализ показал, что примерно 37,94% клеток были CD11b/c+ (моноцитарно-макрофагальный поверхностный антиген). Окрашивание тартрат-резистентной кислой фосфатазой (TRAP) и анализ вестерн-блоттинга показали, что BBM могут дифференцироваться в остеокласты in vitro. Приведенные выше результаты свидетельствуют о том, что вторичные клетки адгезии могут рассматриваться как подходящая клеточная модель для исследования дифференцировки остеокластов.
Введение
Сообщалось, что клетки моноцитарно-макрофаговой линии, существующие в костном мозге, могут дифференцироваться в моноциты крови и тканевые макрофаги 1,2. Вышеуказанные клетки, которые могут дифференцироваться в остеокласты, чтобы сбалансировать рост и развитие костей, обычно используются в качестве клеточной модели для индуцирования остеокластов in vivo 3,4. Костный мозг представляет собой специальную ткань, содержащую несколько различных типов клеток, которые включают, но не ограничиваются только мезенхимальными стволовым....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все эксперименты в этом исследовании были проведены в соответствии с руководящими принципами экспериментов на животных Центра лабораторных исследований животных Чжэцзянского китайского медицинского университета (номер одобрения: IACUC-20181029-11).
1. Извлечение клеток
- Поместите крыс Sprague-Dawley (крысы SD, 1-10 дней, самец или самка) в клетки эвтаназии, заполненные CO2 со сбалансированной скоростью 30%-70% объема контейнера в минуту. После того, как крысы потеряют сознание (20-60 мин), усыпляют крысу путем вывиха шейки матки, чтобы обеспечить безболезненную смерть.
- Погрузите крыс в 75% спир....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Вторичная популяция адгезивных клеток была стабильной и однородной. При непрерывной пролиферации клеток большинство клеток становилось больше, с неправильной формой и росло в радиальный адгезивный диск (рисунок 2C,D). Проточная цитометрия показала, что процент клеток, экспрессирующих CD11b/c, молекулярный маркер на поверхности клеток моноцитарно-макрофаговой линии, составлял примерно 37,94% (рисунок 2A,B<.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Остеокласты являются одним из наиболее значимых типов клеток, участвующих в возникновении и развитии заболеваний костей, а также одним из основных объектов исследования заболеваний костей20. Моноциты / макрофаги могут дифференцироваться в остеокласты. Поскольку мононуклеарные макрофаги (клетки RAW264.7) слишком дороги в покупке и легко активируются во время культивирования, трудно проводить эксперименты по дифференцировке in vitro с использованием этой клеточной линии. Хотя было разработа.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.
Благодарности
Эта работа была поддержана Фондом естественных наук провинции Чжэцзян (грант No. LY19H060001) и Проект научно-технического плана традиционной китайской медицины провинции Чжэцзян (No 2022ZB093).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 35 мм2 срезы для лазания по клеткам | NEST Biotechnology | 80102 | |
| Антикатепсин K | Abcam | ab19027 | 1:1,000 |
| Контроль изотипа Anti-CD11 | Abcam | ab172730 | 1 μ г/тест, 1,675 мг/мл |
| Анти-CD11b/c | Absin | abs124232 | 1μ г/тест, 1 мг/мл |
| Anti-TRAP | Abcam | ab191406 | 1:1,000 |
| Анти-&бета;-актин | Beyotime | AF5003 | 1:1,000 |
| Клеточные лазающие срезы | NEST Biotechnology | 80102 | |
| Чашка для клеточных культур | 430167 | ||
| Колба для клеточных культур | 430168 | ||
| модифицированной орлиной средой Дульбекко (DMEM) | Gibco | C11995500BT | |
| фетальная бычья сыворотка (FBS) | Gibco | 10099141C | |
| Козий антикролиачий IgG | Abcam | ab150077 | для IF, 1:2,000 |
| козий антикроличьи IgG | Abcam | ab6721 | для WB, 1:2,000 |
| M-CSF | Pepro tech | 400-28 | |
| PBS | Biosharp | BL302A | |
| RANKL | Pepro tech | 400-30 | |
| SD крыса | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd | 1-10 дней | |
| SDS-PAGE набор для приготовления геля | Solarbio | P1200 | |
| TRAP/ALP Staining Kit | Wako | 294-67001 | |
| Trypsin-EDTA раствор | Biosharp | BL512A | |
| Wright-Giemsa solution | Keygen Biotech | KGA225-1 |
Ссылки
- Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. Monocyte differentiation and antigen-presenting functions. Nature Reviews. Immunology. 17 (6), 349-362 (2017).
- Locati, M., Curtale, G., Mantovani, A. Diversity, mechanisms, and significance of macrophage plasticity.....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
