Summary
여기에서, 소 난모세포에서 미토콘드리아 DNA 카피 수를 유의하게 감소시키기 위한 프로토콜을 제시한다(P< 0.0001). 이 방법은 원심분리 및 이절제를 사용하여 난모세포 미토콘드리아를 실질적으로 감소시키고 재구성 된 종간 체세포 핵 전달 배아에서 발달 가능성을 높일 수 있습니다.
Abstract
종간 체세포 핵 전이 (iSCNT)는 멸종 위기에 처한 종을 구출하는 데 사용될 수 있지만, 재구성 된 배아 내에 미토콘드리아 DNA (mtDNA)의 두 개의 별개의 집단이 존재합니다 : 하나는 수용자 ooplasm 내에, 다른 하나는 공여자 체세포 내에 있습니다. 이 미토콘드리아 헤테로 플라스마는 배아와 태아의 발달 문제를 일으킬 수 있습니다. 수제 클로닝 프로토콜은 난모세포 이절편을 포함하며, 이는 재구성된 배아에서 mtDNA 카피 수를 감소시키고, 미토콘드리아 헤테로플라스마의 정도를 감소시키는데 사용될 수 있다. 뾰족하고 성숙한 소 난모세포의 원심분리는 난모세포의 한 극에서 눈에 보이는 미토콘드리아 밀도 분획을 생성하였다. 난모세포의 zonae pellucidae는 프로나제 용액에 노출됨으로써 제거되었다. 바이섹션은 가시적인 미토콘드리아 분획을 제거하기 위해 마이크로블레이드를 사용하여 수행되었다. qPCR을 사용하여 전체 난모세포 및 이등분된 ooplasts로부터 추출된 DNA 샘플에 존재하는 mtDNA를 정량화하여, 절제 전후의 mtDNA 카피 수의 비교를 제공하였다. 카피 숫자는 사이클 역치, 표준 곡선의 회귀선 공식, 및 mtDNA PCR 산물 및 게놈 PCR 산물의 각각의 크기를 포함하는 비율을 사용하여 계산하였다. 하나의 소 난모세포는 137,904 ± 94,768 (n = 38)의 평균 mtDNA 카피 수 (± 표준 편차)를 가졌다. 미토콘드리아-고갈된 ooplast의 평균 mtDNA 카피 수는 8,442 ± 13,806 (n = 33)이었다. 미토콘드리아가 풍부한 ooplast에 존재하는 평균 mtDNA 카피는 79,390 ± 58,526 mtDNA 카피 (n = 28)이었다. 이들 계산된 평균 사이의 차이는 원심분리 및 후속 분리가 원래의 난모세포와 비교했을 때 미토콘드리아-고갈된 ooplast에 존재하는 mtDNA 카피 수를 유의하게 감소시킬 수 있음을 나타낸다(P < 0.0001, 단방향 ANOVA에 의해 결정됨). mtDNA의 감소는 재구성 된 배아에서 미토콘드리아 헤테로 플라스마의 정도를 감소시켜야하며, 아마도 표준 배아 및 태아 발달을 촉진 할 수 있습니다. 체세포 공여체로부터의 미토콘드리아 추출물을 보충하는 것은 또한 성공적인 배아 발달을 달성하는 데 필수적일 수 있다.
Introduction
체세포 핵 전달 (SCNT)은 한 동물로부터의 enucleated 난모세포와 동일한 종의 동물로부터의 체세포의 융합을 포함한다. 대부분의 경우, 난모세포와 체세포는 같은 종에서 유래하며 출생률은 6 % 미만입니다.1. 일부 연구는 두 개의 다른 종에서 유래 체세포와 난모세포의 융합을 포함하는 종간 SCNT (iSCNT)의 사용을 포함한다. 이 연구에서 출생률은 SCNT보다 훨씬 낮습니다 - 일반적으로 1 % 1 미만입니다. 그러나, iSCNT는 멸종 위기에 처한 종을 구출하는 방법으로 사용될 수 있는 능력을 가지고 있는데, 이는 이들 동물로부터의 체세포가 그들의 생식세포보다 더 접근하기 쉽기때문이다1. iSCNT에 사용되는 수용자 난모세포는 종종 소, 돼지 및 마우스와 같은 국내 또는 일반적인 실험실 종입니다. 지금까지 이루어진 몇 가지 시도는 성공적으로 살아있는 젊음을 생산했지만, 생산 된 자손은 제네릭 동물 (수용자 난자 종과 기증자 세포 종은 동일한 속의 구성원이었다)2,3,4. 제네릭 모델 (다른 유전자에있는 동물의 난모세포 및 체세포를 활용하는)은 아직 살아있는 동물을 생산하지 않았으며, 재구성 된 배아의 대부분은 시험관 내 발달의 8-16 세포 단계에서 체포됩니다 5,6,7,8. 이 배아 발달 정지에 대한 한 가지 가능한 설명은 배아에서 미토콘드리아 이종 혈장의 발생 - 단일 세포에서 하나 이상의 미토콘드리아 DNA (mtDNA) 유형의 존재입니다. 이질형질은 배아 또는 살아있는 동물에서 발달 비효율 또는 실패와 같은 문제를 야기할 수 있다1. 병인은 또한 동물의 일생 9에서 나중에 발생할 수있습니다. 이 문제는 SCNT 자손에도 존재하지만 iSCNT 배아 내의 상호 특이적 구성 요소는 문제를 악화시킵니다.
배아 mtDNA가 두 개의 다른 종에서 유래 할 때, 대다수를 대표하는 수용자 난모세포 미토콘드리아는 공여체 세포의 핵1,10과 함께 효율적이거나 효과적으로 작동하지 않습니다. iSCNT에 사용 된 두 종 사이의 분류 적 격차가 커지면이 문제가 심화 될 수 있습니다. 제네릭 내 생산된 살아있는 자손(보스가러스 및 보스 황소 난모세포를 이용한 보스 인디쿠스 자손)뿐만 아니라 전통적인 SCNT를 통해 생산된 자손(예를 들어 난소 양자리 난모세포를 사용하는 난소 양자리 자손)은 키메라인 것으로 나타났다(두 개체로부터의 mtDNA는 이들 동물에 존재하였다 11,12,13). 그러나 그들은 제네릭 간 SCNT 배아14,15보다 훨씬 더 발전했습니다. 난모세포 미토콘드리아와 기증자 세포의 핵 사이의 정보 교환은 제네릭 배아16보다 제네릭 내 배아에서 더 성공적일 수 있다.
성숙한 소 난모세포에서 mtDNA의 양은 하나의 체세포(12)에서 발견되는 양보다 약 100배 더 크다. 이 비율을 줄이면 체세포 미토콘드리아가 재건 된 배아 내에서 증식하도록 장려하여 생산적인 미토콘드리아의 더 많은 인구가 존재할 수 있습니다16. 이것은 차례로 발달하는 배아(15)의 요구 사항을 충족시키기 위해 더 많은 에너지를 제공 할 수 있습니다. 난모세포 또는 배아의 mtDNA 카피 수를 감소시키기 위한 이전의 시도는 화학적 적용, 미세조작, 및 공여체 세포 종 16,17,18,19,20으로부터의 추가적인 미토콘드리아로 난모세포 또는 배아를 보충하는 것을 포함한다. 그러나 화학적 적용 (예 : 2',3'-디데옥시시티딘)은 배아 발달에 이상적이지 않으며 난모세포 mtDNA 사본 수를 약18 % 줄였습니다. 미세조작에 의한 이전의 난모세포 mtDNA 감소는 난모세포의 mtDNA17의 평균 64%만을 제거하였다. 기증자 세포 미토콘드리아의 보충이 실행 가능한 옵션이 될 수 있지만, 그 사용은 아직 iSCNT 연구21 내에서 살아있는 제네릭 동물을 생산하지 못했습니다.
난모세포 mtDNA 카피 수를 줄이기 위한 이절제술의 사용은 아직 발표된 연구에서 사용되지 않았다. ooplasts를 체세포와 융합시키려는 의도로 난모세포를 이견하는 것은 수제 클로닝 (HMC)의 전제이며, 이는 전형적으로 메타상 II (MII) 난모세포로부터 극성 체내 및 메타상 플레이트를 제거하는 방법으로서 분리를 이용한다. HMC는 염소, 소, 돼지, 양 및 말 22,23,24,25,26을 포함한 여러 종에서 자손을 성공적으로 생산했지만 일반적으로 이절 전에 원심분리 단계를 포함하지 않습니다. 난모세포의 고속 원심분리를 통합하면 난모세포의 한 극에서 미토콘드리아(따라서 mtDNA)를 분리할 수 있으며, 이를 마이크로블레이드를 사용하여 미토콘드리아 밀도가 높은 분획을 제거하기 위해 이분할 수 있습니다. 두 개의 미토콘드리아-고갈된 ooplasts는 HMC의 경우와 같이 체세포와 융합되어 난모세포 종으로부터 상당히 적은 mtDNA를 포함하는 재구성된 배아를 형성할 수 있다.
우리가이 프로토콜로 대답하려고하는 질문은 덜 이질성 mtDNA를 포함하는 실행 가능한 재구성 된 배아를 생산하기 위해 소 난모세포에서 mtDNA를 줄이는 방법입니다. 이 프로토콜에서, 난모세포를 원심분리하고 이분하였다. Ooplast 및 무손상 난모세포 mtDNA 카피 수를 계산하여 소 난모세포의 mtDNA 카피 수를 감소시키는 데 있어서 이 기술의 효과를 결정하였다.
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Protocol
다음 프로토콜은 유타 주립 대학에서 제공하는 동물 관리 및 윤리 지침을 따릅니다.
1. 미디어 준비
- 난모세포 처리에 앞서, 표 1에 기재된 바와 같이 하기 용액을 준비한다: 400 μL의 히알루로니다아제 용액, 500 μL의 T2 배지, 1,020 μL의 T20 배지, 및 800 μL의 T10 배지.
- T10 배지를 웰 당 400 μL의 4-웰 플레이트의 두 웰로 나눕니다. 하나의 우물은 "M"으로, 두 번째 우물은 "MR"로 레이블을 붙입니다. 절제 후까지 5%CO2 인큐베이터에 놓는다.
- HEPES (HSOF)로 500μL의 시토칼라신 B (CB)/합성 난관액을 준비하십시오. CB/HSOF 용액 50 μL를 분취하여 별도의 1.5 mL 원심분리 튜브에 넣었다.
- 40 μL의 프로나제 용액을 준비하십시오. 2,680 x g에서 적어도 30 s 동안 원심분리. 20 μL의 상청액과 20 μL의 T2를 새로운 원심분리 튜브에 혼합하는 단계; 이것은 희석 된 5 mg / mL 프로나제 용액을 형성합니다.
- HSOF의 3 mL를 준비하십시오. 검색 플레이트 상에, 별도로 400 μL 방울을 증착하고; 이 플레이트를 입체 현미경 아래에 놓습니다.
- CB/T20 용액 500μL를 준비합니다.
2. 소 난모세포의 시험관내 성숙 (IVM)
- IVM: 흡인된 누적-난모세포 복합체(COCs)를 10% FBS, 0.26 IU/mL FSH 및 100 U/mL 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 성숙 배지의 4웰 디쉬에서21 시간 동안 5% CO2 배양기에서 38.5°C에서 배양한다.
- 난모세포를 부인하기 위해 다음 단계를 수행하십시오.
- 200 μL 피펫을 사용하여 원하는 수의 COCs를 수집하고, 이를 1.5 μL 원심분리 튜브의 바닥에 증착한다.
- 난모세포가 있는 원심분리 튜브에 동일한 부피의 0.6mg/mL 히알루로니다아제를 첨가한다(즉, 난모세포와 IVM 배지의 부피가 100μL인 경우, 히알루로니다제 100μL를 첨가).
- 모든 누적 세포가 제거 될 때까지 거품을 만들지 않고 용액을 위아래로 피펫하십시오.
- 난모세포의 성숙을 확인하십시오.
- 피펫을 사용하여 검색 플레이트의 네 HSOF 방울 중 하나에서 난모세포/히알루로니다아제 용액에 HSOF 200μL를 첨가합니다.
- 히알루로니다아제/HSOF 방울에서 난모세포를 옮기고 사용하지 않은 400μL의 HSOF 방울에 넣습니다. 히알루로니다아제와 누적 세포 잔재물을 제거하는 데 도움이 되도록 HSOF 방울을 추가로 두 방울 더 세척하십시오.
- 구강 피펫 (또는 10 μL 피펫 및 팁) 및 높은 현미경 배율을 사용하여, 롤 및 극성체 존재에 기초하여 난모세포를 선택한다.
- 난모세포를 분류한 후, 이분될 MII 난모세포의 원하는 수를 수집하고, 이를 HSOF 방울의 400 μL에 놓는다.
참고: 난모세포가 30분 이상 인큐베이터 외부에 있었다면, 난모세포는 성숙 배지의 웰에 다시 배치되고CO2 조절된 인큐베이터에 배치되어 적어도 30분 동안 휴식을 취할 수 있다. 양분되는 난모세포의 수를 대략 30분 안에 이분량을 완료하기에 실현 가능한 양으로 제한하여 인큐베이션 밖의 시간을 최소화한다. ooplasts가 체세포와 융합되고, 활성화되고, 배아로서 배양되는 경우, 난모세포는 이때 enucleated 되어야 한다.
3. 난모세포의 원심분리
참고 : 난모세포가 성숙 배지의 인큐베이터에 배치 된 경우 가장 최근에 수집 된 HSOF 방울로 이동하십시오.
- 구강 피펫을 사용하여 HSOF 방울에서 선택된 성숙한 난모세포를 수집하여 HSOF/CB 용액 50μL가 들어있는 1.5mL 튜브에 넣습니다. 난모세포를 15,000 x g 에서 12분 동안 원심분리한다.
참고 : 원심 분리기 튜브에 거품이 존재하는 것은 해롭지 않습니다. - 난모세포가 원심분리되는 동안, 복절 플레이트를 준비하십시오.
- 그림 1과 같이 60mm 페트리 접시(방울당 20μL)의 뚜껑에 패턴을 만들고 방울을 미네랄 오일로 완전히 덮습니다.
- 얇은 팁이 있는 마커를 사용하여 그림 2와 같이 접시 아래에 선을 표시하십시오.
- pronase 드롭 주위에 상자를 그리고 CB / T20 방울과 T20 방울의 하단 행 사이에 선을 그립니다.
- 마이크로 드롭의 삼투압 변화를 방지하기 위해 원심분리가 완료 될 때까지 불투명 한 뚜껑으로 접시를 덮으십시오.
- 원심분리가 완료되자마자, 200 μL 피펫을 사용하여 용액 내의 난모세포를 수집하고, 4개의 400 μL HSOF 방울이 있는 새로운 검색 플레이트의 빈 부분으로 옮긴다.
- 네 개의 HSOF 방울을 통해 난모세포를 수집하고 세척하십시오.
그림 1: 바이섹션 플레이트. 표시된 모든 방울은 20 μL 부피를 갖는다. 플레이트의 직경은 60mm입니다. 방울은 미네랄 오일로 완전히 덮여 있습니다. 난모세포는 먼저 맨 위와 가장 왼쪽 T2 방울 (여기에 별과 함께 표시됨)에 배치됩니다. PRO/T2: 10μL의 프로나제와 10μL의 T2를 마이크로드롭을 생성하기 전에 결합. CB/T20: T20 1mL당 시토칼라신 B 1μL를 마이크로드롭을 생성하기 전에 결합. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 표시된 분리판 선은 플레이트 바닥에 얇은 팁이 달린 마커로 그려져 현미경 아래에서 관찰 및 난모세포 및 ooplast 전달에 대한 위치 참조를 제공합니다. 난모세포는 먼저 맨 위와 가장 왼쪽 T2 방울 (여기에 별과 함께 표시됨)에 배치됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
4. 복강을 위한 난모세포의 제조
참고 : 다음 과정은 절제를위한 난모세포의 준비를 포함합니다.
- 가열 스테이지를 37°C로 돌린다.
- 구강 피펫을 사용하여 원심분리된 난모세포를 HSOF 드롭으로부터 복절 플레이트의 왼쪽 T2 드롭으로 이동시킨 다음, 윗줄(T2, T20, T20)의 다음 세 방울을 통해 난모세포를 세척한다.
- 난모세포를 프로나제 방울 중 하나에 침착시켜 이들 사이에 접촉이 거의 없거나 전혀 없음을 보장합니다.
참고 : zona pellucida의 제거는 다양한 시간이 걸릴 수 있지만 일반적으로 가열 단계를 사용하면 30-120 초 사이에 발생합니다. 가열 단계의 부재는 이번에 연장 될 것입니다. - 조내펠루시다의 명확한 변형이 있을 때까지 난모세포를 관찰한다( 도 3 참조).
- 단일 난모세포 조나 펠루시다가 변형되면 그 난모세포를 이웃 T2 방울로 옮깁니다. 추가 난모세포가 변형되면 모든 난모세포가 프로나제에서 제거되어 T2 방울에 놓일 때까지 반복하십시오.
- 영역 펠루시다의 얇은 층 만 남을 때까지 난모세포를 관찰하십시오.
- 행 내의 다음 세 방울 (T2, T20, T20)을 통해 난모세포를 씻은 다음 CB / T20 방울 내의 수직선으로 증착하십시오 ( 그림 4 참조).
- 수직선에서 더 적은 난모세포로 시작하고 이절제 기술이 진행됨에 따라 방울 당 난모세포의 수를 증가시킵니다.
그림 3: 프로나제를 이용한 조나 펠루시다의 제거. (80x) 난모세포가 조나 펠루시다에 영향을 미쳤을 때 난모세포가 인접한 T2 방울로 이동하기에 충분할 때 난모세포 조나 펠루시다가 변형되기 시작할 것이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 쌍단면 방울에서의 난모세포 배향. (80x) 조나-프리 난모세포는 절편성 전에 각 CB/T20 방울 내에 거의 수직 배향으로 침착된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
5. 난모세포의 절제술
- 난모세포가 들어있는 첫 번째, 가장 왼쪽의 CB / T20 (bisection) 방울에 초점을 맞추고 입 피펫을 사용하여 난모세포를 회전시켜 각 난모세포의 미토콘드리아 밀도가 높은 부분이 현미경의 팔을 향하거나 멀리 향하게하십시오.
참고: 미토콘드리아 밀도가 높은 부분에는 지질이 포함되어 있지 않으며, 이는 원심분리 후 난모세포의 가장 어두운 부분으로 나타납니다. - 마이크로 블레이드의 끝을 미토콘드리아 밀도가 높은 부분 바로 위의 공간에 맞춰 맨 위 난모세포의 왼쪽에 놓습니다. 블레이드의 끝을 같은 장소에 보관하고 조심스럽게 블레이드를 내려 난모세포를 끝까지 자릅니다.
- 미토콘드리아가 조밀 한 ooplast와 미토콘드리아-감소 ooplast가 크기가 비슷한지 확인하십시오; bisection은 두 개의 ooplasts를 생산하기 위해 각 난모세포를 반으로 잘라야합니다.
참고 : 단일 난모세포에서 생산 된 ooplasts의 비교 크기는 연구 목표에 따라 다를 수 있습니다. 미토콘드리아가 감소된 ooplasts가 체세포와 융합되어야 한다면, 그들의 부피는 미토콘드리아-밀도가 높은 ooplasts보다 커야 한다'. - 블레이드가 원심분리 된 난모세포의 가장 명확한 세그먼트에서 미토콘드리아 밀도 부분 위와 지질 밀도 부분 아래에서 난모세포를 이중시키고 있는지 확인하십시오.
- 미토콘드리아가 조밀 한 ooplast와 미토콘드리아-감소 ooplast가 크기가 비슷한지 확인하십시오; bisection은 두 개의 ooplasts를 생산하기 위해 각 난모세포를 반으로 잘라야합니다.
- 블레이드를 들어 올릴 때 동일한 라인이 유지되고 블레이드 팁이 같은 위치에 있는지 확인한 다음 플레이트에서 팁을 부드럽게 들어올립니다.
- 첫 번째 절제술 방울 내의 모든 난모세포에 대해 쌍절 단계를 반복하십시오. 난모세포가 추가 방울로 존재하는 경우, 나머지 난모세포를 오리엔테이션하고 이등분한다.
- 입 피펫을 사용하여 첫 번째 bisection 방울에서 미토콘드리아가 감소 된 ooplasts를 수집하십시오. 플레이트의 하단 행에있는 왼쪽 T20 드롭에 놓습니다. 나머지 모든 단면 드롭에 대해 반복하십시오.
참고: 미토콘드리아-감소된 ooplasts는 지질을 함유할 것이며, 그 지질은 난모세포의 나머지 부분보다 더 짙은 색이다. - 입 피펫을 사용하여 첫 번째 bisection 방울에서 미토콘드리아가 조밀 한 ooplasts를 수집하십시오. 플레이트의 하단 행에있는 오른쪽 T20 드롭에 놓습니다. 나머지 모든 단면 드롭에 대해 반복하십시오.
참고 : 미토콘드리아가 밀집된 지역은 외관상 밝은 회색이 될 소기관의 가시적 인 덩어리를 가질 것입니다. - 인큐베이터에서 T10 네 웰 접시를 회수하십시오. 입 피펫을 사용하여 모든 미토콘드리아가 감소된 ooplasts를 잘 라벨이 붙은 "MR"로 옮기고 미토콘드리아가 조밀한 ooplasts를 잘 표시된 "M"으로 옮깁니다.
- 네 웰 플레이트를 다시CO2-조절 인큐베이터 내로 놓는다. mtDNA의 정량화 전에 ooplasts가 적어도 30 분 동안 쉬도록 허용하십시오.
6. mtDNA의 정량화
- 작은 샘플에서 물질을 추출하도록 설계된 DNA 추출 키트를 사용하여 개별 샘플 (단일 난모세포, 단일 미토콘드리아 밀도 ooplasts, 단일 미토콘드리아 고갈 된 ooplasts)에서 DNA를 추출하십시오.
- 선택한 DNA 정량 방법을 사용하여 각 샘플에서 DNA가 성공적으로 추출되었는지 확인하십시오. 정량적 중합효소연쇄반응(qPCR)이 그 때 완료되지 않을 경우, 추출된 DNA를 표지된 튜브에서 -80°C 냉동고에서 동결시킨다.
- qPCR 수행
- 프라이머 서열과 함께 각 qPCR 튜브에 첨가하는 각 시약의 부피를 확인하려면 표 2 를 참조한다. 이들 프라이머는 소 mtDNA의 12S 영역을 증폭하도록 설계되었다.
- 초기 변성 시간을 10분 동안 설정하고, 이어서 94°C에서 변성 30초, 60°C에서 어닐링 15초, 72°C에서 연장 15초의 35사이클을 반복한다. 반응이 완료되면, 사이클 역치(Ct) 값을 기록한다.
참고: 상대적인 mtDNA 카피 수 값을 얻으려면 기하급수적으로 증가하는 mtDNA 카피 번호가 알려진 샘플들을 사용하여 표준 곡선을 생성해야 합니다. 그런 다음 순환 임계값을 다음 수식을 사용하여 조작하여 상대 mtDNA 사본 수를 결정해야 합니다. - 아래 방정식을 사용하여 DNA의 농도를 구하십시오 :
DNA의 농도 = (10 (Ct-절편 / 기울기)) x 테스트 된 부피 - 아래 방정식을 사용하여 복사 번호를 구하십시오.
복사 번호 =
- 아래 방정식을 사용하여 복사 번호를 구하십시오.
셀당 복사 수 = 2 x
도 5: 체세포 mtDNA 표준 곡선. 이 표준 곡선은 프로토콜 단계 6.3에 기재된 바와 같이 qPCR 시약 및 프로그램을 사용하여 소 체세포의 로그 농도의 mtDNA 정량화를 통해 작성되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Representative Results
정량적 PCR(qPCR) 결과는 각 ooplast에 존재하는 mtDNA의 상대적 양을 결정하기 위해 사용된다. 기술된 반응은 소 mtDNA의 12S 영역을 증폭시키도록 설계된다.
양성절편이 성공적이었다면, 전체 난모세포와 미토콘드리아-농축된 ooplasts로부터의 샘플은 유사한Ct 값을 가질 것이다. 미토콘드리아-환원된 ooplasts로부터의 샘플은 다른 두 그룹으로부터의 샘플과 비교할 때 더 높은Ct 값을 가질 것이다. 성공적인 바이섹션 결과를 보여주는Ct 그래프가 아래와 같다. 이러한 결과는 bisection이 미토콘드리아-감소된 ooplasts에서 mtDNA 함량을 효과적으로 감소시켰다는 것을 나타낸다(도 6).
그림 6: 성공적인 바이섹션 qPCR 결과. 주기 수와 형광을 비교한 그래프는 단일 난모세포, 미토콘드리아-환원된 ooplasts(보라색 선으로 나타냄) 및 미토콘드리아 밀도가 높은 ooplasts의 주기 역치값을 표시한다. 미토콘드리아 감소 ooplasts의 Ct 값은 평균 29.931 (보라색 선)이고 단일 난모세포의 평균 Ct 값은 20.802 (적색 및 녹색 선)이며 미토콘드리아 밀도가 높은 ooplasts의 평균 Ct 값은 21.389 (파란색 및 금색 선)입니다. 미토콘드리아-감소된 ooplast 샘플의 증가된 Ct 값은 이들 샘플 내의 mtDNA 카피 수의 감소를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
실패한 바이절 결과를보여주는 Ct그래프 가 도 7에 도시되어 있다. 이러한 결과는 bisection이 미토콘드리아-감소된 ooplasts에서 mtDNA 함량을 효과적으로 감소시키지 않았다는 것을 나타낸다:
그림 7: 실패한 복합 qPCR 결과. 사이클 수와 형광을 비교한 선 그래프는 단일 난모세포(짙은 녹색과 연한 녹색 선), 미토콘드리아 환원 ooplasts(자주색 선) 및 미토콘드리아-밀도가 높은 ooplasts(파란색 및 금색 선)의 주기 임계값을 표시하며, 이들 모두는 20.232-20.757의 범위 내에 있는 Ct 값을 갖는다. 이는 미토콘드리아-감소된 ooplast 샘플에서 mtDNA 카피 수의 유의한 변화가 없음을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표준 곡선의 제조 및 제공된 mtDNA 카피 수 공식의 사용에 이어서, 이 프로토콜을 사용하여 93.88%의 평균 난모세포 mtDNA 감소가 달성되었다(도 8).
도 8: 전체 난모세포, 미토콘드리아-감소된 ooplasts, 및 미토콘드리아-조밀 ooplasts로부터 수득된 상대적 미토콘드리아 DNA 카피 수를 비교하는 박스플롯. 전체 난모세포(n=38), 미토콘드리아-환원된 ooplasts(n=34), 및 미토콘드리아-농축 ooplasts(n=29). 미토콘드리아-감소된 ooplasts는 다른 두 그룹과 비교했을 때 상당히 적은 카피 수를 갖는다(P < 0.001). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 용액 | 총 볼륨 | 용매 | 용질 |
| 히알루로니다아제 용액 | 400 μL | 1 mL M-199 | 히알루로니다아제 0.6 mg |
| T2 미디어 | 500 μL | M-199 | 2% 태아 소 혈청 (v/v) |
| T20 미디어 | 1020 μL | M-199 | 20% 태아 소 혈청 (v/v) |
| T10 미디어 | 800 μL | 400 μL T2 | 400 μL T20 |
| CB / HSOF | 500 μL | 499.5 μL HEPES (HSOF)를 사용한 합성 난관액 | 0.5 μL의 10 mg/mL 시토칼라신 B (CB) |
| 프로나제 솔루션 | 40 μL | 1 mL M-199 | 프로나제 10 mg |
| T20/CB | 500 μL | 499.5 μL T20 | 0.5 μL의 10 mg/mL CB |
표 1: 필요한 솔루션. 프로토콜 내에서 필요한 각 용액에 대해 용질과 용매의 양을 제공합니다.
| 시약 | 음량 |
| qPCR 마스터 믹스 | 10 μL |
| 정방향 프라이머 | 0.6 μL |
| 역방향 프라이머 | 0.6 μL |
| DNA 샘플 | 4.4 μL |
| DNase-free 물 | 4.4 μL |
| 총 볼륨 | 20 μL |
| 정방향 프라이머 GGGCTACATTCTCTACACCAAG | |
| 역방향 프라이머 GTGCTTCATGGCCTAATTCAAC | |
표 2: 정량적 PCR 조성물. 정방향 및 역방향 프라이머 서열과 각 정량적 PCR 튜브에 필요한 모든 시약의 부피를 제공합니다.
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Discussion
난모세포에서 mtDNA 카피 수를 줄이기 위해 이전에 사용 된 방법은 각각의 단점을 가지고 있습니다. 난모세포에서 미토콘드리아를 미세 조작 기반으로 제거하면 mtDNA 카피 수가 평균 64%27 감소합니다. 이전에 enucleation에 사용 된 독특한 방법은 작은 직경의 파스퇴르 피펫을 사용하고 미세 방울의 배지와 주변 미네랄 오일 사이의 경계에서 조나 펠루시다가없는 난모세포를 분할하는 것입니다. 난모세포 원심분리의 활용과 함께, 이 접근법은 실행 가능한 미토콘드리아-환원된 ooplasts(28)를 생성할 수 있다. 그러나, 원심분리와 이러한 난모세포 분할 방법의 조합은 배아를 생산하는 것으로 아직 보고되지 않았다. 화학적 미토콘드리아 환원 방법(예: mtDNA 합성 억제제인 2',3'-dideoxycytidine(ddC)에 대한 난모세포의 노출)은 난모세포 mtDNA 카피 수를 최대 50%까지 감소시켰으며, 시험관내 성숙(IVM)16,27 동안 40시간 이상 동안 COC가 화학물질에 노출될 것을 요구한다. 돼지 난모세포를 ddC가 보충된 배지에서 40시간 동안 배양하는 것은 재구성된 배아(16)에 대한 문제를 제시하지 않았지만, 20-22시간 IVM 또는 이후의 배아 발달 동안 소 난모세포가 ddC에 노출되는 것에 관한 데이터는 아직 발표되지 않았다. 이 논문에 기술된 방법은 상대적인 mtDNA 카피 수를 약 93.88%만큼 감소시키며, 평균 45,565 ± 37,169 카피(SD± 평균)에서 8,396 ± 13,287로 감소시킨다.
프로토콜 내의 몇몇 단계는 난모세포의 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 카피 수를 효과적으로 감소시키는 측면에서 만족스러운 결과를 얻기 위해 매우 중요하다. 난모세포를 최적화된 속도(15,000 x g) 및 시간(12분)으로 원심분리하면 각 난모세포의 한 극에서 더욱 농축된 미토콘드리아 분획이 생성된다. HEPES (CB/HSOF) 용액 (50 μL)을 사용한 Cytochalasin B / Synthetic Oviductal Fluid의 정확한 부피는 원심분리로 인한 난모세포 용해를 제거 할 가능성이 큽니다. 원심분리 후, 조나 펠루시다 (ZP)는 프로나제 용액에 노출에 의해 제거되고; ZP의 완전한 제거는보다 정확한 절편을 보장하고 또한 난모세포에서 남아있는 누적 세포를 분리해야합니다. ZP를 제거하는 동안 현미경 상의 가열 스테이지의 사용은 선택적이지만, ZP 제거를 적어도 1분 이상 서두른다. 이절제술사에서 조나 펠루시다 프리 (ZF) 난모세포의 배향은 정확하게 이분하는 데 중요합니다. 각 난모세포의 한 극에서 발견되는 미토콘드리아 분획은 명확하게 볼 수 있어야하며 절제하기 전에 난모세포의 상단 또는 하단에 위치해야합니다. 반대쪽 극은 어두운 지질 방울을 포함합니다. 복절 후, ooplasts의 선택 및 정확한 분류 (미토콘드리아 밀도 또는 미토콘드리아가 고갈됨)는 bisection의 정확한 평가를 얻는 데 중요합니다. 어떤 메타페이즈 II (MII) 난모세포를 이등분으로 선택하는 것도 중요하다. 사용 된 난모세포가 구형이고 균질 한 세포질을 갖도록 보장하면 각 난모세포와 ooplast에 포함 된 mtDNA 사본 수에 차이가 생길 수 있습니다. 개별 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR)을 설계하고 합성할 때 정확한 결과를 얻기 위해서는 각 반응에 정확한 프라이머 및 시약 농도가 사용되는지 확인하는 것이 중요합니다. 표준 곡선이 생성되면 가능한 한 정확하게 생성되어야하며 모든 반응은 더 높은 정확도를 달성하기 위해 삼중으로 수행되어야합니다. 각 qPCR 단계의 시간과 온도는 모든 실행에 대해 동일하게 유지되어야 합니다.
프로토콜을 따르는 동안 몇 가지 문제가 발생할 수 있습니다. bisection 플레이트에 오일을 첨가 할 때 방울이 방금 덮여 있는지 확인하십시오. 오일이 너무 많으면 피펫 사용의 효율성이 떨어지고 너무 적으면 방울이 증발합니다. 이 증발은 용액의 삼투압의 변화를 일으킬 것이며, 이는 난모세포와 ooplasts에 해로울 수 있습니다. ZP의 소화 후 난모세포가 용해되는 경우, 이는 개인적인 경험과 관찰에 근거하여 다음 중 하나 또는 둘 다에 기인 할 가능성이 큽니다 : 난모세포는 처방 된 시간과 속도 동안 원심분리되지 않았으며 / 또는 난모세포가 너무 오랫동안 프로나제에 노출되었습니다. 일부 ZF 난모세포는 복절 방울 내에서 완전히 구형 형태를 회복하지 못할 수 있다. 모든 ZF 난모세포가 이절제에 최적으로 위치할 수 있는 것은 아니라는 점을 명심하자. 이 경우, 세 가지 옵션이 있습니다 : ZF 난모세포에 구형 모양을 회복 할 수있는 추가 시간을주십시오. 부드럽게 난모세포를 bisection하기 전에 마이크로 블레이드로보다 직립 자세로 유지하십시오. 올바르게 배치 할 수없는 난모세포를 양분하지 마십시오. 복절 후 미토콘드리아가 밀집되거나 미토콘드리아가 고갈된 ooplasts를 결정하는 것은 정량화 결과에 영향을 미칩니다. ooplasts를 분류하는 것이 어려운 경우, 미토콘드리아 분획이 항상 방울의 상단 또는 하단을 향하도록 양분될 난모세포를 위치시키고, 및/또는 그 극 중 하나에서 난모세포의 어두운 부분을 찾습니다 (이 지질 방울은 미토콘드리아 분획으로부터 반대쪽 극에 집중되어 있습니다). 때때로, ooplasts는 서로 달라 붙을 수 있고 / 또는 플레이트의 마이크로 블레이드에 의해 만들어진 들여 쓰기를 할 수 있습니다. 때로는 구형 모양을 회복 할 수있는 추가 시간을 ooplasts에 제공하면 분리에 도움이됩니다. 다른 옵션으로는 플레이트를 부드럽게 두드리거나, 피펫 안팎으로 부드럽게 빨거나, 피펫의 가장자리를 사용하여 ooplasts를 부드럽게 분리하는 것이 포함됩니다.
이러한 mtDNA 카피 수 감소 방법에는 그 한계가 있다; 하나는 난모세포 공급원을 기반으로하고, 다른 하나는 난모세포에서 ZP를 제거하기 때문입니다. 난모세포 공급원 (동물 자체, 특정 난소 및 특정 난포)은 특정 난모세포 내의 mtDNA 카피 수에 크게 영향을 미칩니다. 단일 난모세포의 평균 mtDNA 카피 수 주위에 큰 표준 편차가 있으며, 이는 카피 수가 얼마나 가변적일 수 있는지를 나타낸다. 많은 단일 난모세포 정량화 반응은 ooplasts 및 다른 난모세포와 비교될 강력한 단일 난모세포 표준 카피 수를 갖기 위해 요구된다. 상당한 표준 편차는 또한 ooplast의 카피 수를 기원의 난모세포와 비교할 수 없기 때문에 ooplast와 난모세포의 비교를 덜 절대적으로 만듭니다.
난모세포의 zonae pellucidae의 소화는 생성 된 ZF 난모세포와 ooplasts를 그들의 zonae pellucidae의 제거 이전보다 훨씬 더 약하게 만듭니다. 이러한 취약성은 ooplasts와 ZF 난모세포 자체의 더 높은 용해 속도를 초래하며, 특히 마이크로 블레이드를 사용하면 많은 양의 관리와 정밀도를 사용해야합니다. ooplasts가 융합을 위해 활용 될 경우, 융합을 시도 할 수 있기 전에 이중 절제 후 휴식이 필요합니다. 그렇지 않으면, 많은 ooplasts가 용해 될 가능성이 큽니다. 미토콘드리아가 고갈 된 ooplasts는 미토콘드리아가 풍부한 것보다 더 섬세한 경향이 있습니다. 난모세포의 미세 소관은 원심분리 중에 미토콘드리아와 함께 난모세포의 동일한 극으로 이동하는 경향이 있으며, 이는 미토콘드리아가 고갈 된 ooplasts를 더 적은 구조적 성분29로 남겨 둡니다. 다른 난모세포 소기관이이 프로토콜에서 ooplasts를 생산하는 데 사용되는 원심분리와 이절편의 조합에 의해 부정적인 영향을 받는지 여부를 결정하기 위해서는 추가 연구 및 염색이 필요합니다.
난모세포 미토콘드리아의 감소는 생성된 iSCNT 배아에서 난모세포 종의 미토콘드리아를 감소시킬 것이고, 따라서 재구성된 배아에서 미토콘드리아 헤테로플라스마의 발생률을 감소시킬 것이다. 배아의 발달 가능성은 비교적 증가하지만, 발달 중에 에너지 요구 사항을 충족시키기 위해 기증자 세포 종의 미토콘드리아를 보충해야 할 가능성이 큽니다. 지금까지 제네릭 간 십자가를 사용한 iSCNT 시도는 살아있는 자손을 생산하지 못했습니다. iSCNT 배아에서 이질성 플라스마를 감소시키면 성공적인 임신의 확률이 높아질 수 있다. iSCNT는 멸종 위기30 종으로 분류 된 40,000 종 중 일부를 구출하는 데 도움이되는 방법입니다. 이 종의 체세포는 일반적으로 생식 세포보다 더 접근하기 쉽기 때문에 iSCNT는 국내 종의 난모세포와 함께 이러한 체세포를 활용할 수 있습니다. 제네릭 내 시도는 살아있는 동물 31,32,33을 생산하는 데 성공했지만, 자손은 일반적으로 mtDNA에 대한 키메라이며, 제네릭 내 난모세포 공급원을 찾는 것이 항상 가능한 것은 아닙니다. mtDNA 카피 수를 줄이고, 이들 ooplasts를 상호 특이적 체세포와 융합시키는 것을 목표로 난모세포의 양성 절제술은 iSCNT 배아에서 키메라증과 이질성 플라스마를 감소시킬 것이다. 이러한 감소로 인해, 설명 된 방법의 사용은 제네릭 간 출생의 더 큰 잠재력과 멸종 위기에 처한 종의 지속을 허용합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자들은 유타 주립 대학의 동료들, 샌디에고 동물원의 생식 과학 연구원, 그리고 Genus PLC의 Rebecca Krisher 박사에게 감사하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL centrifuge tubes | Fisher Scientific | 5408129 | |
| 60 mm dish | Sigma-Aldrich | D8054 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | C6762 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| M199 Media | Sigma-Aldrich | M4530 | |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| Mini Centrifuge | SCILOGEX | D1008 | |
| mtDNA Primer: Forward (12S) | GGGCTACATTCTCTACACCAAG | ||
| mtDNA Primer: Reverse (12S) | GTGCTTCATGGCCTAATTCAAC | ||
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND2000 | |
| Opthalmic Scalpel with Aluminum Handle | PFM Medical | 207300633 | Microblade for bisection |
| Protease/pronase | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| QIAamp DNA Micro Kit | Qiagen | 56304 | |
| QuantStudio™ 3 - 96-Well 0.2-mL | ThermoFisher | A28567 | |
| Search plate | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| SYBR Green qPCR Master Mix | ThermoFisher | K0221 | qPCR master mix |
| Synthetic Oviductal Fluid with HEPES (HSOF) | |||
| ThermoPlate | Tokai Hit | TPi-SMZSSX | Heating stage |
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