ここでは、ウシ卵母細胞におけるミトコンドリアDNAコピー数を有意に減少させるプロトコールを提示する(P < 0.0001)。この方法は、遠心分離および二分法を利用して卵母細胞ミトコンドリアを実質的に減少させ、再構成された種間体細胞核移植胚における発生の増大の機会を可能にし得る。
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方法論記事
牛卵母細胞のミトコンドリアDNAを減少させるための二分法の使用
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
種間体細胞核移植(iSCNT)は絶滅危惧種を救うために使用することができるが、ミトコンドリアDNA(mtDNA)の2つの異なる集団が再構築された胚内に存在する:1つはレシピエント卵形質内および1つはドナー体細胞内である。このミトコンドリアヘテロプラスミーは、胚および胎児の発達上の問題につながる可能性がある。手作りのクローニングプロトコルには卵母細胞二切除が含まれ、mtDNAコピー数を減らし、再構築された胚におけるミトコンドリアヘテロプラズムの程度を低下させるために使用できる。脱蹄した成熟したウシ卵母細胞の遠心分離は、卵母細胞の一極に目に見えるミトコンドリア緻密画分を生じた。卵母細胞の透明帯は、プロナーゼ溶液への曝露によって除去した。可視ミトコンドリア画分を除去するためにマイクロブレードを用いて二分断を行った。qPCRを使用して、卵母細胞全体および二等分した卵子から抽出したDNAサンプル中に存在するmtDNAを定量し、二分切除前後のmtDNAコピー数を比較した。コピー数は、サイクル閾値、標準曲線の回帰直線式、およびmtDNA PCR産物およびゲノムPCR産物のそれぞれのサイズを含む比率を用いて計算した。1つのウシ卵母細胞は、137,904±94,768(n=38)の平均mtDNAコピー数(標準偏差±)を有していた。1つのミトコンドリア枯渇卵母細胞は、8,442±13,806(n = 33)の平均mtDNAコピー数を有していた。ミトコンドリアに富む卵母細胞中に存在する平均mtDNAコピーは、79,390±58,526 mtDNAコピーであった(n = 28)。これらの計算された平均の差は、遠心分離とその後の二分割が、元の卵母細胞(P<0.0001、一元配置分散分析によって決定される)と比較して、ミトコンドリア枯渇した卵細胞中に存在するmtDNAコピー数を有意に減少させることができることを示している。mtDNAの減少は、再構築された胚におけるミトコンドリアヘテロプラミーの程度を低下させ、おそらく標準的な胚および胎児の発達を促進するはずである。体細胞ドナー細胞からのミトコンドリア抽出物の補充もまた、胚発生を成功させるために不可欠であり得る。
概要
体細胞核移植(SCNT)は、1匹の動物からの除核卵母細胞と、同じ種の動物からの体細胞との融合を含む。ほとんどの場合、卵母細胞と体細胞は同じ種に由来し、出生率は6%1未満です。いくつかの研究は、2つの異なる種に由来する体細胞と卵母細胞の融合を含む種間SCNT(iSCNT)の使用を含む。これらの研究では、出生率はSCNTよりもさらに低く、通常は1%未満です1。しかしながら、iSCNTは、これらの動物由来の体細胞が生殖細胞1よりもアクセスしやすいため、絶滅危惧種を救出する方法として使用できる能力を有する。iSCNTで使用されるレシピエント卵母細胞は、多くの場合、ウシ、ブタ、およびマウスなどの国内または一般的な実験室種である。これまでになされたいくつかの試みは、生産された子孫がジェネリック内動物であったが(レシピエント卵母細胞種およびドナー細胞種は同じ属のメンバーであった)2、3、4。ジェネリック間モデル(異なる属の動物由来の卵母細胞および体細胞を利用する)はまだ生きた動物を産生しておらず、再構成された胚の大部分は、in vitro発生の8〜16細胞段階で停止する
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プロトコル
以下のプロトコルは、ユタ州立大学が提供する動物ケアと倫理のガイドラインに従っています。
1. メディアの準備
- 卵母細胞の取り扱いに先立って、 表1に記載されるように、以下の溶液を調製する:400 μLのヒアルロニダーゼ溶液、500 μLのT2培地、1,020 μLのT20培地、および800 μLのT10培地。
- T10培地を4ウェルプレートの2つのウェル(1ウェルあたり400μL)に分割します。1 つのウェルに "M" のラベルを付け、2 番目のウェルに "MR" のラベルを付けます。二分後まで5%CO2 インキュベーターに入れる。
- サイトカラシンB(CB)/合成卵管液500μLをHEPES(HSOF)で調製する。50 μL の CB/HSOF 溶液を別の 1.5 mL 遠沈管にアリコートします。
- 40 μLのプロナーゼ溶液を調製する。2,680 x gで少なくとも30秒間遠心分離機。20 μLの上清と20 μLのT2を新しい遠沈管に混合する。これは、希釈された5mg/mLプロナーゼ溶液を形成する。
- 3mLのHSOFを調製する。検索プレート上に、400μL滴4滴を別々に堆積させる。このプレートを実体顕微鏡の下に置きます。
- 500 μL の CB/T20 ....
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結果
定量PCR(qPCR)結果は、各ウープラスト中に存在するmtDNAの相対量を決定するために使用されます。記載された反応は、ウシmtDNAの12S領域を増幅するように設計されている。
二分割が成功した場合、卵母細胞全体およびミトコンドリア密度の卵子からのサンプルは、同様のCt 値を有するであろう。ミトコンドリア還元型卵子からのサンプルは、他の2つの群からのサンプルと比較すると、より高いCt 値を有するであろう。成功した二分割 結果を示すCtグラフを以下に示す。これらの結果は、二分切除がミトコンドリア減少卵胞のmtDNA含量を効果的に減少させたことを示している(図6)。
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ディスカッション
卵母細胞におけるmtDNAコピー数を減少させるために以前に用いられた方法は、それぞれの欠点を有する。卵母細胞からのミトコンドリアのマイクロマニピュレーションベースの除去は、mtDNAコピー数を平均64%減少させる27。以前は除核に使用されていたユニークな方法は、小径パスツールピペットの使用と、媒体のマイクロドロップと周囲の鉱物油との境界で透明帯を含まない卵母細胞の分割を含みます。卵母細胞遠心分離の利用とともに、このアプローチは、生存可能なミトコンドリア還元オプラストを産生し得る28。しかしながら、遠心分離法とこの卵母細胞分裂法の組み合わせが胚を産生することは未だ報告されていない。化学的ミトコンドリア還元法(mtDNA合成阻害剤である2',3'-ジデオキシシチジン(ddC)への卵母細胞の曝露など)は、卵母細胞のmtDNAコピー数を最大50%減少させ、COCをin vitro成熟(IVM)中に40時間以上化学物質に曝露することを必要とする16,27
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開示事項
著者らには開示するものは何もありません。
謝辞
著者らは、ユタ州立大学の同僚、サンディエゴ動物園の生殖科学研究者、およびPLC属のレベッカ・クリッシャー博士に感謝したい。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL遠心チューブ | フィッシャーサイエンティフィック | 5408129 | |
| 60 mmディッシュ | Sigma-Aldrich | D8054 | |
| 遠心分離機 | エッペンドルフ | 5424 | |
| サイトカラシンB | Sigma-Aldrich | C6762 | |
| ウシ胎児血清 | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| M199 メディア | Sigma-Aldrich | M4530 | |
| 鉱油 | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| ミニ遠心分離機 | SCILOGEX | D1008 | |
| mtDNA プライマー: フォワード (12S) | GGGCTACATTCTCTACACCAAG | ||
| mtDNA プライマー: リバース (12S) | GTGCTTCATGGCCTAATTCAAC | ||
| NanoDrop 分光光度計 | Thermo Scientific | ND2000 | |
| アルミハンドル付き眼科用メス | PFM 医療用 | 207300633 | マイクロブレード 二切片 |
| 用 プロテアーゼ/プロナーゼ | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| QIAamp DNA マイクロキット | Qiagen | 56304 | |
| QuantStudio™ 3 - 96-Well 0.2-mL | ThermoFisher | A28567 | |
| サーチプレート | フィッシャーサイエンティフィック FB0875711A | ||
| SYBR Green qPCR Master Mix | ThermoFisher | K0221 | qPCR Master mix |
| 合成卵管液 HEPES (HSOF) | |||
| ThermoPlate | Tokai Hit | TPi-SMZSSX | 加熱ステージ |
参考文献
- Loi, P., Modlinski, J. A., Ptak, G. Interspecies somatic cell nuclear transfer: A salvage tool seeking first aid. Theriogenology. 76 (2), 217-228 (2011).
- Wani, N. A., Vettical, B. S., Hong, S. B.
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再版と許可
